نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، دانشکده علوم، گروه بیوشیمی، واحد شوشتر، شوشتر، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی، دانشکده علوم پزشکی، گروه دامپزشکی، واحد شوشتر، شوشتر، ایران
چکیده
هدف: هدف این تحقیق بررسی و تعیین حساسیت و ویژگی استفاده همزمان DNA متیلاسیون ژن RASSF1A و بیان ژن FHL1 در تشخیص افتراقی تومورهای خوش خیم از پاپیلاری کارسینومای تیرویید میباشد.
مواد و روش‌ها: 160 نمونه از بیماران با تومورهای بدخیم تیرویید (80 نمونه) وخوش خیم تیرویید (80 نمونه) از بین کل بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی اهواز به این تحقیق وارد شدند، استخراج RNA از نمونههای پارافینه شده سپس از روی آنcDNA ساخته شد. جهت بررسی بیان ژن از مخلوط واکنش Real Time PCRحاوی مادهی فلورسانت سایبر گرین استفاده شد همچنین برای بررسی هیپرمتیلاسیون ژن پس از استخراج DNA نمونههای مختلف بهروش COBRAانجام شد در نهایت میزان حساسیت و ویژگی استفاده همزمان دو تست از محاسبات اپیدمیولوژیکی استفاده شد.
نتایج: در تومورهای بدخیم یک همبستگی معکوس معنیدار در سطح 05/0 بین هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A با بیان ژن FHL1 وجود دارد همچنین حساسیت استفاده همزمان تست هیپر متیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A (کیفی و کمی) و تست بیان نسبی mRNAژن FHL1 بهترتیب 2/98 و 32/79 درصد، همچنین ویژگی استفاده همزمان تست هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A (کیفی و کمی) و تست بیان ژن FHL1 بهترتیب 47/39 و 29/75 درصد محاسبه شد.
نتیجهگیری: استفاده همزمان تست هیپرمتیلاسیون پروموتر ژنRASSF1A بهصورت کیفی و تست بیان ژن FHL1 جهت تشخیص افتراقی تومورهای خوش خیم از پاپیلاری کارسینومای تیروئید حساسیت بالاتری دارد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Sensitivity& Specificityof Simultaneous use of RASSF1Agene DNA methylation and FHL1 gene Expression technique in Differential Diagnosis of Benign Tumors from Papillary Carcinoma tumor in Thyroid gland
نویسندگان [English]
- GA Dinarvand 1
- SZ Peighambarzadeh 2
- M Tavana 2
1 Department of Biochemistry, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University, Shoushtar, Iran
2 Department of Veterinary medicine, Faculty of Medical Science, Islamic Azad University, Shoushtar, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study is determining the sensitivity and specificity of simultaneous use of both DNA methylation of RASSF1A gene and expression of FHL1 gene in the differential diagnosis of benign tumors from malign papillary carcinoma tumor in the thyroid gland.
Material and Methods: 160 samples of patients with malign thyroid tumors (80 samples) and benign thyroid (80 samples) were used in this study. The RNA was extracted from paraffinic samples, and then cDNA was made from it. Gene expression was investigated by Real Time PCR mixture containing the Cyber Green fluorescence material. After DNA extraction, the hypermethylation of the gene was performed using COBRA method. Finally, an epidemiological calculation was used for calculating the effects of sensitivity and specificity of two simultaneous tests.
Results: There was a negative significant correlation (P ≤0.05) between promoter hypermethylation of the RASSF1A gene and the FHL1 gene expression. Net sensitivity of simultaneous use of the promoter methylation of the RASSF1A gene (quantitative and quantitative) and expression of the FHL1 gene were 98.2% and 79.32%, respectively. The Net specificity of simultaneous use of the promoter methylation of the RASSF1A gene (quantitative and quantitative) and the FHL1 gene expression test were 39.47 and 75.29%, respectively.
Conclusion: simultaneous use of the hypermethylation of the RASSF1A gene promoter as a qualitative and expression test for FHL1 gene is more sensitive and more reliable in differential diagnosis of benign tumors from malign papillary carcinoma tumors.
کلیدواژه‌ها [English]
- Hypermethylation
- RASSF1A gene
- FHL1 gene
- Sensitivity
- Specificity
مقدمه
سرطان تیرویید شایعترین بدخیمی غدد درون ریز است که در دو دهه اخیر در جهان موارد ابتلا به این سرطان افزایش یافته است (1). در آمریکـا افزایش سالیانه موارد ابتلا به سرطان تیرویید بین سالهای 2000 تا 2009، 6 درصد میباشد که در میان همه انواع سرطانها بالاترین مقدار را دارد (1). اگرچه میزان مرگ ومیر ناشی از این سرطان پایین است میزان عود یا دوره درمان بیماری بالا است که موجب افزایش ناتوانی در درمان و مرگ و میر میشود (2). بر اساس آمار انیستیتو سرطان ایران، سرطان تیرویید 8/1 درصد کل میانگین سنی بیماران ایرانی 43 سال و نسبت زن به مرد 8/1 به 1 بوده است. سرطان تیرویید در ایران هفتمین سرطان شایع در زنان و چهاردهمین در مردان و یازدهمین سرطان شایع در هر دو جنس است (3).
بقا 10 ساله سرطان تیرویید در بالغین میانسال 80 تا 96 درصد است. عود مجدد در 5 تا 20 درصد موارد پاپیلاری تیرویید کارسینوما دیده میشود. عود مجدد ممکن است ناشی از درمان ناقص اولیه و یا بهدلیل وجود تومور با سلولهای خیلی مهاجم باشد (4). ریسک بدخیمی در نمونههای FNA (Fine Needle Aspiration) که مشکوک به سرطان بین 10 تا 40 درصد گزارش میشوند لذا تمام بیماران نیازمند برداشت ندول مشکوک خواهند بود تا جواب دقیقتر با بررسی نمونههای بیوپسی پاتولوژی مشخص شود و فقط در حدود 20 درصد این نمونههای مشکوک دارای نئوپلاسم بدخیم خواهند بود (5). از طرف دیگر در 10 درصد موارد FNA جوابهای منفی کاذب گزارش میشود که منجر به تشخیص دیر هنگام سرطان و در نتیجه درمان دیر هنگام میشود و این امر بر روی سیر بیماری تاثیر منفی میگذارد (5).
ژن (Ras association domain family 1) RASSF1A: نام دیگر این ژن NORE2A است و بر روی کروموزوم 3 در محل 3p21.3 قرار دارد. این ژن پروتئینی را رمزبندی میکند که به پروتئینهای اثرگذارRAS RAS effector proteins)) شباهت دارد (6). تغییر بیان این ژن با پاتوژنز انواع مختلفی از سرطانها ارتباط دارد که سرکوبگر تومور بودن این ژن را پیشنهاد میدهند. یکی از راههای غیر فعال شدن این ژن، هیپرمتیلاسیون جزایرCpG در پروموتر آن است. پروتئین تولید شده با پروتئینهای سیستم ترمیم DNA مانند XPA واکنش دارد (6). همچنین این پروتئین مانع تجمع سیکلین D1 میشود و بنابراین موجب توقف چرخه سلولی میشود (7).
بررسی بر روی وضعیت متیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A نشان داده است که در 35 درصد تومورهای خوش خیم و بدخیم تیرویید این ژن متیله میشود (8). در تحقیقی هیپرمتیلاسیون پروموتر این ژن در سرطانها از جمله تیرویید گزارش شده بود و از آن بهعنوان یک نشانهای زیستی مولکولی که امکان تشخیص سلولهای سرطانی را فراهم میسازد، ذکر شده بود (9). هیپرمتیلاسیون RASSF1A در خون و مایعات بدن افراد مبتلا به برخی بدخیمیها مثل سرطانهای تیرویید هم مشاهده شده بود و بنابراین میتواند بهعنوان یک نشانهای زیستی در تشخیص زودرس سرطان تیروئید کاربرد داشته باشد (9). در یک بررسی بر روی 89 تومور تیرویید و 3 رده سلولی نشان داده شد که در هر سه رده سلولی و در 35 درصد موارد تومورهای خوشخیم و بدخیم هیپرمتیلاسیون RASSF1Aدیده میشود، این تحقیق نشان داد که میزان هیپرمتیلاسیون RASSF1A با مقدار بیان آن ارتباط دارد.
ژن FHL1(Four and a half LIM domains 1): این ژن بر روی کروموزوم X و در محل Xq26 قرار دارد و شماره شناسایی آن 2273 و از 7 اگزون تشکیل شده است. محصول آن از رشد سلولهای سرطانی از طریق مسیر پیامرسانی مشابه با TGFb جلوگیری میکند. این ژن کنترل کننده پرولیفراسیون، تکامل و آپوپتوز سلولی است (10). در تحقیقی مشخص شد که ژن FHL1 بیشترین تفاوت بیان نسبی mRNA را در بین دو گروه تومورهای فولیکولار خوش خیم و بدخیم تیرویید دارد و نتیجهگیری شده بود که با بررسی تعداد اندکی ژن مانندFHL1 امکان افتراق تومورهای خوش خیم از بدخیم تیرویید وجود دارد (11).
تاکنون هیچ نشان زیستی منفردی که بتواند تمام تومورهای خوش خیم را از بدخیم افتراق دهد شناخته نشده است و بههمین دلیل از ترکیبهای انواع مختلف نشانهای زیستی استفاده میشود تا بهترین نتایج بهدست آید (12). بههرحال، بهجز تعداد اندکی از این ژنها که در مطالعات گوناگون بهعنوان نشانهای زیستی برای بدخیمی معرفی شدهاند، بیشتر آنها فقط در یک مطالعه بررسی شده اند و درمطالعات جداگانه دیگر کارایی آنها به اثبات نرسیده است. در این تحقیق تصمیم گرفته شد تا حساسیت و ویژگی استفاده همزمان تستهای تشخیصی مولکولی DNA متیلاسیون ژن RASSF1A و بیان ژن FHL1 در تشخیص افتراقی تومورهای خوش خیم از پاپیلاری کارسینومای تیروئید بررسی و تعیین شود.
مواد و روش‌ها
حجم نمونه در این تحقیق 160 مورد بود و 80 نمونه از بیماران با تومورهای بدخیم تیرویید و 80 نمونه با تومورهای خوشخیم تیرویید در این تحقیق وارد شدند. بلوکهای پارافینی بعد از بازبینی مجدد توسط یک پاتولوژیست مناسبترین آنها انتخاب شدند. سه نمونه که در گزارش پاتولوژی هیچ ضایعه خوش خیم یا بدخیم گزارش نشده بود بهعنوان بافت نرمال انتخاب شدند.
برای انجام مایکرودایسکشن در ابتدا بهوسیله میکروتوم برشهای 6 میکرونی از بلوکهای پارافینی داده شد. سپس این برشها در یک محیط عاری از RNase بر روی لامهای مخصوص مایکرو دایسکشن گذاشته شدند. از هر بلوک 5 لام تهیه شد و در هر لام بین 2 تا 3 برش گذاشته شد. دو عدد از این لامها برای استخراجRNA و دو عدد دیگر برای استخراج DNA در نظر گرفته شدند و یک لام هم با رنگ هماتوکسلین ائوزین (Sigma) رنگ آمیزی شد تا در زمان مایکرودایسکشن بهعنوان راهنما برای شناسایی محدوده سلولها استفاده شود. لامهای مخصوص برای استخراج RNA در فریزر 80- سانتیگراد نگهداری شدند و لامهای مخصوص برای استخراج DNA در دمای اتاق نگهداری شدند. سپس با مقایسه بین لامهای رنگآمیزی شده با رنگ هماتوکسلین ائوزین و لامهای رنگآمیزی شده با متیلن گرین و با کمک دستگاه لیزر مایکرو دایسکشن (LEICA) و یا با کمک استریومیکروسکپ و تیغ جراحی سلولهای مورد نیاز از سطح لامها برش داده شده و در میکرو تیوبهای 5/1 میکرولیتری قرار داده شدند و تا زمان استخراجDNA و یا RNA در فریزر80- سانتیگراد نگهداری شدند. برای استخراج DNA از نمونههای پارافینی از کیت QIAamp DNA Micro Kit شرکتQIAGEN استفاده شد. برای استخراج DNA از بافت تازه از روش فنل و کلروفرم استفاده شد.
در سال 1997 برای اولین بار روش Combined Bisulfit Restriction Analysis (COBRA) برای بررسی کمی هیپر متیلاسیون ابداع شد (13). در این روش بعد از تیمار DNA با بیسولفیت و انجامPCR ، محصولات آن تحت برش آنزیمی قرار میگیرند. با توجه به ردیف بازهای اولیهDNA این آنزیم بهگونهای انتخاب میشود که عمل برش را فقط در جزایرCpG دارای هیپرمتیلاسیون انجام دهد. میزان هیپرمتیلاسیون درDNA اولیه با میزان کمی برش محصولاتPCR متناسب است (13). اگر CpG درDNA اولیه فاقد هیپرمتیلاسیون باشد در اثر تیمار بیسولفیت سیتوزین تبدیل به تیمین شده و جایگاه برش آنزیم از بین میرود و عمل برش انجام نخواهد شد. اگر در DNA اولیه مخلوط آللهای متیله و غیرمتیله وجود داشته باشد در زمان هضم آنزیمی، میزان برشها وابسته به مقدارCpG های متیله دارد. سپس با غلظت سنجی باندها در ژل پلی اکریل آمید (با کمک نرمافزار ImageJ) میزان کمی هیپرمتیلاسیون محاسبه میشود. درصد هیپرمتیلاسیون براساس فرمولX 100% Methylation= C / (C + B) محاسبه شد که در آن B دانسیته باند محصولات قبل از برش و C دانسیته باند حاصل از برش آنزیمی است (شکل 1).
شکل1: نتایج بررسی هیپرمتیلاسیون RASSF1A: نتایج آنالیز MS-PCR برای ژن RASSF1A در نوارM و نوارN بهترتیب مقصود متیله شده و غیرمتیله شده است، نوار انتهایی(L) بهعنوان مارکر با جرم مولکولی bp 100 میباشد.
در بررسی هیپرمتیلاسیون ازDNA محصول شرکتMillipore بهنامCpGenome™ Universal Methylated DNA بهعنوان کنترل مثبت استفاده شد. در اینDNA تمام جزایرCpG دارای هیپرمتیلاسیون هستند. همچنین از DNA لنفوسیتهای خون محیطی (PBL) بهعنوان کنترل منفی استفاده شد. برای انجام تیمار بیسولفیت از کیت EZ DNA Methylation Kit ™CA, USA) (ZYMO REASERCH استفاده شد.
پرایمرهای مورد نیاز برای بررسی هیپرمتیلاسیون RASSF1A با کمک سایت Primer 3 طراحی شد(جدول1). در ابتدا توالیDNA در محدوده اگزون شماره یک این ژنها در سایت Meth Primer وارد شد و جزایرCpG در این منطقه شناسایی شدند. سپس ردیف بازهایDNA بعد از تیمار با بیسولفیت بهدست آمد (مطابق راهنمای کیت متیلاسیون). سپس یک جایگاه برش آنزیمی که واجد یکCpG باشد انتخاب و پرایمر لازم در اطراف این جایگاه طراحی شد. بهدلیل اینکه نمونههایDNA از بافتهای پارافینی بهدست آمده بودند سعی شد که طول محصولPCR زیر 90 جفت باز طراحی شود.
جدول1: ردیف بازی، طول محصول و آنزیم استفاده شده برای بررسی هیپر متیلاسیون بهروش COBRA
|
نام ژن |
ردیف بازی پرایمرها |
طول قطعه |
طول بعد از برش |
آنزیم |
|
RASSF1A |
F:GGTTYGYGTTTGTTAGYGTTTAAAGTT R:CTCAAACTCCCCCRACATAA |
70 |
35-35 |
RsaI |
سه آنزیم استفاده شده برای بررسی هیپرمتیلاسیون دارای جایگاه برش بهشرح زیر بودند. آنزیم Taq1 (TCGA)، آنزیم RsaI (GTAC) و آنزیم BstUI (CGCG). شرایط دمایی و مدت زمان تیمار بر اساس توصیه شرکت سازنده عمل شد.
برای استخراجRNA از نمونههای مایکرو دایسکت شده از کیت شرکت Roche بهنام High Pure RNA Paraffin Kit استفاده شد.
همچنین برای ساخت cDNA از کیت شرکت Qiagen بهنام Quanti TechRT بر اساس دستور العمل شرکت سازنده استفاده شد.
واکنش Real Time PCR در حجم 20 میکرولیتر و بهصورت دوپلیکیت انجام گرفت. از مخلوط واکنشReal Time PCR که دارای ماده فلورسانس سایبر گرین و محصول شرکت TAKARA بهنامSYBR ®Premix Ex Taq ™ استفاده شد چون نسبت به مخلوط واکنشی رنگ EvaGreen جوابهای بهتری بهدست آمده بود.در هر تیوب واکنش، مواد با مقادیر زیر اضافه شد.
1-PreMix 2X 10 μl
2-primer 2μM each 1 μl
3-D.W 7 μl
4-cDNA 2μl
واکنشهایReal Time PCR هم با دستگاه مارک CORBET بهنام Rotor-Gene 6000 انجام شد. چرخه دمایی بهصورت 10 ثانیه 95 درجه سپس 45 سیکل شامل 5 ثانیه 95 درجه، 15 ثانیه 60 درجه و 10 ثانیه 72 درجه بود. در انتهای هر سیکل در دمای 72 درجه نور سنجی با نور سبز و طول موج تابش 470 و بازتاب 510 نانومتر انجام میگرفت. سپس منحنی ذوب از دمای 65 تا 95 درجه محاسبه میشود (مطابق راهنمای کیت مورد استفاده).
برای بررسی بیان FHL1 با تکنیک Real Time PCR از پرایمریهایی استفاده شد که با کمک سایت اینترنتیPrimer3 طراحی شده بودند. پرایمرها طوری طراحی شدند که هر کدام در اگزون جداگانهای قرار بگیرند تا از تکثیرDNA ژنومیک جلوگیری شود. طول محصولPCR کمتر از 80 جفت باز طراحی شد تا برای تکثیر نمونههای پارافینی مشکلی ایجاد نشود. از ژن GAPDH بهعنوان کنترل استفاده شد. ردیف بازی پرایمرها و طول قطعه تکثیر شده در جدول 2 ارائه شده است. بعد از انجام موفقیتآمیز PCRها، مقدارCycle threshold) )Ct که نمایانگر سیکل آستانهای PCR است محاسبه شد. این کار با استفاده از منحنیهای تکثیرPCR که توسط دستگاهReal Time تهیه میشود و نرمافزار دستگاهCORBET انجام شد. برای هر ژن میزان تعدیل شده بیان mRNA بر حسب درصد با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
= بیان نسبی mRNA (درصد)
[2 -(Ct of gene ofinterest - Ct of GAPDH) x 100%]
جدول2: ردیف بازی پرایمرها و طول محصول PCR در آزمایش بررسی بیان نسبی mRNA
نام ژن |
ردیف بازی پرایمر |
طول قطعه (bp) |
|
FHL1 |
F: GCCAACACCTGTGTGGAAT R: GCCAGAAGCGGTTCTTATAGTG |
76 |
|
GAPDH |
F : ATGGGGAAGGTGAAGGTCG R: GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA |
72 |
برای انجاممحاسبات آماری از نرمافزار SPSS نسخه 16 استفاده شد. از آزمون مجذور مربع کای برای بررسی ارتباط بین متغیرهایی همچون گروه سنی، جنس، تهاجم و متاستاز با وضعیت کیفی هیپرمتیلاسیون استفاده شد. در موارد خاصی از آزمون دقیق فیشر برای این منظور استفاده شد. برای بررسی ارتباط احتمالی بین مقدار کمی هیپرمتیلاسیون و بیان mRNA با متغیرهایی مانند گروه
سنی، جنس، تهاجم و متاستاز از آزمون t استفاده شد. در تمامی آزمون های استفاده شده ارزش p برابر 05/0 ملاک عمل قرار گرفت.
برای محاسبه حساسیت (Sensitivity)، ویژگی (Specificity)، ارزش اخباری مثبت (Positive predictive value)، ارزش اخباری منفی(Negative predictive value) و صحت (Accuracy) جواب آزمایش از فرمولهای زیر استفاده شد. در این محاسبات جواب گزارشات پاتولوژی بهعنوان آزمایش استاندارد در نظر گرفته شد که حقیقی یا کاذب بودن نتایج هیپرمتیلاسیون و بیانmRNA در مقایسه با گزارشات پاتولوژی سنجیده شد. (مثبت حقیقی(TP): شخص بیمار، بهدرستی بیمار تشخیص داده شود. مثبت کاذب(FP): شخص سالم، به اشتباه بیمار تشخیص داده شود. منفی حقیقی(TN): شخص سالم، بهدرستی سالم تشخیص داده شود. منفی کاذب(FN): شخص بیمار، به اشتباه سالم تشخیص داده شود).
همچنین برای محاسبه حساسیت دو تست همزمان حاصلضرب حساسیت دو تست از مجموع حساسیت دو تست کم شد و برای محاسبه ویژگی دو تست همزمان؛ ویزگی دو تست در هم ضرب شدند.
از آزمون ROC برای محاسبه بهترین مقدار مرزی در بررسی های نتایج هیپرمتیلاسیون DNA بیان نسبیmRNA استفاده شد. این آزمون بهترین مقدار مرزی برای نتایج هر آزمایش را که بالاترین حساسیت و ویژگی را بهدست آورد در اختیار ما قرار میدهد و با محاسبه سطح زیر منحنی(AUC) کارایی آزمایش برای افتراق تومورهای خوشخیم از بدخیم محاسبه شد.
نتایج
نتایج اطلاعات توصیفی بیماران
در تحقیق جاری تعداد 160 نمونه بلوک پارافینی مربوط به نمونههای بایگانی طی سالهای 1385 تا 1395 از آزمایشگاههای پاتولوژی مراکز درمانی شهر اهواز بعد از بازبینی توسط یک پاتولوژیست جمع آوری و انتخاب شدند. نمونهها مشتمل بر 80 مورد تومورهای بدخیم و همچنین تعداد 80 مورد تومورهای خوش خیم شامل 40 مورد گواتر، 13 مورد تیروئیدیت هاشیماتو، 12 مورد آدنوم فولیکولار بودند که در تحقیق حاضر مورد بررسی قرار گرفتند. علاوه بر این تعداد 23 نمونه بافت تازه تیرویید در خلال انجام طرح مربوط به 4 مورد تومورهایCV-PTC و 19 مورد تومورهای خوش خیم از اتاق عمل بهطور مستقیم جمعآوری شد. در جدول 3 اطلاعات مربوط به گسترش جنسی، سنی و نوع هیستولوژیک تومورها ارائه شده است.
بررسی ارتباط هیپر متیلاسیون ژنRASSF1A با نوع تومورها
بررسی هیپرمتیلاسیون در 160 مورد تومورهای خوش خیم و بدخیم تیرویید نشانگر 138 مورد هیپرمتیلاسیون مثبت بود. از این تعداد 67 مورد خوشخیم و 71 مورد بدخیم بودند. مابقی 22 نمونههایی که هیپرمتیلاسیون را نشان ندادند 9 مورد بدخیم و 13 مورد خوشخیم بودند (جدول3). اگر چه فراوانی هیپرمتیلاسیون در نمونههای بدخیم (75/88 درصد) بیشتر از خوشخیم (75/83 درصد) بود اما تفاوت این دو گروه از نظر آماری معنیدار نبود (123/0=p).
بررسی کمی هیپرمتیلاسیون ژنRASSF1A
بررسی کمی هیپرمتیلاسیون در ژن RASSF1A بهصورت میانگین و انحراف از معیار به تفکیک گروههای مختلف انجام و مشخص شد که در گروه تومورهای بدخیم میزان آلل های دارای هیپرمتیلاسیون 28/28 درصد بود درحالیکه در گروه تومورهای خوش خیم این میزان 40/11 درصد بود و تفاوت بین این دو گروه معنیدار بود (01/0=p).
جدول 3: میانگین و انحراف معیار سن در زمان تشخیص بیماری (سال) و فراوانی جنس در بیماران مبتلا به تومورهای خوش خیم و بدخیم تیرویید به تفکیک طبقهبندی هیستوپاتولوژی (183n=)
|
توزیع سنی(سال) Mean ± SD Min – Max |
جنس (تعداد) مرد زن |
نوع هیستوپاتولوژی |
نوع تومور |
||||
|
82 - 15 78 - 21 13 - 13 85 - 58 |
17/21 ± 20/41 18/39 ± 01/48 00/0 ± 00/13 19/18 ± 51/71 |
18 6 5 6 |
32 6 1 6 |
CV-PTC TC-PTC FV-PTC UTC |
بدخیم (n=80)
|
پارافینی |
|
|
56 - 29 83 - 38 68 - 22 72 - 22 |
22/11 ± 33/44 78/15 ± 41/56 87/14 ± 74/46 99/26 ± 33/49 |
1 2 5 6 |
12 10 35 9 |
HT FA GT N |
خوش خیم / طبیعی (n=80) |
||
|
57 - 28 |
16/12 ± 00/47 |
0 |
4 |
CV-PTC |
بدخیم (n=4) |
بافت تازه |
|
|
42 - 42 55 - 26 65 - 25 56 - 23 |
00/0 ± 00/42 42/13 ± 27/38 68/13 ± 82/38 93/22 ± 52/38 |
0 0 1 1 |
1 5 10 1 |
HT FA GT N
|
خوشخیم / طبیعی (n=19) |
||
CV-PTC, Classic Variant Papillary Thyroid Carcinoma. TC-PTC, Tall cell variant papillary thyroid carcinoma. FV-PTC, follicμlar variant papillary thyroid carcinoma. UTC, Undifferentiated thyroid carcinoma. HT, Hashimato’s thyroiditis. FA, Follicμlar adenoma. GT, goiter. N, Normal.
بررسی هیپر متیلاسیون ژنRASSF1A در جهت افتراق تومورها
بررسی هیپر متیلاسیون بهصورت کیفی نشان داد که اگر هیپرمتیلاسیون ژنRASSF1A بهعنوان یک آزمایش تشخیصی برای سرطان تیرویید استفاده میشد برای 73 مورد بدخیم و 12 مورد خوش خیم درست تشخیص داده میشدند. اما 7 مورد بدخیم و 68 مورد خوشخیم بهطور کاذب تشخیص داده میشدند. حساسیت و ویژگی این آزمایش بهترتیب 25/91 و 15 درصد بهدست بود (جدول 4).
اما اگر بررسی کمی بهعنوان ملاک تشخیصی قرار میگرفت بهترین نقطه مرزی برای افتراق تومورهای خوشخیم از بدخیم میزان بالاتر از 40 درصد هیپرمتیلاسیون در ژنRASSF1A بود و با این میزان نقطه مرزی تعداد 22 مورد بدخیم و 79 مورد خوشخیم درست تشخیص داده میشدند. اما 58 مورد بدخیم و یک مورد خوشخیم بهطور کاذب تشخیص داده میشدند. بنابراین حساسیت و ویژگی این آزمایش بهترتیب 5/27 و 75/98 درصد بهدست بود (جدول 4).
جدول4: نتایج صحت تشخیص تومورهای خوش خیم و بدخیم بر اساس بررسی کیفی و کمّی هیپر متیلاسیون ژن RASSF1A
|
متغیر |
نتایج کیفی هیپرمتیلاسیون تعداد/درصد |
نتایج کمی هیپرمتیلاسیون تعداد/درصد |
|
مثبت حقیقی منفی حقیقی مثبت کاذب منفی کاذب |
73 12 68 7 |
22 79 1 58 |
|
حساسیت ویژگی |
25/91% 15% |
5/27% 75/98% |
|
ارزش اخباری مثبت ارزش اخباری منفی صحت آزمایش |
77/51% 15/63% 12/53% |
65/95% 66/57% 12/6% |
بررسی بیان ژنFHL1
بیان در ژنFHL1 در گروه بدخیم برابر 50/0 درصد بود درحالیکه در گروه خوشخیم این میزان خیلی بالاتر بود (29/5 درصد) و تفاوت بین این دو گروه معنیدار بود (019/0=p). تجزیه و تحلیلROC نشان داد که این ژن برای افتراق بین دو گروه تومورهای خوش خیم و بدخیم تیرویید کارایی خوبی دارد (92/0=AUC).
اگر بررسی بیان ژنFHL1 بهعنوان ملاک تشخیصی قرار میگرفت بهترین نقطه مرزی برای افتراق دو نوع تومورهای خوش خیم از بدخیم میزان کمتر از 57/0 درصد بود و با این میزان نقطه مرزی تعداد 63 مورد بدخیم و 61 مورد خوشخیم درست تشخیص داده شدند. اما 17 مورد بدخیم و 19 مورد خوشخیم بهطور کاذب تشخیص داده شدند. بنابراین حساسیت و ویژگی این آزمایش بهترتیب 75/78 و 25/76 درصد بهدست آمد (جدول 5).
جدول5: نتایج صحت تشخیص تومورهای خوش خیم و بدخیم بر اساس بررسی بیان ژن FHL1
|
متغیر |
نتایج بیان تعداد / درصد |
|
مثبت حقیقی منفی حقیقی مثبت کاذب منفی کاذب |
63 61 19 17 |
|
حساسیت ویژگی |
75/78 % 25/76 % |
|
ارزش اخباری مثبت ارزش اخباری منفی صحت آزمایش |
82/76 % 76/80 % 5/77 % |
در تومورهای بدخیم یک همبستگی معکوس(431/0-r=) معنیدار در سطح 05/0 بین هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A با بیان نسبی ژن FHL1 وجود دارد. با توجه به اطلاعات جدول 6 مقدار حساسیت و ویژگی کلی استفاده همزمان (Simultaneously) دو تست DNAمتیلاسیون پروموتر ژنRASSF1A بهصورت کمی و کیفی و بیان ژن FHL1 در جدول 7 ارائه شده است.
جدول 6: خلاصه حساسیت و ویژگی تست هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A (کمی و کیفی) و تست بیان نسبی mRNAژن FHL1 بهطور جداگانه
|
بیان نسبی mRNA ژن FHL1 |
هیپرمتیلاسیون پروموترژن RASSF1A (کیفی) |
هیپرمتیلاسیون پروموترژن RASSF1A (کمی) |
|
|
75/78% |
25/91% |
5/27 % |
حساسیت تست |
|
25/76% |
15% |
75/98% |
ویژگی تست |
جدول 7: حساسیت و ویژگی کلی استفاده همزمان تست هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A (کمی و کیفی) و تست بیان ژن FHL1
|
استفاده همزمان تست هیپر متیلاسیون پروموتر ژنRASSF1A (کیفی) و تست بیان ژن FHL1
|
استفاده همزمان تست هیپر متیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A (کمی) و تست بیان ژن FHL1
|
|
|
2/98% |
32/79% |
حساسیت کلی استفاده همزمان دو تست |
|
47/39% |
29/75% |
ویژگی کلی استفاده همزمان دو تست |
بحث
تکامل و پیشرفت تومورهای تیرویید توسط انکوژنها و ژنهای سرکوبگر تومور کنترل میشوند که تنها تعداد معدودی از آنها تاکنون شناسایی شده اند (14، 15). ژن RASSF1A بهعنوان یک ژن سرکوبگر تومور است که در سال 2000 مشخص شد بیان آن با هیپرمتیلاسیون کنترل میشود. این ژن در انواع مختلفی از سلولهای بدن بیان میشود (16). فرم جهش یافته آن بهطور معنیداری باعث کاهش فعالیت توقف رشد سلولی میشود (17). بیان مجدد آن در انواع ردههای سلولی مانند پروستات و
ریه، باعث توقف رشد سلولی میشود (16، 17). عملکرد آن باعث توقف پیشرفت چرخه سلولی و جلوگیری از تجمع سیکلین D1 میشود (18). غیر فعال شدن آن در انواعی از تومورها منجمله ریه، پستان، کلیه، پروستات، تخمدان، کولون و تیرویید و دیگر سرطانها گزارش شده است (16، 19). هیپرمتیلاسیون این ژن موجب کاهش بیان پروتئین آن میشود (16، 20، 21). این ژن یکی از شایعترین ژنهای سرکوبگر تومور است که بهطور معمول در نئوپلاسمها دچار هیپرمتیلاسیون میشود (16،22).
در تحقیق حاضر بررسی کیفی هیپرمتیلاسیون ژنRASSF1A نشان داد که هم در تومورهای خوشخیم و هم بدخیم هیپرمتیلاسیون یافت میشود. فراوانی هیپرمتیلاسیون در تومورهای خوش خیم بیشتر بود اما در تومورهای بدخیم سطح کمی هیپرمتیلاسیون بالاتر بود. این نتایج تاییدکننده گزارشات قبلی مشابه است که عنوان کردهاند هیپرمتیلاسیون RASSF1A در هر دو نوع تومورهای خوش خیم و بدخیم تیرویید مشاهده میشود. در تحقیقی توسطXing و همکاران (20) که بر روی تومورهای تیرویید انجام شده بود مشخص شد که هیپرمتیلاسیون در هر دو گروه تومورهای خوشخیم و بدخیم مشاهده میشود. نتایج پژوهش حاضر با نتایج مطالعهNakamura و همکاران (23) نیز همخوانی دارد در نتایج آنها هیپرمتیلاسیون ژنRASSF1A در تومورهایPTC ، ATC وFA با فراوانی نسبتا یکسانی مشاهده شده بود. همچنین در مطالعهای دیگر روی تومورهای تیرویید، نتایج مشابهی بهدست آمده بود. در آن تحقیق با بررسی 22 مورد تومورهای خوش خیم و 22 مورد تومورهای بدخیم تیرویید بهاین نتیجه رسیده بودند که در 62 درصد مواردPTC ، 77 درصد مواردUTC ، 75 درصد موارد گواتر و 70 درصد موارد آدنوم فولیکولار هیپرمتیلاسیون ژن RASSF1A مشاهده شده بود (2).
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که در هر دو گروه تومورهای خوش خیم و بدخیم، هیپرمتیلاسیون ژن RASSF1A بهوفور مشاهده میشود و از این یافته میتوان چنین نتیجه گیری کرد که احتمالا هیپرمتیلاسیون در مراحل اولیه تومورزایی تیرویید رخ میدهد که تایید کننده نتایج بهدست آمده در تحقیقات قبلی است (23، 24). RASSF1A یک ژن سرکوبگر تومور است در اثر هیپرمتیلاسیون، احتمالا بیان پروتئین آن کاهش یافته و میزان تکثیر سلولی افزایش مییابد و سلولها بهسمت مراحل بعدی تومورزایی پیشرفت میکنند.
در بررسی هیپرمتیلاسیون توسط Schagdarsurengin و همکارانش بر روی نمونههای تیرویید؛ارتباط معنیداری بین هیپرمتیلاسیون ژن RASSF1A با سن شناسایی کرده بودند. یعنی با افزایش سن فراوانی هیپرمتیلاسیون هم بیشتر مشاهده شده بود (2) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. در بررسی هیپر متیلاسیون ژن RASSF1A در سلولهای اپیتلیال پستان نشان داده شده بود که سن میتواند باعث افزایش فراوانی هیپرمتیلاسیون در سلولهای اپیتلیال شود (25). بنابراین نتایج پژوهش حاضر تایید کننده این نظریه است که در افراد مسن احتمالا سرکوب بعضی از ژنهای سرکوبگر تومور مانندRASSF1A بهوسیله هیپرمتیلاسیون آنها را بیشتر مستعد ابتلا به سرطان تیرویید میکند.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که در ژن مورد بررسی برای هیپرمتیلاسیون ارتباط معنیداری با جنسیت بیماران نداشتند که تاییدکننده نتایج بهدست آمده از تحقیقات قبلی است و با آنها همخوانی دارد (26). نظر به اینکه سرطان تیرویید بیشتر در خانمها رخ میدهد و این تفاوت بروز باید علت و اساس مولکولی داشته باشد. در این بررسی نشان داده شد که تفاوتی در هیپرمتیلاسیون بین دو جنس در ژن بررسی شده وجود ندارد بنابراین میتوان از نتایج پژوهش حاضر چنین برداشت کرد که احتمالا هیپر متیلاسیون ژنRASSF1A عامل ایجاد تفاوت بروز سرطان تیرویید در دو جنس نیست.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بین تهاجم و متاستاز در تومورهای بدخیم تیرویید با هیپرمتیلاسیون ژنRASSF1A ارتباط معنیداری وجود ندارد که تاییدکننده نتایج مطالعاتSchagdarsurengin و Hu میباشد (26،2). عدم وجود ارتباط بین هیپرمتیلاسیون این ژنها با متاستاز و تهاجم را میتوان اینگونه تفسیر کرد که ژنهای درگیر در روند متاستاز و تهاجم در مراحل انتهایی تومورزایی درگیر هستند و سلولها را وادار به مهاجرت میکنند. اما ژن بررسی شده در پژوهش حاضر در تومورهای خوش خیم هم هیپرمتیلاسیون را نشان دادند بنابراین عملکرد احتمالی آنها در تومورزایی در همان مراحل اولیه است (24،23).
یکی از اهداف پژوهش حاضر این بود تا با بررسی وضعیت هیپر متیلاسیون ژن، بتوان از آن در افتراق تومورهای خوش خیم از بدخیم کمک گرفت. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که بررسی های کیفی برای این منظور قابل استفاده نیست. بهدلیل اینکه هیپرمتیلاسیون این ژن فقط مختص تومورهای بدخیم تیرویید نبوده و بهوفور در تومورهای خوش خیم هم دیده میشود و این از نقاط ضعف های بررسی هیپرمتیلاسیون بهعنوان یک نشان زیستی در تشخیص سرطانها است.
با بررسی سطح کمی هیپرمتیلاسیون بهتر از بررسی کیفی دو گروه تومورهای خوشخیم را از بدخیم افتراق داده شدند. چون در ژن بررسی شده سطح کمی هیپرمتیلاسیون در گروه بدخیم بالاتر از گروه خوشخیم بهدست آمد و با تعیین نقطهای مرزی برای ژن توانستیم تعدادی از تومورهای بدخیم را از خوش خیم افتراق دهیم. با وجود این در تعدادی از تومورهای بدخیم این کار عملی نبود.
در تحقیق حاضر مشخص شد که بیان نسبی mRNA ژنFHL1 در تومورهای بدخیم خیلی کمتر از خوش خیم بود و این تفاوت در سطح 019/0= معنیدار بود بهطوریکه شاید بتواند بهعنوان یک نشان زیستی برای افتراق تومورهای بدخیم از خوشخیم تیرویید قابل استفاده شود. این نتیجه تایید کننده گزارشFryknas و همکارانش است. در مطالعه آنها برای شناسایی نشانهای زیستی جدید برای افتراق تومورهای بدخیم از خوش خیم فولیکولار تیرویید که با روش میکروآرری انجام داده بودند چندین ژن را معرفی کرده بودند و بهترین این ژنها، FHL1 معرفی شده بود که بیان mRNA آن در تومورهای بدخیم فولیکولار تیرویید نسبت به خوشخیم کاهش می یافت (11).
مطالعه Fryknas و همکاران تنها مطالعهای بود که بر روی تیرویید انجام شده بود. اما چندین مطالعه دیگر بر روی انواع مختلف سرطانها از جمله پروستات، کلیه، پستان (27)، معده (28) و کبد (11) نشان دادهاند که در تمام این نوع سرطانها بیان mRNA این ژن در تومورهای بدخیم نسبت به گروه خوشخیم و بافت طبیعی کاهش بیان دارد و بهعنوان یک نشان زیستی خوب برای تشخیص بدخیمیها معرفی شده بود. محصول ژنFHL1 از رشد سلولهای سرطانی جلوگیری میکند بنابراین با کاهش بیان، باعث افزایش رشد سلولها میشود. اگر چه نقش دقیق آن در تکامل سلولهای سرطانی هنوز مشخص نشده است (27).
نتیجهگیری
از این نتایج میتوان چنین نتیجهگیری کردکه: استفاده همزمان تست هیپرمتیلاسیون پروموتر ژن RASSF1A بهصورت کیفی و تست بیان ژن FHL1 جهت تشخیص افتراقی تومورهای خوشخیم از پاپیلاری کارسینومای تیروئید حساسیتبالاتری دارد. همچنین بررسی همبستگی بین هیپرمتیلاسیون با بیان نسبی mRNA نشان داد که هیپرمتیلاسیون ژن RASSF1A یک همبستگی منفی با بیان نسبی mRNA داشت وافزایش هیپرمتیلاسیون در ژنRASSF1A احتمالا موجب کاهش بیانFHL1 میشود و احتمالا این کاهش بیان بهوسیله هیپرمتیلاسیون در پروموتر ژنFHL1 ایجاد میشود. یعنی کاهش بیان RASSF1A با کاهش بیانFHL1 هماهنگ است. بنابراین توصیه میشود که ارتباط هیپرمتیلاسیون بین دو ژنRASSF1A باFHL1 در تحقیقات بعدی مورد بررسی بیشتری قرار گیرد.
1. Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Neyman N, et al. Editors.SEER Cancer Statistics Review, 1975- 2009 (Vintage 2009 Populations), National Cancer Institute [Internet]. 2012 Apr [cited 2018 Jan 15].
2. Tuttle RM, Ball DW, Byrd D, Dilawari RA, et al. NationalComprehensive Cancer Network. Thyroid carcinoma. J Natl Compr Canc Netw. 2010; 8(11): 1228-74.
3.Taghavi Kojidi H, Farzadfar F, Peykari N, Larijani B, et al. A comprehensive study on national and sub national trend in thyroid cancer prevalence in the Iranian population, 1990-2010. Iran J Diabetes Metab. 2016; 15(2): 91-100.
4. Lee, JH, Lee ES, Kim YS. Clinicopathologic significance of BRAF V600E mutation in papillary carcinomas of the thyroid: a meta-analysis. Cancer. 2007; 110(1): 38-46.
5. Kebebew E, Peng M, Reiff E, Duh QY, et al. Diagnostic and prognostic value of angiogenesis-modulating genes in malignant thyroid neoplasms. Surgery. 2005; 138: 1102-9; discussion 1109-10.
- 6. Dammann RC, Li JH, Yoon PL, Chin S, et al. Pfeifer, Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000. 25(3): 315-9.
7. Shivakumar L, Minna J, Sakamaki T, Pestell R, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1accumulation. Mol Cell Biol. 2002; 22: 4309-18.
8. Nakamura N, Carney JA, Jin L, Kajita S, et al. Rassfia and noreia methylation and BRAFV600E mutations in thyroid tumors. Lab Invest. 2005; 85(9): 1065-75.
9. Pfeifer GP, Dammann R. Methylation of thetumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Mosc), 2005; 70(5): 576-83.
10. Ding L, Wang Z, Yan J, Yang X, et al. Human four-and-a-half LIM family members suppress tumor cell growth through a TGF-beta-like signaling pathway. J ClinInvest. 2009; 119: 349-61.
11. Fryknas MU, Wickenberg-Bolin H, Goransson MG, et al. Molecular markers for discrimination of benign and malignant follicular thyroid tumors. Tumour Biol, 2006; 27(4): 211-20.
12. Asa SL. The role of immunohistochemical markers in the diagnosis of follicular-patterned lesions of the thyroid. Endocr Pathol. 2005; 16(4): 295-309.
13. Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997; 25(12): 2532-4.
14. Soares P, Maximo V, Sobrinho-Simoes M. Molecular pathology of papillary, follicular and Hurthle cell carcinomas of the thyroid. Arkh Patol, 2003; 65: 45-7.
15. Segev DL, Umbricht C, Zeiger MA. Molecular pathogenesis of thyroid cancer. Surg Oncol. 2003; 12(2): 69-90.
16. Dammann R, Li C, Yoon JH, Chin PL, et al. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000; 25(3): 315-9.
17. Dreijerink K, Braga E, Kuzmin I, Geil L, et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(3): 7504-9.
18. Shivakumar LJ, Minna T, Sakamaki R, Pestell R, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1accumulation. Mol Cell Biol. 2002; 22(12): 4309-18.
19. Schagdarsurengin UO, Gimm C, Hoang-Vu H, Dralle GP, et al. Frequent epigenetic silencing of the CpG island promoter of RASSF1A in thyroid carcinoma. Cancer Res. 2002; 62(13): 3698-701.
20. Xing M, Cohen Y, Mambo E, Tallini G, et al. Early occurrence of RASSF1A hypermethylation and its mutual exclusion
with BRAF mutation in thyroid tumorigenesis. Cancer Res. 2004; 64(5): 1664-8.
21. Ruebel KH, Jin L, Qian X, Scheithauer BW, et al. Effects of DNA methylation on galectin-3 expression in pituitary tumors. Cancer Res. 2005; 65(4): 1136-40.
22. Burbee DG, Forgacs E, Zochbauer-Muller S, Shivakumar L, et al. Epigenetic inactivationof RASSF1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression. J Natl Cancer Inst. 2001; 93(9): 691-9.
23. Nakamura N, Carney JA, Jin L, Kajita S, et al. RASSF1A and NORE1A methylation and BRAFV600E mutations in thyroid tumors. Lab Invest. 2005; 85(9): 1065-75.
24. Trovisco V, Soares P, Sobrinho-Simoes M. B-RAF mutations in the etiopathogenesis, diagnosis, and prognosis of thyroid carcinomas. Hum Pathol. 2006; 37(7): 781-6.
25. Sakashita K, Mimori K, Tanaka F, Kamohara Y, et al. Clinical significance of loss of Fhl1 expression in human gastric cancer. Ann Surg Oncol. 2008; 15(8): 2293-300.
26. Hu S, Liu D, Tufano RP, Carson KA, et al. Association of aberrant methylation of tumor suppressor genes with tumor aggressiveness and BRAF mutation in papillary thyroid cancer. Int J Cancer. 2006; 119(10): 2322-9.
27. Strunnikova M, Schagdarsurengin U, Kehlen A, Garbe JC, et al. Chromatin inactivation precedes de novo DNA methylation during the progressive epigenetic silencing of the RASSF1A promoter. Mol Cell Biol. 2005; 25(10): 3923-33.
28. Ding L, Wang Z, Yan J, Yang X, et al. Human four-and-a-half LIM family members suppress tumor cell growth through a TGF-beta-like signaling pathway. J Clin Invest. 2009; 119(2): 349-61.
)