مقدمه

نورون‫ها تحت تاثیر عوامل فیزیکی، شیمیایی و پاتولوژیک دچار صدمه می‫شوند و تخریب(degeneration)  آن‫ها یک صدمه دائمی محسوب می‫شود (1). هر نورون یک واحد عملکردی و ساختمانی است و سلول‫هایی هستند که برای ارسال و دریافت علایم تخصص یافته‫اند. قسمتی از سلول که حاوی هسته می‫باشد، جسم سلول نامیده می‫شود و سیتوپلاسم این قسمت پریکاریون نام دارد (2). هنگامی‫که یک عصب قطع می‫شود، ارتباط آکسون با جسم سلولی قطع شده و قطعه دیستال آن از محل ضایعه تا انتها شروع به دژنراسیون هم‫زمان می‫کند. به‫علاوه دژنراسیون تا اولین گره رانویه به‫سمت پروگزیمال نیز ادامه می‫یابد که این فرایند را دژنراسیون والرین می‫گویند (3). چنانچه میزان تخریب بخش پروگزیمال شدید باشد اثرات ضایعه رو به عقب به‫سوی جسم سلولی توسعه یافته و سبب دژنراسیون مرکزی (تخریب جسم سلولی) می‫شود، اجسام نیسل شکسته شده و در سرتاسر سیتوپلاسم پراکنده می‫شود که این فرآیند را کروماتولیز گویند. همچنین هسته از موقعیت مرکزی خود به‫سمت محیط سلول تغییر مکان می‫دهد و جسم سلولی به‫دلیل تغییرات اسمزی متورم می‫شود (4). اگرچه نورون‌ها عموما پس از تولد فاقد قدرت تکثیر می‫باشند. اما می‫توانند در مقابل درجات معینی از ضایعات مقاومت کرده و بهبود یابند. اگر یک فیبر عصبی قطع شود هم در اعصاب محیطی و هم در اعصاب مرکزی تغییراتی ایجاد می‫شود که در صورت شدید بودن این تغییرات منجر به مرگ سلولی می‫شود (5). استفاده از ماده ای که در این مرحله بتواند شدت ضایعات را کاهش دهد و یا به روندهای التیامی شدت ببخشد، می‫تواند راه‫گشای بسیاری از مشکلات عصبی باشد. در این زمینه بهره جویی از عصاره‫های گیاهی به‫علت طبیعی بودن و نداشتن اثرات جانبی بر عملکرد سایر دستگاه‌های بدن مورد توجه اکثر محققان می‌باشد. یکی از گیاهانی که در روند ترمیم سیستم عصبی نقش دارد، گیاه نعناع است. نعناع با نام علمی Menthapulegium از خانواده نعناعیان(Lamiacace)  گیاهی علفی چند ساله با فرم خوابیده و یا خیزان، با ساقه‫های متعدد، از قاعده منشعب، پوشیده از کرک‫های متراکم گسترده، برگ‫ها با دمبرگ‌های کوتاه می‫باشد (6). گیاه نعناع دارای خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضدالتهابی است که منتول موجود در گیاه نعناع به‫طور اختصاصی تولید 3 مدیاتور اصلی التهاب توسط مونوسیت‫ها را مهار می‫کند (7). وجود منتول دارای اثر ضد التهابی بوده، که این ترکیب اثر خود را از طریق بلوکه کردن تولید پیش التهاب‌های بیوشمیایی مثل کولوترین و پروستاگلاندین اعمال کرده و نیز آزاد سازی هیستامین و دیگر میانجی‫های آلرژیک را مهار می‌کند. همچنین منتول موجود در عصاره هیدروالکلی گیاه نعناع خاصیت آنتی اکسیدانتی اثبات شده‌ای دارد نشان داده شد با افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانتی ترکیب GSH و آنزیم GSH-Px و GR در گروه‌های حاوی منتول باعث کاهش میزان سیتوکین‌های التهابی مانند فاکتورهای نکروز کننده توموری آلفا (TNF-α)، اینترلوکین یک بتا (1L-1β) و اینترلوکین 6 (1L-6) جلوگیری می‌نماید (8).گیاه نعناع به‫علت دارا بودن فلاونول‌های بالا و ساختار فیتوشیمیایی آن فعالیت ضد میکروبی دارد که در درمان بیماری‫های انسان و پروسه‫های التهابی کاربرد دارد (9). نعناع حاوی غلظت بالایی از آنتی اکسیدانت‫ها می‫باشد که این گیاه حاوی بالاترین ترکیبات فنولیک و فلاونوئید است که فلاونوئیدها از طریق چلاته کردن یون‫های فلزی فعالیت آنتی اکسیدانتی خود را اعمال می‫کنند .با توجه به اثرات ضد التهابی و آنتی‌آپوپتوزی عصاره این گیاه احتمال می‌رود که بتوان از آن جهت کاهش شدت ضایعات عصبی و یا بهبود روند ترمیم استفاده نمود (10). بر این اساس این تحقیق با هدف بررسی اثر حفاظت نورونی عصاره هیدروالکلی نعناع بر دانسیته نورون‌های آلفای شاخ قدامی نخاع پس از کمپرسیون عصب سیاتیک در موش‫های صحرایی نر انجام شده است.

مواد و روش‌ها

به‫‌منظور رعایت اصول اخلاقی، کار بر روی حیوانات بر اساس پروتوکل هلسینکی و دستور کار انجمن علوم اعصاب آمریکا انجام شد (11). گیاه نعناع به‫طور دستچین از استان خراسان رضوی و توابع شهرستان نیشابور جمع‫آوری شد. این گیاه توسط مرکز هرباریوم دانشکده علوم دانشگاه آزاد مشهد با کد 9828 مورد تایید قرار گرفت. بعد از شستن با آب معمولی، اجزای گیاه در سایه خشک شدند. سپس به‫صورت پودر جمع آوری شدند. 50 گرم از پودر خشک گیاه نعناع داخل کاغذ مخصوص کارتوش ریخته و در دستگاه سوکسله قرار داده شد. سپس 150 میلی‫لیتر آب مقطر و 150 میلی‫لیتر اتانول 96 درصد در محفظه مخصوص دستگاه ریخته شد. همچنان که کیسه حرارتی دستگاه، آرام آرام گرم می‌شود حلال (آب و الکل) نیز گرم شده و عصاره گیاه نعناع با حلال مخلوط گشته و به بالن بر می‌گردد. بدین ترتیب از حجم کل محلول کاسته نمی‌شود. عصاره‌گیری در 10 ساعت صورت گرفت تا اطمینان حاصل شود که تمام عصاره قابل حل در حلال از پودر استخراج شده است (12). در نهایت 34/6 گرم عصاره خشک به‫دست آمد بازده روش 68/12 درصد بود. موش‌های صحرایی نر از بخش حیوانات دانشکده پزشکی دانشگاه فردوسی مشهد خریداری شدند. تا زمان انجام آزمایش حیوانات در شرایط نوری استاندارد روزانه و درجه حرارت 22 تا 24 درجه سانتی‌گراد در اتاق حیوانات دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد نگه‫داری شدند. آب مورد نیاز حیوانات از آب آشامیدنی شهر و غذای آن‌ها نیز دارای فرمول استاندارد و از شرکت جوانه خراسان تهیه شد. در این تحقیق 30 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 250 تا 300 گرم به شش گروه 5 تایی کنترل، کمپرسیون، کمپرسیون + تیمار با دوز50 میلی گرم (A)، کمپرسیون + تیمار با دوز 75 میلی‫گرم .(B) کمپرسیون+ تیمار با دوز 100میلی گرم (C) تقسیم شدند. به‫صورت تجربی در مطالعات قبلی اثبات شده است که این دوز‫هامی‫تواند موثر باشد (13).

عصاره در 2 نوبت در روزهای اول هم‌زمان با کمپرسیون و در روز هفتم به‌‫صورت درون صفاقی تزریق شد. رت‌های هر گروه با تزریق داخل صفاقی ماده بیهوشی زایلازین 6 میلی‌گرم و کتامین 60 میلی‫گرم به نسبت وزن بدن بی‫هوش شدند، سپس عصب سیاتیک پای راست در ناحیه سر استخوان ران توسط پنس قفل‌دار (قفل دوم برای 60 ثانیه) تحت کمپرسیون قرار گرفت (13). پس از کمپرسیون محل ضایعه ضدعفونی و توسط گیره فلزی بخیه زده شد. بعد از این که موش‌ها هوشیاری اولیه خود را به‫دست آوردند به قفس‌های جداگانه منتقل و در شرایط استاندارد اتاق حیوانات از نظر نور، دما و رطوبت نگه‫د‫اری شدند. در گروه‌های تیمار اولین تزریق عصاره بلافاصله بعد از انجام عمل کمپرسیون انجام شد و دومین مرحله تزریق درون صفاقی عصاره در گروه‌های تیمار 7 روز پس از اولین تزریق صورت گرفت. 28 روز پس از کمپرسیون از قطعات نخاعی مربوط به عصب سیاتیک (L4-L6) نمونه برداری انجام شد (13). از آنجا که بافت عصبی بافتی حساس است و سریعا دچار فرآیند‫های اتولیز می‫شود و علاوه بر این تثبیت کننده به‫علت وجود پرده‫های سخت اطراف نخاع نیز به‫خوبی در آن نفوذ نمی‫کند. برای تثبیت از روش پرفیوژن استفاده شد. در این روش در حیوان بی‫هوش، تثبیت کننده (فرمالین 10 درصد نمکی) در بستر‫های عروقی جریان می‫یابد (14). پس از اتمام پرفیوژن، نمونه برداری از نخاع انجام شد. ابتدا با قیچی ناحیه قفسه سینه باز شده تمام محتویات قفسه سینه و شکم خارج می‫شود سپس در ناحیه مهره‫های قفسه سینه با اسکارپل ستون مهره‫ها به‫طور عرضی برش خورده و به‫آرامی با قیچی نوک باریک سطح شکمی مهره‫ها تا انتهای ستون مهره‫ها  برش خورده و برداشته شده و نخاع به‫صورت کامل خارج می‫شود. برای یکسان بودن نمونه برداری در همه نمونه‫ها،  نخاع به‫طور کامل تا انتهای دم اسب جدا شد و از انتهای دم اسب به اندازه 18 میلی‫متر بالا رفته و نمونه‫هایی به‫طول 8 میلی‫متر تهیه شد. نمونه‫های تهیه شده به‫مدت 2 هفته درون فیکساتور قرار گرفته و پس از آن وارد مرحله پاساژ بافتی شدند. نمونه‫ها پس از طی مراحل پاساژ وارد مرحله برش‫گیری شده، برش‫گیری با استفاده از دستگاه میکروتوم انجام شد. برش‫گیری به‫صورت سریالی صورت گرفت به این صورت که از هر 30 برش 3 برش متوالی بر روی لام قرار گرفت و در نهایت از هر نمونه 30 لام تهیه شد. و برش‫های سریال 7 میکرونی تهیه شده با آبی تولوئیدین و ائوزین رنگ آمیزی شدند (14). با استفاده از دستگاه فتومیکروسکپ از منطقه شاخ قدامی نخاع در سمت راست در لام‫های تهیه شده، از 2 برش متوالی عکس‫هایی تهیه شد برای شمارش نورون‫های حرکتی آلفا شاخ قدامی نخاع در سمت راست، از روش دایسکتور استفاده شد. در این روش در یک چهار چوب مرجع نورون‫ها شمارش می‌‫شوند. اگر ذره‫ای در چهار چوب مرجع باشد ولی در چهار چوب بعدی (در برش متوالی بعدی) نباشد، در شمارش به‫حساب می‫آید، اما اگر نورونی در هر دو چهار چوب باشد، در شمارش محسوب نمی‫شود (15).

آنالیز آماری

برای بررسی داده‫ها به پارامتر دانسیته نورون‫ها (ND) نیاز بود که از طریق فرمول زیر محاسبه شد (15).

ND=åQ/åFrame × V dissector

Q∑: مجموع نورون­های شمارش شده در یک نمونه

frame∑: مجموع دفعات نمونه ­برداری شده

V dissector: حجم چهارچوب نمونه­برداری که برابر است با:

Vdissector =A Frame×H

:A Frame مساحت چهارچوب نمونه ­برداری

H: فاصله بین دو برش یا ضخامت هر برش

نتایج

شمارش نورون‫های حرکتی آلفا و دانسیته نورونی در شاخ قدامی نخاع در گروه‫های مختلف نشان داد که پدیده کمپرسیون باعث کاهش معنی‫دار دانسیته نورونی در نورون‌های شاخ قدامی نخاع پس از کمپرسیون نسبت به گروه کنترل شده (001/0p<) و در گروه‫های تیمار در مقایسه با کمپرسیون دانسیته نورونی افزایش یافته است (001/0p<). بیشترین اثرات حفاظت نورونی مربوط به دوز 100 میلی‫گرم بود.

جدول 1: بررسی معنی‫داری اختلاف دانسیته نورون‌های حرکتی آلفا در شاخ قدامی نیمه راست نخاع بین گروه کمپرسیون و سایر گروه‌ها (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100)

نمودار 1: مقایسه دانسیته تعداد نورون‌های حرکتی آلفا در شاخ قدامی نیمه راست نخاع بین گروه­ کمپرسیون و سایرگروه­ها (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100) (6n=). در هرگروه اعداد بیانگر میانگین دانسـیته نورونی ± انحراف استاندارد می‌باشد.

***: اختلاف معنی‫داری را نشان می‫دهد 001/0p

&&&: اختلاف معنی‫داری را نشان می‫دهد001/0p<. (مقایسه گروه کمپرسیون با گروه کنترل)

آنالیز داده‌ها نشان می‌دهد که بین گروه کمپرسیون با گروه‌های (کنترل، هیدروالکلی50، هیدروالکلی 75، هیدروالکلی 100) تفاوت معنی‌داری (001/0p<) در دانسیته نورونی وجود دارد به‫طوری‫که این معنی‫داری به‫صورت افزایش دانسیته تعداد نورون‌ها در گروه‫های تیمار هیدروالکلی (دوز 50 میلی‫گرم برکیلوگرم) و (دوز 75 میلی‫گرم برکیلوگرم) و (دوز 100 میلی‫گرم برکیلوگرم) نسبت به گروه کمپرسیون می باشد.

نتایج هیستولوژی

جهت بررسی میکروسکوپی تغییرات ایجاد شده، از شاخ قدامی  نیمه راست نخاع تصاویری تهیه شده که در آن تغییرات جسم سلولی نورون‫ها در گروه‫های مختلف قابل مقایسه است. در گروه‫های تیمار و کنترل، جسم سلولی نورون‫های حرکتی نخاع وضعیت نرمال داشته و پدیده دژنراسیون در آن‫ها کمتر دیده می‫شود که بیانگر اثرات احتمالی حفاظتی عصاره هیدروالکلی این گیاه بر جسم سلولی نورون‫ها پس از آسیب عصب سیاتیک است. درحالی‫که در گروه کمپرسیون جسم سلولی چروکیده و غیر نرمال است.

شکل 1: در شکل الف برش عرضی نخاع را در گروه کنترل را نشان می‫دهدکه جسم سلولی نورون های سالم می‫باشد (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب که هسته در مرکز قرار گرفته و  شکل نورون‫ها به‫حالت کروی است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

شکل 2: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه کمپرسیون را نشان می‫دهد که هسته به کنار رانده شده است و به‫تدریج در حال ناپدید شدن است (درشت نماییx 200 ). در شکل ب  نورون‫ها از حالت کروی خارج شده است و ظاهر چندوجهی به‫خود گرفته است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

شکل 3: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 50 (کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 50 میلی گرم/ کیلوگرم) که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع  را  نشان می‫دهد که تزریق عصاره هیدروالکلی دوز (50 میلی‫گرم برکیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب رژنراسیون در آکسون می شود. به‫دنبال تغییرات رژنراسیون در آکسون، جسم سلولی به‫حالت طبیعی در آمده، تورم سلولی کم می‫شود (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب نورون‫ها را نشان می‫دهد که تقریبا به‫حالت کروی نزدیک شده اند (درشت‫نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

شکل 4: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 75 ( کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 75 میلی‫گرم/ کیلوگرم)  که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع را  نشان می‫دهد که تزریق عصاره هیدروالکلی (دوز 75 میلی‫گرم بر کیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب تغییرات رژنراسیون در آکسون می‫شود (درشت نماییx 200 ).  در شکل ب به‫دنبال این تغییرات، جسم سلولی تقریبا به‫حالت طبیعی درآمده و هسته به مرکز برگشته است (درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

[

شکل 5: در شکل الف برش عرضی نخاع در گروه تیمار 100 ( کمپرسیون + عصاره هیدروالکلی با دوز 100 میلی‫گرم/ کیلوگرم) که جسم سلولی نورون‫ها و شاخ قدامی نخاع را نشان می‫دهد تزریق عصاره هیدروالکلی (دوز100 میلی‫گرم بر کیلوگرم) پس از کمپرسیون عصب سیاتیک موجب تغییرات رژنراسیون در آکسون می‫شود (درشت‫نماییx 200 ). در شکل ب  به‫دنبال تغییرات در رژنراسیون آکسون، جسم سلولی به‫حالت طبیعی در آمده، تورم سلولی کم می‫شود، هسته به مرکز بر می‫گردد و این تغییرات به ویژگی‫های گروه کنترل نزدیک‫تر می‫شود(درشت نماییx1600). (رنگ آمیزی آبی تولوئیدین- اریتروزین).

شکل 6: تصویر میکروسکپی حاصل از برش عرضی قطعات نخاعی عصب سیاتیک (L1-L4)