مقدمه

نانوذرات آهن کاربرد وسیعی در علم پزشکی به‫خصوص در ساخت شناسه‏گرهای زیستی فلورسانس، درمان تومورهای سرطانی، تشخیص زیستی پاتوژن‏ها دارند (1-3). باکتری‏های مگنتوتاکتیک گروهی از باکتری‏های گرم منفی که به‏صورت آرام در طول میدان مغناطیسی و میدان‏های دیگر جهت‏گیری و شنا می‏کند. این توانایی بر روی ساختار کریستال درون سلولی به‏نام مگنتوزوم‏ها بنا شده است (4). مگنتوزوم‏های موجود در باکتری‏های مغناطیسی اطراف غشاء از مواد معدنی آهن مگنتیک، مگنتیت (Fe₃O₄) یا گریگیت (Fe₃S₄) تشکیل شده‏اند (5).

درمیان روش‌‌های مختلف موجود در بیوسنتر نانوذرات، استفاده از باکتری‌‌های پروکاریوتی از توجه ویژ‌ه‌ای برخوردار است. مگنتیت یکی از محصولات رایج احیا، از طریق باکتری بوده که می‌تواند به‏عنوان یک شاخص پتانسیل فیزیکی به‏صورت اکتیویته زیست‌شناسی در سیستم‌‌های زمین‌شناسی استفاده شد باکتری‏های مگنتوتاکتیک قادر به‏تولید کریستال‌‌های مغناطیسی (Fe₃O₄)  تک-دامنه است که به‏طور متوالی و به‏صورت زنجیره‌‌های دوتایی و اشکال دایره‌ای تشکیل می‌شوند (6). مطالعات مختلفی بر روی گونه‏های ﺑﺎﮐﺘﺮیﻫﺎی مگنتوتاکتیک در ﻧﻘﺎط ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺟﻬﺎن انجام شده است. سویه مگنتواسپریلیم گریفسوالدنزیک باکتری میکروائروفیل و گرم منفی از باکتری‏های مغناطیسی است که از شاخه پروتئوباکتر، طبقه آلفا پروتئوباکتر، رده رودوسپیریلا می‏باشد (7). شکل‏گیری مگنتوزوم نسبت به تغییر شرایط شیمیایی و فیزیکی بسیار حساس می‏باشد. غلظت اکسیژن یکی از مهم‏ترین فاکتورهای محیطی است که نه تنها بر معدنی شدن زیستی مگنتوزوم تاثیر می‏گذارد بلکه بر رشد باکتری‏های مگنتوتاکتیک اثرگذار است (8). شاید ادعای اینکه سرطان را می‌توان با استفاده از آهن‌ربا درمان کرد، ادعای گزافی به‌نظر برسد. اما گروهی از محققان فرانسوی از ساختارهای اکسید آهن استخراج شده از باکتری‌ها برای کشتن انتخابی سلول‌های سرطانی با استفاده از یک میدان مغناطیسی متناوب بهره برده‌اند. مطالعات نشان داده‏اند که مگنتوزوم‏ها باعث ازبین‏رفتن انسجام بین سلول‏های سرطانی شده که منجر به افزایش نفوذ داروهای ضد سرطانی درون تومور می‏شود و این عملکرد با افزایش تخریب سلول‏های سرطانی همراه می‏باشد (9).

Alphandery و همکارانش (9) در سال 2014 به‏منظور ارزیابی کردن فعالیت ضدتوموری از سوسپانسیون محتوی مگنتوزوم استفاده کردند. تومورهای سینه xeno-grafted زیر پوست موش که تحت تاثیر جریان میدان مغناطیسی قرار گرفته بودند با تیمار با مگنتوزوم ها، اثرات مثبت در درمان سرطان به‏ثبت رسید. با توجه به‏فراوانی سرطان سینه در دنیا و عوارض داروهای شیمی درمانی، هدف از این پژوهش ارزیابی اثر سمیت سلولی مگنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 می‏باشد.

مواد و روش‌ها

سویه استاندارد مگنتواسپریلیم گریفس والدنز گونه MSR-1 با کد اختصاصی (DSM6361) از شرکتDetschesammlung von microorganismen und zellkulturen آلمان خریداری شد. این سویه در محیط کشت اختصاصی DSMZ  آلمان کشت داده شد. برای تهیه محیط کشت مواد بر طبق روش استاندارد DSMZ Medium 380 (آلمان) باکتری Magnetospirillum عمل شد. محلول عناصر معدنی و محلول ویتامین در حجم یک لیتر و محلول کوئینات فریک در حجم 100 میلی‏لیتر تهیه شد. به‏ازای هر لیتر محلول مادر، 10 میلی لیتر محلول ویتامین، 5 میلی مولار محلول عناصر معدنی، 2 میلی‏مولار محلول کوئینات فریک،KH2PO4  68/0 گرم،Succinic acid  37/0گرم ،L(+)-Tartaric acid 37/0 گرم،  Na05/0 گرم، Na-thioglycolate 05/0 گرم، NaNO3 acetat 12/0 گرم و Resazurin 5/0 میلی‏گرم مورد استفاده قرار گرفت. قبل ازمخلوط کردن این ترکیبات  pHمحلول حاوی عناصر معدنی با اضافه کردن  KOHیا هیدروکسید پتاسیم به 5/6 رسانده و به‏کمک گاز  N2اکسیژن‏زدایی شد. محلول کوئینات فریک و عناصر معدنی به‏مدت 15 دقیقه با فشار 15پاسکال در دمای 121 درجه سانتی‏گراد اتوکلاو شدند. بعد از اتوکلاوگذاری، زمانی که دمای محلول به 45 درجه سانتی‏گراد رسید، محلول ویتامین فیلتر شده به آن اضافه شد. محلول ویتامین واجد Pyridoxine-HCl،Nicotinic acid ،Riboflavin ،Thiamine-HCl·2H2O Folic acid می‏باشد. سایر مواد از شرکت Merck آلمان تهیه شد. با سوزن استریل مقداری از باکتری MSR-1 که داخل محیط است برداشته و داخل محیط کشت مایع باکتری تزریق شد و بعد درون جار بی‏هوازی قرار داده و برای شارژکردن به دستگاه آنوکسومات وصل شد و به‏مدت 1 هفته تا 10روز برای رشد باکتری درون انکوباتور گذاشته تا زمانی که رنگش کدر شود (10، 11). بعد از 1 هفته تا 10روز که باکتری ها بر روی محیط مایع رشد کرد از روی محیط مایع برداشته بر روی محیط کشت جامد DSMZ به‏صورت کشت خطی کشت داده و درون جار بی‏هوازی و هوازی در دمای 28 درجه سانتی‫گراد به‏مدت 1 هفته تا 10روز نگه‫داری شد (12). جهت شناسایی باکتری از رنگ آمیزی گرم و ارزیابی حرکت  باکتری در زیر میکروسکوپ به‏وسیله آهن‏ربای مغناطیسی انجام شد. به ‏این منظور مقداری از باکتری‏هایی که رشد کرده را با سرنگ برداشته بر روی لام گذاشته و آّب مقطر را بر روی آن ریخته و در زیر میکروسکوپ نوری با قرار دادن آهن‏ربا از طرف قطب شمال و جنوب حرکت باکتری مشاهده و ثبت شد (13). به‏منظور بررسی دقیق باکتری و مشاهده نانوذرات آهن درون آن، عکس‏برداری با میکروسکوپ الکترونی زایس مدل EM900 انجام گرفت. برای مشاهده نمونه به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی چند لاندا از محیط کشت غلیظ شده حاوی باکتری را برداشته بر روی گرید (شبکه مسی) ریخته شد. پس از خشک شدن  WFI (آب تزریقی) ریخته داخل محفظه مخصوص قرار داده و به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی (Ziemens 300kv) در آزمایشگاه دانشکده هوا و فضا خواجه نصیر طوسی مشاهده و عکس‏برداری شد (14).جهت جداسازی و خالص‏سازی مگنتوزوم‏ها، از روش فیزیکی استفاده شد که دیواره باکتری با استفاده از دستگاه French press (شرکت Thermo، آلمان) پاره شد که عصاره سلولی حاصل شد. این دستگاه با فشار مستقیم باعث لیز سلول می‏شود. نحوه‏ی کار آن بدین گونه می‏باشد که با سانتریفیوژ 7000 دور در دقیقه محیط کشت باعث جدا شدن باکتری از محیط می‏شود. در انتها رسوب به‏دست آمده را از خروجی دستگاه برداشته می‏شود. حدودا 10 گرم (بر اساس محاسبات  ODباکتری) از سلول‏های مگنتواسپریلیم گریفیس والدنز استخراج شده را در 50 میلی لیتر از HEPES 50 میلی‏مولار و EDTA  4 میلی‏مولار با سه بارعبور دادن از دستگاه French press (2000IB/IN2) دیواره سلولی باکتری را پاره کرد (کلیه بافرهای نام برده که برای استخراج مگنتوزوم استفاده شد، حاوی فنیل متیل سولفونیل فلوراید به‏عنوان بازدارنده پروتئین می‏باشد). سلول‏های سالم و آشغال‏های سلول به‏وسیله سانترفیوژ با دور rpm 10000 در دقیقه جداسازی شد. مایع رویی از میان ستون جداسازی مغناطیسی عبور داده شد (ستون بین دو مغناطیس قرار داده شد که این ستون یک میدان مغناطیسی قوی را تولید می‏کند و جاذب مغناطیسی آهن است).

ابتدا ذرات مغناطیسی خارج شده با 50 میلی‏لیتر از HEPES 10 میلی‏مولار و NaCl 200 میلی‏مولار (pH=7/4) بعد با 100 میلی‏لیتر از HEPES 10 میلی‏مولار شستشو داده شد. سپس ستون از ذرات مغناطیس پاک شد و ذرات مغناطیسی با بافرHEPES  10 میلی‏مولار از ستون به‏وسیله فلاش کردن یا با فشار خارج شد و در یخچال نگه‏داری شد (15).

جهت شناسایی مولکولی استخراج DNA با استفاده از کیت (یکتا تجهیز آزما-ایران) براساس دستورالعمل کیت انجام شد. برای شناسایی دقیق‏تر و جهت تکثیر از پرایمرهای اختصاصی MT12166 رفت و برگشت  مگنتواسپیریلیم گریفیس استفاده شد (16). واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad-USA) انجام گرفت.  تمام اجزا واکنش از شرکت یکتا تجهیز آزما خریداری شد. مخلوط واکنش شامل: 25 ماکرولیتر Master Mix (شامل بافر PCR با غلظت 10 برابر، کلرید منیزیم dNTP، آنزیم Taq DNA پلی‏مراز) 3 ماکرولیتر DNA، 2 ماکرولیتر پرایمر رفت (5′-TTAAGGGGCAGAGAGGGAA-3′)، 2 ماکرولیتر پرایمر برگشت (5′-GGCGACGATGAAGCTCTTAC-3′) با غلظت 10 پیکومول و 18 ماکرولیتر آب می باشد. توالی پرایمرها بر اساس مطالعات چاپ شده انتخاب شدند و سنتز آن‫ها توسط شرکت توپاز ژن در ایران انجام شد. در این تکنیک برای آغاز فرایند پلیمریزاسیون دستگاه ترمال سیکلر به‏مدت 1 دقیقه بر روی دمای 94 درجه سلسیوس تنظیم شد و متعاقبا 35 سیکل PCR به‏صورت 94 درجه سلسیوس برای 1 دقیقه، 8/58 درجه سلسیوس برای 30 ثانیه و 72 درجه سلسیوس برای مدت 1 دقیقه اجرا شد. در نهایت به‏مدت 4 دقیقه نیز عمل طویل سازی نهایی در 72 درجه سلسیوس انجام شد. سپس جهت اطمینان از تکثیر ژن S rDNA 16، الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد، حاوی بافر TBE 1X به‏مدت 60 دقیقه در ولتاژ 90 انجام شد (16). در نهایت جهت مشاهده نتایج ژل از دستگاه UV Transilluminator-USA استفاده شد (17). در نهایت محصول PCR به حجم 30 میکرولیتر همراه با پرایمرهای رفت و برگشت (با غلظت‏های 10 پیکومول بر میکرولیتر) برای توالی یابی به شرکت First Base به کشور مالزی ارسال شد. در این پژوهش رده سلولی سرطان سینه انسانی  MCF-7که مشابه سلول‏های اپیتلیال می‏باشد با کد C135 جهت بررسی خاصیت ضدسرطانی مگنتووزم استخراج شده، از کلکسیون رده سلولی انیستیتو پاستور ایران تهیه شد .سلول‏ها در محیط کشتRPMI 1640 Sigma-Aldrichav)، امریکا) حاوی 2 میلی‏مولار ال-گلوتامین، 10 درصد سرم جنین گاوی، پنی سیلین به‏میزان unit/mL 100 و استریتوماسیون به‏میزان 100 میکروگرم در میلی‏لیتر در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، 95 درصد اکسیژن و فشار 5 درصد CO₂ کشت داده شدند. شمارش سلول‏ها با کمک هموسایتومتر انجام شد. درصد سلول‏های زنده با تریپان‏بلو تعیین شد. به‏منظور بررسی فعالیت ضدتکثیری مگنتزوم باکتری مگنتواسپیریلیم گریفیس ابتدا سلول‏های رده سلولی کشت داده شدند به‏طوری‏که به‏هر چاهک پلیت96 خانه‏ای تعداد10⁴×1 سلول اضافه شد. ظروف کشت حاوی سلول به‏مدت24 ساعت در انکوباتور CO₂دار و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرارگرفتند. سپس سلول‏ها با 10 میکرولیتر مگنتوزوم‏های خالص شده با غلظت‏های مختلف (غلظت‏های 1، 1/.، 01/.، 001/.، 0001/.، 00001/. میلی گرم بر میلی لیتر) به‏مدت 24 ساعت انکوبه و تیمار سلولی انجام گرفت. نمونه کنترل مثبت (سلول‏های کشته شده با تریتون 100X) و کنترل منفی (فاقد توکسین) نیز ارزیابی شد. پس از اتمام مراحل کار کشت سلولی و اثر دادن غلظت های مختلف بر سلول‏های هدف، به‏هر چاهک 10 میکرولیتر محلول 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر ازMTT  اضافه شد. سپس به‏مدت 3 ساعت در انکوباتور (5 درصد) CO₂ در 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از آن، مایع رویی دور ریخته شد و با افزودن 100 میکرولیتر محلول دی متیل سولفوکساید به‏هر چاهک و قرار دادن آن برای مدت 30 دقیقه بر روی شیکر و دور از روشنایی، کریستال‏های فورمازان ایجاد شده حل شدند. سپس با استفاده ازالیزا ریدر میزان جذب نوری چاهک‏ها در طول موج 595 نانومتر در مقابل کنترل قرائت شد (18، 19).

آنالیز آماری

تحلیل نتایج آزمون با استفاده از نرم افزار آماری spss نسخه 21 و آزمون آتالیز واریانس و تست اماری غیرپارامتریک Kruskaiwalis انجام شد. همچنین از نرم افزارCurve expert 1.4 جهت به‏دست آوردن IC50 مگنتوزوم جدا شده از باکتری در راستای کشت سلول استفاده شد.

نتایج

پس از کشت باکتری مگنتواسپریلیوم گریفس والدنز، کلنی‏های این باکتری به‏صورت برآمده، با شکلی نامنظم و به‏رنگ کرم مشاهده شد (شکل 1).

شکل 1: مرفولوژی کلنی مگنتواسپریلیم گریفس والدنز درمحیط کشتDSMZ

کلنی‏های باکتری مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز بعد از کشت رنگ آمیزی شدند و مارپیچ‏های گرم منفی مشاهده و ثبت شد (شکل 2).

با قرار دادن باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز در زیر میکروسکوپ نوری و قرار دادن آهن‏ربا در دو طرف قطب شمال و جنوب در نزدیکی صفحه میکروسکوپ، باکتری به‏سرعت به‏طرف قطب شمال آهنربا تمایل داشت که North seeking تشخیص داده شد.

شکل2: رنگ‏آمیزیگرمباکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنزکه باکتری مارپیچی مشاهده شد.

عکس‏برداری با استفاده از میکروسوپ الکترونی جهت تعیین ساختار باکتری و مگنتوزوم مگنتواسپریلیم گریفس والدنز انجام شد. این از باکتری مارپیچی شکل، دارای دو تاژک یکی در ابتدا و یکی در انتها، که توانایی تولید 20 مگنتوزوم دارند مشاهده شدند. اندازه مگنتوزوم این باکتری 50 و 60 نانومتر مشاهده شد که جز دسته مگنتوزوم‏های بزرگ در باکتری‏های مگنتوتاکتیک می‏باشد (شکل3).

شکل 3: ساختار مگنتوزوم با میکروسکوپ الکترونی. الف: باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز با مقیاس 750 نانومتر. ب: ذرات مگنتوزوم با مقیاس 60  نانومتر.

در شناسایی مولکولی باند 1166 جفت بازی حاصل شد که بعد از انجام تعیین توالی، 98 درصد همولوژی با باکتری مگنتواسپیریایم گریفیس در بانک ژنی نشان داد. نتایج ژل الکتروز درشکل  4 آمده است.

شکل4: ژل الکتروفورز محصول PCR. ستون اول مارکر 100 جفت بازی سیناژن. ستون دوم  محصول PCR حاصل از ژن مگنتواسپریلیم گریفس والدنز با اندازه 1166 جفت باز می‏باشد.

پس از جداسازی مگنتوزوم باکتری مگنتوتاکتیک، اثر سیتوسیدالی آن‏ها در غلظت‏های مختلف به‏مدت 24 ساعت ارزیابی شد، نتایج در شکل 5 آمده است. توان سلول‏های زنده و خاصیت ضد سرطانی مگنتوزوم باکتری مگنتو اسپریلیم گریفس والدنز در غلظت‏های مختلف بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 در مقایسه با نمونه‏های کنترل منفی (فاقد مگنتوزوم) مورد مقایسه قرار گرفته شد. نمودار نشان میدهد که روند اثر غلظت بر توان سلول های زنده و خاصیت ضد سرطانی نمونه مگنتوزوم باکتری جداسازی شده تاثیر مثبتی ندارد. علاوه‏براین ماکزیمم توان سلول‏های زنده در برابر مگنتواسپریلیم گریفس والدنز 85 درصد می‏باشد که با توجه به تست آماری Kruskalwalis (04/0=p) این تفاوت معنی‫دار نمی‏باشد.

شکل5: ارزیابی اثر مگنتوزوم باکتری مگنتوتاکتیک در خوانش 24 ساعته برروی رده‏ی سرطانی سینه MCF-7. M: باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز می‏باشد که سمیت سلولی مکنتوزوم باکتری مگنتواسپریلیم گریفس والدنز در غلظت‏های مختلف بر رده سلولی MCF-7 با نمونه‏های کنترل مقایسه شده است. با توجه به آنالیز آماری 04/0 حاصل شد.