نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، گروه بیوتکنولوژی، کرمان، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، گروه علوم دامی، تهران، ایران
چکیده
هدف: ارزیابی تاثیر نانوذره اکسید روی در مقایسه با اثرات فرم بالک آن بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، بیان ژن پراکسیداز، محتوای پرولین و بیان ژن آنزیم 1-پرولین-5-کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) در گیاهچههای ازمک.
مواد و روش‌ها: گیاهچههای ازمک با سه تکرار مستقل و در قالب طرح کاملاً تصادفی بمدت 7 روز در حضور غلظتهای مختلف این ذرات رشد کردند، سپس پارامترهای مذکور اندازهگیری شدند.
نتایج: درحالیکه فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار با ذرات نانو و بالک بهترتیب در حضور غلظتهای بالاتر از 50 و 100 میلیگرم بر لیتر نسبت به نمونه شاهد بهطور معنیداری افزایش نشان داد، بیان ژن پراکسیداز در آنها مشابه نمونه شاهد بود. از طرف دیگر، محتوای پرولین گیاهچههای تیمار شده، هماهنگ با افزایش غلظت نانوذره در محیط در مقایسه با نمونه شاهد بهطورمعنیداری افزایش یافت، درحالیکه تفاوت معنیداری در بیان ژن P5CS در تیمارهای مختلف نسبت به نمونه شاهد مشاهده نشد. در گیاهچههای تیمار شده با فرم بالک، محتوای این اسیدآمینه تا غلظت 100 میلیگرم بر لیتر بهطور معنیداری افزایش و در غلظتهای بالاتر از 250 میلیگرم بر لیتر بهصورت معنیداری نسبت به نمونه شاهد کاهش نشان داد. بیان ژن P5CS درگیاهچههای تیمار شده با فرم بالک نیز تا غلظت 500 میلیگرم بر لیتر مشابه نمونه شاهد بود و در حضور بالاترین غلظت این ذره بهصورت معنیداری کاهش نشان داد.
نتیجه گیری: از مجموع نتایج چنین بهنظر میرسد که نانوذره اکسید روی نسبت به فرم بالک تاثیر کمتری بر پارامترهای ذکر شده داشته است که احتمالا بهدلیل آزاد شدن کمتر یون روی تحت این شرایط باشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigation of nano- and balk ZnO particles effects on genes expression level of peroxidase and Δ1- pyrroline-5-carboxylate synthetase and peroxidase activity and proline content in Lepidiumdraba seedlings
نویسندگان [English]
- A Riahi-Madvar 1
- M Ghazizadeh Ahsaei 1
- F Jadid Bonyad 1
- E Nasirifar 2
1 Department of Biotechnology, Faculty of Science and Modern Technology, Technology and Advanced Technology University, Kerman, Iran
2 Department of Animal Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: Evaluation effects of ZnO nanoparticles on peroxidase activity, gene expression of peroxidase enzyme, proline content and expression of proline-5-carboxylate synthetase (P5CS) gene in L. draba seedlings in compared to the effects of its balk form.
Material and Methods: L. draba seedlings were grown in the presence of different concentrations of these particles for 7 days in fully-random designs with three repetitions; thereafter the mentioned parameters were measured.
Results: While the peroxidase activity was significantly evaluated in the presence of nano and balk particle in the concentration more than 100 and 50 mg/L respectively, in them, the gene expression level of peroxidase was the same as the control. On the other hand, in the treated seedlings, proline content was significantly increased in accordance to the rising nanoparticle doses in media, while, no significant difference was seen in the P5CS gene expression in different treatments rather than control sample. In the balk treated seedlings, content of this amino acid were significantly increased up to 100 mg/L concentrations and dramatically decreased in the presence of doses more than 250 mg/L in compared to the control sample. Gene expression level of P5CS was the same as the control in the presence of the balk form up to 500 mg/L and significantly decreased at the highest concentration.
Conclusion: Based on the results, it seems that nanoparticle has fewer effects rather than the balk form on the mentioned parameters, which may be due to release less Zn ion in this condition.
کلیدواژه‌ها [English]
- gene expression
- nano ZnO
- peroxidase
- proline
مقدمه
کاربرد روزافزون نانو ذرات در شاخه‌های مختلف پزشکی و علوم پایه می‌طلبد تا اثرات سمی ممکن آنها علیه سلول‌ها بیشتر مورد بررسی قرار گیرد (1، 2 و 3). نانوذرات به ذراتی با ابعاد کمتر از 100 نانومتر اطلاق میشود و شامل نانو ذرات فلزی و اکسیدی آنها و ... می‌باشند (4). این ذرات با سطح ویژه بالا و واکنش‌پذیری سطحی بالا نه تنها از طریق تماس فیزیکی جذب میشوند بلکه می‌توانند با پروتئینهای زیستی میانکنش دهند و حتی توسط سلول‌ها جذب گردند (5). اندازه، مهمترین ویژگی نانو ذرات است، به همان میزان که اندازه ذرات کاهش مییابد نسبت سطح به حجم آنها افزایش و اجازه می‌دهد تا سهم بزرگ‌تری از اتم‌ها یا مولکول‌ها در سطح نسبت به لایه داخلی ماده ظاهر شود (6).
مکانیسمهای مختلفی برای توجیه اعمال آسیب‌رسان نانو ذرات مطرح میشوند که در این میان بالا بردن سطح گونههای فعال اکسیژن (ROS) درون سلولی از اهمیت بیشتری برخوردار است. ثابت شده است که ROSها از روش‌های مختلفی نظیر آسیب رساندن به DNA، تداخل با مسیر سیگنالینگ سلولی، تغییرات در روند رونویسی ژنها و غیره می‌توانند به سلول‌ها آسیب وارد کنند (7). علاوه بر این، تولید ROS در نتیجه حضور نانو ذرات می‌توانند آسیب‌های جدی و قابل وراثتی را به DNA وارد کند. به عنوان مثال تغییرات شیمیایی در هیستون‌ها و یا دیگر پروتئین‌هایی که در شکل‌دهی ساختار DNA نقش دارند، ساختار مارپیچی DNA را از هم باز میکند و DNA را در معرض هر گونه تغییر قرار می‌دهد (8 و 9).
گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از تولید ROSها مکانیسمهای آنزیمی و غیر آنزیمی مختلفی استفاده میکنند. از مهمترین اجزای سیستم آنتیاکسیدان آنزیمی میتوان به پراکسیدازها (POD) و کاتالاز (CAT) که موجب شکسته شدن هیدروژن پراکسید (H2
O2
) در سلول میشوند و بدین شکل از تجمعROS ها در سلول جلوگیری میکنند (10) و همچنین سوپراکسیددیسموتاز (SOD) که رادیکال‌های سوپراکسید را به اکسیژن و پراکسید هیدروژن کاتالیز میکند (11) اشاره نمود. سیستم دفاعی غیرآنزیمی در گیاهان شامل ترکیبات آنتی‌اکسیدانی مانند ترکیبات فنلی و رنگیزهها اشاره نمود که به طور مستقیم و غیر آنزیمی باعث دفع رادیکال‌های آزاد اکسیژن میشوند (12).
علاوه بر این، مطالعات قبلی نشان داده است که پرولین به عنوان یک اسمولیت مهم در تعدیل فشار اسمزی سلول تحت تنش‌هایی مانند دمای پایین، کمبود مواد غذایی، قرار گرفتن در معرض فلزات سنگین و اسیدیته بالا نقش اساسی دارد (13). آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان آنزیمهای دلتا- ۱-پرولین ۵-کربوکسیلات سنتتاز(P5CS) است (14 و 15). در واقع P5CS یک آنزیم دوعملکردی است که دو واکنش ابتدایی را در مسیر بیوسنتز پرولین در گیاهان کاتالیز میکند (16). نقش مثبت پرولین در تعدیل فشار اسمزی نسبت به شوری و خشکی توسط محققین در گیاهان مختلف مانند ذرت (17) ، یونجه (18) و آرابیدوپسیس (19) گزارش شده است.
گیاه ازمک (Lepidium draba) یک علف هرز چندساله با سیستم ریشه عمیق و متعلق به خانواده براسیکاسه است. این گیاه ویژه مناطق گرم و نواحی آفتاب‌گیر است و خاک‌هایی با بافت سنگین و حاصلخیز را ترجیح می‌دهد (20 و 21). ازمک، مشابه سایر گونههای خانواده براسیکا حاوی گلوکوزینولاتها میباشد (22 و 23) که اثرات پیشگری و درمانی آنها و مشتقاتشان بر بیماریهای مختلف ثابت شده است (8، 24 و 25).
ZnO یکی از پراستفاده‌ترین نانو ذرات است، به طوری که تولید این نانو ذره رتبه سوم را بعد از سیلیکا SiO2
)) و تیتانیاTiO2
)) رادارد و در آب نامحلول است (26). این نانوذره در صنایع مختلف می‌توانند جانشین ماکرومولکول ZnO شوند وبه طور گسترده در تولید لاستیک، سلول‌های خورشیدی، به عنوان یک جاذب uv در محصولات آرایشی مثل کرم‌های ضد آفتاب و محصولات زیبایی و غیره استفاده میشود (27). در این تحقیق، فعالیت آنزیم پراکسیداز و بیان ژن پراکسیداز و همچنین محتوای پرولین و بیان ژن P5CS در گیاهچههای ازمک تیمار شده با فرم نانوذره و بالک اکسید روی مورد آنالیز قرار گرفتند.
مواد و روش‌ها
کشت گیاه و تیمار آنها: بذرهای مورد استفاده در این تحقیق از گیاهان رشد یافته در اطراف شهر کرمان در اواخر بهار و اوایل تابستان جمع‌آوری گردیدند. به منظور کشت، ابتدا بذرها با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد (15 دقیقه) و پس از آبکشی با آب مقطر استریل (چهار مرتبه) در معرض الکل70 درصد (45 ثانیه) قرار داده شدند و سپس آبکشی (چهار مرتبه با آب مقطر استریل) شدند. سپس بذرها در پلیتهای نه سانتی‌متری حاوی محیط کشت MS (28) (pH برابر 7) که با آگار (8/0 درصد) جامد شده و حاوی فرمهای مختلف اکسید روی (نانو و بالک) بودند قرار گرفتند. غلظتهای مورد استفاده از فرم نانو و بالک اکسید روی شامل غلظت صفر (به عنوان شاهد)، 25، 50، 100، 250، 500 و 1000 میلیگرم بر لیتر بود. ابتدا پلیتها در دمای 2±28 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 5±55 درصد در انکوباتور و در تاریکی مطلق قرار گرفتند. پس از گذشت دو روز پتری دیش‌ها به ژرمیناتور با دمای 2±25 درجه سانتیگراد با رطوبت نسبی 65-60 درصد و دوره نوری 16:8 (تاریکی/ روشنایی) منتقل شدند. پس از گذشت پنج روز گیاهچه جمع‌آوری شدند و بعد از شسته شدن با آب مقطر استریل، اندام‌های هوایی جدا و در داخل فویل آلومینیوم استریل قرار گرفتند. جهت انجماد سریع، بلافاصله فویلها در داخل ازت مایع قرار گرفتند و سپس به فریزر 80- درجه سانتیگراد منتقل شدند.
آنالیز بیان ژنهای P5CS و POD:بیان ژنهای P5CS و POD به این صورت اندازهگیری شد که ابتدا استخراج RNA کل از گیاهچههای تیمار شده انجام و پس از سنتز کتابخانه cDNA و تکثیر ژنهای مذکور در حضور پرایمرهای اختصاصی، میزان بیان آنها به صورت نیمه کمی مورد آنالیز قرار گرفت (29).
استخراجRNA کل: استخراج RNA کل از گیاهچهها مطابق دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده کیت استخراج RNA (RNX-Plus سیناژن) انجام شد. ابتدا مقدار یک گرم از اندام هوایی گیاهچههای فریز شده در حضور نیتروژن مایع کاملاً ساییده شده تا پودر سفید رنگی حاصل شود. پودر حاصله به میکروتیوب 5/1 میلیلیتری و فاقد RNase انتقال یافت. سپس یک میلیلیتر از محلول RNX-plus به پودر مذکور اضافه و میکروتیوب ورتکس شد تا سوسپانسیون کاملاً همگن بدست آید. سوسپانسیون بدست آمده به مدت 60 دقیقه بر روی یخ نگهداری شد. در ادامه،200 میکرولیتر کلروفرم به سوسپانسیون اضافه و میکروتیوب بشدت تکان داده شد و پس ازسانتریفوژ (12000 دور بر دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، به مدت 15 دقیقه) فاز رویی به میکروتیوب جدید منتقل و هم حجم آن ایزوپروپانول به آن اضافه گردید و به مدت 20 دقیقه روی یخ نگهداری شد. یکبار دیگر، سانتریفیوژ با شرایط فوق الذکر تکرار شد و این بار پس از حذف محلول رویی، به رسوب موجود، یک میلیلیتر اتانول 70 درصد اضافه شد و میکروتیوبها با 7500 دور بر دقیقه، به مدت 8 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. سپس محلول رویی خارج و درب میکروتیوب باز نگهداشته شد تا باقیمانده الکل در دمای اتاق تبخیر شود. در انتها به رسوب حاصله، 30 میکرولیتر آب Diethylpyrocarbonate (DEPC) (%1/0) اضافه شد و نمونهها به فریزر 20- درجه سانتیگراد انتقال داده شدند.
جهت تعیین کمیت (میزان غلظت) و کیفیت (نسبت میزان RNA به پروتئین) RNA استخراج شده از دو روش اندازهگیری جذب در طول موج nm۲۶۰ با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری و الکتروفورز نمونه بر روی ژل آگارز (یک درصد) استفاده شد.
بمنظور حذف DNA ژنومی از RNA تخلیص شده، از کیت DNase I (Fermentas) استفاده شد. بدین منظور در یک میکروتیوب حاوی 4 میکروگرمRNA استخراج شده، یک میکرولیتر آنزیم DNase و یک میکرولیتر از بافر آن اضافه گردید و حجم نهایی توسط آب DEPC زده به 10 میکرولیتر رسانده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت. به منظور غیرفعال نمودن آنزیم، یک میکرولیتر EDTA (25 میلیمولار) به میکروتیوب اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در نهایت نمونهها جهت انجام مراحل بعدی آزمایش به فریزر 20- منتقل شدند.
سنتز کتابخانه cDNA: بدین منظور، ابتدا مقدار لازم از RNA کل (یک میکروگرم) به پرایمر الیگو dT (یک میکرولیتر) و 5/0 میکرولیتر از مهار کننده RNase (U/µL40) اضافه گردید و میکروتیوبها به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس میکروتیوبها به روی یخ منتقل شدند و 5/2 میکرولیتر از بافر (X 10) (RT)Reverse Transcriptase ، 8/0 میکرولیتر از dNTPها، 5/0 میکرولیتر از مهار کنندهRNase ، 1 میکرولیتر از آنزیم رونوشت بردار معکوس(RT) (U/µL; MMuLV200) و در نهایت آب دیونیزه استریل فاقد RNase تا حجم نهایی 25 میکرولیتر به تیوبها اضافه گردید. پس از اسپین کردن ویالها، در حمام آب گرم 42 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت قرار گرفتند. در انتهای واکنش به منظور حذف اثر RT، تیوبها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
تکثیر ژنها و اندازهگیری بیان آنها:
توالی آغازگرهای مربوط به ژن P5CS بر اساس توالی ثبت شده در سایت NCBI از Arabidopsis thaliana با شماره دسترسیNM_115419 و توالی آغازگرهای مربوط به ژن POD بر اساس توالی ثبت شده در سایت NCBI از گیاهLepidium draba با شماره دسترسی KJ819932 و همچنین توالی آغازگرهای مربوط به ژن کنترل داخلی GAPDH از روی توالی ژن این آنزیم در گیاه Armoracia rusticana (جدول 1) با استفاده از نرم افزار Gene Runner طراحی و توسط شرکتMWG ساخته شدند. واکنش تکثیر ژنهای مذکور با استفاده از آنزیم Taq پلیمراز و در حضور آغازگرهای اختصاصی برای حجم µl 25 طبق جدول 2 در دستگاه ترموسایکلر Eppendorfو طبق پروفایل حرارتی در جدول 3 انجام شد. در پایان، الکتروفورز محصولات واکنش روی ژل آگارز یک درصد انجام شد و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید در زیر نور UVدر دستگاه Gel documentationمشاهده شدند.
برای ارزیابی نیمه کمی بیان ژنهای مذکور در غلظتهای مختلف فرم نانو و بالک ZnO از مقایسه شدت باند تکثیر شده حاصل از بارگذاری پنج میکرولیتر از محصول PCR مربوط به هر نمونه بر روی ژل آگارز یک درصد، نسبت به کنترل داخلی، توسط نرم افزار TotalLap TL120 استفاده شد.
جدول1: توالی آغازگرها.
|
GC (%) |
Tm (C˚) |
توالی آغازگرها |
نام آغازگر |
|
45.4 |
60.3 |
5´- AAGAAAGCTGGTATGATCCCTC -3´ |
F-GAPDH |
|
50 |
58.4 |
5´-TACCTTAACCGCAGTGCATC-3´ |
R-GAPDH |
|
50 |
60.3 |
5´- CTTGTTCAGATAGCTTCGCTTG -3´ |
F-P5CS |
|
50 |
65.3 |
5´-TTATTCCCACCTCAGCACCAAGTC -3´ |
R-P5CS |
|
41.7 |
59.6 |
5ˊ-TGGACAGGTTATACGACTTTAGCAACACTGGTTTAC -3ˊ |
F-POD |
|
77.6 |
59.6 |
5ˊ- TCTATAAGCTTTTAAGAGTTAGTTCACCACCCTACA - 3ˊ |
R-POD |
جدول 2: مقدار و مواد مورد استفاده در واکنش .PCR
|
مقدار در 25 میکرو لیتر |
غلظت محلول پایه |
محلول پایه |
|
2.5 |
10 X |
PCR Buffer |
|
1.5 |
50 mM |
Mgcl2 |
|
0.6 |
10 mM |
dNTPmix |
|
0.6 |
10 pmol/µl |
Forward Primer |
|
0.6 |
10 pmol/µl |
Reverse Primer |
|
2 |
30-40ng/µl |
Template |
|
0.5 |
1Unit/ µl |
DNATaq Polymerase |
|
Up to 25 |
|
Water (ddw) |
جدول 3:پروفایل حرارتی واکنش PCR.
|
مراحل PCR |
دما (درجه سانتیگراد) |
زمان (دقیقه) |
سیکل |
|
واسرشت سازی اولیه |
95 |
5 |
1 |
|
واسرشت سازی هر چرخه |
95 |
1 |
30 |
|
اتصال آغازگر |
51 |
5/0 |
|
|
بسط |
72 |
1 |
|
|
بسط نهایی |
72 |
10 |
1 |
اندازهگیریمقدارپرولین: برای اندازهگیری پرولین از روش Bates و همکاران استفاده شد (30). بدینمنظور مقدار نیم گرم از برگ گیاهچههای ازمک در 51 میلیلیتر محلول سه درصد سولفوسالیسیلیک اسید سائیده و عصاره حاصل بهمدت 01 دقیقه با دور g 0004 سانتریفوژ شد. سپس دو میلیلیتر از مایع رویی با دو میلیلیتر معرف نین هیدرین و دو میلیلیتر استیک اسید خالص مخلوط شد و یک ساعت در دمای 001 درجه سانتیگراد در حمام آبگرم قرار گرفت. سپس بلافاصله لوله‌های محتوی مخلوط در حمام یخ سرد شد. در ادامه، چهار میلیلیتر تولوئن به مخلوط اضافه شد و لوله‌ها بهخوبی تکان داده شد. با ثابت نگه‌داشتن لوله‌ها به مدت 51 تا 02 ثانیه دو لایه مجزا تشکیل شد. میزان جذب لایه رنگی فوقانی که حاوی پرولین بود در 025 نانومتر اندازهگیری شد. جهت محاسبه مقدار پرولین از منحنی استاندارد پرولین استفاده گردید و نتایج بر حسب میلیگرم بر گرم وزنتر گزارش شد.
سنجش فعالیت پراکسیداز: عصارهگیری آنزیمی و سنجش محتوای پروتئین محلول کل عصارهگیری پروتئینهای محلول از گیاهچهها به این صورت انجام شد که مقدار 500 میلیگرم از اندام هوایی (بافت فریز شده) در بافر فسفات پتاسیم mM 50 (5/7 pH) حاوی 1 درصد پلی وینیل پیرولیدین (PVP)، یک میلیمولار EDTA و یک میلیمولار PMSF ساییده شد. سوسپانسیون بدست آمده به مدت 20 دقیقه با دور rpm 9000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد (29). محلول رویی پس از تعیین غلظت جهت اندازهگیری فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) مورد استفاده قرار گرفت. غلظت پروتئین استخراج شده توسط روش Bradford (31) محاسبه گردید. بدین منظور، از سرم آلبومین گاوی (BSA) به عنوان استاندارد استفاده شد و میزان جذب نمونهها در طول موج nm 595 اندازهگیری شد.
سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD; EC.1.11.1.7 ) با استفاده از روش Plewa و همکاران سنجیده شد. در روش مذکور میزان جذب تتراگایاکل تشکیل شده از گایاکل در نتیجه فعالیت پراکسیداز در مدت زمان 3 دقیقه و طول موج 470 نانومتر محاسبه شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیمMm 50 با pH برابر 5/7، گایاکل 4 درصد و یک درصد H2O2 و 100 میکرولیتر عصاره پروتئین محلول بود. از ضریب خاموشی تتراگایاکل 25.5 cm-1 mM-1= ε جهت محاسبه فعالیت آنزیم استفاده شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیمی بر میلیگرم پروتئین محلول گزارش شد (32).
آنالیز آماری
کلیه آزمایشات با سه تکرار مستقل انجام شدند. میانگین دادهها با استفاده از نرم‌افزار SAS توسط آزمون چند دامنه ای دانکن با در نظر گرفتن سطح اطمینان پنج درصد مورد تجزیه واریانس قرار گرفتند و برای رسم نمودار از نرم‌افزار2010 Excel استفاده شد
نتایج
آنالیز بیان ژنهایP5CS و POD
استخراج RNAو سنتز کتابخانه cDNA
کیفیت RNA کل استخراج شده از گیاهچههای بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی گردید. همانطور که در شکل 1 مشاهده می‌گردد دو باند S28 و S18 مربوط بهRNA ریبوزومی به وضوح برای تمامی نمونهها قابل مشاهده است که نشان دهنده کیفیت مناسب RNA استخراج شده میباشد. به منظور تکثیر ژنهای مذکور، از RNA استخراج شده با استفاده از پرایمرهای Oligo dT و آنزیم رونوشت بردار معکوس (RT)، کتابخانه cDNA مربوط به هر نمونه ساخته شد.
شکل 1: نمونهای از ژل آگارز یک درصد از RNAهای استخراج‌شده از گیاهچههای L. drabaتیمار شده با ZnO. M مارکر وزن مولکولی میباشد.
بیان ژن P5CS
تکثیر ژنهای P5CSو GAPDH با استفاده از cDNA سنتز شده در حضور پرایمرهای اختصاصی و آنزیم Taq پلیمراز صورت گرفت. همانطور که در شکل 2 مشاهده میشود طول قطعه تکثیر شده مربوط به ژن P5CS ، bp 757 به دست آمد.
نتایج مربوط به تأثیر غلظتهای مختلف فرم بالک و میزان بیان ژن P5CS در گیاهچههای L. draba تیمار شده با نانو ذره ZnOدر مقایسه با نمونه کنترل تفاوت معنی داری را نشان نداد. همان طور که در شکل 3، قابل مشاهده است تغییر بیان این ژن در تیمار با فرم بالک ZnOنیز مشابه نمونه شاهد بود و تنها در حضور بالاترین غلظت این ذره نسبت به نمونه شاهد کاهش معنیدار بیان مشاهده گردید.
شکل 2: نمونهای از ژل آگارز مربوط به تکثیر ژن P5CS در حضور غلظتهای مختلف نانوذره ZnO (الف) و فرم بالک ZnO(ب). M مارکر وزن مولکولی میباشد.
شکل 3: مقایسه میزان نسبی بیان ژن P5CS در گیاهچههای تیمار شده L. draba با غلظتهای مختلف فرم بالک ZnO. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی داری در سطح پنج درصد است.
بیان ژن POD
همانطور که در شکل 4 مشاهده میشود طول قطعه تکثیر شده مربوط به ژن POD در ژل یک درصد، bp 367 به دست آمد. غلظتهای مختلف فرم بالک و نانو ذره ZnO بر میزان بیان ژن POD گیاهچههای هفت‌روزه L. draba تاثیری نداشتند.
شکل 4: نمونهای از ژل آگارز مربوط به تکثیر ژن POD در حضور غلظتهای مختلف نانوذره ZnO (الف) و فرم بالک ZnO (ب). M مارکر وزن مولکولی میباشد.
محتوی پرولین
همان طور که درشکل 5،الف مشاهده میشود محتوای پرولین گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف فرم نانو با افزایش میزان غلظت نانوذره در محیط به طور معنیداری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافته است به طوری که محتوی پرولین در غلظت mg/L 1000 این ذره بیش از سه برابر نمونه شاهد میباشد. بر اساس شکل 5،ب محتوی پرولین گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف فرم بالک تا غلظت mg/L100 در مقایسه با نمونه شاهد به طور معنیداری افزایش یافته است و بالاترین میزان پرولین در حضور غلظت mg/L100 این ذره مشاهده گردید. با افزایش غلظت این ذره در محیط محتوای پرولین کاهش یافت بطوریکه در حضور غلظتهای mg/L 1000 و 500 کاهش معنیداری در سطح پنج درصد با نمونه شاهد مشاهده شد.
شکل 5: محتوای پرولین گیاهچههای L. draba تیمار شده با غلظتهای مختلف نانو ذره ZnO (الف) و فرم بالک ZnO(ب). حرف‌های متفاوت بالای نمودارها سطح معنیداری را در سطح پنج درصد نشان می‌دهند.
فعالیت پراکسیداز
همانطور که درشکل 6،الف و ب مشاهده میشود فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچههای تیمار شده با غلظتهای مختلف فرم بالک تا غلظت 50 میلیگرم بر لیتر تفاوت معنیداری در سطح 5 درصد نسبت به نمونه شاهد نشان نداد ولی در غلظتهای بالاتر به صورت گرادیان هماهنگ با افزایش غلظت این ذره در محیط به طور معنیداری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش نشان داد. همچنین فعالیت این آنزیم در حضور نانوذره اکسید روی تا غلظت 100 میلیگرم بر لیتر تفاوت معنیداری با نمونه شاهد نداشت ولی در غلظتهای بالاتر به صورت گرادیان هماهنگ با افزایش غلظت نانوذره در محیط به طور معنیداری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش نشان داد. فعالیت این آنزیم در حضور بالاترین غلظت فرم بالک نزدیک به 3 برابر و در حضور نانوذره نزدیک به 5/2 برابر نمونه شاهد افزایش یافت
شکل 6- فعالیت آنزیم پراکسیداز گیاهچههای L. draba تیمار شده با غلظتهای مختلف فرم بالک ZnO (الف) و نانو ذره ZnO(ب). حرف‌های متفاوت بالای نمودار، معنیداری را در سطح پنج درصد نشان می‌دهند.
بحث
استفاده روزافزون از نانوذرات در نهایت منجر به رها شدن این مواد به طبیعت میشود (33 و 34). درحالیکه مطالعات مختلف حاکی از تحت تاثیر قرار گرفتن موجودات زنده پس از در معر ض قرار گرفتن این مواد میباشد، هنوز مکانیسم اصلی عملکرد نانو ذرات شناخته نشده است (6). مطالعات مختلف در محیط‌های in vitro و in vivo پیشنهاد میکنند که آنها قادرند گونههای فعال اکسیژن (ROS) را تولید کنند و روی غلظت کلسیم درون سلولی، فعال نمودن فاکتورهای رونویسی و ایجاد تغییر در سیتوکینین‌ها نقش داشته باشند (7). بر حسب میزان تنش، گیاهان ممکن است با تولید متابولیت‌های سازگاری نظیر اسیدآمینه، آنتی اکسیدانت‌های و هورمون‌ها اثرات تنش را خنثی نموده و به رشد خود ادامه دهند (13). در این تحقیق، بمنظور بررسی اثرات نانو ذره اکسید روی بر گیاه ازمک، فعالیت آنزیم پراکسیداز و محتوی پرولین و همچنین بیان ژنهای آنزیمهای POD و P5CS که در سنتز آنها درگیر هستند در مقایسه با اثرات فرم بالک این ذره مورد آنالیز قرار گرفتند.
همانطور که در نتایج قابل مشاهده است، فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاهچههای تیمار شده با نانوذره در حضور غلظتهای بالاتر از 100 میلیگرم بر لیتر و در حضور فرم بالک در غظلتهای بالاتر از 50 میلیگرم بر لیتر به صورت معنیداری در مقایسه با نمونه شاهد افزایش یافته است. همچنین در حضور بالاترین غلظت این ذرات بیشترین فعالیت آنزیم در حضور فرم بالک مشاهده گردید (حدود 3 برابر نسبت به شاهد). آنزیم پراکسیداز در گیاهان نقشهای فیزیولوژیکی متعددی دارد و یکی از آنزیمهای کلیدی در جاروب کردن H2O2 میباشد (35). افزایش فعالیت آنزیمهای جاروب کننده H2O2 تحت تنش با فلزات سنگین از قبیل آهن و مس و همچنین نانوذرات اکسید آهن و اکسید مس در این گیاه مشاهده شده است (36 و 37). همچنین مطالعات انجام شده بر روی این گیاه نشان داده شده است که فعالیت آنزیمهای کاتالاز (جاروب کننده H2O2) و SOD (جاروب کننده سوپر اکسید) در تیمار با یون روی افزایش مییابد که با نتایج حاصل از این تحقیق همخوانی دارد (38).
در مقابل با تغییر فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار با هر دو ذره، تغییر معنیداری در بیان ژن آنزیم پراکسیداز در تیمار با هر دو فرم این ذره در مقایسه با نمونه شاهد مشاهده نشد. بنابراین بنظر میرسد که افزایش فعالیت پراکسیداز میتواند به دلیل پایداری حضور این آنزیم در سلول بوده که میتواند سبب حذف H2O2 شود و یا به دلیل وجود ایزوآنزیمهای دیگری از این آنزیم. مطالعات گذشته نشان داده است که در گیاه ترب وحشی (Horseradish) از خانواده براسیکاسه همخانواده گیاه ازمک بیش از 15 ایزوآنزیم وجود دارد (39). بیان ژن آنزیم پراکسیدازی که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت مربوط به ایزوآنزیم خنثی LDP بوده که اخیراً ژن آن از این گیاه استخراج و در بانک جهانی ژن ثبت شده است و ویژگیهای آن مورد آنالیز قرار گرفته است (40). ثابت شده است که پرولین پایدارترین اسیدآمینه‌ای است که در برابر تنشهای اکسیداتیو مقاومت کرده و کمترین اثر بازدارندگی را بر رشد سلول‌ها در بین تمام اسیدآمینه‌ها دارد (13) و تولید آن تحت تنشهای مختلف افزایش یافته است (41 و 42). بر اساس نتایج حاصله، تولید پرولین در گیاهچههای تحت تیمار با هر کدام از فرم نانو و بالک بسته به نوع و غلظت تحت تاثیر قرار گرفته است. نکته قابل توجه در ارتباط با تولید پرولین تحت شرایط تنش با این ذرات این است که در حضور نانوذره، محتوای این اسید آمینه به صورت گرادیان همزمان با افزایش غلظت نانوذره در محیط افزایش مییابد، در حالیکه در حضور فرم بالک تا غلظت 100 میلیگرم بر لیتر به صورت گرادیان افزایش و در غلظتهای بالاتر، محتوای آن کاهش یافته بطوریکه کاهش معنیدار آن در حضور غلظتهای 500 و 1000 میلیگرم بر لیتر قابل مشاهده است. هماهنگ با این نتایج، گزارشات قبلی نیز نشان داده است که برخی ترکیبات آنتیاکسیدان از قبیل محتوای فلاونوئیدی کل گیاهچههای ازمک در تیمار با یون روی افزایش یافته است (38).
همانطور که در نتایج نشان داده شده است، بیان ژن P5CS در تیمار گیاهچههای L. draba با غلظتهای مختلف نانوذره ZnOنسبت به نمونه شاهد تغییر معنیداری نشان نداد. در حالیکه در تیمار گیاهچهها با غلظتهای مختلف فرم بالک ZnOبیان این ژن تا غلظت mg/L 100 مشابه نمونه شاهد بود و با افزایش غلظت این ذره در محیط کاهش بیان آن مشاهده شد بطوریکه کاهش معنیدار آن تنها در بالاترین غلظت این ذره در محیط مشاهده گردید. این نتایج با تغییرات محتوای پرولین گیاهچههای تیمار شده با فرم بالک این ذره مطابقت دارد. نشان داده شده است که افزایش سطح پرولین، حتی پس از حذف شرایط تنش تا مدتی حدود یک ماه باقی می‌ماند. در واقع تجمع افزایشی پرولین در سلول به دلیل القاء فعالیت آنزیمهای P5CSو پرولین۵- کربوکسیلات ردوکتاز (P5CR) در چرخه تولید این ماده و نیز ممانعت از فعالیت آنزیمهای اکسیدکننده پرولین مانند پرولین دهیدروژناز (ProDH) و پرولین ۵- کربوکسیلات دهیدروژناز (P5CDH) در سلول است (43).
نتیجهگیری
از مجموع نتایج چنین بر می‌آید که هر دو فرم بالک و نانو ذره ZnO بر محتوای پرولین و فعالیت آنزیم پراکسیداز تاثیر داشتهاند. افزایش محتوای پرولین و همچنین فعالیت این آنزیم میتواند دلیلی بر بروز تنش اکسیداتیو تحت این شرایط باشد. اما فرم بالک در مقایسه با نانو اثر سمیتی بیشتری داشته است که سبب افزایش بیشتر فعالیت آنزیم پراکسیداز و همچنین کاهش محتوای پرولین و بیان ژن P5CS در مقایسه با نمونه شاهد در غلظتهای بالای این ذره شود. این نتیجه احتمالاً به دلیل حضور یون روی و یا آزاد شدن سریعتر یون روی بیشتر در فرم بالک نسبت به نانو بوده است و در نتیجه در حضور فرم بالک در غلظتهای به‌کاربرده شده ایجاد رادیکال‌های آزاد بیشتر سبب تنش اکسیداتیو میشود. با این وجود مطالعات بیشتری لازم است تا اثرات فرم نانو و بالک ZnOبر بیان این ژنها و همچنین سایر پارامترهای گیاهان اثبات شود.
تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت مالی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته با قرارداد شماره 401/95/ص/7 مورخ 26/2/1395 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام میدارند.
)