مقدمه

بیماری مالتیپل اسکلروزیس(Multiple sclerosis=MS)  بیماری تحلیل رونده سیستم عصبی مرکزی است که در آن میلین، آکسون و اولیگودندروسیت‫ها تخریب می‫شوند. روند این بیماری می­تواند به‫صورت عودکننده، فروکش­کننده یا به‫صورت پیش‫رونده باشد. ضایعات MS معمولا در زمان­های مختلف و در نواحی مختلف سیستم عصبی رخ می­دهد. حدود 000/350 نفر در آمریکا و 5/2 میلیون نفر در سراسر جهان به MS مبتلا هستند. فراوانی این بیماری در زنان دو برابر مردان است و بیشتر در بین سنین 20 تا 40 سالگی بروز می کند (1). در کشورهای غربی، MS پس از تروما دومین علت ناتوانی نورولوژیک با شروع در اوایل میانسالی است. تظاهرات MS می­تواند از یک بیماری خوش­خیم تا بیماری سریعا پیش­رونده و ناتوان ­کننده که نیازمند تطابق سریع در شیوه زندگی است متغیر باشد (2).

در سیستم عصبی محیطی سلول­های شوان و در سیستم عصبی مرکزی سلول­های اولیگودندروسیت­ در تولید میلین نقش  دارند. پروتئین‫های مهم میلین شامل پروتئین اصلی میلین (Myelin basic protein=MBP)، Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) ، CNPase و پروتئین پروتئولیپید(Proteolipid protein)  می‫باشد. CNPase آنزیمی است که 4 درصد از پروتئین میلین را تشکیل می دهد و MOG به میزان کم در میلین وجود دارد ولی خاصیت اتوانتی ژنی (autoantigen) در رابطه با پاتوژنز بیماری MS دارد. CNPase به‫تدریج در طول عمر انسان متحمل تغییراتی می‫شود. این آنزیم در تمایز الیگودندروسیت‫های فعال و هدایت تولید میلین نقش اساسی دارد. CNPase از تکثیر ویروس HIV1 نیز جلوگیری می‫کند (3). MOG پروتئینی با وزن مولکولی 26-28 کیلو دالتون وعضو خانواده بزرگ ایمونوگلوبولین بوده و به‫طور انحصاری در سیستم عصبی مرکزی و مخصوصا در سطح اولیگودندروسیت‫های فعال بیان می‫شود. اگر چه فقط 01/0 تا 05/0 در صد از پروتئین‫های میلین را تشکیل می‫دهد ولی نقش مهمی در بیماری اتوایمون بازی می‫کند. MOG در تکمیل و حفظ غلاف میلین و واکنش سلول و سلول نقش دارد (4).  در مدل‫های حیوانی که میلین آن‫ها تخریب شده است، تعداد کمی اولیگودندروسیتی‫های تولید کننده میلین از سلول‫های اجدادی اولیگودندروسیت (Oligodendrocyte‫ progenitor cells = OPGs) ایجاد می‫شوند (5)، ولی تولید میلین محدود بوده و ایجاد دوباره میلین به‫زودی متوقف می‫شود. MBP پروتئین مهم در فرایند تولید میلین اعصاب در سیستم عصبی بوده و در حفظ ساختمان صحیح میلین و واکنش با لیپیدها در غلاف میلین مهم است. MBP نقش مهمی در تنظیم تکثیر سلول‫های بنیادی عصبی دارد و حذف ژن MBP مانع تولید میلین می‫شود (6). MBP در نتیجه تغییرات بعد از ترجمه به انواع مختلف تبدیل می‫شود. فرم اصلی آن 5/18 کیلو دالتون و دارای 170 اسید آمینه است. MBP در بیماری‫های تحلیل رونده عصبی نظیر MS مهم است و در اکثر موارد آنتی‫بادی‫ها بر علیه MBP در این بیماری‫ها دیده می‫شود (7).  

تغذیه نقش مهمی در میلین‫سازی دارد. چندین نوع ویتامین، مواد معدنی و اسید چرب برای میلین سازی ضروری است و کمبود این مواد در بدن منجر به اختلال در میلین سازی می‫شود. برای مثال ویتامین‫های B1 و B12 اعمال مختلفی در بدن انجام می‫دهند که یکی از آن‫ها اثر بر روند میلین سازی است به‫طوری‫که کمبود این ویتامین‫ها در بدن منجر به کاهش میلین سازی و ایجاد علائمی از قبیل، مشکلات حافظه، مشکلات در راه رفتن، درد ماهیچه و غیره می شود (8). یکی دیگر از عوامل مهم در روند میلین سازی ویتامین D است. گیرنده‫های ویتامین D (VDR) به‫طور گسترده در مغز جنین به‫خصوص در نورو اپیتلیوم و نواحی  تکثیر  شونده، یافت می‫شوند. سنتز موضعی دی هیدروکسی ویتامین D توسط نورون‫ها و میکرو‫گلیا صورت می‫گیرد. ویتامین D  باعث تغییر در بیان فاکتور  رشد  عصبی و نوروتروفین (neurotrophin) در  مغز می‫شود. اضافه کردن ویتامین D به محیط کشت حاوی سلول های هیپوکامپ، منجر به افزایش رشد به سمت خارج (outgrowth) نورون‫ها می‫شود (9). این ویتامین منجر به معکوس کردن تغییرات التهابی وابسته به سن در ناحیه هیپوکامپ موش صحرایی می‫شود (10). ویتامین D تمایز و عمل‫کرد سلول‫های سیستم ایمنی را تحت تاثیر قرار می‫دهد. به‫نظر می‫رسد لنفوسیت‫های T هدف‫های ویتامینD  هستند. دی هیدروکسی ویتامین D سلول‫های Th1 و تولید سایتوکاین‫های التهابی مثل  IL-2 , IFN-γ , TNF-αرا از آن‫ها مهار می‫کند. مشخص شده که ویتامین D سلول‫های Th1 و تولید سایتوکاین‫های IL-2 , IFN-γ , TNF-α را تنظیم می‫کند (11). با توجه به  نقش مهم ویتامینD  در بیولوژی سیستم عصبی مرکزی و پاتوژنز بیماری مالتیپل اسکلروزیس، در این تحقیق به اثر این ویتامین در بیان MBP در جسم پینه‫ای مغز  موش‫های دمیلینه القا شده با کاپریزون در in vivo پرداخته شد.

مواد و روش‌ها

ایجاد موش انسفالومیلیت اتوایمون تجربی: جهت مطالعه اثرات ویتامین D بر بیان ژن MBP که یک ترکیب مهم در پوشش میلین است، از موش آزمایشگاهی نژاد Balb/c استفاده شد. موش‫ها در دمای اتاق 22 درجه سانتی‫گراد و تناوب نوری 12:12 ساعت قرار داده شدند. غذا و آب نیز به‫میزان کافی در اختیار موش‫ها قرار داده شد. در تمام آزمایشات ملاحظات اخلاقی در نظر گرفته شد. برای انجام آزمایش‫ها از موش‫های بالغ 6 تا 8 هفته‫ای استفاده شد و در سه گروه مجزا نگه‫داری شدند. برای هر گروه یازده موش استفاده شد (11n=).

برای دمیلینه شدن تجربی، به موش‫ها برای مدت 5 هفته Cuprizone 2/0 درصد (از شرکت Sigma-Aldrich ) مخلوط با غذای موش داده شد. بعد از پنج هفته و ایجاد علائم MS نظیر عدم تعادل حرکتی در این موش‫ها، به آن‫ها غذای فاقد Cuprizone داده و از همان زمان به سه گروه تقسیم شدند: به گروه اول به‫میزان 5 میکروگرم بر کیلوگرم وزن بدن ویتامین D به‫صورت داخل صفاقی (Intraperotoneally) تزریق شد. به گروه دوم (شم)، سرم فیزیولوژی و به گروه سوم هیچگونه تزریق نشد (گروه کنترل).

برای هر گروه، تعداد 11 موش و در مجموع 33 موش استفاده شد. شش هفته بعد از تزریق‫ها، موش‫ها با دی اتیل اتر بی‫هوش شده و کورتکس مغز آن‫ها پس از جدا کردن در ظرف حاوی سرم فیزیولوژی شستشو داده و جهت تهیه عصاره، جسم پینه‫ای مغز  در بافر لیز کننده لیز شد. جسم پینه‫ای مغز  جدا و به قطعات ریز تقسیم و در 5/0 میلی‫لیتر بافر لیز کننده پروتئین (150mMNaCl, 1.0% Np40,20 mM (Tris (pH.7.5),5mM EDTA به همراه مهارکننده پروتئاز (Roche Diagnostic Ltd, West Sussex,Uk) قرار داده شده و توسط سونیکاتور هموژن شد. بعد از سانتریفوژ کردن، عصاره‫های پروتئین جدا و در فریزر 70-­ درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد.

الف) بررسی غلظت کل پروتئین: برای بررسی کمی غلظت کل پروتئین در عصاره جسم پینه ای مغز  از روش بردفورد استفاده شد. این روش از رنگ کوماسی برلیانت بلو G-250 استفاده می شود. اتصال رنگ به پروتئین موجب می شود که ماکزیمم جذب از 465 نانومتر (رنگ قرمز) به 595 نانومتر (رنگ آبی) تغییر یابد. ابتدا برای رسم نمودار استاندارد بردفورد، محلول هایی پروتئینی با غلظت های 100، 200، 400، 600، 800 و 1000 میکروگرم در میلی‫لیتر تهیه، که از سرم آلبومین گاوی (Bovine serum albumin= BSA) استفاده شد و این مقادیر در 1 میلی لیتر آب مقطر حل شد. سپس در

لوله‫های آزمایش 5/2 میلی‫لیتر معرف بردفورد (01/0 درصدBrilliant Blue G-250  Coomassie، 5 درصد اتانول 95 درصد، 10 درصد اسید فسفریک 85 درصد) ریخته و در هر یک 100 میکرولیتر از محلول های BSA تهیه شده اضافه شد. لوله‫ها را به‫خوبی مخلوط کرده و 20 بعد از دقیقه جذب در 595 نانومتر خوانده شد. با استفاده از جذب‫های به‫دست آمده در غلظت‫های 100 تا 1000 میکروگرم BSA در میلی لیتر منحنی استاندارد رسم شد. با توجه به جذب محلول به‫دست آمده در 595 نانومتر و منحنی استاندارد، غلظت پروتئین در عصاره‫ها محاسبه شد.

ب) بررسی بیان نسبی MBP در عصاره جسم پینه ای مغز  به روش وسترن بلات: برای آنالیز میزان بیان MBP از وسترن بلات استفاده شد. برای وسترن بلات، عصاره‫ها با بافر حاوی SDS 2/3 درصد (Sodium dodecyl sulfate)، گلیسرول 15 درصد، β-مرکاپتواتانل 8/2 مولار و بروموفنول آبی مخلوط شد. سپس نمونه‫ها بر روی ژل الکتروفورز پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Milan, Italy) 15 درصد قرار داده و بر اساس روش لاملی جدا شدند. سپس پروتئین‫های جدا شده بر روی ژل به صفحات نیتروسلولز با اندازه منفذ 45/0 میکرومتر منتقل شد. بعد از 2 ساعت انکوباسیون در محلول بلوکه کننده (سالین بافر فسفات به‫همراه 5 درصد شیر خشک)، صفحه نیترو سلولز برای 24 ساعت در محلول حاوی آنتی بادی مونوکلونال بر علیه MBP (شرکت Anti-MBP antibody, Abcam) با غلظت 1:1000 در دمای 4 درجه سانتی‫گراد قرار داده شد. سپس نمونه‫ها برای 2 ساعت در کمپلکس آویدین- بیوتین (Vector Lab., Peterborough, UK) قرار داده شدند. سپس نمونه‫ها با دی آمینوبنزیدین (DAB)(Vector Lab., UK) رنگ آمیزی شده و برای بررسی غلظت پروتئین‫ها در باندها از نرم افزار Metaview استفاده شد. از β-توبولین نیز به‫عنوان کنترل استفاده شد.

آنالیز آماری

تمام نتایج ارائه شده به‫صورت Mean±SEM محاسبه شد. در تمام آزمایش‫ها تعداد 12 نمونه مورد استفاده قرار گرفت. آنالیز آماری با استفاده از واریانس (One Way ANOVA) انجام و فقط 05/0≥p به‫عنوان معنی‫دار در نظر گرفته شد.

نتایج

الف: اثر ویتامین D بر غلظت کل پروتئین: غلظت کل پروتئین‫های عصاره جسم پینه‫ای مغز  در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D و گروه‫های شم و کنترل اندازه‫گیری شد که به‫ترتیب 003/0± 918/0، 004/0± 917/0، و 004/0± 916/0،گرم در لیتر محاسبه شد. غلظت کل پروتئین‫های عصاره جسم پینه‫ای مغز  در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D نسبت به گروه تزریق شده با سرم فیزیولوژی (گروه شم) و گروه کنترل به‫میزان کمی افزایش یافته است. این افزایش معنی‫دار نبوده و سطح احتمال نسبت به گروه شم و گروه کنترل به‫ترتیب P=0.76 و P=0.54 می باشد (شکل 1). همچنین اختلاف غلظت پروتئین بین دو گروه شم و کنترل معنی‫دار نمی باشد P=0.78) ) .

شکل 1: غلظت کل پروتئین‫های عصاره جسم پینه‫ای در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D ، شم و کنترل. غلظت کل پروتئین‫های عصاره جسم پینه‫ای در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D نسبت به گروه تزریق شده با سالین و گروه کنترل تفاوت معنی‫دار ندارد (p<0.05).

ب: اثر ویتامین D بر بیان MBP: بررسی اثر ویتامین D بر بیان MBP در جسم پینه‫ای مغز  در موش‫های با MS تجربی و مقایسه آن با دو گروه دیگر (گروه‫های شم و کنترل) نشان داد که میزان بیان MBP  در گروه تزریق شده با ویتامین D بیشتر از دو گروه شم و کنترل می‫باشد (شکل 2). این مقدار برای گروه‫های تزریق شده با ویتامین D، شم و کنترل به‫ترتیب  45/3 ± 28/18، 91/1±11 و  42/2±71/10 می‫باشد.  بررسی کمی به کمک نرم افزار   Metaview و Image Analyzer نشان داد که میزان بیان نسبی MBP در گروه تزریق شده با ویتامین D بیشتر از آن در گروه کنترل و شم است. این افزایش به‫صورت معنی‫دار است (به‫ترتیب در مقایسه با گروه کنترل و شم p=0.0003 و p=0.0004 محاسبه شد)(شکل 2). اختلاف در بیان پروتئین MBP مورد مطالعه بین گروه کنترل و شم معنی‫دار نبوده است (p=0.81).

شکل 2: (A میزان بیان پروتئین MBP در عصاره جسم پینه‫ای موش‫های گروه کنترل (چاهک  1)، گروه شم (چاهک 2) و تزریق شده با ویتامین D (چاهک 3). میزان بیان بتا توبولین (50 کیلو دالتون) به‫عنوان کنترل  (loading  control)در نظر گرفته شده است. (B بیان نسبی MBP در عصاره جسم پینه‫ای در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D ، شم و گروه کنترل. افزایش بیان نسبیMBP در نمونه‫های تزریق شده با ویتامین D در مقایسه با گروه‫های دیگر مشخص است. شدت سیگنال‫های آزمایش‫ها ایمونوبلاتینگ نمونه‫ها توسط آنالیز های دانسیتومتری تعیین شد.

بحث

مطالعات نشان می دهد که دو عامل محیط و ژنتیک در بیماری MS نقش دارند. درصد فراوانی این بیماری در نقاط مختلف جهان متفاوت است اما شواهد نشان می‫دهند که در شمال اروپا و جنوب استرالیا درصد ابتلا به بیماری شایع تر است و به‫نظر می‫رسد که نور خورشید و ویتامین D در پیشگیری از آن نقش داشته باشد. در این بیماری لنفوسیت‫های T نقش مهمی را در ایجاد التهاب در سیستم عصبی ایفا می‫کنند. لنفوسیت‫های T فعال از سد خونی-مغزی عبور کرده و با تولید سایتوکاین‫ها و کموکاین‫ها در روند التهاب  دخالت  می‫کنند (12). 

ویتامین‫هایی نظیر D نقش مهمی در تولید میلین دارند و کمبود ویتامین در بدن منجر به اختلال در تولید میلین می‫شود. نقش این ویتامین به‫عنوان تنظیم کننده سیستم ایمنی و نقش آن در بیماری MS بسیار مورد توجه واقع شده است. همچنین دیده شده که در عرض‫های جغرافیایی بالا (دور از استوا) کاهش سطح 25-هیدروکسی ویتامین D در خون افراد با افزایش ریسک وقوع MS در آن‫ها در ارتباط است. افزایش مواجه شدن با نور خورشید و میزان مناسب ویتامین مناسب ویتامین D در بدن در دوران کودکی و نوجوانی با کاهش ریسک ابتلا به MS در ارتباط است. مطالعه‫ای بر روی 199 زن مبتلا به MS نشان داد که ریسک نسبی ابتلا به  MS، در نوزادان دختر متولد شده از مادرانی که در طول دوره حاملگی میزان بالایی از شیر و ویتامین D دریافت کرده بودند، بسیار کاهش پیدا کرده بود (13). گیرنده ویتامین D در اکثر مناطق سیستم عصبی مرکزی مشاهده شده است. آنزیم‫های اصلی در مسیر متابولیکی ویتامین D‫، 1آلفا-هیدروکسیلاز و 24-هیدروکسیلاز، هم در CNS بیان می‫شوند (14). بنابراین CNS ممکن است که مکانی برای عملکرد، متابولیسم و کاتابولیسم ویتامین D باشد. مجموعه این یافته‫ها نقش ویتامین D را در CNS و بیماری MS و نقش آن در میلین‫سازی نشان می‫دهد. ویتامین D با فعال کردن چندین ژن مرتبط با میلین در میلین سازی نقش دارد (15). همچنین این ویتامین باعث کاهش اثرات تخریبی میلین در بیماری MS می‫شود (16).

وجود میزان مناسب از ویتامینD  در بدن  احتمالا می‫تواند تولید سایتوکاین‫های التهابی را در سلول‫های T مهار کرده و فعالیت التهابی لنفوسیت‫های T را سرکوب کند و در نهایت منجر به بقای الیگودندروسیت‫ها و تولید دوباره میلین می‫شود.

پوشش میلین از لیپید و پروتئین‫هایی نظیر پروتئین پروتئولیپید (Proteolipid protein)‫، پروتئین اصلی میلین (Myelin basic protein)، و MOG ساخته شده است. مطالعات متعدد نشان داد که آنتی بادی بر علیه MOG و MBP در ارتباط با بیماری التهابی مغز نظیر MS می‫باشد.  این دو پروتئین اهداف اصلی آنتی ژن‫ها در بیماری‫های التهابی مغز می‫باشد (17).

مطالعات متعدد نشان می‫دهد که فاکتورهای رشد و ویتامین‫ها نقش مهمی در بیان پروتیین‫های تشکیل دهنده میلین دارد. نشان داده شد که فاکتور مهار کننده لوکمیا باعث افزایش بیان MOG و MBP در کورتکس مغز موش‫های دمیلینه شده با کاپریزون می‫شود (18، 19). ضمنا این فاکتور باعث افزایش بیان Opalin در کورتکس مغز موش می‫شود (20). در مطاله دیگری نشان داده شد که ترکیب epigallocatechin-3-gallate (EGCG) در چای سبز باعث افزایش بیان پروتئین پروتئولیپید، ماده سازنده میلین، در مغز موش‫های تحت تیمار با کاپریزون شد (21). در یک تحقیق نشان داده شد که ویتامین D با اثر بر گیرنه خود باعث تنظیم فعالیت اولیگودندروسیت‫ها و تولید دوباره میلین می‫شود (22). نشان داده شده است که ویتامین D باعث تنظیم بیان صدها ژن طی مکانیسم های ژنتیکی و اپی ژنتیکی می‫شود (23).

نتیجه‫گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که ویتامین D باعث افزایش بیان MBP در جسم پینه ای مغز موش‫های دمیلینه القا شده توسط کاپریزون می‫شود. اما ویتامین D باعث تفاوت معنی‫داری در غلظت کل پروتئین در جسم پینه‫ای مغز در مقایسه با گروه کنترل یا شم نشد. این موضوع که چرا در گروه تزریق شده با ویتامین D افزایش بیان MBP باعث افزایش در غلظت کل پروتئین نشده است ممکن است به این دلیل باشد که افزایش غلظت MBP احتمالا با کاهش بیان یک یا چند پروتئین دیگر در جسم پینه ای مغز همراه باشد که در مجموع باعث تغییر در غلظت کل پروتئین نشده است.

 لذا نتیجه گیری می‫شود که ویتامین D ممکن است با افزایش بیان MBP در فرایند تولید دوباره میلین در جسم پینه‫ای مغز موش های دمیلینه شده نقش داشته باشد.    

تشکر و قدردانی

از آزمایشگاه زیست شناسی سلولی و تکوینی دانشگاه گیلان و مرکز تحقیقات علوم سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی گیلان تشکر می‫شود.

منابع

1. Kurtzke JF. Epidemiology in multiple sclerosis: a pilgrim's progress. Brain. 2013; 136(Pt 9): 2904-17.
2. Rudick RA, Cohen JA, Weinstock-Guttman B, Kinkel RP, et al. Management of multiple sclerosis. N Engl J Med. 1997; 337(22): 1604-11.
3. Dabrowska-Bouta B, Sulkowski G, Struzyńska L, Rafałowska U. CNPase activity in myelin from adult rat brains after prolonged lead exposure in vivo. Chem Biol Interact. 2004; 150(2): 171-8.
4. Gori F, Mulinacci B, Massai L, Avolio C, et al. IgG and IgM antibodies to the refolded MOG(1-125) extracellular domain in humans. J Neuroimmunol. 2011; 233(1-2): 216-20.
5. Reynolds R, Dawson M, Papadopoulos D, Polito A, et al. The response of NG2-expressing oligodendrocyte progenitors to demyelination in MOG-EAE and MS. J Neurocytol. 2002; 31(6-7): 523-36.
6. Xu W, Sachewsky N, Azimi A, Hung M, et al. Myelin Basic Protein Regulates Primitive and Definitive Neural Stem Cell Proliferation from the Adult Spinal Cord. Stem Cells. 2017; 35(2): 485-496.
7. Vassall KA, Bessonov K, De Avila M, Polverini E, et al. The effects of threonine phosphorylation on the stability and dynamics of the central molecular switch region of 18.5-kDa myelin basic protein. PLoS One. 2013; 8(7): e68175.
8. Slavov GS, Trenova AG, Manova MG, Kostadinova II, et al. Vitamin D immunomodulatory potential in multiple sclerosis. Folia Med (Plovdiv). 2013; 55(2): 5-9.
9. Brown J, Bianco JI, McGrath JJ, Eyles DW. 1,25-dihydroxyvitamin D3 induces nerve growth factor, promotes neurite outgrowth and inhibits mitosis in embryonic rat hippocampal neurons. Neurosci Lett. 2003; 343(2): 139-43.

10.Moore ME, Piazza A, McCartney Y, Lynch MA. Evidence that vitamin D3 reverses age-related inflammatory changes in the rat hippocampus. Biochem Soc Trans. 2005; 33(Pt 4): 573-7.

11.He XJ, Ding Y, Xiang W, Dang XQ. Roles of 1,25(OH)2D3 and Vitamin D Receptor in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus by Regulating the Activation of CD4+ T Cells and the PKCδ/ERK Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2016; 40(3-4): 743-756.

12. Bar-Or A. The immunology of multiple sclerosis. Semin Neurol. 2008; 28(1): 29-45.

13. Mirzaei F, Michels KB, Munger K, O'Reilly E, et al.  Gestational vitamin D and the risk of multiple sclerosis in offspring. Ann Neurol. 2011; 70(1): 30-40.

14. Zehnder D, Bland R, Williams MC, McNinch RW, et al. Extrarenal expression of 25-hydroxyvitamin d(3)-1 alpha-hydroxylase. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86(2): 888-94.