نویسندگان
1 گروه علوم جانوری، دانشکده‌ی علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
2 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده‌ی علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
3 گروه زیست شناسی، دانشکده‌ی علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران
4 گروه زیست شناسی، دانشکده‌ی علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
5 گروه بیوتکنولوژی سلولی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، پژوهشکده‌ی زیست فناوری جهاد دانشگاهی، پژوهشگاه رویان، اصفهان، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر Resveratrol (RSV) بهعنوان یک پلیفنول طبیعی دارای اثرات بیولوژیکی مختلف، بر تکثیر و توانایی تشکیل کلنی سلولهای بنیادی جنینی انسانی (hESCs)منفرد شده میباشد.
مواد و روشها: در مطالعهی حاضر از ردهی hESCsبهنام RH6 استفاده شد. سلولها بر ماتریژل و در محیط غنی شدهی اختصاصی hESCs کشت شدند. میزان تکثیر سلولی با استفاده از روش شمارش سلولی و تکنیک الحاقی BrdU سنجیده شد. میزان بیان عوامل دخیل در تشکیل کلنی (E-cadherinو (β-catenin با استفاده از وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت و مکان قرارگیری β-catenin نیز با رنگ آمیزی ایمنوسیتوشیمی بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان دادند که RSV بدون تاثیر بر توانایی تشکیل کلنی موجب پیشبرد تکثیر hESCs منفرد شده میشود.
نتیجهگیری: با توجه به افزایش میزان تکثیر hESCs در حضور RSV میتوان این ترکیب را بهعنوان مکمل جدیدی برای محیط کشت hESCs معرفی نمود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigating the effects of Resveratrol on proliferation and colony formation of dissociated human embryonic stem cells
نویسندگان [English]
- Zahra Safaeinejad 1
- Mohammad Nabiuni 2
- Maryam Peymani 3
- Kamran Ghaedi 4
- Mohammad Hossein Nasr-Esfahani 5
1 Department of Animal Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
2 Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
3 Department of Biology, Sharekord Branch, Islamic Azad University, Sharekord, Iran.
4 Department of Biology, School of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran.
5 Department of Cellular Biotechnology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was study the role of Resveratrol (RSV) on proliferation and colony efficiency of dissociated human embryonic stem cells (hESCs).
Material and methods: In the current study, we used HESC line, RH6. Cells were cultured on the matrigelin supplemented hESC specific medium. Cell proliferation was estimated using cell counting and Brdu incorporation assays. The expression of colony efficiency markers (E-cadherin and β-catenin) was evaluated by western blot technique and β-catenin localization examined by immune-cytochemistry staining.
Results: We have shown that RSV promoted hPSCs proliferation without affecting their colony efficiency.
Conclusion: According to these observations, RSVcan be suggested as a new supplement for hESCs culture.
کلیدواژه‌ها [English]
- Human embryonic stem cells
- Colony formation
- Proliferation
- Resveratrol
مقدمه
سلولهای بنیادی جنینی (ESCs) سلولهای پرتوانی هستند که از توده سلولی داخلی (ICM) بلاستوسیت منشا میگیرند. این سلولها با دو ویژگی اصلی یعنی خود نوزایی و پرتوانی توصیف میشوند (1، 2 و 3). سلولهای بنیادی جنینی انسانی (hESCs) بر خلاف همتای موشی خود (mESCs) در حالت منفرد قابلیت زیست ندارند و پس از منفرد شدن متحمل مرگ برنامه ریزی شده میشوند (4). در نتیجه این امر، hESCs بایستی جهت تکثیر و حتی تمایز بهصورت کلنی و متصل بههم کشت داده شوند (5). در سال 2007 مولکول کوچکی بهنام Y-27632 بهعنوان مهار کننده آپوپتوزیسhESCs معرفی شد (4). این مولکول کوچک مهار کننده پروتئین کیناز وابسته به Rho(Rock) است. در سال 2010 مشخص شد که از دست رفتن مولکول‌های چسبنده سطحی E-cadherin در hESCs منفرد شده علت اصلی وقوع مرگ در این سلولها است. از دست رفتن این مولکول موجبات تشکیل فرم فعال مولکول Rho را فراهم میآورد (Rho- GTP).Rho فعال شده نیز فعال شدن Rock را میانجیگری میکند. نتیجه فعال شدن این آبشار، فسفریلاسیون بیش از حد اجزای اسکلت داخل سلولی نظیر میوزین‌ها، انقباض بواسطه اکتین- میوزین و در نهایت blebbing غشایی و وقوع مرگ سلولی است (5). با توجه به اهمیت hESCs جهت فهم مراحل اولیه رشد و نمو جنین انسان و همچنین کاربرد داشتن در زمینهی سلول درمانی، امروزه تلاشها جهت افزایش میزان خود نوزایی و پرتوانی (9-6) و همچنین بهبود شرایط کشت این سلولها در حالت منفرد (10 و 11) همچنان ادامه دارد. Resveratrol (RSV) یا trans-3,5,4'-trihydroxystibene یک فیتوآلکسین طبیعی با خاصیت ضدقارچی و ساختار پلیفنولی است که از منابع گیاهی از جمله پوست انگور قرمز مختلف استخراج میشود (12). در سال 2003، RSV بهعنوان فعال کننده SIRT1(silentinformation regulator 1) معرفی شد (13). در سالهای اخیر مطالعات زیادی به بررسی نقش RSV و SIRT1 در سلولهای بنیادی پرداختهاند (19-14). بهعلاوه پارهای از مطالعات نیز نقش SIRT1 را در فرآیندهای مختلفی که مولکول E-cadherin در آنها دخیل است را آشکار میسازند. بهطور مثال در سلولهای سرطان سینه با ویژگیهای مزانشیمی مانند رده سلولی MDA-MB-231 و همچنین در رده سلولهای سرطان گاستریک نشان داده شده است که miRNAs ویژهای از طریق کاهش بیان SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin و کاهش فرآیند گذر از اپی تلیوم به مزانشیم ((EMT میشود (20 و 21). بر مبنای مطالعهی سیمیک و همکاران SIRT1 در سرطان سینه و فیبروز کلیوی با لوکالیزه نمودن E-cadherin در غشای سلولی موجب کاهش EMT میشود (22). در مطالعه دیگری نیز که در سال 2012 انجام شد، اثبات شد که هم افزایش بیان SIRT1 و هم استفاده از RSV بهعنوان فعالکننده این داستیلاز موجب افزایش بیان E-cadherin میشود. در این مطالعه که محققین مراحل اولیه پذیرش اندومتری جنین را در in vitro شبیه سازی کردهاند بهعلاوه اثبات شد که RSV علاوه بر این که میتواند از طریق SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin شود قادر است بر قرارگیری E-cadherin در غشای سلولی نیز مؤثر باشد (23). بر مبنای این یافتهها و با در نظر گرفتن این نکته که تاکنون گزارشی در مورد تاثیر RSV بر hESCs صورت نگرفته است. هدف از مطالعهی حاضر بررسی اثر RSV بر تکثیر و توان شکلگیری کلنی hESCs منفرد شده میباشد.
مواد و روشها
کشت سلول: در این بررسی از ردهی سلولهایبنیادی جنینی انسانی با نام RH6 استفاده شد (24). این سلولها در ظروف کوت شده با ماتریژل (ECM)(Sigma-Aldrich) و DMEM/F12 حاوی Knock-out Serum 20%،mM Non-Essential Amino Acids 1/0، Insulin-transferrin-selenite 1%، Penicillin/streptomycin 1%و ng/ml100 فاکتور رشد فیبروبلاستی پایهای (bFGF) (جهت جلوگیری از تمایز) کشت داده شدند. (تمامی اجزای محیط کشت از شرکت Gibco خریداری شد). محیط سلولها روزانه تعویض شده و سلولها در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و رطوبت 95 درصد و CO25 درصد نگهداری شدند. hESCs را میتوان بهدو صورت کلنی یا منفرد کشت داد. با توجه به این که یکی از اهداف این پژوهش بررسی نقش RSV در بهینه سازی شرایط زیست hESCs بودکه تحت استرس منفرد شدن قرار گرفتهاند hESCs در تمامی مراحل بهصورت منفرد کشت داده شدند و در زمان پاساژ از مهار کنندهی (Y-27632) ROCK استفاده شد.
شمارش سلولی: بهمنظور ارزیابی تاثیر RSV(Sigma-Aldrich-R5010) بر تعداد hESCs تست شمارش سلولی با استفاده از رنگ تریپان بلو انجام گرفت. بدینمنظور 105×2 از سلولهای RH6 در هر یک از چاهکهای پلیت 6 خانهای کشت شدند پس از گذشت یک شب، سلولها بهمدت 72 ساعت با غلظتهای مختلف RSV (1، 10، 25، 50 و µM 100) و یا با دی متیل سولفوکساید DMSO(Sigma-Aldrich) بهعنوان حلال RSV تیمار شدند. جهت شمارش سلولی سلولهای آنزیمه شده سانتریفیوژ شدند. پس از دور ریختن محیط رویی و تهیه سوسپانسیون سلولی با 1 میلی لیتر محیط کشت تازه،10 میکرولیتر از محلول حاوی سلول به یک میکروتیوب 500 میکرولیتری منتقل شد و 10 میکرولیتر تریپان بلو 4 درصد به آن اضافه شد. سپس 12 میکرولیتر از محلول فوق به زیر لامل قرار گرفته بر روی لام هموسایتومتر (نئوبار) تزریق شد. بهمنظور شمارش سلولی، سلولهای زنده که در چهار مربع بزرگ اطراف لام که هر کدام از 16 مربع کوچکتر تشکیل شدهاند و از هر طرف توسط خطوط سه تایی احاطه شده اند با بزرگنمایی ×200 شمارش شدند، پس از شمارش، میانگین سلولهای شمارش شده در چهار میدان دید محاسبه شد.
تست الحاق BrdU: تاثیر RSV بر میزان تکثیر hESCs با استفاده از تست الحاق BrdU سنجیده شد. جهت انجام این بررسی پس از اتمام زمان تیمار (72 ساعت) سلولها با نشانگر هستهای BrdU(Sigma-Aldrich) با غلظت نهایی 10 میکرولیتر بهمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. در ادامه پس از حذف محیط رویی و آنزیمه کردن، سلولها سانتریفیوژ و سپس با پارافرمآلدهید 4 درصد (Sigma-Aldrich) بهمدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. پس از سانتریفیوژ و شست و شو با PBS، سلولها با تریتون 2/0 درصد(Sigma-Aldrich) بهمدت 30 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. بعد از سانتریفیوژ و شست و شو، نمونهها بهمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با اسید هیدروکلریک 2 نرمال انکوبه شدند و سپس بورات سدیم ((Merck1/0 مولار با5/8pH= بهمدت 5 دقیقه به نمونهها اضافه شد. پس از سانتریفیوژ و شست و شو، سلولها با محلول PBS/BSA بهمدت 1 ساعت بلوک شدند و سپس بهمدت یک شب با آنتی بادی مونوکلونال anti-BrdU((Sigma-Aldrich, B2531 و دو ساعت با آنتی بادی ثانویه کونژوگه با FITC(Millipore, AP 124F) انکوبه شدند. در پایان با اضافه نمودن 500 میکرولیتر PBS-، نمونهها جهت بررسی به دستگاه فلوسیتومتری منتقل شدند.
ایمونوسیتوشیمی: در ارزیابی اثر RSV بر تشکیل کلنی سلولهای بنیادی منفرد شده، جایگاه قرارگیری β-catenin بهعنوان مارکر تشکیل اسکلت سلولی با تکنیک رنگ آمیزی بررسی شد. به این ترتیب که ابتدا محیط کشت رویی سلولها که در هر یک از چاهکهایChamber slides کشت داده شده بودند خارج و سلولها 3 مرتبه با PBS شست و شو شدند. در مرحله بعد سلولها با پارافرمالدهید 4 درصد بهمدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. پس از شست و شو، سلولها با استفاده از تریتون 2/0 درصد بهمدت 30 دقیقه در دمای اتاق نفوذپذیر شدند. سپس عمل بلوکه کردن توسط محلول BSA/PBS با غلظت mg/mL10 بهمدت 1 ساعت انجام شد. در ادامه پس از خروج محلول بلوکه کننده ابتدا سلولها بهمدت 2 ساعت در آنتی بادی اولیه β-catenin(Santa CruzBiotechnology, SC-7963) و پس از شست و شو بهمدت 1 ساعت با آنتی بادی ثانویه کونژوگه با FITC انکوبه شدند پس از حذف آنتی بادی ثانویه و شست و شو بهمنظور رنگآمیزی هسته بههر چاهک رنگ DAPI (با غلظت نهایی ng/mL3) اضافه شد و پس از 1 الی 2 دقیقه چاهکها با PBS شست و شو شدند. دیوارههای chamber slides بهآرامی جدا و لامل بزرگ بهکمک چسب انتلان بر روی لام چسبانده شد. پس از خشک شدن چسب، از لامها بهکمک میکروسکوپ فلورسانس (Olympus) و با نرم افزاز Olysia عکس گرفته شد.
استخراج پروتئین: در این بررسی جهت استخراج پروتئین از محلول ترایزول(Thermo Scientific) استفاد شد. بدینمنظور پس از هموژن نمودن سلولها در ترایزول، بههریک از نمونه ها 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه و نمونهها بهمدت 15 دقیقه در دور g12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. در این مرحله 3 فاز تشکیل می شود: فاز رویی محتوی RNA، فاز وسط محتوی DNA و فاز زیرین محتوی پروتئین است. پس از انتقال محلول رویی حاوی RNA به یک ویال جدید، به ویال محتوی DNA و پروتئین 300 میکرولیتر اتانول 100 درصد اضافه و نمونهها بهمدت 5 دقیقه در دور g2000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. در این مرحله، فاز رویی که محتوی پروتئین بود به یک ویال جدید منتقل شد. بهمنظور رسوب پروتئینها، 1 میلیلیتر استون DTT بههر یک از ویالها اضافه و نمونهها بهمدت 15 دقیقه در دمای 20- درجه سانتیگراد انکوبه شدند و سپس بهمدت 15 دقیقه در دور g16000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. در نهایت پس از دور ریختن فاز رویی، مقدار 30 تا 100 میکرولیتر بافر لیز کننده بههر یک از نمونهها افزوده شد. در نهایت نیز غلظت پروتئینها با استفاده از روش بردفورد محاسبه شد.
الکتروفورز به روش SDS-PAGE: در این تکنیک ژل مورد استفاده دارای دو بخش بهنامهای ژل بالایی (Stacking gel) و ژل پایینی (Running gel یا Resolving gel) است. این دو ژل در میزان خلل و فرج و pH با هم تفاوت دارند. مواد تشکیل دهندهی این دو ژل شامل محلول آکریل آمید-بیس آکریل آمید، SDS، باز تریس، آمونیوم پرسولفات و TEMED میباشد. پس از آماده سازی ژل دو بخشی و قرار دادن آن در تانک حاوی بافر الکتروفورز 30 میکروگرم از نمونهی پروتئینی با حجم مناسبی از بافر بارگذاری مخلوط شده و پس از 4 دقیقه حرارت دادن در دمای 95 درجه سانتیگراد در هر یک از چاهکهای ژل بارگذاری شدند (علاوه بر نمونههای مورد بررسی یک شناساگر اندازهی پروتئین نیز در یکی از چاهکها بارگذاری شد). تانک الکتروفورز به دستگاه مولد برق با ولتاژ 70 و 120 ولت (بهترتیب برای ژل بالایی و پایینی) متصل شد.
وسترن بلات: پس از انجام الکتروفورز جهت انتقال پروتئینها از ژل به غشای برگههای واتمن، غشای PVDF(Bio Rad) و ژل درون کاست چیده شدند و ساندویچ حاصل در بانک حاوی بافر انتقال قرار داده شد. پس از اتمام فرآیند انتقال، غشا PVDF بهمدت یک شب توسط محلول 10 درصد شیر خشک بدون چربی(Millipore) بلوکه شد. غشا بعد از بلوکه شدن و شست و شو، بهمدت 5/1 الی2 ساعت با آنتی بادیهای اولیه β-catenin ((Santa Cruz, SC-7963، E-cadherinab76055)Abcam,)و GAPDH(Santa Cruz) سپس بهمدت 1 ساعت با آنتی‌بادی ثانویه کونژوگه با HRP(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG)(Dako,P0477) انکوبه شد. سوبسترای مورد استفاده برای آنزیم HRP در این بررسی، سوبسترای ECL شرکت Amersham بود که شامل دو محلول A و B است که به نسبت 1:1 با هم ترکیب و در تاریکی روی سطح غشا ریخته شدند. در نهایت پس از ظهور باندها بر روی فیلم رادیولوژی، از فیلم ها عکس گرفته شد.
آنالیز آماری
نتایج بهدست آمده در این مطالعه بهطور نسبی با سه بار تکرار مستقل آزمایشها بهدست آمده است. تعیین معنیداری اختلاف میانگینهای بیش از دو گروه با روش One way ANOVA و آزمون Tukey انجام گرفت. برای تعیین معنیداری اختلاف میانگینها بین دو گروه از Student’s t test استفاده شد. آنالیزها با نرم افزار SPSS (version 17) و در سطح معنیداری 05/0p< انجام گرفت. همه دادهها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین گزارش شدند.
نتایج
نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر تعداد hESCs
بهمنظور ارزیابی تاثیر RSV بر تعداد hESCs تست شمارش سلولی با استفاده از رنگ تریپان بلو انجام گرفت. نتایج این بررسی نشان داد کهاز میان غلظتهای مختلف RSV(1، 10، 25، 50 و 100 میکرومول) تعداد سلولهای RH6 تنها در حضور غلظتهای 50 و 100 میکرومول از RSV بهصورت معنیداری نسبت به گروه کنترل (گروه تیمار شده با دی متیل سولفوکساید) افزایش یافت. با توجه به این که تفاوت معنیداری در تعداد سلولهای تیمار شده با دو غلظت 50 و 100 میکرومول،RSV مشاهده نشد، غلظت50 میکرومول بهعنوان غلظت بهینهی این ترکیب انتخاب شد و سایر بررسیها تنها با این غلظت RSV انجام گرفت (شکل1).
شکل 1: نتایج آزمون شمارش سلولی. اثر غلظتهای مختلف (RSV) Resveratrolبر تعداد سلولهای RH6 پس از گذشت 72 ساعت از تیمار در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید(DMSO). خط شاخص نشان دهندهی میانگین ± خطای استاندارد میانگین است و“**” نشان دهندهی اختلاف معنیدار بین نمونهی تیمار شده و کنترل در سطح 01/0p< میباشد. NS بهمعنی عدم معنیداری است.
نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر میزان تکثیر hESCs
جهت انجام این بررسی سلولهای RH6 بهمدت 72 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شدند. سلولها پس از اتمام زمان تیمار بهمدت 1 ساعت در معرض BrdU قرار گرفتند و در نهایت پس از گذراندن مراحل تست الحاق BrdU، با دستگاه فلوسیتومتری بررسی شدند. همانگونه که در شکل 2 نشان داده شده است تعداد سلولهای BrdU+در حضور RSV به صورت معنی داری افزایش یافته است.
شکل 2: اثر (RSV) Resveratrol بر میزان الحاق BrdU و تکثیر hESCs. درصد سلولهای BrdU+RH6 که بهمدت 72 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شدهاند در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید (DMSO). یک نمونه از سه تکرار بههمراه نتایج کمی شدهی سه تکرار نشان داده شده است. خط شاخص نشان دهندهی میانگین ± خطای استاندارد میانگین است و “**”نشان دهندهی اختلاف معنیدار بین نمونهی تیمار شده و کنترل در سطح 01/0p< میباشد.
نتایج حاصل از بررسی اثر RSV بر بیان E-cadherinوβ-catenin
با توجه به این که یکی از علل شناخته شدهی قدرت زیست پایین hESCs منفرد شده، کاهش بیان اجزای تشکیل دهندهی اسکلت سلولی در سطح پروتئین است (5)، باید تاثیر RSV بر بیان ژنهای مؤثر در شکلگیری کلنی نظیرE-cadherin و β-catenin در مدت زمان کوتاهی پس از منفرد شدن ارزیابی شوند. بدینمنظور سلولهای RH6 بلافاصله پس از منفرد شدن بهمدت 2و 4 ساعت با غلظت 50 میکرومول از RSV تیمار شدند و در ادامه پروتئین آنها جهت بررسی بیان دو فاکتور مذکور استخراج شد. بنابر دادههای حاصل از تکنیک وسترن بلات اثر RSV بر بیان E-cadherin و β-catenin معنیدار نبود (شکل 3).
شکل 3: اثر Resveratrol (RSV) بر میزان بیان عوامل دخیل در تشکیل کلنی. الگوی بیان(A) E-Cadherinو (B)β-Catenin 2 و 4 ساعت پس از منفرد شدن سلولهای RH6 در حضور RSV در مقایسه با گروه کنترل دی متیل سولفوکساید (DMSO) توسط تکنیک وسترن بلات. یک نمونه از سه تکرار بههمراه نتایج کمی شده سه تکرار نشان داده شده است. اختلاف بین گروه تیمار شده و تیمار نشده معنیدار نبود.
β-catenin بر اساس جایگاه قرارگیری در سلول (ناحیهی هستهای یا غشایی) ، نقشهای متفاوتی را ایفا میکند. این نقش حیطهی گستردهای از شرکت در مسیر سیگنالیگ Wnt/β-catenin تا برقراری ارتباط با E-cadherin را شامل میشود (25). لذا اگرچه دادههای حاصل از مرحلهی قبل عدم تغییر بیان β-catenin را نشان داد این احتمال داده شد که ممکن است RSV بدون تغییر در میزان بیان β-catenin تنها موجب افزایش قرارگیری این پروتئین در غشا شود. جهت بررسی این احتمال، جایگاه قرارگیری β-catenin با استفاده از رنگآمیزی ایمنوفلوروسنت بر روی سلولهایی که بلافاصله پس از منفرد شدن و بهمدت 24 ساعت با RSV تیمار شده بودند مورد بررسی قرار گرفت. دادههای حاصل از این آزمایش عدم تغییر در میزان β-catenin استقرار یافته در غشاء را نشان داد (شکل 4).
شکل 4: اثر Resveratrol (RSV)بر جایگاه قرارگیری β-catenin در hESCs. محل قرار گیریβ-catenin در hESCs تیمار شده با RSV بهمدت 24 ساعت پس از منفرد شدن با استفاده از تکنیک رنگآمیزی ایمنوفلوروسنت. هستهها با رنگ DAPI رنگ آمیزی شدهاند. تصاویر بهصورت منطبق بر هم (Merged) گرفته شده اند. یک نمونه ازسه تکرار نشان داده شده است. اختلاف بین گروههای تیمار شده و تیمار نشده معنیدار نبود. خط معیار: 100 میکرومتر.
بحث
با توجه به اهمیت hESCs در حوزههای تحقیقاتی و بالینی مختلف، امروزه تلاشهای زیادی جهت بهبود شرایط کشت این سلولها و فهم دقیق مکانیسمهای دخیل در خودنوزایی و پرتوانی این سلولها در حال انجام است. در پژوهش حاضر به بررسی اثرات RSV بر تکثیر و کارایی شکلگیری کلنی hESCs منفرد شده پرداخته شد. در نخستین گام این پژوهش افزایش تعداد hESCs در حضورRSV نشان داده شد. در ادامه با استفاده از آزمون BrdU اثبات شد که افزایش مشاهده شده در تعداد سلول ناشی از افزایش میزان تکثیر hESCs بوده است. در تناقض با یافتههای ما، Liu و همکاران (26) نشان دادند که RSV تاثیری بر توان تکثیری سلولهای پرتوان القا شده انسانی ندارد. در واقع این محققین بر پایهی روش رنگ سنجی که تحت تاثیر عوامل مختلفی مانند محتویات محیط، سرم آلبومین و اسیدهای چرب قرار میگیرد (27 و 28) عدم تاثیر RSV بر تکثیر سلولهای پرتوان انسانی را گزارش نمودهاند. فعالیت تکثیری RSV در مطالعات دیگر نیز اثبات شده است. لی و همکاران (29) به بررسی اثر RSV بر پرتوانی و خود نوزایی mESCs و سلولهای پر توان القا شده موشی (miPSCs) که با رتینوئیک اسید بهسمت تمایز هدایت شده بودند پرداختند. بر مبنای یافتههای این محقیقین، در حضور غلظتهای 50 و 500 نانومول از RSV بیان مارکرهای پر توانی OCT4، NANOG و SOX2، بیان مارکرهای تنظیم کننده سیکل سلولی Pcna، Cyclin D،Cyclin A و میزان تکثیر سلولی در سلولهای مذکور افزایش می یابد. این دانشمندان اذعان داشتند که RSV اثرات مثبت خود بر پر توانی و خود نوزایی سلولهای پر توان موشی را از طریق فعال نمودن مسیر JAK/STAT3 و مهار مسیر mTOR اعمال می کند. کاربرد 10 میکرومول از RSV در محیط کشت پروژنیتورهای نورونی با فعال نمودن مسیرهای ERK و P38 موجب پیشبرد تکثیر این سلولها شده است (18). RSV همچنین موجب پیشبرد تکثیر و تمایز استئوژنیکی در سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان موش و انسان بهترتیب از طریق مسیرهایER/NO/cGMP و ER/ERK میشود (14، 15). در این پژوهش تاثیر RSV بر توانایی تشکیل کلنی hESCs که متحمل استرس منفرد شدن قرار گرفته بودند نیز بررسی شد. بر مبنای یافتههای ما بیان E-cadherin و β-catenin بهعنوان عوامل اصلی دخیل در اتصالات سلولی درحضور RSV تغییر نمییابد. بهعلاوه بر اساس نتایج حاصل از رنگ آمیزی ایمنوفلوروسنت میزان β-catenin غشایی نیز بهدنبال تیمار با RSV افزایش نمییابد. یافتههای ما در تناقض با مطالعاتی است که SIRT1 را بهعنوان تنظیم کنندهی مثبت بیان E-cadherin معرفی مینمایند. بهطور مثال در مطالعهای که در سال 2012 انجام شد (23) مشخص شد که RSV قادر است از طریق فعال نمودن SIRT1 موجب افزایش بیان E-cadherin در سلولهای کارسینومای اندومتر انسانی شود. بر مبنای یافتههای این مقاله، افزایش بیان E-cadherin ناشی از اتصال یافتن SIRT1 به نواحی E-box پروموتور ژن E-cadherin است. در سال 2013 نیز سیمیک و همکاران (22) نشان دادند که SIRT1 از طریق داستیله نمودن Smad4 مانع از بیان ماتریکس متالوپروتئیناز 7 ((MMP7 میشود. بهدنبال کاهش بیان MMP7، E-cadherin کلیواژ نشده و در اتصال به β–catenin در غشای سلول باقی میماند. بر مبنای این بررسی SIRT1 در سرطان سینه و فیبروز کلیوی با ممانعت نمودن از کلیواژ E-cadherin از یک سو و با لوکالیزه نمودن β–catenin در غشای سلول از سوی دیگر موجب کاهش EMT میشود. تناقض مشاهده شده بین یافتههای پژوهش پیش رو با دو بررسی مذکور احتمالا ناشی از عملکرد وابسته به نوع سلول SIRT1 میباشد.
نتیجهگیری
بر مبنای نتایج مطالعهی حاضر این گونه نتیجهگیری شد که اگرچهRSV نقش چشمگیری در تشکیل کلنی و بهبود شرایط زیست hESCs منفرد شده ندارد اما قادر به افزایش میزان تکثیر این سلولها است. بر این اساس میتوان RSV را بهعنوان یکی از اجزای محیط کشت hESCs که قادر به بهبود شرایط رشد و تولید انبوه سلولهای مذکور در بازه زمانی کوتاه است معرفی نمود.
تشکر و قدردانی
این تحقیق در قالب پایان نامه دکتری در پژوهشکده رویان اصفهان انجام گرفت لذا نویسندگان قدردان حمایتهای این مجموعه جهت فراهم نمودن امکانات اجرایی و مالی این طرح میباشند.
منابع
1. Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy. Physiol. Rev. 2005; 85(2): 635-78.
2. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001;17: 435-462.
3. YH YU, Zhang L, Wu DS, Zhang Z, et al. MiR-223 Regulates Human Embryonic Stem Cell Differentiation by Targeting the IGF-1R/Akt Signaling Pathway. Plos One. 2013;.8 :11.
4. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, NishiyamaA,et al. A ROCK inhibitor permits
survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 681–686.
5. Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2010; 7(2): 225–239.
6. Ren-He X, Peck RM, Li DS, Feng X, et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature methods. 2005; 2(3): 185.
7. Armstrong L, Hughes O, Yung S,Hyslop L,et al. The role of PI3K/AKT, MAPK/ERK and NFκβ signalling in the maintenance of human embryonic stem cell pluripotency and viability highlighted by transcriptional profiling and functional analysis. Human molecular genetics.2006; 15(11): 1894-1913.
8. Li J, Wang G, Wang C,Zhao Y,et al. MEK/ERK signaling contributes to the maintenance of human embryonic stem cell self-renewal. Differentiation. 2007; 75(4): 299-307.
9. Esmailpour T, Huang T. TBX3 promotes human embryonic stem cell proliferation and neuroepithelial Differentiation in a differentiation stage dependent manner. Stem Cells. 2012; 30(10): 2152-2163.
10. Xua T, Zhua X, Hahma H, Wei W, et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. PNAS.2010; 107(18): 8129–8134.
11. Kajabadi NS, Ghoochani A, Peymani M, Ghaedi K, et al. The synergistic enhancement of cloning efficiency in individualizedhuman pluripotent stem cells by peroxisome proliferative-activated receptor-γ (PPARγ) activation and Rho-associated Kinase (ROCK) inhibition. JBC. 2015; 290(43): 26303-26313.
12. Burns J, Yokota T, Ashihara H, Lean ME, et al. Plant foods and herbal sources of resveratrol. Journal of agricultural and food chemistry. 2002; 50(11): 3337-3340.
13. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 2003; 425: 191-196.
14. Song LH, Pan W, Yu YH, Quarles LD, et al. Resveratrol prevents CsA inhibition of proliferation and osteoblastic differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells through an ER/NO/cGMP pathway. Toxicology in Vitro. 2006; 20(6):915-922.
15. Dai Z, Li Y, Quarles L, Song T, et al.Resveratrol enhances proliferation and osteoblastic differentiation in human mesenchymal stem cells via ER-dependent ERK1/2activation. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY,Lamming, DW,et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature.2003; 425: 191-196.
16. Jablonska B, Gierdalski M, Chew LJ, Hawley T,et al. Sirt1 regulates glial progenitor proliferation and regeneration.in white matter after neonatal brain injury. Nature communications 7. 2016; 13866: 1-16.
17. Wang L, Xue R, Sun C, Yang C, et al. SIRT1 regulates C2C12 myoblast cell proliferation by activating Wnt signaling pathway. IntJ Clin Exp Pathol. 2016; 9(3): 2857-2868.
18. Kumar V, Pandey A, Jahan S, Shukla RK,et al. Differential responses of Trans-Resveratrol on proliferation of neural progenitor cells and aged rat hippocampal neurogenesis. Scientific reports. 2016; 6: 28142.
19.Calvanesea V, Larab E, AlvarezcBS, AbuDawudd R, et al.Sirtuin 1 regulation of developmental genes during differentiation of stem cells. PNAS. 2010; 107(31): 1-6.
20. Tryndyak PV, Beland AF, Pogribny PI. E-cadherin transcriptional down-regulation by epigenetic and microRNA-200 family alterations is related to mesenchymal and drug-resistant phenotypes in human breast cancer cells. Int. J. Cancer. 2010; 126: 2575–2583.
21. Zhang L, Wang X, Chen P. MiR-204 down regulates SIRT1 and reverts SIRT1-induced epithelial- mesenchymal transition, anoikis resistance and invasion in gastric cancer cells. BMC.Cancer. 2013;14(13): 290.
22. Simic P, Williams OE, Bell LE, Gong J, et al. SIRT1 suppresses the epithelial-to-mesenchymal transition in cancer metastasis and organ fibrosis. Cell.Rep. 2013; 3(4): 1175–1186.
23. Shirane A, Wada-Hiraike O, Tanikawa M, Seikia T, et al. Regulation of SIRT1 determines initial step of endometrial receptivity by controlling E-cadherin expression.Biochem.Biophys. Res. Commun. 2012; 424(3): 604–610.
24. Baharvand H, Ashtiani SK, Taee A,Massumi M,et al. Generation of new human embryonic stem cell lines with diploid and triploid karyotypes. Development, growth & differentiation. 2006; 48(2): 117-128.
25. Huang G, Ye S, Zhou X, Liu D, et al. Molecular basis of embryonic stem cell self-renewal: from signaling pathways to pluripotency network. Cellular and molecular life sciences. 2015; 72(9): 1741-1757.
26. Liu H, Zhang S, Zhao L, Zhang Y, et al. Resveratrol enhances cardiomyocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells through inhibiting canonical WNT signal pathway and enhancing serum response factor-miR-1 axis. Stem cells international 2016; 1-11.
27. Huang KT, Chen YH, Walker AM. Inaccuraciesin MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 2004; 37(406): 410-402.
28.Wang P, Henning SM, Heber D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PloS one.2010; 5(4): e10202.
29. Li N, Du Z, Shen Q, Lei Q,et al. Resveratrol enhances self Renewal of mouse embryonic stem cells. JCB. 2017; 118(7): 1928-1935.
)