مقدمه

صحت تمامیت ژنتیکی سلول‫ها از جمله دلایل اصلی سلامت انسان است. ناهنجاری‫های کروموزومی به اشکال تعدادی و ساختاری به درجات مختلف زندگی ما را تحت تاثیر مخرب خود قرار می‫دهند. جدا از تاثیر آن‫ها در تولد نوزادان ناهنجار می‫توان به تاثیر عمیق آن‫ها در ایجاد سرطان اشاره کرد. امروزه ارتباط بین صدمات کروموزمی و سرطان در مطالعات متعددی بررسی و پیشنهاد شده است (1). بیشتر سلول‫های سرطانی حاوی انواعی از ناهنجاری‫های کروموزومی اعم از ساختاری و تعدادی از نوع آنیوپلوئیدی بوده که در سلول‫های طبیعی بسیار نادرند (2 و 3). سیر تکوینی سلول­های سرطانی از حالت خوش خیم به‫حالت تهاجمی با افزایش آنیوپلوئیدی ارتباط دارد (4). به‫هم خوردن تعادل کروموزمی با تاثیر عمیق خود بر نظم بیان ژنی سلول باعث تغییراتی در زمان و میزان ساخت پروتئین های دخیل در کنترل تقسیمات سلولی و همچنین پروتئین‫های مرتبط با تعمیر DNA می‫شود که نتیجه آن با گذشت زمان عدم کنترل صحیح سلول بر تقسیمات و ایجاد سلول‫های سرطانی خواهد بود (5).

جهت شناخت و مبارزه بهتر با سرطان، امروزه تمرکز بر یافتن عواملی ست که در ایجاد صدمات کروموزومی نقش اساسی ایفا می کنند. از این میان، تاثیر شرایط محیطی و نقش آن بر روند سلامت جسمی و کروموزومی انسان موضوعی غیر قابل انکار است (6). از جمله عوامل محیطی که تاثیرات مخرب سلولی و بافتی آن مورد شک و بررسی است می‫توان به امواج الکترومغناطیسی که ما را به اشکال مختلف احاطه کرده‫اند، اشاره نمود.

طیف امواج الکترومغناطیس (0 Hz ­- 300 GHz) به‫دو دسته تقسیم می­شوند: پرتوهای یونیزه کننده، مانند پرتو x، اشعه گاما و فرابنفش و پرتوهای غیر یونیزه کننده، مانند فرکانس­های رادیویی مربوط به تلفن­های همراه، تجهیزات وایرلس و امواج با فرکانس بسیار پایین (7) مطالعات متعددی تاثیر میدان‫های الکترومغناطیس را بر ایجاد صدمات کروموزومی از نوع ساختاری و تعدادی نشان می‫دهند. سلول‫های در معرض میدان‫های الکترومغناطیس تابش شده از منابعی مانند نمایش‫گرهای رایانه‫ای و یا تلفن‫های همراه افزایش معنی‫داری از صدمات کروموزومی را نشان داده اند (8-11)

اگرچه تاثیر مستقیم میدان های الکترومغناطیس بر ایجاد صدمات کروموزومی بررسی شده، اما تا‫کنون نقش آن‫ها در ایجاد شرایط مناسب برای تاثیر عمیق تر سایر عوامل با توانایی القای صدمات به سیستم کروموزومی سلول‫ها به‫درستی مورد مطالعه قرار نگرفته است. در این مطالعه تاثیر هم‫زمان امواج الکترومغناطیس غیر یونیزان در محدوده امواج تلفن‫های همراه و یک عامل آنیوژن شناخته شده به‫نام وین بلاستین در ایجاد و یا ترغیب سلول به آنیوپلوئیدی بر روی سلول­های L929 بررسی شد.

در انجام این مطالعه جهت بررسی صدمات کروموزومی احتمالی از آزمون میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته‫ای استفاده شد. این آزمون از روش‫های بسیار رایج در مطالعات بررسی صدمات القایی کروموزومی می‫باشد. برای انجام آن، سلول‫های در محیط کشت با استفاده از سایتوکالاسین-b در مرحله سیتوکینز از تقسیم سلولی متوقف می شوند که نتیجه آن سلول‫های دارای دو هسته مستقل در یک سیتوپلاسم مشترک می‫باشد. تاثیر عامل مورد مطالعه بر جاماندن یک کروموزوم کامل یا شکستن و جاماندن بخشی از کروموزوم از محاسبه فراوانی سلول‫های دو هسته ای دارای هسته‫های کوچک در کل سلول‫های دو هسته ای براحتی قابل بررسی خواهد بود (12).

مواد و روش‫ها

کشت سلولی: در این پژوهش از رده سلولی L929 خریداری شده از انستیتو پاستور تهران استفاده شد. سلول‫ها در محیط DMEM LG با 10 درصد FBS و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد CO₂ کشت شدند (13).

تیمار با وین‌بلاستین: جهت تعیین غلظت مناسب وین‌بلاستین، سه غلظت نهایی 5/0، 5/1 و ng/ml 2 از وین‌بلاستین به‫مدت 24 ساعت در دو محیط کشت موازی به محیط سلولی اضافه ‌شدند. محاسبه صدمات کروموزومی ناشی از تمیار با وین بلاستین با روش آزمون میکرونوکلئوس و سمیت ناشی از تیمار با وین بلاستین با استفاده از روش MTT صورت پذیرفت.

تیمار سلول‌ها با میدان الکترومغناطیسی و وین‌بلاستین: جهت تولید میدان الکترومغناطیس از دستگاه ایجاد میدان ساخت دانشکده مهندسی دانشگاه فردوسی مشهد، گروه برق و الکترونیک استفاده شد. امواج الکترومغناطیس در این دستگاه توسط دو آنتن به ارتفاع پنج سانتیمتر و فاصله ده سانتیمتر از یکدیگر تولید می‫شود. برای بررسی تاثیر میدان الکترومغناطیس فلاسک‌های سلولی T25 در میدانی با طول موج    MHz 900 با فاصله مساوی از هر دو آنتن قرار گرفتند.

سلول‫ها به مدت 24 ساعت تحت تیمار ng/ml 5/1 از وین بلاستین قرار گرفتند. سلول‫های تیمار شده در دو ساعت پایانی به‫همراه سلول‫های تیمار نشده، تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس ثابت و منقطع قرارداده شدند. جهت تولید میدان منقطع دستگاه در فواصل 15 دقیقه‫ای روشن و خاموش گردید. در پایان این زمان محیط آن‫ها با محیط کشت حاوی سایتوکالاسین-b با غلظت نهایی g/mlµ4 تعویض شد.

برداشت سلولی: برداشت سلولی 24 ساعت پس از افزودن سایتوکالاسین-b و بر اساس روش پیشنهادی Fenech  با کمی تغییر صورت پذیرفت. سلول‫های برداشت شده پس از تیمار با محلول هایپوتونیک KCL( 56/0 درصد) دو بار با فیکساتور متانول: اسید استیک       (1:9) شستشو شده و سپس قطراتی از سوسپانسیون سلولی بر روی لام‫های تمیز چکانده شد. لام‫های آماده و خشک در محلول 10 درصد گیمسا برای مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شده و سپس آبکشی شدند.

شمارش میکرونوکلئوس‌ها: لام‌های تهیه شده، زیر میکروسکوپ نوری Olympus BH-2 با بزرگ‫نمایی 1000X بررسی شدند. بر روی هر لام سلول‌های تک هسته (Mono)، دو هسته (Bi) و دو هسته‌ای دارای میکرونوکلئوس( MnBi) شمارش شدند. در این مطالعه از هر محیط کشت تعداد حداقل دو لام، و از هر لام حداقل 300 سلول دوهسته‌ای شمارش ‌شد. فراوانی سلول‌های دو هسته‌ای (Binary index) در کل سلول‫های شمارش شده (Mono+Bi)، و فراوانی سلول‌های دو هسته‌ای دارای میکرونوکلئوس(%MnBi) در کل سلول‫های دوهسته ای (Bi) محاسبه شد.

آزمون MTT پس از تیمار سلول‌ها با میدان الکترومغناطیسی و وین‌بلاستین: سلول‫های تیمار شده با وین بلاستین و سه حالت میدان منقطع، پیوسته و خاموش، در ظروف کشت 96 خانه‌ای در 200 میکرولیتر محیط کشت، کشت داده ‌شدند. در زمان های 24، 48 و 72 ساعت پس از پایان هر تیمار به‫هر یک چاهک‫های کشت نمک تترازولیوم با غلظت نهایی 500 میکرولیتر بر میلی‫لیتر اضافه شد. سلول‫ها ی زنده این نمک بی‫رنگ را به مشتقات آبی رنگ فورمازان احیا کرده که نمایانگر حیات سلولی است. پس از گذشت 4 تا 6 ساعت محیط کشت تخلیه و به سلول‫ها معادل حجم محیط کشت، محلول DMSO اضافه شد. جذب نوری هر یک از چاهک ها در طول موج nm545 نانومتر دستگاه ELISA reader خوانده ‌شد و با حالت غیر تیمار مقایسه شد.

آنالیز آماری

نتایج این آزمایش با استفاده از نرم افزارMinitab 14  برای آزمون آنالیز واریانس یک‫طرفه (ANOVA) بررسی شد. مقایسه میانگین‫ها در نرم افزار SPSS 11 و توسط تست آماری Tucky در سطح معنی‫داری p

نتایج

استفاده از سیتوکالازین-b با جلوگیری از تقسیم سیتوپلاسم در سلول‫های در حال تقسیم، سبب ایجاد سلول‫های دو هسته‌ای می‌‫شود (شکل 1:A). هر گونه صدمه کروموزومی اعم از جاماندن و یا شکستگی‫های کروموزومی در این سلول‫ها به‫صورت میکرونوکلئوس درون سیتوپلاسم قابل مشاهده خواهد بود (‫شکل 1:B).

شکل 1: A) سلول دو هسته‫ای نتیجه تیمار با سیتوکالازین-b، B) سلول دو هسته‫ای دارای میکرونوکلئوس

بررسی اثر وین‌بلاستین بر روی سلول‌های L929 نتایج حاصل از شمارش سلولی در تیمارهای با غلظت‫های مختلف وین بلاستین در جدول 1 آمده است. تیمار سلول‫ها با وین بلاستین در غلظت های مختلف در این آزمایش فقط در بالاترین غلظت به‫کار رفته (ng/ml 2)، باعث کاهش معنی‫دار در شاخص تقسیم سلولی شده است ( p<0.05). همچنین نتایج بیانگر افزایش معنی‫دار          (p<0.05) در فراوانی میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته‫ای در دو غلظت ng/ml 5/1 و 2 وین بلاستین است که بیانگر افزایش صدمات کروموزومی در این سلول‫ها است.

جدول 1: فراوانی میکرونوکلئوس و شاخص تقسیم (‫BI) کنترل و گروه‌های تیمار شده با وین‌بلاستین.

نتایج حاصل از آزمون MTT پس از تیمار با غلظت‌های مختلف وین‌بلاستین

 جهت نشان دادن تاثیر کشندگی احتمالی تیمار 24 ساعته وین بلاستین در سه غلظت 5/0، 5/1 و ng/ml 2، و در زمان های 24، 48 و 72 ساعت پس از پایان تیمار از آزمون MTT استفاده شد. نتایج (شکل 2) نشان می‫دهد که وین بلاستین در 3 غلظت مورد بررسی تاثیری معنی‫داری بر روی بقا سلول‌ها ندارد که بیانگر عدم سمیت وین بلاستین در این سه غلظت است. جهت انجام مراحل بعدی آزمایش از کمترین غلظت وین بلاستین که توانایی ایجاد آسیب کروموزومی را نشان داد ( ng/ml 5/1) استفاده شد.

شکل 2: تاثیر غلظت‌های مختلف وین‌بلاستین بر روی بقا سلولی. داده‌ها نشان‫دهنده میانگین 3 بار تکرار به همراه SD می‌باشند.

نتایج حاصل از تیمار سلولی با میدان الکترومغناطیسی ثابت و منقطع

 نتایج حاصل از بررسی سلولی پس از تیمار با میدان الکترومغناطیس ثابت و منقطع به‫مدت دو ساعت، در جدول 2 آمده است. نتایج نشان می‫دهد که تیمار سلول‫ها با میدان الکترومغناطیس در هر دو حالت ثابت و منقطع تاثیرمعنی‫داری در میزان تقسیم سلولی نداشته است. درحالی‫که فراوانی میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته‫ای تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس به‫طور معنی‫داری بیشتر از کنترل و سلول‫های میدان خاموش است (p<0.05).  همچنین نتایج نشان می‫دهند که تیمار سلول‫ها با میدان الکترومغناطیس منقطع باعث افزایش بیشتری در فراوانی میگرونوکلئوس در مقایسه با میدان ثابت شده است (p<0.05).

نتایج حاصل از تیمار سلولی با میدان الکترومغناطیسی و وین‌بلاستین

 تیمار هم‫زمان سلول‫های L929 با وین بلاستین به‫همراه میدان الکترومغناطیس ثابت و منقطع باعث افزایش معنی‫دار فراوانی میکرونوکلئوس در مقایسه با کنترل شده است( p<0.05). مقایسه تمام حالات تیمار شده با میدان الکترومغناطیس به‫دو شکل منقطع و ثابت و همچنین حالات تیمار شده هم‫زمان میدان و وین بلاستین نشان می دهد که در تمامی حالات فراوانی میکرونوکلئوس القا شده تفاوت معنی‫داری با حالت تیمار با وین بلاستین به‫تنهایی ندارند (جدول 2).

جدول2: نتایج حاصل از تاثیر میدان های الکترومغناطیس منقطع و ثابت در حضور و عدم حضور وین بلاسیتن با غلظت ng/ml 5/1

در حالی‫که سلول‫های تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس ثابت به‫تنهایی فراوانی کمتری از میکرونوکلئوس را در مقایسه با سایر تیمارها نشان می‫دهند (p<0.05). در تمامی حالات شاخص تقسیم تغییر معنی‫داری را با کنترل نشان نمی‫دهد.

نتایج حاصل از آزمون MTT پس از تیمار با میدان الکترومغناطیسی و وین‌بلاستین

جهت بررسی اثر سمی میدان الکترومغناطیس و وین بلاستین با غلظت ng/ml 5/1 بر روی سلول‫های L929، در زمان های 24، 48 و 72 ساعت آزمون MTT انجام شد. نتایج این آزمون در تیمارهای مختلف با وین بلاستین و میدان الکترومغناطیس در شکل 3 آمده است. نتایج نشان می‫دهد تیمارهای منفرد و ترکیبی تغییری در توان زندگی سلول‫ها در مقایسه با سلول‫های کنترل ایجاد نکرده است.

شکل3: نمودار بقای سلولی الف) پس از تیمار با میدان الکترومغناطیسی خاموش و وین‌بلاستین، ب) پس از تیمار با میدان الکترومغناطیسی پیوسته و وین‌بلاستین و ج) پس از تیمار با میدان الکترومغناطیسی منقطع و وین‌بلاستین در بازه‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت. (داده‌ها نشان دهنده میانگین 3 بار تکرار در هر تیمار به‫همراه SD است).

بحث

امروزه سرطان به‫عنوان یک بیماری با منشا ژنتیکی، از جمله مشکلات جدی است که سلامت بشر را به‫شدت تهدید می‫کند (14). مطالعات متعددی، نقش مهم آنیوپلوئیدی را در سرطانی شدن سلول‫های سالم پیشنهاد می‫کنند (15 و 16) آنیوپلوئیدی نتیجه عدم تفکیک صحیح کروموزومی در تقسیمات سلولی است. با توجه به نقش و اهمیتی که آنیوپلوئیدی در بیماری سرطان دارد شناسایی عوامل موثر در شروع و پیشرفت آن نیز امری ضروری است. در مطالعه حاضر رابطه میدان الکترومغناطیسی با طول موج نزدیک به امواج تلفن‫های همراه( MHz 900) در ایجاد شرایط مناسب جهت وقوع آنیوپلوئیدی، به‫همراه تیمار با وین بلاستین بر روی سلول‌های L929 مورد مطالعه قرار گرفت.

وین بلاستین از جمله آلکالوئیدهای وینکا بوده که خاصیت آنیوژنیک آن با مطالعات متعدد مورد تایید و بررسی قرار گرفته است. در مطالعات صورت پذیرفته تیمار سلول‫های در محیط کشت با دوزهای حتی پایین این دارو باعث افزایش صدمات تعدادی کروموزومی از قبیل جاماندن و یا مهاجرت همزمان کروموزومی شده است (17 و 18). در مطالعه حاضر نیز تیمار سلول‫های L929 با دوز‫های غیر کشنده وین بلاستین باعث افزایش فراوانی میکرونوکلئوس در سلول‫های تیمار شده شد. با توجه به توانایی آنیوژنیک قوی وین بلاستین، می‫توان انتظار داشت که این افزایش فراوانی به‫دلیل اختلال در مهاجرت کروموزوم‫ها در هنگام تقسیمات سلولی بوده و نتیجه جاماندن کروموزوم کامل است. تیمار رده سلولی Luc2 با غلظت‫های مختلف وین بلاستین باعث افزایش فراوانی میکرونوکلئوس‫های دارای کینه توکور می‫شود که نشان‫دهنده افزایش جاماندن کروموزوم ها در هنگام تقسیم سلولی است (19). وین بلاستین با ایجاد اختلال در ساختار میکروتیوبول‫های دوک تقسیم باعث قطع ارتباط کروموزوم ها با رشته های دوک و افزایش صدمات تعدادی کروموزومی در سلول می‫شود (20).

در ارتباط با توانایی میدان های الکترومغناطیس با طول موج پایین ساطع شده توسط تلفن‫های همراه در ایجاد صدمات کروموزومی نتایج متفاوتی وجود دارد (21 و 22). در مطالعه حاضر تیمار سلول‫های L929 در میدان الکترومغناطیس با طول موج مشابه طول موج تلفن‫های همراه سبب افزایش صدمات کروموزومی به‫صورت افزایش فراوانی میکرونوکلئوس شد. این امواج اثرات تخریبی خود را به کروموزوم‫ها از سه طریق: تاثیرات حرارتی، تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن و تغییر فرآیند ترمیم DNA به‫جا می‫گذارند (23). در این بررسی، میدان الکترومغناطیس منقطع باعث افزایش فراوانی میکرونوکلئوس‫های القایی در مقایسه با میدان الکترومغناطیس ثابت با شدت و طول موج مشابه شد. تاثیر جدی تر میدان الکترومغناطیس منقطع بر تمامیت ژنتیکی سلول می‫تواند به‫دلیل ایجاد نوسانات بسیار کوچک القایی بر DNA که سبب از هم گسیختگی ساختاری آن می‫شود و یا بر اثر القای تغییرات بر محیط اطراف ماده ژنتیکی با تاثیر مخرب بر روی ملکول DNA باشد (24).

هم‫چنان‫که از نتایج مشخص است، تیمار هم‫زمان سلول‫ها با وین بلاستین در میدان الکترومغناطیس منقطع باعث افزایش بیشتر فراوانی صدمات کروموزومی نسبت به سلول‫های تیمار شده فقط با وین بلاستین، نشده است. بررسی ها نشان می‫دهد سلول‫های تیمار شده در میدان الکترومغناطیس به‫دلیل القای صدمات سلولی در مرحله S از چرخه سلولی، متوقف می‫شوند (25) این توقف ممکن است ناشی از صدمه به سیستم سنتزی DNA و یا تعمیری آن باشد و یا در اثر اختلال در حرکت چنگال همانند سازی به‫دلیل بریدگی‫های در رشته‫های DNA ایجاد شده باشد (25). توقف و یا اختلال در حرکت سلول درون چرخه سلولی غیر مستقیم باعث عدم توانایی وین بلاستین در ایجاد صدمات اختصاصی خود که القای آنیوپلوئیدی است خواهد شد. لازمه مشاهده میکرونوکلئوس های ناشی از جاماندن کروموزومی حرکت و عبور سلول از فاز تقسیم است. اختلال و توقف در مرحله S باعث کاهش در فراوانی میکرونوکلئوس‫های القایی توسط وین بلاستین می‫شود. به‫نظر می رسد تاخیر حرکت سلول‫ها در چرخه سلولی در آن‫هایی که با میدان الکترومغناطیس منقطع تیمار شده اند بیشتر از سلول‫های تیمار شده با میدان الکترومغناطیس ثابت باشد. چراکه گروه دوم سلولی تیمار شده با وین بلاستین افزایش معنی‫داری در فراوانی میکرونوکلئوس نسبت به‫حالتی که فقط تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس قرار گرفته اند را نشان می‫دهد. مشابه این نتیجه در کشت لنفوسیت‌های انسانی و یا در اووسیت‌های موشی نیز مشاهده شده و نشان داده شده است که تیمار با وین‌بلاستین اثر میدان الکترومغناطیسی پیوسته را تقویت کرده و باعث افزایش میکرونوکلئوس‌ها می‌شود (26 و 27).

براساس نتایج حاضر به نظر می‫رسد میدان‫های الکترومغناطیس با فرکانس معادل امواج موبایل قابلیت ایجاد صدمات کروموزومی را به سلول در شرایط آزمایش شده دارا می‫باشند. نتایج حاضر توسط مطالعات مشابه دیگری در شرایط in vitroو in vivo تایید شده‫اند (22 و 25). اگرچه خلاف این نتایج نیز گزارش شده است (28). تفاوت‫ها ممکن است به‫دلیل تفاوت در نحوه انجام آزمایش و یا نوع سلول‫های به‫کار رفته باشد.

نتیجه گیری

میدان الکترومغناطیس با شدت مشابه امواج تلفن‫های همراه، در شرایط آزمایشگاهی طراحی شده، توانایی القای صدمات کروموزومی به رده سلولی L929 را دارد. از دو میدان الکترومغناطیس منقطع و پیوسته، میدان منقطع صدمات بیشتری را به مجموعه کروموزومی سلول‫های مورد بررسی وارد نموده است. تیمار هم‫زمان سلول‫های تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس با وین بلاستین باعث افزایش صدمات کروموزومی القایی نشده است.

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل پایان‌نامه با عنوان "بررسی تاثیر امواج الکترومغناطیس با فرکانس پایین در ایجاد آنیوپلوئیدی القایی با وین بلاستین در سلول‫های L929 با استفاده از روش آزمون میکرونوکلئوس در سلول‫های دو هسته ای" در مقطع کارشناسی ارشد با کد 31515/3 است که با حمایت دانشگاه فردوسی مشهد اجرا شده است.

منابع

1. Grade M, Difilippantonio MJ, Camps J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors, in Chromosomal Instability in Cancer Cells. 2015; Springer. p. 115-142.

2. Mandrioli, D, et al. Aneuploidy: a common and early evidence-based biomarker for carcinogens and reproductive toxicants. Environ Health, 2016. 15(1): 97.

3. Pihan GA. Centrosome dysfunction contributes to chromosome instability, chromoanagenesis, and genome reprograming in cancer. Frontiers in oncology. 2013; 3: 277.

4. Siegel JJ, Amon A. New insights into the troubles of aneuploidy. Annual review of cell and developmental biology. 2012; 28(1): 189-214.

5. Nicholson JM, Duesberg P. On the karyotypic origin and evolution of cancer cells. Cancer genetics and cytogenetics, 2009; 194(2): 96-110.

6. Hassold T, Hall H, Hunt P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human molecular genetics, 2007; 16(R2): R203-R208.

7. Elwood JM. A critical review of epidemiologic studies of radiofrequency exposure and human cancers.

Environmental Health Perspectives. 1999;107(Suppl 1): 155.

8. Crumpton MJ, Collins AR. Are environmental electromagnetic fields genotoxic? DNA repair, 2004; 3(10): 1385-1387.

9 . Carbonari K, et al. Increased micronucleated cell frequency related to exposure to radiation emitted by computer cathode ray tube video display monitors. Genetics and Molecular Biology. 2005; 28(3): 469-474.

10. Mashevich M, et al. Exposure of human peripheral blood lymphocytes to electromagnetic fields associated with cellular phones leads to chromosomal instability. Bioelectromagnetics. 2003; 24(2): 82-90.

11. Mazor R, et al. Increased levels of numerical chromosome aberrations after in vitro exposure of human peripheral blood lymphocytes to radiofrequency electromagnetic fields for 72 hours. Radiation research. 2008; 169(1): 28-37.

12. Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2000; 455(1): 81-95.

13. Ozdemir KG, Yılmaz H, Yılmaz S. In vitro evaluation of cytotoxicity of soft lining materials on L929 cells by MTT assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2009; 90(1): 82-86.

14. Jemal A, et al. Global cancer statistics. CA: a cancer journal for clinicians. 2011; 61(2): 69-90.

15. Li R, et al. Aneuploidy vs. gene mutation hypothesis of cancer: recent study claims mutation but is found to support aneuploidy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000; 97(7): 3236-3241.

16. Duesberg P, et al. Aneuploidy and cancer: from correlation to causation, in Infection and inflammation: impacts on oncogenesis. 2006; Karger Publishers. 16-44.

17. Huber R, et al. Detection of centromeres in vinblastine and radiation induced micronuclei of human lymphocytes using FISH with an α satellite pancentromeric DNA probe. Environmental and molecular mutagenesis. 1996; 27(2): 105-109.

18. Marshall RR, et al. Fluorescence in situ hybridisation with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 1996; 372(2): 233-245.

19. Lynch A, Parry J. The cytochalasin-B micronucleus/kinetochore assay in vitro: studies with 10 suspected aneugens. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 1993; 287(1): 71-86.

20. Wendell  KL, Wilson L, Jordan MA. Mitotic block in HeLa cells by vinblastine: ultrastructural changes in kinetochore-microtubule attachment and in centrosomes. Journal of Cell Science. 1993; 104(2): 261-274.

21. RosLlor I, et al. Effect of mobile phones on micronucleus frequency in human exfoliated oral mucosal cells. Oral diseases. 2012; 18(8): 786-792.

22. Daroit NB, et al. Cell phone radiation effects on cytogenetic abnormalities of oral mucosal cells. Brazilian oral research. 2015; 29(1): 1-8.

23. Ruediger HW. Genotoxic effects of radiofrequency electromagnetic fields. Pathophysiology. 2009; 16(2): 89-102.

24. Davies E, et al. A weak pulsed magnetic field affects adenine nucleotide oscillations, and related parameters in aggregating Dictyostelium discoideum amoebae. Bioelectrochemistry and bioenergetics. 1999; 48(1): 149-162.

25. Mihai CT, et al. Extremely low-frequency electromagnetic fields cause DNA strand breaks in normal cells. Journal of Environmental Health Science and Engineering. 2014; 12(1): 15.

26. Mailhes JB, et al. Electromagnetic fields enhance chemically-induced hyperploidy in mammalian oocytes. Mutagenesis. 1997; 12(5): 347-351.

27. Verheyen G, et al. Effect of coexposure to 50 Hz magnetic fields and an aneugen on human lymphocytes, determined by the cytokinesis block micronucleus assay. Bioelectromagnetics. 2003; 24(3): 160-164.

28. Bourthoumieu S, et al. Aneuploidy studies in human cells exposed in vitro to GSM-900 MHz radiofrequency radiation using FISH. Int J Radiat Biol. 2011; 87(4): 400-8.