نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک و روند زمانی وقوع آنها در معرض با فلز سنگین کروم در اندامهای آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفه ای آب شیرین Anodonta cygnea بود.
مواد و روشها: 24 عدد دوکفه ای با دامنه طولی (7/12 تا 3/13سانتیمتر) از منطقه سمسکنده ساری برداشت گردید. در آزمایشگاه دوکفه ایها با غلظتµg l-1 125 برای مدت 18 روز در معرض فلز کروم قرار گرفتند. در روزهای 4، 9 و 18 از دوکفهایها جهت بهدست آوردن تودههای بافتی از اندامهای مورد مطالعه، نمونهبرداری شد. برشهای بافتی از نمونههای در معرض فلز و شاهد تهیه گردید و با روش هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند.
نتایج: وضعیت هیستولوژیک در هر سه اندام مورد مطالعه در مقایسه با نمونههای شاهد، تغییرات قابل توجهی را نشان داد. در آبشش هیپوپلازی، تغییرات شکلی و اندازهای تیغههای آبششی، گرانولوما، هیپرپلازی و آتروفی کانالهای همولنفی مشاهده گردید. در غده هاضمه آتروفی توبولهای گوارشی، ریزش سلولهای گوارشی و بازوفیل به درون توبولها و همچنین تجمع هموسیتها و گرانولوما در بافت پیوندی مشاهده گردید. در پا هیپوپلازی اپیتلیوم بیرونی، افزایش تعداد سلولهای موکوسی و تورم و گسستگی بافتی در ساختار دسته های میوسیت مشاهده گردید. اولین علائم تغییر در روز چهارم ثبت و با افزایش مدت زمان معرض، ظهور علائم جدیدتر و افزایش گستره تغییرات هیستوپاتولوژیک در هر سه اندام دیده شد.
نتیجهگیری: تغییرات هیستوپاتولوژیکی در اندامهای دوکفهای A. cygnea به عنوان بیومارکرهای هیستوپاتولوژیکی بسیار مناسبی جهت پایش اثرات این فلز در محیط آبی پیشنهاد میشود و روند زمانی ظهور تغییرات، دقت این شاخصها را افزایش میدهد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of Histopathological Biomarkers and Their Incidence Time Pattern in Gill, Digestive Gland and Foot in Freshwater Bivalve, Anodonta cygnea, in Exposure to Sublethal Concentration of Chromium (Cr)
چکیده [English]
Aim:The aim of this study was to investigate histopathological alterations and their incidence time pattern due to chromium (Cr) exposure during 18 days in gill, digestive gland and foot in freshwater bivalve, Anodonta cygnea.
Material and Methods: 24 bivalve specimens with length range of 12.7-13.3 cm were collected from Semeskandeh region, Sari. They were exposed to 125 µg l-1 of Cr for 18 days. Bivalves were sampled in days 4, 9 and 18 for obtaining tissue samples of studied organs. Tissue sections of exposed and control group samples were prepared and staining was done using haematoxylin and eosin (H&E) method.
Results: Histology of all of three studied organs of exposed bivalves in comparison with control group showed significant histopathological changes. Hypoplasia and changes in shape and size of gill lamellae, granuloma, hyperplasia and atrophy of haemolymph channels were observed. In digestive gland, atrophy of digestive tubules, loss of digestive and basophilic cells from tubules, and haemocyte aggregation and granuloma in connective tissue were occurred. Hypoplasia of external epithelium, increase of mucus cells, and swelling and tissue rapture in myocyte blocks were observed in foot. Primary signs of histopathological alteration were appeared in fourth day, and in following days appearance of new signs and expansion of affected area was detected in all of investigated organs.
Conclusion: Based on our results, histological changes due to Cr exposure in studied organs in A. cygnea are proposed as appropriate histopathological biomarkers to monitoring Cr levels in aquatic environments and their incidence time pattern can increase fidelity of these indices.
کلیدواژه‌ها [English]
- Histopathology
- Anodonta cygnea
- Chromium
- Internal organs
مقدمه
فلزات سنگین یک اصطلاح عام برای گروهی از عناصر فلزی است که چگالی آنها بیش از gr cm-3 3 است که در غلظتهای کم دارای اثرات بیولوژیکی تعریف شده بوده و زمانی که در غلظتهای بالاتر از سطوح فیزیولوژیکی قابل تحمل در سلولها وجود داشته باشند، میتوانند اثرات سمی اعمال نمایند (1). این عناصر از آلایندههای بسیار مهم محیطهای آبی هستند که پیامدهای نامطلوبی بر جوامع زنده این زیستگاهها دارند (2 و 3). فعالیتهای انسانی یکی از منشاهای اصلی ورود این آلایندهها به پیکرههای آبی است (4).
در دهههای اخیر گروههای مختلف موجودات زنده بهطور گسترده جهت بررسی وقوع آلودگیهای شیمیایی در محیطهای طبیعی مورد استفاده قرار گرفتهاند. دوکفهایها، گروهی از نرمتنان هستند که مطلوبیت بسیار بالایی جهت استفاده بهعنوان بیواندیکاتورهای آلودگی در محیطهای آبی دارند (5). با توجه به این که این موجودات در تماس مستقیم با بخشهای آلوده شده زیستگاههای آبی (رسوبات و آب) هستند و میتوانند سطوح بالایی از فلزات سنگین را در بافتهای نرم خود ذخیره کنند، شواهد مناسبی را در رابطه با وقوع آلودگیهای محیطی با مقیاس زمانی از طریق بررسی پاسخهای سلولی و فیزیولوژیکی فراهم میسازند (6).
در میان طیف گسترده شاخصهای زیستی مورد استفاده در ارزیابی اثرات آلایندهها، تغییرات هیستوسیتولوژیکی بهعنوان ابزارهایی مناسب جهت پایش آلودگی پیشنهاد شدهاند (7). سلولها نخستین محلهای برهمکنش مواد شیمیایی و سیستمهای بیولوژیکی هستند (8). تفاوتهای موجود در فرایندهای بیوشیمیایی در اندامکهای مختلف سلول، محل اثر مواد سمی را تعیین میکند و تفکیک مکانی انواع سلولها در بافتهای مختلف مشخص میسازد که چه بافتی بیشتر تحت تاثیر یک عامل سمی قرار گرفته یا این که بیشترین پاسخدهی را به آسیب عامل سمیتزا داشته است. تعیین پاسخهای هیستوسیتولوژیکی نسبتا آسان بوده و میتوان آنها را به سلامت و شایستگی افراد در جوامع اکولوژیک نسبت داد (6). در معرض قرارگیری بلندمدت با فلزات سنگین میزان مستعد بودن نسبت به استرسهای محیطی را افزایش داده و گسترش ناهنجاریهای هیستوپاتولوژیک را در موجودات زنده در پی دارد (9). مطالعات انجام شده در این زمینه بیانگر بروز تغییرات پاتولوژیکی انحطاطی (degenerative)، تخریبی (destructive) و التهابی (inflammatory) در ارزیابی وضعیت شکلی- عملکردی بافتها و اندامهای مختلف دوکفهایها در معرض قرارگیری با فلزات سنگین بوده است (7، 10-13 ).
در این مطالعه، اثرات هیستوپاتولوژیکی معرض قرارگیری با فلزات سنگین و الگوی زمانی پیدایش آنها در سه اندام آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفهای آب شیرین Anodonta cygneaمورد بررسی قرار گرفت. این دوکفهای از بیمهرگان ساکن در رودخانهها و تالابهای شمال کشور است که پراکنش گستردهای در خارج از ایران نیز دارد. از آنجا که در منابع متعدد اثرات اختصاصی هیستوپاتولوژیک برای عناصر سنگین مختلف ذکر نشده است (7)، همچنین با توجه به اینکه، در میان فلزات سنگین، فلز کروم سطوح آلایندگی بالاتری را در آبهای شیرین بهوجود آورده است (14)، لذا در این مطالعه فلز کروم بهعنوان عامل آلاینده انتخاب گردید.
مواد و روشها
جمعآوری نمونههای دوکفهای و شرایط نگهداری در آزمایشگاه: در آذرماه 1390، 30 نمونه از دوکفهای A. cygnea با دامنهی طولی (7/12 تا 3/13 سانتیمتر) از مصب رودخانه تجن، منطقه سمسکنده ساری در استان مازندران (36°48΄46΄΄N, 53°6΄57΄΄E) برداشت شد. این نمونهها پس از انتقال به آزمایشگاه بیولوژی آبزیان گروه شیلات دانشکده منابع طبیعی دانشگاه تهران، جهت تطابق با شرایط آزمایشگاهی به مدت 2 هفته در تانکهای فایبرگلاس نگهداری شدند. شرایط مخازن آزمایشی در طول دوره مطالعه ثابت نگه داشته شد بهطوری که دامنهی تغییرات دما و pH بهترتیب عبارت بود از 15 تا 17 درجهسانتیگراد و 8/6 تا 4/7.
پلان مواجهه با فلز کروم: پس از دوره تطابق، 24 نمونه از دوکفهایها در 4 تانک تقسیم شدند (سه مخزن آزمایشی و یک مخزن شاهد). با توجه به غلظتهای طبیعی فلز کروم و غلظتهای مورد استفاده آن در مطالعات پیشین (15)، در این مطالعه غلظت µg l-1 125 جهت معرض قرارگیری استفاده شد. در روزهای 4، 9 و 18 پس از معرض قرارگیری دوکفهایها با فلز کروم، از مخازن نمونهگیری شد به طوری که در مجموع در هر بار نمونهبرداری حداقل 3 نمونه از دوکفهایها جهت استفاده تودههای بافتی برداشت شد.
بافتشناسی: پوستههای دوکفهای با استفادهی از یک اسکالپل جهت بریدن عضلات جمعکننده قدامی و خلفی، باز شده و از بخش احشایی جدا گردید. سپس تودهی بافتی با حجم تقریبی 5/0 سانتیمتر مکعب از اندامهای آبشش، غده هاضمه و پا بریده شده و بهمنظور فیکس شدن به مدت 48 ساعت در محلول بوئن (پیکریک اسید اشباع: 75 بخش؛ فرمالدهید 40 درصد: 25 بخش؛ استیک اسید گلاسیال: 5 بخش) و بهدنبال آن در اتانول 70 درصد نگهداری گردید. مراحل آمادهسازی و رنگآمیزی هماتوکسیلین – ائوزین نمونههای بافتی بر اساس پروتکل Hewitson and Darby (16) انجام شد.
نتایج
وضعیت هیستولوژیک اندامهای مورد مطالعه در نمونههای شاهد:
وضعیت هیستولوژیک اندامهای مورد مطالعه در بافتهای بهدست آمده از نمونههای شاهد در شکل 1 نشان داده شده است. در آبشش ساختارهای تیغههای آبششی با اندازه و شکل یکسان با فواصل نسبتا برابر از هم مشاهده گردید (شکل 1- A).
شکل 1: برشهای بافتی 5 تا 7 میکرونی از نمونههای شاهد اندامهای آبشش (A, B, C)، غده هاضمه (D, E, F) و پا (G, H, I). hch: کانال همولنف؛ ct: بافت پیوندی؛ gl: تیغه آبششی؛ ci: مژه؛ ep: اپیتلیوم؛ pt: توبول گوارشی اولیه؛ st: توبول ثانویه؛ dc: سلول گوارشی؛ bc: سلول بازوفیل؛ ha: هموسیت؛ cc: سلول پیوندی؛ mc: سلول موکوسی؛ mb: دسته میوسیت؛ t-mb: مقطع عرضی دسته میوست؛ l-mb: مقطع طولی دسته میوست. رنگآمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین.
ساختارهای مژهای در اپیتلیوم یکپارچه تیغههای آبششی بهصورت کاملا واضح دیده شد (شکل 1- B) و در بخشهای درونی این اندام، کانالهای همولنفی در یک الگوی ردیفی مشاهده گردید بهطوری که فواصل بینابینی آنها را بافت پیوندی پر کرده بود (شکل 1- C). در غدهی هاضمه، مقاطع عرضی توبولهای گوارشی اولیه و انشعابات چندگانهی آن به وضوح مشاهده گردید (شکل 1- D) به طوری که سلولهای گوارشی و بازوفیل تشکیلدهنده ساختار توبولها قابل تشخیص بود (شکل 1- E). فضای بینابین توبولها نیز متشکل از سلولهای بافت پیوندی بود که در میان آنها هموسیتها با پراکنش نامنظم و تعداد کم وجود داشتند (شکل 1- F). بخش عمدهی بافت پا از دستههای متراکم و یکپارچهی میوسیت تشکیل شده بود به طوری که در جهتهای مختلف توزیع شده بودند و مقاطع عرضی و طولی آنها در برشهای بافتی مشاهده گردید (شکل 1- G و I). اپیتلیوم مژهدار بیرونی این اندام نیز بهطور کاملا مشخص دیده شد که ساختاری چین خورده را نشان میداد (شکل 1- H). همچنین در بخشهای زیراپیتلیال پا، سلولهای بافت پیوندی فضای بینابین دستههای میوسیت را پر کرده بودند و در قسمتهای نزدیک به اپیتلیوم سلولهای موکوسی نیز وجود داشتند (شکل 1- G).
انواع تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده در اندامها: در آبشش تغییرات قابل توجهی در وضعیت هیستولوژیک تیغهها مشاهده شد. پوستهپوسته شدن (lifting) و همچنین هیپوپلازی (تخریب ساختارهای مژهای) در اپیتلیوم تیغهها رخ داده بود (شکل 2-A و C) و در نتیجه آن گرزی شکل شدن تیغهها و کاهش فضای بینابینی آنها و همچنین تخریب دیواره تیغهها و اتصال تیغههای مجاور در محلهای تخریب مشاهده گردید (شکل 2- B، C و F). دیواره کانالهای همولنفی دچار هیپرپلازی شده و ضخامت آن افزایش یافته بود (شکل 2- D) و با گذشت زمان تخریبهای گسسته و آتروفی ساختار کانال دیده شد (شکل 2- E). گرانولوما (ظهور سلولهای دارای رنگدانههای لیپیدی به رنگ زرد تا قهوهای روشن) در بافتهای پیوندی بینابین کانالها و همچنین در ناحیهی پایهی تیغههای آبششی رخ داده بود (شکل 2- A و E). گسستگیهای بافتی شدید در نواحی قشری (محل تیغهها) و درونی (محل کانالهای همولنفی) دیده شد (شکل 2- F).
شکل 2. برشهای بافتی 5 تا 7 میکرونی آبشش در نمونههای معرض با فلز کروم. A: گرانولوما (gr) و پوستهپوسته شدن (li) در ناحیه تیغههای آبششی؛ B: گرزی شکل شدن تیغههای آبششی و گسستگی دیواره تیغهها (tr) و اتصال تیغههای مجاور (gl-c)؛ C: هیپوپلازی و کاهش ضخامت اپیتلیوم تیغههای آبششی؛ D: هیپرپلازی (hyp) و افزایش ضخامت اپیتلیوم کانالهای همولنفی؛ E: وقوع گرانولوما (gr) در بافت پیوندی بینابین کانالها و همچنین آتروفی کانالهای همولنفی؛ F: تغییرات نامنظم در طول و شکل تیغههای آبششی و اتصال تیغههای مجاور (gl-c) و گسستگی بافتی در تیغههای آبششی و کانالهای همولنفی. رنگآمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین.
آشکارترین تغییر مشاهده شده در غده هاضمه، تخریب و گسستگی دیواره و آتروفی توبولهای گوارشی بود (شکل 3- A). در بافت پیوندی فضای بینابین توبولها، گسستگی بافتی و تجمع متراکم و تقریبا متمرکز هموسیتها بههمراه گرانولوما مشاهده شد (شکل 3- B و C). در انشعابات چندگانهی توبولهای گوارشی، ریزش سلولهای بازوفیل و گوارشی بهدرون فضای توبولها نیز بهطور گسترده رخ داده بود (شکل 3- B). هیپرپلازی شدید در دیوارهی توبولهای گوارشی (شکل 3- D) هم دیده شد.
مشابه آبشش، هیپوپلازی و تخریب اپیتلیوم بیرونی در پا نیز اتفاق افتاد (شکل 4- A و B). در موارد بسیاری افزایش تعداد سلولهای موکوسی در محلهای اپیتلیوم تخریب شده مشاهده گردید (شکل 4- B). در بخشهای درونیتر گسستگی و اضمحلال دستههای میوسیت پراکنده شده در این اندام در مقایسه با وضعیت شاهد دیده شد (شکل 4- C و D). همچنین تورم ابری میوسیتها نیز رخ داده بود (شکل 4- D).
شکل 3: برشهای بافتی 5 تا 7 میکرونی از غده هاضمه در نمونههای در معرض با فلز کروم. A و B: آتروفی و تغییرشکل در ساختار دیوارهی توبولهای گوارشی و گسستگی بافتی (tr) در بافت پیوندی بینابین توبولها؛ C: گسستگی بافتی (tr) در بافت پیوندی و تجمع متراکم هموسیتها (ha) و وقوع گرانولوما (gr)؛ D: هیپرپلازی (hyp) سلولهای گوارشی در دیوارهی توبولهای گوارشی. رنگآمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین.
شکل 4: برشهای بافتی 5 تا 7 میکرونی پا در نمونههای در معرض با فلز کروم. A: هیپوپلازی (hpo) و گسستگی (tr) در ساختار اپیتلیوم بیرونی؛ B: هیپوپلازی (hpo) و افزایش تعداد سلولهای موکوسی (mc) در اپیتلیوم بیرونی؛ C: گسستگی بافتی (tr) در ساختار بافت عضلانی بخش زیراپیتلیال؛ D: تورم (sw) میوسیتها و گسستگی بافتی (tr) در ساختار دستههای میوسیت در بخشهای داخلی پا. رنگآمیزی: هماتوکسیلین-ائوزین.
روند زمانی وقوع تغییرات هیستوپاتولوژیک:
روند زمانی ظهور انواع تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده در اندامهای مورد مطالعه در جدول 1 آمده است. در روز چهارم، تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از مواجهه با فلز کروم در هر سه اندام مشاهده شد بهطوری که بخشهای سطحی اندامها را تحت تاثیر قرار داده بودند. در روز نهم تغییرات شدیدتری مشاهده گردید که بدشکلیهای ساختاری قابل توجهی را در هر سه اندام منجر شده بود. در روز هجدهم نیز علائم جدیدتری در دو اندام آبشش و پا دیده شد که باز هم پیشرفت گستره تاثیر فلز کروم را نشان داد بهطوری که بخشهای درونیتر را درگیر کرده بود.
جدول 1: ترتیب زمانی وقوع انواع مختلف تغییرات هیستوپاتولوژیک در اندامهای مختلف در طول دورهی مطالعهی 18 روزی.
|
اندام |
زمان |
||
|
روز چهارم |
روز نهم |
روز هجدهم |
|
|
آبشش |
هیپوپلازی اپیتلیوم تیغههای آبششی پوستهپوسته شدن اپیتلیوم تیغهها
|
گرزی شکل شدن و تغییر طول تیغهها کاهش فواصل بین تیغهها هیپرپلازی دیواره کانالهای همولنفی گرانولوما |
گسستگی کانالها و آتروفی آنها به هم چسبیدگی تیغههای مجاور در نقاط تخریب دیوارهتیغه ها |
|
غده هاضمه |
ریزش سلولهای گوارشی و بازوفیل به فضای درونی توبولها |
آتروفی توبولهای گوارشی تجمع هموسیتها در بافت پیوندی بینابین توبولها گرانولومای گسترده |
|
|
پا |
هیپوپلازی اپیتلیوم افزایش تعداد سلولهای موکوسی در لایه زیراپیتلیال |
گسستگی بافتی در اپیتلیوم و بخشهای زیراپیتلیال |
تورم و گسستگی در ساختار دستههای میوسیت |
بحث
مطالعات متعدد انجام شده تغییرات هیستوپاتولوژیکی ناشی در معرض قرارگیری با فلزات سنگین را بهعنوان شاخصهایی مناسب جهت پایش اثرات آلودگی این عناصر بر موجودات زنده پیشنهاد کردهاند (3، 7، 9، 17). نتایج بهدست آمده در این تحقیق نشان داد که در معرض قرار گیری با غلظت تحت کشندهی فلز سنگین کروم در مدت 18 روز تغییرات هیستوپاتولوژیکی قابل توجهی را در سه اندام آبشش، غدهی هاضمه و پا به دنبال دارد. هر چند این سه اندام عملکردهای متفاوتی دارند (آبشش: عملکرد فیلتراسیونی؛ غده هاضمه: عملکرد تغذیهای و پا: عملکرد حرکتی) (18) و مسیرهای معرض قرارگیری با فلز در آنها متفاوت است، اما در روز چهارم پس از معرض قرارگیری با فلز کروم تغییرات بافتی در هر سه اندام مشاهده گردید.
نتایج مطالعات پیشین در موارد زیادی همسو با نتایج بهدست آمده در این پژوهش است. وقوع گرانولوما ناشی از جذب فلزات سنگین دانسته شده است (19،20 و 21). همچنین نفوذ و تجمع هموسیتها، بهعنوان یک پاسخ دفاعی در محلهای آسیب دیده در بافتهای مختلف بیمهرگان گزارش شده است (22) که در مطالعهی حاضر نیز چنین علائمی در آبشش و غده هاضمه مشاهده شد. افزایش سلولهای موکوسی در پا به احتمال زیاد در پاسخ به تخریب مژههای اپیتلیوم و نقص فرآیند حرکتی این اندام رخ داده است. افزایش تعداد سلولهای موکوسی پوششی در اویسترها در معرض با آلایندههای شیمیایی گزارش شده است (23). تغییرات عمدهی هیستولوژیکی ناشی از حضور آلایندهها در دوکفهایها به صورت فرم نامنظم سلولهای گوارشی و بازوفیل و واکوئلها ذکر گردیده است (24). تغییر در اندازه میوسیتهای موجود در گروههای میوسیت و همچنین تخریب ساختار گروهی میوسیتها در بلوکهای عضلانی عضلات جمعکننده در ماسلها در نتیجه مواجهه با فلز مس مشاهده شده است (25). در این مطالعه چنین تغییراتی در ساختارهای عضلانی پا مشاهده شد. ناهنجاریهای شکلی در آبشش و غدهی هاضمه نیز که در این مطالعه رخ داده بود، در مطالعات پیشین (20، 25، 26، 27 و 28) گزارش شده است. وقوع گسستگی بافتی در بافتهای مختلف نیز در نتیجه در معرض قرارگیری با فلزات سنگین گزارش شده است (25).
بررسی الگوی زمانی تغییرات هیستوپاتولوژیک در اندامهای مختلف میتواند یک رویکرد مناسب را جهت تعیین دقیق زمانهای وقوع آلودگی در محیطهای آبی ارائه دهد. در این مطالعه در هر سه اندام در روز چهارم علائم تغییر مشاهده شد و به تدریج با افزایش دوره معرض گذاری، علائم مشاهده شده نشان دهنده افزایش گستره و شدت آسیبها در اندامهای مورد مطالعه بود. در مطالعات پیشین (24، 26 و 27) دورههای زمانی مواجهه با فلزات سنگین و سایر آلایندهها بیش از 10 روز بوده است و تغییرات هیستوپاتولوژیک پس از اتمام دوره مورد بررسی قرار گرفتهاند، اما در این مطالعه زمانهای ظهور علائم بهصورت مشخص در دفعات مختلف در طول دوره مطالعهی 18 روزی پس از معرض قرارگیری تعیین گردید و اولین زمان روز چهارم بود. این الگوی بهدست آمده میتواند در پایشهای محیطی بسیار مفید باشد.
نتیجهگیری
در مجموع با توجه به نتایج بهدست آمده در این مطالعه احتمالا میتوان تغییرات هیستوپاتولوژیکی در سه اندام آبشش، غده هاضمه و پا در دوکفهای آب شیرین Anodonta cygnea را بهعنوان بیومارکرهایی در رابطه با در معرض قرار گیری با فلز سنگین کروم بهعنوان نمونهای از آلایندههای فلزی سنگین مورد استفاده قرار داد. همچنین روند زمانی مشاهده شده در ظهور این بیومارکرهای هیستوپاتولوژیک، سودمندی آنها را جهت تعیین دقیقتر اثرات آلودگی دوچندان میسازد.
)