نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه رازی، دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، کرمانشاه، ایران
2 دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه گیاه پزشکی، کرمانشاه، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه مقایسهی خواص ضدتکثیری و مرگ برنامهریزی شده سلولی عصارههای هیدروالکلی گیاهان مختلف (بومادران، سرخارگل، دانهی خارمریم، پرسیاوش و هستهی زردآلو) بر علیه سلولهای سرطان سینه (Mcf-7) بود.
مواد و روشها: برای این منظور گیاهان مربوطه خشک و آسیاب شدند. پس از خیساندن آنها در اتانول 70 درصد برای مدت 72 ساعت، عصارههای آنها با کمک دستگاه روتاری استحصال شد. مقادیر متفاوت از آنها (5/12، 25، 50 و 100 میلیگرم/میلیلیتر) به محیط کشت سلولهای سرطانی اضافه شد و خواص سمیت سلولی آنها و مرگ برنامهریزی شده سلولی بهترتیب بعد از گذشت 24 ساعت با کمک آزمون MTT و رنگآمیزی با آکریدیننارنجی-اتیدیومبروماید مورد بررسی قرار گرفت. دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS، مقایسه میانگین دانکن در سطح معنیداری 5 درصد مورد آنالیز قرار گرفتند.
نتایج: افزودن حداکثر غلظت در تمامی عصارهها به محیط کشت نسبت به سایر غلظتهای همان عصاره بیشترین تاثیر معنیداری ضدتکثیری و مرگ برنامهریزی شده را نشان داد (05/0>p). همچنین در بین حداکثر غلظتها (100 میکروگرم/میلیلیتر) بیشترین اثر سمیت سلولی مربوط به عصارههای پرسیاوش و سرخارگل بود (05/0>p).
نتیجهگیری: نتایج این مطالعه نشان میدهد که افزودن غلظتهای بالای عصارههای پرسیاوش و سرخارگل به محیط کشت بیشترین تاثیر معنیدار ضدتکثیری و مرگ برنامه ریزی شده سلولی بر سلولهای سرطان سینه در مقایسه با سایر عصارههای گیاهی و غلظتهای مختلف بر جای گذاشته است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Comparison of Achillea wilhelmsii, Silybum marianumseed, Echinacea purpurea, Adiantum capillus-veneris and apricot kernel extracts effects on the proliferation and apoptosis of breast cancer cells
نویسندگان [English]
- L Soltani 1
- M Darbemamieh 2
1 Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture and Engineering, Razi University, Kermanshah, Iran
2 Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Razi University, Kermanshah, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to compare the anti-proliferative and apoptotic effects of hydroalcoholic extracts of different herbal medicines (Achillea wilhelmsii, Silybum marianumseed, Echinacea purpurea, Adiantum capillus-venerisand apricot kernel) against breast cancer cells (Mcf-7).
Material and method: For this purpose, the plants were dried and milled, then, soaked in 70% ethanol for 72 hours and their extracts were extracted using a rotary evaporator.Different concentrations of herbal extracts (12.5, 25, 50 and 100 μg/ml) were added to the cancer cell culture medium and their cytotoxicity and apoptotic effects were investigated after 24h by MTT assay and acridine orange - ethidium bromide staining, respectively.Data was analyzed by SPSS software at the significant level of 5%.
Results: Addition of the highestconcentration of all extracts to the culture mediumshowed the most significant anti-proliferative and apoptotic effects (p < 0.05) compared to other concentrations of the same extracts.Also, among the high concentrations (100μg/ml), the highest cell cytotoxicity effects were related to the extracts of Echinacea purpureaand Adiantum capillus-veneris (p < 0.05).
Conclusion: The results of this study indicated that the addition of Echinacea purpurea and Adiantum capillus-venerisextractsto the cell culturesin high concentrationshad the most significant anti proliferative and apoptotic effects on breast cancer cells in comparison with other plant extractsand concentrations.
کلیدواژهها [English]
- Apoptosis
- Breast cancer cells
- Cytotoxicity
- Herbal extracts
مقدمه
سرطان سینه یکی از عوامل تهدیدکنندهی زندگی زنان است. در سال 2012، بیش از 6/1 میلیون نفر مبتلای جدید به این بیماری شناسایی شد که از میان آنان، 521907 نفر به خاطر ابتلا به این بیماری جان خود را از دست دادند (1). عمل جراحی یکی از موثرترین درمانها برای سرطان سینه است. شیمیدرمانی، پرتودرمانی و هورموندرمانی بهطور معمول جهت حذف باقیماندههای تومور و مهار رشد آن و کاهش وقوع مجدد سرطان سینه موثر است. این درمانها سبب بهبود کیفیت و افزایش طول عمر بیماران مبتلا به سرطان سینه میشوند (2). اما متاسفانه، برخی بیماران با اثرات جانبی مرتبط با درمان یا مقاومت به این گونه درمانها مواجه میشوند. بنابراین، یافتن مواد زیستی فعال طبیعی، ممکن است جایگزین مناسبی برای درمان سرطان سینه یا کاهش عوارض جانبی درمانهای متداول باشد. مطالعات زیادی در رابطه با اثر عصارههای گیاهی بر سرطان انجام شده است (3) و تحقیقات متعددی اثربخشی مثبت مواد موثرهی گیاهی برسلولهای سرطانی را نشان دادهاند (4-6).
گیاه بومادران با نام علمی Achille wihelmsii Koch، از تیرهی کاسنی بوده و با داشتن 100 جنس و 20000 گونه در تمامی سطح کره زمین پراکنده است و در مناطق مختلف اروپا، شمال آمریکا و نواحی معتدل آسیا از جمله ایران رشد میکند (7، 8). این گیاه که دارای ساقهی ضخیم و استوانهای کم و بیش ایستاده و تا حدودی پوشیده از کرک است، در فصل اردیبهشت و خرداد گل میدهد (9). اسانس بومادران میتواند جهت پیشگیری از آسیبهای کبدی ناشی از شیمیدرمانی همراه با سیس پلاتین، بهعنوان یک داروی گیاهی با خواص آنتیاکسیدانتی توصیه شود (10). عصارهی الکلی این گیاه کاهندهی فشار سیستولی و دیاستولی خون است، اثر مهاری بر ترشح اسید با مهار تولید استیل کولین از عصب واگ اعمال میکند و علاوهبرآن محرک سیستم ایمنی نیز است (8 ، 11-12). دلالی و همکاران (13)، اثرات سیستوتوکسیک عصارهی متانولی و اسانس گیاه بومادران در غلظتهای متفاوت را بر ردهی سلولی HT-29 سرطان کلون مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج حاکی از این بود که اسانس برگ در مقایسه با عصارهی متانولی، اثرات سمیت سلولی قویتری دارد و این اثر میتواند بهدلیل وجود ترکیبات مونوترپنی بالاتر همچنون 1و8 سینئول و آلفاپنتین باشد.
گیاه سرخارگل،Echinacea purpurea (L.) ، از خانواده گیاهان ستارهآسا (Asteraceae) است (14) که در طب سنتی برای پیشگیری و درمان بیماریهایی از قبیل سرماخوردگی معمولی، عفونتهای ریوی، اختلالات جلدی و بیماریهای مزمن ناشی از نقص سیستم ایمنی استفاده داشته است (17-15). برای اولین بار این گیاه در سال 1372 وارد ایران شد و سرخارگل نامیده شد (18). کافئیک اسید موجود در سرخارگل که جزو مواد فنولی این گیاه است، اثرات آنتیاکسیدانتی اعمال میکند و منجر به مهار تکثیر سلولهای سرطانی سینه و کبد نیز میشود (20، 19). علاوهبراین، غلظت 1000 میکروگرم بر میلیلیتر عصارهی آبی این گیاه سبب کاهش بقای سلولهای سرطانی آستروسایتوما در طی بررسی با آزمون MTT شده بود (21).
گیاه خار مریم، Silybum marianum (L.)،گیاهی گلدار از خانواده گل آفتابگردان یا آستراسه میباشد. این گیاه بومی نواحی مدیترانه، شمال آفریقا و خاورمیانه است. نام خار مریم از دو ویژگی برگهای آن مشتق شده استکه خالدار سفید بوده و دارای عصاره شیری رنگ میباشد. از 2000 سال قبل گیاهشناسان از دانههای این گیاه جهت مراقبت از بافت کبد برضد سموم و درمان بیماریهای مزمن استفاده میکردند (23 و22). مواد موثرهی گیاه خار مریم که طی فرایند عصاره گیری استخراج میشود، سیلیمارین و اسیدلینولئیک میباشند (24). بخشی از سیلیمارین، سیلیبینین با دو ایزومر A و B است که اثرات قوی بر سلولهای توموری نظیر پروستات، کلون و مثانه اعمال میکند (25).
گیاه دارویی پرسیاوشان (Adiantum capillus-veneris L.) متعلق به تیرهی بسپایکیان است. اثرات متفاوتی از قبیل: ضداستفراغ، ضدسرفه، تببر، مسکن و غیره به این گیاه نسبت داده میشود (26). محل رویش این گیاه دارویی در اروپای جنوبی، کوههای آلپ و سواحل آتلانتیک و همچنین شمال ایران است (27). از جمله ترکیبات متفاوت در پرسیاوشان میتوان به فلاونوئیدها، استرهای سولفات، هیدروکسی سینامیکاسید، کافئیکاسید، کاپیلارین، موسیلاژ، انواع تریترپنوئیدها، استرولها، تانن، صمغ، کوئینیکاسید، شیکیمیکاسید و قند اشاره کرد (28). از طرفی ترکیبات متعدد آنتیاکسیدانتی در این گیاه شناسایی شده است وتحقیقات متعدد اثرات ضدتوموری، ضدمیکروبی، ضدالتهابی، ضدآلرژی، ضد دیابت و تنظیمکنندهی فعالیت تیروئید را نیز به آن نسبت دادهاند (35-29).
زردآلو، Prunus armeniaca L.، بهعنوان یکی از درختان هسته دار مناطق معتدله در بسیاری از نقاط ایران کشت و کار میشود. مناطق عمدهی کشت زردآلو در کشور شامل استانهای آذربایجان شرقی، غربی، سمنان، تهران، یزد، کرمان، زنجان، و خراسان رضوی است و ایران بعد از ترکیه مقام دوم در تولید زدآلو را در جهان دارد (36). بر طبق مطالعات روان و همکاران (37) هستههای زردآلو و هلو که بهشکل خام آن مصرف میشوند سبب القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی و تمایز در سلولهای توموری میشوند. سلولهای سرطانی DU145 و LNCaP پروستات انسان تغییرات مورفولوژیکی مرتبط با مرگ برنامهریزی شده سلولی و بههمان اندازه افزایش بیان Bax و فعالیت آنزیم کاسپاز-3 را، بعد از اضافه کردن عصارهی هستهی زردآلو را نشان میدهند (37). هستههای زردآلو و هلو متشکل از موادی نظیر گلیکوزیدها بهشکل آمیگدالین، روغنهایی نظیر اولئیکاسید و لینولئیکاسید، روغنهای فرار مانند بنزالدئید هستند (38). علاوهبراین، هستهی زردآلو حاوی پلیفنولهایی نظیر فلاونوئیدها و گالیک اسید نیز است (38، 39). در مطالعهایی که اخیرا منتشر شده، افزودن غلظتهای بالای عصارهی هستهی زردآلو به محیط کشت سلولهای سرطان کلون HT-29 در یک دورهی 24 ساعته، سبب کاهش تکثیر سلولها شده بود. ایندرحالی است که غلظتهای پایین سبب افزایش تکثیر شده بودند. علاوه بر این محققین مشاهده کردند که غلظتهای بالا پس از گذشت 72 ساعت باعث افزایش تکثیر و غلظتهای پایین سبب کاهش تکثیرسلولها شده بودند (40).
اطلاعات کمی راجع به مقایسه تاثیر گیاهان مختلف در القای مرگ برنامهریزی شده و اثرات ضد تکثیری آنها بر علیه سلولهای سرطانی وجود دارد. در این تحقیق بر آن شدیم که به مقایسهی اثرات ضدسرطانی (در قالب سمیت سلولی و بررسی مرگ برنامهریزی شده) عصارههای اتانولی چند گیاه متفاوت (بومادران، سرخارگل، خارمریم، پرسیاوشان و هستهی زردآلو) در غلظتهای متفاوت با کمک آزمون MTT و رنگآمیزی فلوروسنت آکریدین نارنجی-اتیدیومبروماید، بر علیه ردهی سلولهای سرطانی سینه MCF-7 بپردازیم.
مواد و روشها
این مطالعهی پژوهشی در زمستان سال 1398 در آزمایشگاه کشت سلول دانشگاه رازی انجام گرفت.
تهیه عصاره گیاهی: نمونههای گیاه بومادران در خرداد 98 از شهرستان کرمانشاه جمعآوری، شسته و خشک شدند. هستههای زردآلو نیز پس از مصرف میوهی آن، تهیه و خشک شدند. سه گیاه پرسیاوش، دانهی خارمریم و سرخارگل از عطاری تهیه شدند. جهت تهیه عصارهای الکلی، نمونههای گیاهی در الکل 70 درصد خیسانده شدند (41). برای اجرای کار، نمونههای گیاهی (بومادران، سرخارگل، دانهی خار مریم، هسته زردآلو و پرسیاوشان) با استفاده از دستگاه آسیاب پودر شدند. 10 گرم از پودر بهدست آمده به 100 میلیلیتر الکل 70 درصد اضافه شد و برای مدت 72 ساعت در دستگاه همزن در دمای اتاق مخلوط شد. در ادامه محلول گیاه و الکل سانتریفیوژ شد و مایع رویی با کمک کاغذ صافی واتمن 1 صاف شد. سپس در جهت جداسازی الکل با کمک دستگاه روتاری (Heidolph Rotary Evaporator 4011) نمونه عصاره به بالن تقطیر دستگاه اضافه شد و در خلا در 45 درجه سانتیگراد، بادور 120 و زمان 15 دقیقه جداسازی صورت گرفت. فاز آبی در آون (Memmert) در 45 درجهی سانتیگراد برای مدت 48 ساعت خشک شده، پودر شد و تا زمان استفاده در فریزر 20- سانتیگراد نگهداری شد. از عصارههای خشک شده، غلظتهای متفاوت 5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلیلیتر آب برای استفاده تهیه شد.
ردهی سلولی MCF-7 از ردههای سلولی سرطان سینه، از بانک سلولی انسیتیو پاستور تهیه شد و جهت فرآیند کشت مورد استفاده قرار گرفت. محیط کشت DMEM (Gibco) مکمل شده با 10 درصد سرم گوسالهی جنینی FBS (Gibco) همراه با 1 درصد آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومایسین (Sigma)، جهت اجرای آزمایشها مورد استفاده قرار گرفت. سلولها پس از کشت در محیط کشت DMEM مکمل شده با FBS و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومایسین در انکوباتور (Binder) حاوی 5 درصد دیاکسیدکربن، هوای اتمسفری مرطوب، و 37 درجه سانتیگراد کشت و تکثیر شدند. از سلولهای پاساژ سوم جهت مراحل کار استفاده شد. جهت شمارش سلولی و بررسی تعداد سلولهای زنده، از رنگ تریپان بلو و لام هموسایتومتر استفاده شد (42).
بررسی تاثیر سمیت عصارههای گیاهی بر سلولهای سرطان سینه: جهت بررسی سمیت عصارههای گیاهی بر سلولهای سرطان سینه از تست MTT (Sigma) استفاده شد. جهت انجام آن پودر MTT بهحالت محلول با غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر در بافر DPBS حل شد. در ادامه محلول تهیه شده با استفاده از فیلتر 2/0 میکرومتر جهت حذف آلودگیهای احتمالی و همچنین باقیماندههای حل نشدهی پودر MTT فیلتر شد. رنگ تا زمان استفاده در فریزر نگهداری شد. سلولهای مورد نظر با غلظت 10000 سلول در پلیت 96 خانه کشت شدند. محیط رویی این سلولها DMEM مکمل شده با 10 درصد سرم گوسالهی جنینی و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومایسین بود. برای هر عصاره 4 غلظت در سه تکرار سلول در چاهکها کشت شد. سلولها در شرایط یکسان در انکوباتور کشت سلول 5 درصد دیاکسیدکربن، هوای اتمسفری مرطوب، و 37 درجهی سانتیگراد کشت شدند. علاوهبراین، جهت رسم نمودار استاندارد و محاسبهی تعداد سلولهای گروههای تیماری، سلولها با غلظتهای متفاوت 10000، 20000، 30000، 40000، 50000 سلول در سه تکرار در پلیت 96 خانه در همان روز کشت شدند. پس از گذشت 24 ساعت از کشت، محیط کشت رویی خارج شد و به سلولها محیط جدید با غلظتهای متفاوت عصارههای اتانولی بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوشان و هستهی زردآلو در غلظتهای متفاوت (5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلیلیتر) اضافه شد. بعد از طی زمان انکوباسیون 24 ساعت، 20 میکرولیتر از محلول MTT به سلولها اضافه شد. در ادامه، سلولها برای مدت زمان 4 ساعت در انکوباتور انکوبه شدند. پس از پایان زمان انکوباسیون، مایع رویی برداشته شد. بههر چاهک 100 میکرولیتر محلول DMSO (Sigma) اضافه شد. پس از حل شدن کریستالهای بنفش رنگ، در دستگاه الایزاریدر BioTek (Power Wave XS2)با طول موج 570 نانومتر خوانش انجام گرفت (43).
سنجش میزان مرگ برنامهریزی شده سلولی با کمک رنگ آکریدیننارنجی-اتیدیومبروماید: برای انجام این آزمون و بررسی القای مرگ برنامهریزی شده سلولی، غلظتهای مختلف عصارههای الکلی گیاهی (5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلیلیتر) به محیط کشت سلولهای سرطان سینه اضافه شد. بعد از گذشت 24 ساعت از کشت، بهوسیلهی رنگ آمیزی آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید، مرگ برنامهریزی شده سلولی سلولها مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور، پس از اتمام دورهی کشت، مایع رویی سلولها حذف شدند و با محلول بافر DPBS شستوشو انجام گرفت. در ادامه، سلولها توسط محلول پارافرمآلدهید 4 درصد برای مدت زمان 15 دقیقه ثابت شدند. سپس مایع رویی حاوی محلول ثابت کننده، حذف شد و به آن DPBS اضافه شد. در ادامه، در زمان عکسبرداری بههر چاهک 2 میکرولیتر محلول آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید (نسبت حجمی 1:1 هر کدام از رنگها) اضافه شد و پپیپتاژ شد. نهایتا، نمونهها زیر میکروسکوپ فلورسانس ارزیابی، شمارش و عکسبرداری شدند (44).
تحلیل آماری
جهت اجرای آزمون MTT، همانطور که در قسمت مواد و روشها ذکر شد، غلظتهای متفاوت سلولی کشت شدند تا بتوان در اکسل نمودار استاندارد را رسم کرد. از فرمول رگرسیونی که نمودار استاندارد ارائه داد، با کمک OD حاصل از آزمون MTT عصارههای الکلی گیاهی مختلف و در غلظتهای متفاوت، تغییرات تعداد سلولها محاسبه شد. پس از محاسبه تعداد سلولها با توجه به اینکه حدقل سه تکرار برای هر تیمار وجود دارد، نمونهها وارد نرم افزار SPSS (ورژن 16) شد و آنالیز آماری در قالب طرح فاکتوریل کاملا تصادفی و مقایسه میانگین دانکن صورت گرفت. جهت آزمون مرگ برنامهریزی شده سلولی نیز در قالب طرح فاکتوریل کاملا تصادفی و مقایسه میانگین دانکن، آنالیز آماری صورت گرفت. دادهها در سطح معنیداری 5 درصد مورد آنالیز قرار گرفتند.
نتایج
نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن غلظتهای متفاوت عصارههای گیاهان ذکر شده (بومادران، سرخارگل، پرسیاوش و هستهی زردآلود) به محیط کشت سلولهای سرطانی، سبب کاهش تکثیر و افزایش مرگ برنامهریزی شده سلولی در سلولهای سرطان سینه شده بود (جدول 1و 2 شکل 1). بیشترین میزان کاهش تکثیر و افزایش مرگ برنامهریزی شده سلولی، مربوط به غلظت 100 میکروگرم در میلیلیتر بود (05/0>p). البته بایستی توجه داشت که کمترین میزان کاهش تکثیر و افزایش میزان مرگ برنامهریزی شده سلولی مربوط به غلظت 100 میلیگرم در میلیلیتر از عصارههای پرسیاوش و سرخارگل بود که نسبت به سایر عصارهها با همان غلظت اختلاف معنیدار نشان میداد (جدول 1و 2) (05/0>p). در مطالعهی حاضر کمترین اثر کشندگی و مرگ برنامهریزی شده سلولی مربوط به عصارهی اتانولی دانهی گیاه خار مریم بود (05/0<p). هرچند که غلظت 100 این عصاره در مقایسه با سایر غلظتهای آن بیشترین تاثیر را داشت (05/0>p). علاوهبراین، غلظت 100 عصارهی خارمریم نسبت به سایر عصارهها با همین مقدار،کمترین تاثیر کشندگی و مرگ برنامهریزی شده سلولی را داشت.
جدول 1: بررسی میزان سمیت سلولی غلظتهای مختلف عصارهی گیاهان مختلف (بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوش و هستهی زردآلو)- با کمک آزمون MTT
تیمار |
تعداد سلولهای زنده پس از آزمون MTT |
شاهد |
bc66/85 ±10994 |
عصاره بومادران غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
f76/92 ±10048 |
عصاره بومادران غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
j92/78 ±8916 |
عصاره بومادران غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
i12/75±9242 |
عصاره بومادران غلظت 100 میکروگرم در میلیلیتر |
l45/52±7750 |
عصاره خارمریم غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
a01/68±11525 |
عصاره خار مریم غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
b40/75±11141 |
عصاره خار مریم غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
c61/97±10843 |
عصاره خار مریم غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
hi60/83±9287 |
عصاره سرخارگل غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
d07/63±10585 |
عصاره سرخارگل غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
ed74/175±10441 |
عصاره سرخارگل غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
h92/104±9430 |
عصاره سرخارگل غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
o13/148±6596 |
عصاره پرسیاوش غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
g15/89±9876 |
عصاره پرسیاوش غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
j52/39±8929 |
عصاره پرسیاوش غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
k63/65±7982 |
عصاره پرسیاوش غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
n36/49±6769 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
e16/114±10313 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
i09/55±9232 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
k09/55±7958 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
m98/64±7302 |
میانگینهای دارای حروف متفاوت در هر ستون اختلاف معنیدار دارند.
میانگینهای دارای حروف مشترک در هر ستون نشاندهندهی عدم اختلاف معنیدار بین گروههای تیماری است.
جدول 2: درصد زندهمانی سلولهای سرطان سینه ردهی (MCF-7) پس از تیمار با غلظتهای مختلف عصارهی گیاهان مختلف (بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوش و هستهی زردآلو) – با کمک ارزیابی آکریدین نارنجی- اتیدیوم بروماید
تیمار |
درصد زندهمانی پس از بررسی مرگ برنامه ریزی شده سلولی با رنگآمیزی آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید |
شاهد |
a76/0 ±56/99 |
عصاره بومادران غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
a79/0 ± 17/98 |
عصاره بومادران غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
cde94/1 ± 12/91 |
عصاره بومادران غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
ef16/1 ± 24/88 |
عصاره بومادران غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
h14/2 ± 89/72 |
عصاره خارمریم غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
a32/1 ± 68/98 |
عصاره خار مریم غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
a39/2 ± 94/97 |
عصاره خار مریم غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
ab63/0 ± 93/96 |
عصاره خار مریم غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
def09/2 ± 21/89 |
عصاره سرخارگل غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
ab25/2 ± 93/95 |
عصاره سرخارگل غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
bcd67/0 ± 93/92 |
عصاره سرخارگل غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
ef74/2 ± 03/88 |
عصاره سرخارگل غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
j29/2 ± 11/60 |
عصاره پرسیاوش غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
bc40/1 ± 8/93 |
عصاره پرسیاوش غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
f47/2 ± 80/86 |
عصاره پرسیاوش غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
g94/2 ± 28/80 |
عصاره پرسیاوش غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
j88/3 ± 33/59 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر |
ab38/2 ± 96/95 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر |
ef10/1 ± 13/87 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر |
f41/2 ± 17/85 |
عصاره هستهی زردآلو غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر |
i 27/2± 28/65
|
میانگینهای دارای حروف متفاوت در هر ستون اختلاف معنیدار دارند. میانگینهای دارای حروف مشترک در هر ستون نشاندهندهی عدم اختلاف معنیدار بین گروههای تیماری است.
|
|
شکل1: رنگ آمیزی همزمان اتیدیوم بروماید-آکریدین نارنجی سلولهای سرطانی تیمار شده با غلظتهای مختلف عصاره گیاهی مختلف (a1: شاهد، a2، غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a3: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a4: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a5: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، b1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خارمریم، b2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، b3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، b4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، c1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، d1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش، d2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش ، d3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش ، d4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش، e1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هستهی زردآلو ، e2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هستهی زردآلو ، e3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هستهی زردآلو ، e4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هستهی زردآلو).
بحث
بیشتر بیماران سرطانی در اثر رشد اولیهی تومور جان خود را از دست نمیدهند، بلکه در پی رشد و توسعهی آن جانشان در معرض خطر قرار میگیرد. جلوگیری و مهار رشد تومور مهاجم و متاسازی، ابزاری امیدوارکننده جهت کاهش مرگ و میر بیماران مبتلا به تومورهای بدخیم است. در سالهای اخیر مطالعات بر روی داروهای ضدتومور رو به افزایش است. برخی از این مطالعات بر روی مواد طبیعی انجام میگیرد تا قابلیت جایگزینی درمان در برخی سرطانها از جمله سرطان سینه بررسی شد (47-45). برخی بخشهای داروهای گیاهی از قبیل، ریشهها، ساقهها، برگها و گلها برای تولید غذا و درمان بر علیه برخی از بیماریها مورد استفاده قرار میگیرند که میتوانند حاوی متابولیتهای اولیه و ثانویه باشند. متابولیتهای اولیه همان کربوهیدراتها، پروتئینها، و لیپیدها هستند درحالیکه متابولیتهای ثانویه شامل فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، ترپنوئیدها هستند که نقش مهمی در انواع فعالیتهای بیولوژیکی برعهده دارند. علیرغم افزایش تحقیقات در این زمینه، هنوز ابهامات زیادی برای گسترش استفاده کاربردی از این ترکیبات وجود دارد.
در مطالعهی حاضر، غلظتهای بالای عصارههای هیدروالکلی کلیه گیاهان مورد استفاده، در مقایسه با غلظتهای پایین آن اثرات معنیدار به مراتب بالاتری در زمینههای ضدتکثیری و مرگ برنامهریزی شده سلولی نشان میداد. علاوهبراین، غلظت 100 میکروگرم در میلیلیتر از گیاهان سرخارگل و پرسیاوش در مقایسه با سه گیاه دیگر تاثیر ضدتکثیری و مرگ برنامهریزی شده سلولی بالاتری را نشان میداد.
در مطالعات دیگر نیز تاثیرات مثبت این عصارهها بر سلولهای سرطانی مختلف ثبت شده است. در مطالعهی جعفریانی و همکاران (21) که از عصارهی آبی سرخارگل بر سلولهای سرطانی آستروسایتوما استفاده کردند، تاثیر مثبت غلظت 1000 میکروگرم بر میلیلیتر را طی آزمون MTT مشاهده کردند که این غلظت سبب کاهش بقای سلولها شده بود. در مطالعهی دیگر تاثیر عصارهی هیدروالکلی گلهای سرخارگل و مادهی موثرهی آن (Cichoric acid) بر سلولهای سرطان کولون انسانی Cavo-2 و HCT-116 مورد بررسی قرار گرفت. اثرات سمی این ترکیبات بر تکثیر سرطانی هر دو رده تایید شده بود (48). علاوهبراین، بخش هگزان عصارهی ریشهی سه گونهی سرخارگل اثرات ضد سرطانی خود را اثبات کردهاند (49). در مطالعهایی دیگر تاثیر عصارهی هیدروالکلی ریشهی مخلوط دو گونهی سرخارگل بر ردههای مختلف سلولی در غلظتهای متفاوت مورد ارزیابی قرار گرفت. مشاهده شد که عصارهی مخلوط سبب افزایش رشد سلولهای سرطانی Hela و QBC-939 میشود (50). عصارهی گیاه سرخارگل از ترکیبات متعددی شامل، ترکیبات قطبی (مشتقات کافئیکاسید)، غیرقطبی (آلکیلآمیدها و متابولیتهای ثانویهی استیلنی) و ساختارهای با وزنمولکولی بالا (پلیساکاریدها و گلیکوپروتئینها) تشکیل شده است. آلکیلآمیدهای جداسازی شده از گونههای سرخارگل اغلب متابولیتهای ثانویهای با یک یا بیش از یک گروه استیلنی در بخش انتهای زنجیرهی خود هستند که فعالیتهای بیولوژیکی متعددی از خود نشان میدهند (51). ترکیبات استیلنی منابع مختلف اثرات سمی برعلیه سلولهای سرطانی اعمال میکنند و فعالیت سمیت سلولی داروهای ضدسرطانی را نیز افزایش میدهند (52). مصرف عصارهی ریشهی آن سبب تحریک تولید سایتوکین TNF بهوسیلهی کانکاوالین-A توسط سلولهای طحال شده است (53). مطالعات دیگری نیز مشابه با مطالعهی حاضر تاثیر مثبت عصارهی پرسیاوش را بر سلولهای سرطانی مورد ارزیابی قرار دادهاند. عصارهی پرسیاوش دارای اثرات ضدسرطانی است که فعالیت خود را از طریق پروتئینهای دخیل در چرخهی سلولی و مرگ برنامهریزی شده سلولی یعنی Bcl-2 و سیکلین D1 اعمال میکند (54). در مطالعهایی دیگر اثر سمیت بخشهای هوایی و زیرزمینی پرسیاوشان بر مهار رشد سلولهای ردهی سرطان سینه مورد تایید قرار گرفته است (55). در بخشهای متعدد دنیا از گیاهان دارویی برای تقویت سلامتی استفاده میشود عصارهی متانولی پرسیاوش اثرات ضدسرطانی را نشان داده است (56).
عصارهی هستهی زردآلو نیز اثرات مثبت ضدتکثیری و القای مرگ برنامهریزی شده سلولی بر سلولهای مورد مطالعه اعمال کرده بود. گرچه این غلظت در مقایسه با بومادران و دانهی خارمریم اثرات معنیدار بیشتری نشان میداد، اما در مقایسه با سرخارگل و پرسیاوش تاثیر 100 میکروگرم در میلیلیتر آن معنیدار نبود. بررسی خواص آنتیاکسیدانتی عصارهی واریتههای مختلف هستهی زردآلو در مطالعه دیگری نشان داده است که واریتههای Habbi، Waflu Chuli، Thukdeena و Balaani منابع غنی از ترکیبات بیواکتیو و آنتیاکسیدانتی هستند. بیشترین فعالیت مهار رشد سلولهای سرطانی (HepG2) در واریتهی Waflu Chuli دیده شده هرچند که ارتباطی بین محتوی فیتوشیمیایی و مهار تکثیر سلولهای سرطانی پیدا نشده است (57). در مطالعهی ما از مخلوطی از هستههای واریتههای متفاوت زردآلو عصارهگیری انجام گرفت. شاید اگر ما نیز مشابه با مطالعهی چن و همکاران (57) در سال 2019، از واریتههای مختلف عصارهگیری انجام میدادیم تاثیرات بهمراتب مثبتتر را در این مطالعه مشاهده مینمودیم و اختلافات بین واریتهها نیز مشخص میشد. در مطالعهی دیگر اثرات ضدتکثیری غلظتهای متفاوت عصارهی هستهی زردآلو بر روی سلولهای سرطان کولون HT-29 مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از گذشت 24 ساعت، غلظتهای پایین محرک رشد سلولهای سرطانی بوده و غلظتهای بالا بهعنوان مهارکنندهی رشد عمل کرده است. ایندرحالی بود که پس از گذشت 72 ساعت، غلظت پایین اثرات مهارکنندگی داشته و غلظتهای بالا اثرات محرکی برای تکثیر سلولهای سرطانی اعمال کردهاند (40).
اثر سودمند غلظت بالای بومادران در مطالعهی ما مشاهده شده است هر چند که نسبت به غلظت بالای عصارهی سرخارگل، پرسیاوش و هستهی زردآلو معنیدار نبود. شاهانی و همکاران (58) اثرات سودمند عصارهی متانولی گیاه بومادران را بر مهار رشد سلولهای سرطانی پروستات همراه با bleomycin مورد بررسی قرار دادهاند. این محققین برخلاف مطالعهی ما که از عصارهی اتانولی استفاده نمودیم، از عصاره متانولی و همچنین از غلظتهای بسیار بالای این عصاره در مطالعهی خود استفاده کردند (20، 50، 100، 500، 1000 و 2000 میکروگرم در میلیلیتر) و اثرات ضدتکثیری را در ترکیب باbleomycin و بهتنهایی مشاهده نمودند. بهعلاوه، در آن مطالعه مشاهده شد که عصارهی متانولی بومادران سبب مهار رشد سلولهای طبیعی پوست انسان HFFF2 نمیشود (54). متابولیتهای Guaianolide جداسازی شده از عصارهی گیاه بومادران، پتانسیل ضدتکثیری بالایی را بر پنج ردهی سلولی تومور سرطان ریه در انسان ارائه نموده و حتی در آن مطالعه گزارش شده که از سیس-پلاتین نیز قویتر عمل کرده است (59). مطالعات دیگری نیز اثرات ضدتکثیری عصاره بومادران را بر ردههای سرطانی سلولهای کبدی (60) نشان دادهاند. علاوهبراین در سال 2017، در مطالعهی دیگر بر روی سلولهای سرطانی پروستات (PC3) مشاهده شد که عصارهی هیدروالکلی بومادران علاوهبر اعمال اثرات ضدتکثیری و مرگ برنامهریزی شده سلولی، قادر به مهار بیان تلومراز ترانسکریپتاز معکوس انسانی در سلولهای سرطان پروستات انسان بود (61). براساس این مطالعه، آسیب کبدی به سلولها و هپاتوسیت، ناشی از مصرف سیسپلاتین در موشهای صحرایی پس از مصرف اسانس و عصارهی بومادران کاهش یافته بود (10).
در جستجوی داروهایی با اثرات ضدسرطانی و بدون اثرات جانبی که تنها سلولهای سرطانی را حذف کند، تلاشهای بسیاری صورت پذیرفته است و سنتز و استفاده از ترکیبات با پایهی طبیعی یا تغییر ساختار محصولات طبیعی میتواند کمککننده باشد. یکی از محصولات طبیعی گیاه خار مریم است. در حقیقت از این گیاه برای حفاظت از بافت کبد در طول و بعد از شیمی درمانی و پرتودرمانی بهعنوان نوعی درمان کمکی همچنین جهت درمان عوارض کبدی و صفراوی نیز استفاده میشود (62). دانهی خار مریم غنی از سیلیمارین و مخلوطی از مولکولهای پلیفنولی است. یکی از ترکیبات موثر در این گیاه با اثرات ضدسرطانی، سیلیمارین است و بیشتر مادهی موجود در آن، سیلیبین است، نوعی از فلاونون خارمریم و فلاونولیگنان که اثرات ضدتوموری ویژه دارد (65-63). در مطالعهی حاضر در مقایسه با سایر عصارههای گیاهی، عصارهی اتانولی دانهی خار مریم در مقایسه با سایر عصارهها در غلظت بالا پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، کمترین تاثیر کشندهگی معنی دار را داشت. هرچند که غلظت 100 میکروگرم این عصاره درمقایسه با سایر غلظتهای پایینتر آن، بیشترین کشندگی را نشان میداد. افزودن عصارهی آبی خار مریم سبب مهار فعالیت سلولهای سرطانی معده شده است (66). پاسخ سلولهای مختلف به عصارهها و حتی ترکیبات مختلف متفاوت است. شاید اگر ما از غلظتهای بهمراتب بالاتری در مورد بومادران و خارمریم حتی سایر عصارههای موجود در این مطالعه استفاده میکردیم، تاثیرات مثبت و معنیدار بیشتری را مشاهده میکردیم.
نتیجهگیری
در پایان بهنظر میرسد که غلظتهای بالای عصارههای گیاهی (100 میکروگرم در میلیلیتر) مورد استفاده در این مطالعه در مقایسه با غلظتهای پایین اثرات معنیداری بیشتری را نشان میدهد. همچنین در بین غلظتهای 100 میکروگرم در میلی لیتر از عصاره گیاهان مورد استفاده در این مطالعه، گیاه سرخارگل و پرسیاوش در مقایسه با سه گیاه دیگر تاثیرات معنیدار بالاتری را نشان دادند. مطالعات بیشتری نیاز است که تاثیر معنیدار گیاهان دارویی را با هم مقایسه کند و علاوهبراین، غلظتهای بالاتر این ترکیبات نیز بایستی مورد بررسی قرار بگیرند. همچنین بررسی اثرات ضدسرطانی ترکیبی از عصارههای گیاهان استفاده شده در این مطالعه در شرایط آزمایشگاهی و درونتنی توصیه میشود.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از همکاری معاونت محترم پژوهشی و فناوری، مدیریت محترم امور پژوهشی و سرپرست محترم گروه برنامهریزی و نظارت پژوهشی دانشگاه رازی جهت انجام این پژوهش قدردانی میشود.