نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: آرتمیزینین مهمترین متابولیت جنس Artemisia می باشد. بهدلیل اهمیت آرتمیزینین در درمان مالاریا، تولید آرتمیزینین در درمنه کوهی، کشت کالوس و کشت سوسپانسیون سلولی گیاه بررسی شد. همچنین توانایی تبدیلات بیوشیمیایی در جهت تولید آرتمیزینین در کشت سوسپانسیون گیاه ارزیابی شد.
مواد و روشها: با جمع آوری اندام هوایی گیاه و انتقال دانه رستها به محیط کشت جامد موراشیگ و اسکوگ (MS) کالوس بهدست آمد. کالوس های به محیط کشت مایع منتقل و سوسپانسیون سلولی حاصل شد. بررسی وجود آرتمیزینین در عصاره دی کلرومتانی اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه با روش TLC و GC انجام گرفت. کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون بهعنوان پیشساز آرتمیزینین به سوسپانسیون افزوده و تولید آرتمیزینین با GC بررسی شد.
نتایج: محیط حاوی )Kinetin5/0( D,-4-2( 5/0)، NAA( 1) و محیط حاوی BA( 25/0) و NAA( 05/0) برای رشد کالوس مناسب بود. نور تاثیر مثبت بر رشد کالوس داشت. بر اساس نتایج TLCو GC تولید آرتیمیزنین در گیاه اثبات نشد ولی کالوس و سوسپانسیون سلولی، گیاه آرتمیزینین تولید کردند اما افزودن کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون به سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی بر تولید بیشتر آرتمیزینین تاثیر نداشت. بهنظر میرسد این ترکیبات پیشساز مناسبی برای تولید آرتمیزینین در گیاه درمنه کوهی نیست.
نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که میتوان با بهکارگیری روشهای نوین ترکیب ارزشمند آرتیمیزنین را در درمنه کوهی علیرغم عدم تولید آن در گیاه تهیه نمود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Artemisinin Production in Plant, Callus and Cell Suspension Culture of Artemisia aucheri Boiss.
چکیده [English]
Aim: Artemisinin, an outstanding cumpound in genus Artemisia, is the most important anti malaria medicine. Therefore, plant cell culture of Artemisia aucheri Bioss was established and production of artemisinin was studied on plant, callus, and cell suspension culture.
Material and Methods: Artemisia aucheri aerial parts and seeds were obtained. Seedling was prepared and transferred on solid MS medium containing different growth regulators and callus was established. Fresh callus was transferred to liquid MS medium and suspension culture was obtained. For detection of artemisinin, the dichloromethanolic extract of callus, suspension and seeds of the plant was analysed by TLC and GC methods. Biotransformation was studied by feeding cholesterol, bisabolol and artemisia ketone to suspension culture.
Results: MS medium supplemented with kinetin (0.5 mg/l), 2, 4-D (0.5 mg/l), NAA (1 mg/l) and BA (0.25 mg/l), NAA (0.05 mg/l) was suitable for establishment of callus. Light showed positive effect on calli growth. No artemisinin was detected on plant aerial part. It seems, however, that callus and suspension culture of A. aucheri produced artemisinin. Also, Cholesterol, bisabolol and artemisinin keton feeding did not influence artemisinin production. Therefore, it seems these precursors are not proper for biotransformation experiments.
Conclusion: Despite of undetected artemisinin in aerial parts of the A. aucheri, the production of artemisinin using new methods such as in vitro culture of A. aucheri is a promising result.
کلیدواژه‌ها [English]
- Artemisinin
- Artemisia aucheri Bioss
- Callus
- Cell culture
- Biotransformation
مقدمه
امروز، در قرن بیست و یکم، مالاریا بهعنوان یک بیماری قدیمی، همچنان سلامت مردم را در بسیاری از کشورهای جهان تهدید میکند. سالانه بیش از چند صد میلیون مورد ابتلا به مالاریا در جهان گزارش میشود که حدود یک میلیون نفر از آنها جان خود را از دست میدهند (1).
آرتمیزینین و مشتقات حاصل از آن از پرکاربردترین داروهای ضد مالاریا در بازار دارویی جهان محسوب میشوند که اثر دهی سریع، ایمن و مناسب در برابرگونههای حساس و مقاوم به دارو دارند (2). آرتمیزینین، یک سزکوئی ترپن لاکتونی است که بهطور طبیعی در گونههای مختلف جنس آرتمیزیا از جمله Artemisia annua L یافت می شود (3). با اینحال راندمان تولید این ترکیب بهطور طبیعی پائین است (01/0 تا 5/0 درصد وزن خشک گیاه) و تولید این ماده در صنعت از لحاظ اقتصادی با نوع طبیعی آن رقابت ندارد (4). از این رو افزایش بازده تولید در گیاه و کشت سلولی حاصل از آن مورد توجه قرار گرفته است.
کشت بافت گیاهی که در محیطهای کشت مصنوعی و استریل شده صورت میگیرد سرشار از آنزیمهای اختصاصی برای تولید متابولیتهای گیاهی میباشد. همچنین امکان شناسایی مسیرهای بیوسنتز و ترکیبات واسطه آن در این محیطها وجود دارد که زمینه تولید بیشتر متابولیتهای گیاهی را فراهم میکند (5).
تولید آرتمیزینین، در کشت بافت گیاهی بارها مورد مطالعه قرار گرفته است و نتایج آن ارائه شده است. ایجاد شرایط مناسب در این کشتها، زمینه تبدیل پیشسازهای طبیعی نظیر آرتمیزینیک اسید و دی هیدروآرتمیزینیک اسید را فراهم کرده است. اثر عوامل متعدد، از قبیل تنظیم کنندههای رشد، القاگرها و پیش سازها بر میزان آرتمیزینین تولیدی بررسی شده است. همچنین تلاشهایی در جهت بهتر کردن شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر نور، دما، pH ، غلظت نیترات و قند صورت گرفته است (6-12).
Artemisia aucheri Boiss(درمنه کوهی) گونهای از جنس Artemisia است که به فراوانی در نقاط مختلف ایران پراکنده است (13). بر اساس مطالعات انجام گرفته، گیاه درمنه کوهی آرتمیزینین را تولید نمیکند اما ژن اصلی مسیر بیوسنتزآن درگیاه وجود دارد و احتمال فعال شدن آن در محیط کشت سلولی وجود دارد (14). این جنس بالغ بر450 گونه دارد که عدم تولید آرتمیزنین در اغلب گونههای گیاه نیز گزارش شده است (15 و 16). یکی از علل عدم تولید آرتمیزینین میتواند تولید نشدن ترکیبات واسطه در گیاه بهعلت عدم بیان آنزیم خاص درگیر در ایجاد حلقه سزکوئی ترپن و یا فعال نشدن آن باشد (17). کاهش تولید آرتمیزینین بهعلت عوامل فنوتیپی و ژنوتیپی حتی در خود گونه درمنه خزری گزارش شده است (18). با توجه به جایگاه درمانی آرتمیزینین در درمان مالاریا و فراوانی گیاه درمنه کوهی در ایران، در این مطالعه کشت کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه انجام شد. علاوه بر این تولید آرتمیزینین و توانایی تبدیلات بیوشیمیایی در آن مدنظر قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه نمونه گیاهی مورد تحقیق: گیاه درمنه کوهی (Artemisia aucheri Boiss) در تاریخ 17/3/1389 ازکیلومتر 60 جاده اصفهان- زفره در ارتفاع 1650 متر از سطح دریا توسط کارشناسان مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی و منابع طبیعی استان اصفهان تهیه شد. نمونه هرباریومی آن به شماره 1384 در هرباریوم گروه فارماکوگنوزی دانشکده داروسازی دانشگاه اصفهان نگهداری می شود.
کشت کالوس: بذر گیاه تحت شرایط آسپتیک در زیر کابین لامینار ایرفلو، ابتدا با اتانول 96 درجه به مدت 3 دقیقه و بعد با هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت 9 دقیقه استریل شد. پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل و به پتری دیشهای استریل منتقل شد. پتری دیشهای حاوی دانههای استریل در اتاق کشت در تاریکی و دمای 2±25 درجه سانتیگراد نگه داری شدند. برای تولید کالوس، محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) جامد با ترکیبی از اکسین و سیتوکینین بهعنوان تنظیم کنندههای رشد گیاهی به کار رفت. جدول 1 هفت تیمار مختلف بهکار رفته در محیطهای کشت را نشان میدهد که در 5 تکرار انجام گرفت. کالوس گیاه با انتقال دانه رستهای رشد یافته به ظروف کشت جامد ایجاد شد. سپس نیمی از محیطهای کشت در تاریکی 24 ساعت و بقیه در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در اتاق کشت نگه داری شد. واکشت کالوس با انتقال قطعه شاداب و تازه کالوس به محیط کشت تازه صورت گرفت (19). مطالعه آنالیز آرتیمیزنین برروی کالوس تیمار شماره 1 که بهترین رشد را داشت تا 7 نسل ادامه یافت و تولید آرتیمیزنین در سایر تیمارها مورد مطالعه قرار نگرفت.
جدول 1: تیمارهای مختلف تنظیم کننده های رشد مورد استفاده در کشت کالوس درمنه کوهی
|
شماره تیمار محیط کشت |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
2-4-D (mg/l) |
5/0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
0 |
|
a-NAA (mg/l) |
1/0 |
5/0 |
05/0 |
05/0 |
0 |
0 |
0 |
|
Kinetin (mg/l) |
5/0 |
5/0 |
0 |
0 |
0 |
2/0 |
0 |
|
BAP (mg/l) |
0 |
0 |
5/0 |
25/0 |
5/0 |
0 |
0 |
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, NAA: Naphtaleneacetic acid,
BAP: Benzylaminopurine
کشت سوسپانسیون: کشت سوسپانسیون با انتقال قطعات شاداب کالوس تیمار شماره 1 به محیط کشت مایع مشابه محیط کشت کالوس ولی فاقد آگار انجام شد. این محیطها در طول زمان کشت برروی تکان دهنده دوار100 دور در دقیقه، در اتاق کشت قرار داشت. واکشت سوسپانسیون با عبور سوسپانسیون حاصل از یک صافی استریل تحت شرایط استریل به محیط کشت تازه صورت گرفت.
بررسی حضور آرتمیزینین در کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه درمنه کوهی به روش TLC: برای انجام TLC از عصاره دی کلرومتانی اندام هوایی گیاه، کالوسهای نسل هفتم و سوسپانسیونهای نسل سوم بهروش ماسراسیون با خیساندن پودر عصاره خشک کالوس و یا سلولهای فیلتر شده سوسپانسیون که به نسبت 5 به 1 در حلال آلی بهمدت 24 ساعت قرار گرفته بودند انجام شد. سلیکاژل 6OGF254 بهعنوان فاز ثابت و سیستم حلال اتیل استات- پترولیوم اتر (6:4) بهعنوان فــاز متحرک انتخــاب گردید (20). جهت آشکارســـازی مـــــواد مورد نظـــر، از معــرف وانیلین- اسید سولفوریک استفاده که برروی صفحه TLC اسپری شد(21). استاندارد آرتمیزینین بهعنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت.
بررسی وجود آرتمیزینین در اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با دستگاه گاز کروماتوگرافی: گاز کروماتوگرافی با دستگاهPerkin-Elmer ، دارای دتکتور FID و ستون HP-5MS به طول 30 متر و قطر داخلی 3/0 میلی متر انجام شد. برنامه حرارتی ستون از دمای100 درجه سانتیگراد شروع و تا دمای 270 درجه سانتیگراد ادامه یافت و دما در هر دقیقه 20 درجه افزایش یافت. دمای اتاقک تزریق و دمای ردیاب 270 درجه سانتیگراد بود. فراکسیون جدا شده از صفحه TLC بهعنوان نمونه انتخاب و 2/0 میکرولیتر آن به دستگاه تزریق شد. زمان بین تزریق و ظهور پیک یعنی زمان بازداری (Rt) بررسی و با زمان بازداری نمونه استاندارد آرتمیزینین و با استفاده از بیزابولن بهعنوان استاندارد داخلی مقایسه شد (22).
بررسی توانایی تبدیلات بیوشیمیایی سوسپانسیون گیاه درمنه کوهی: بهمنظور بهبود تولید آرتمیزینین، کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون که ساختار مشابه آرتمیزینین دارند بهعنوان سوبسترای پیشساز استفاده شدند. محلول استوک این مواد در اتانول 99 درصد آماده شد. کلسترول به میزان 100، بیزابولول 50 و آرتمیزیاکتون 120 به کار گرفته شد. با توجه بهسرعت رشد سوسپانسیون، سوبسترا به سوسپانسیونهای هفته سوم افزوده و به ازای هر سوبسترا سه ظرف سوسپانسیون در نظرگرفته شد. 6 روز بعد از افزودن سوبسترا، سوسپانسیونها جمع آوری و خشک شدند و عصاره دیکلرومتانونی 25/0گرم آن بدست آمد. آنالیز تولید آرتمیزینین با تزریق 5/0 میکرولیتر از هر نمونه به دستگاه گازکروماتوگرافی صورت گرفت و سطح زیر پیک حاصل بررسی گردید. بهمنظور مقایسه تغییرات احتمالی با نمونه شاهد سلولی، به سه ظرف از سوسپانسیون هر کدام 5/0 میلیلیتر آب مقطر افزوده شد و 6 روز روی شیکر قرار گرفت. همچنین تست شاهد محیط کشت با افزودن هر یک از استانداردهای سوبسترا به طور مجزا به محیطهای کشت فاقد سلول انجام شد (23).
نتایج
ایجاد کشت کالوس و کشت سوسپانسیون:
کشت کالوس در محیطهای حاوی غلظتهای مختلف تنظیم کنندههای رشد نتایج متفاوتی داشت. نتایج بهدست آمده در جدول 2 نمایش داده شده است. همچنین مشاهده شد که کالوس رشد یافته در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی سبز رنگ و شاداب بوده و رشد بهتری نسبت به کالوس نگهداری شده در تاریکی داشت. کالوس رشد یافته در شرایط 24 ساعت تاریکی، کرم رنگ بود. کشت سوسپانسیون یکنواخت و کرمی رنگ تهیه شد.
جدول 2: رشد و شادابی کالوس درمنه کوهی در تیمارهای مختلف تنظیم کنندههای رشد
|
شماره تیمار محیط کشت |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
میزان رشد |
++ |
+++ |
++++ |
++++ |
+ |
+ |
- |
|
میزان شادابی |
بسیار شاداب |
نکروزه |
شاداب |
شاداب |
کمی شاداب |
نکروزه |
- |
+ رشد بسیار کند، ++++ رشد تند، ++ رشد کند، - عدم رشد
+++ رشد متوسط به طور تقریب هر مثبت بیانگر مساحتی معادل 2 سانتیمتر مکعب است.
آنالیز عصاره اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با :TLC
همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است در بررسی عصاره کالوس کشت شده در دو شرایط نوری متفاوت به روش TLC، 4 فراکسیون با Rf (2/0، 4/0، 52/0، 76/0) مشاهده شد. سوسپانسیون سلولی نیز 4 فراکسیون باR (23/0، 4/0، 52/0، 76/0) را نشان داد. استاندارد آرتمیزینین باندی با 52/0= Rf و رنگ بنفش ایجاد کرد که از لحاظ Rfو رنگ با یکی از فراکسیونهای ایجاد شده از نمونه کالوس و سوسپانسیون مطابقت داشت ولی این باند در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت.
شکل 1: آنالیز TLC سوسپانسیون(A) ، کالوس تاریکی(B) ، کالوس روشنایی(C) ،گیاه(D) ، استاندارد آرتمیزینین(E)
نتایج بررسی وجود آرتمیزینین در اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با دستگاه گاز کروماتوگرافی:
همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است با تزریق استاندارد آرتمیزینین به دستگاه گاز کروماتوگرافی پیک با 6/5= Rt دقیقه در کروماتوگرام مربوطه حاصل شد. نمونه مربوط به کالوس و سوسپانسیون سلولی نیز هر کدام یک پیک به ترتیب با 6/5= Rt و 66/5= Rt دقیقه ایجاد کردند ولی این پیک در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت.
شکل 2: آنالیز GC عصارها به ترتیب از راست به چپ: گیاه ، کالوس، سوسپانسیون، استاندارد آرتمیزینین
شکل 3 : آنالیزGC عصارها حاصل از تبدیلات بیوشیمیایی به ترتیب از راست به چپ: آرتمیزیاکتون ، بیزابولول ، کلسترول ، شاهد (سوسپانسیون سلولی فاقد پیش ساز)
بررسی توانایی تبدیلات بیوشیمیایی:
همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است با تزریق 5/0 میکرولیتر از عصاره نمونه شاهد سلولی به دستگاه پیک با 6/5= Rtو مساحت تقریبی 26/81 میلیمتر مربع مشاهده شد که 53/0 درصد از مساحت کل پیک حاصل را شامل شد. نمونه حاوی کلسترول، آرتمیزیاکتون و بیزابولول هر کدام پیک مشابه بهترتیب به مساحت 30/79 میلیمتر مربع (52/0 درصد مساحت کل پیک حاصل)، 14/21 میلیمتر مربع (14/0 درصد مساحت کل پیک حاصل) و 7/75 میلیمتر مربع (49/0 درصد مساحت کل پیک حاصل) ایجاد کردند. نمونه مربوط به بیزابولول پیک دیگری با 05/7= Rtدقیقه ایجاد کرد. با تزریق استاندارد بیزابولول پیک با 02/7= Rtدقیقه حاصل شد.
بحث
در بررسی کشت کالوس مشاهده شد کالوسهای ایجاد شده در محیطهای کشت متفاوت دارای خصوصیات ظاهری و رشد متفاوت هستند. بر اساس نتایج بهدست آمده میتوان به این نکته پی برد که نوع و نسبت هورمونهای تنظیم کننده رشد در ایجاد کالوس و تمایز سلولی نقش بسزایی داشته است. نتایج مشابه نیز توسط Zia و همکارانش (24) در مورد گیاه Artemisia absinthium بهدست آمده است. همچنین مشاهده شد کالوس کشت شده در شرایط نوری متفاوت، رنگ و سرعت رشد متفاوت داشته که حاکی از این است که نور بهعنوان یک فاکتور فیزیکی در رشد کالوس و قدرت فتوسنتز آن اثر گذار بوده است.
در بررسی TLC حاصل از عصاره کالوس و سوسپانسیون درمنه کوهی، باندی با Rf و رنگ مشابه با استاندارد آرتمیزینین مشاهده شد و بهنظر میرسد آرتمیزینین در کشت سلولی گیاه تولید شده است ولی این باند در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت. در مطالعات قبلی TLC بارها برای شناسایی آرتمیزینین بهکار گرفته شده است. Quispe-Condori و همکارانش (25) برای شناسایی آرتمیزینین در عصاره های مختلف درمنه خزری از متد TLC استفاده کردند. Sarin و Sing (26) نیز در مطالعه خود بر روی کالوس Artemisia scoparia با TLC به شناسایی آرتمیزینین پرداختند
همچنین مشاهده شد کالوسهای کشت شده در شرایط نوری متفاوت باندهای مشابهی از لحاظ Rf و رنگ ایجاد کردند و به نظر میرسد نور نتوانسته است تاثیری بر نوع ترکیبات تولیدی در کالوس بگذارد، اما مقایسه TLC حاصل از کالوس با سوسپانسیون سلولی تفاوتهایی را نمایان کرد که بیانگر توان بیوشیمیایی متفاوت این محیطها است.
با بررسی نتایج گازکروماتوگرافی، مشاهده شد که نمونه مربوط به کالوس و سوسپانسیون سلولی پیک با زمان بازداری ( Rt) مشابه استاندارد آرتمیزینین دارند و بهنظر میرسد آرتمیزینین در این نمونهها وجود دارد. Peng و همکارانش (27) نیز شناسایی و اندازهگیری آرتمیزینین و پیشسازهای آن را بهطور مستقیم با دستگاه GC-FID انجام دادند و یک رابطه خطی بین غلظتهای استاندارد آرتمیزینین و سطح طیف حاصل بهدست آوردند.
علی رغم عدم تایید تولید آرتیمیزنین در گیاه درمنه کوهی بر اساس نتایج حاصل احتمال میرود مسیر تولید آرتمیزینین در کشت سلولی گیاه فعال شده و تنظیم کنندههای رشد در فعال کردن این مسیر نقش داشتهاند . در مطالعهای نیز که بر گیاه Artemisia absinthium انجام شد افزودن NAA و BA به محیط MS باعث تولید آرتمیزینین و شناسایی آن در کالوس شد (28).
با توجه به عدم افزایش کمی آرتیمیزنین در تبدیلات بیوشیمیایی سوسپانسیون سلولی گیاه درمنه کوهی، بهنظر میرسد کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون پیشساز مناسبی برای آرتمیزینین در کشت سلولی درمنه کوهی نیستند. در این مطالعه افزودن کلسترول نتوانست تولید آرتمیزینین را در کشت سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی تحت تاثیر قرار دهد در حالیکه در مطالعه Baldi و Dixit (29) بر گیاه درمنه خزری افزودن کلسترول به سوسپانسیون سلولی بر رشد سلولها و تولید آرتمیزینین اثرگذار بود. با مقایسه پیک حاصل از گازکروماتوگرافی نمونه حاوی بیزابولول و شاهد سلولی نیز تغییر قابل توجهی مشاهده نشد. بیزابولول یک سزکوئی ترپن الکلی است و با توجه به مسیرهای بیوشیمیایی گیاهی درمنه خزری انتظار میرفت بتواند به پیشسازهای اصلی آرتمیزینین تبدیل شود (30). کاهش تولید آرتیمیزنین با افزودن آرتمیزیاکتون به سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی شاید بهدلیل بلوک مسیر بیوسنتز آرتمیزینین شده باشد.
نتیجه گیری
درمجموع تولید آرتیمیزنین در کشت کالوس و سوسپانسون درمنه کوهی علیرغم عدم تولید آن در گیاه بیانگر توانمندی نهفته درمنه کوهی است که با فراهم نمودن شرایط مناسب امکان تولید آرتیمیزنین را که بیشتر در درمنه مازندرانی مطالعه شده است (31) فراهم نمود و با بهینه کردن شرایط کشت بافت و سلول از جمله افزودن پیشسازهای مناسب بتوان میزان تولید آرتمیزنین را افزایش داد.
تشکر و قدردانی
هزینه های این تحقیق توسط معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان تامین شده است که بدینوسیله قدردانی میشود. از مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی استان اصفهان در تامین اندام هوایی درمنه کوهی نیز تشکر بهعمل میآید.
)