مقدمه

سرطان بیماری مهلکی است که برخلاف کشف داروهای ضد سرطان همچنان منجر به مرگ و میر می­شود (1). اخیرا استفاده از نانو ذرات با قطر کمتر از 100 نانومتر(nm)  منجر به پیشرفت­های مهمی در تشخیص و درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله سرطان در هر دو محیط in vivo   و in vitro  شده است (2).

مطالعات نشان می­دهد که نانو ذرات بر اساس اندازه، شکل، ترکیب، پوشش و ... تاثیرات متفاوتی نشان می­دهند (3). نانو ذرات اکسید آهن تنها نانو ذرات اکسید فلز تایید شده برای استفاده کلینیکی در تشخیص سرطان هستند (4 و 5).

نانو ذرات به‏دلیل اندازه بسیار کوچک و میزان سطح به حجم بسیار بالا، دارای ویژگی­های منحصر به‏فردی هستند که در علوم پزشکی از این ویژگی­ها جهت تشخیص و درمان بیماری­ها بهره گرفته می­شود (6 و 7). بسیاری از محققین اخیرا درصدد دستیابی به موارد استفاده دارویی به‏خصوص دارورسانی هدفمند و تصویربرداری پزشکی با کمک نانو ساختارها هستند (8).

توسعه دانش نانوتکنولوژی، بحث و تبادل نظر در مورد سمیت نانو مواد و تاثیر آن‏ها بر محیط زیست و سلامت انسان را به‏همراه دارد. مواد سمی منجربه پاسخ­های گوناگونی در محیط سلول می­شوند (9).

با وجود مطالعات گسترده در زمینه سمیت نانومواد بر آسیب میتوکندری­ها، استرس اکسیداتیو، آسیب ژنوم، تغییر تنظیمات چرخه سلولی و دناتوره کردن پروتئین­ها، مکانیسم چگونگی عمل آن‏ها بر اجزای بدن هنوز ناشناخته مانده است. یکی از مکانیسم­های محتمل در ارتباط با مکانیسم عمل نانو ذرات، ایجاد رادیکال­های واکنش­گر اکسیژن (ROS یاreactive oxygen species) و در نتیجه آن ایجاد استرس اکسیداتیو است که منجر به‏وقوع تغییراتی در میزان کلسیم خارج سلولی، وقوع پاسخ­های التهابی سلول، فعال­سازی فاکتورهای رونویسی (p53 یک فاکتور رونویسی است) و افزایش تولید سیتوکین­ها می­شود. التهاب و استرس اکسیداتیو سبب آسیب دیدگی مولکول­های زیستی شامل لیپیدها، پروتیین­ها و ژنوم می­شود که خود منجر به تخریب سلول­ها و بافت­ها و در نهایت سمیت ژنی و سمیت سلولی می­‏شود (10).

قابل توجه­ترین روش قرار گرفتن در معرض نانو ذرات، روش تنفس است. تنفس عمیق نانو ذرات، ممکن است سبب فرار این ذرات از فاگوسیت­ها و غشاهای سلولی ریه شده و به دیگر بخش­های بدن انتشار یافته و باعث اثرات مخرب می‏شود (11).

ذرات کوچکتر از 100 نانومتر از طریق بازدم خارج نمی­شوند و تقریبا همه آن‏ها در آلوئول­ها باقی مانده و ناراحتی­های مزمن را ایجاد می­کنند. نانو ذرات دارای قابلیت و توانایی ورود، جابه‏جایی در درون بدن و آسیب به موجودات زنده می­باشند. این توانایی، عمدتا به‏خاطر اندازه کوچک آن‏هاست که اجازه نفوذشان به موانع فیزیولوژیک و عبور در داخل سیستم گردش خون میزبان را می­دهد (12).

ژن  p53 یک ژن سرکوبگر تومور است که در موش روی کروموزوم 11 و درانسان روی کروموزوم 17 قرار دارد (13). ژن p53 و پروتئین آن تکثیر و مرگ برنامه­ریزی شده سلول را کنترل نموده و نقش مهمی در درمان سرطان ایفا می­کند (14،  15 و 16).

در طی تحقیقاتی گزارش شده است که حضور نانو ذرات مغناطیسی یک مسمومیت سلولی وابسته به دوز را تحریک می­کند و منجر به افزایش بیان p53 در سطح mRNA در سلول­های کشت شده فئوکروموسیتوم (pc12) می­شود (17 و 18).

نانوذرات به صورت استنشاقی، خوراکی، تزریقی و پوستی وارد بدن موجودات زنده از جمله انسان شده و از آنجا که توانایی عبور از غشاهای زیستی را دارند می­توانند تاثیرات بالقوه سوء بر سلامت انسان و محیط زیست داشته باشند.

مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر استنشاق نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن بر روی بیان پروتئین p53 در بافت بیضه­ی موش آزمایشگاهی انجام شد.

مواد و روش‌ها

هجده سر موش­ سوری نر نژاد Balb/C شش هفته­ای با وزن 25 تا 30 گرم از انستیتو پاستور تهران تهیه شده و در حیوانخانه دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان نگهداری شدند. موش­ها به‏صورت تصادفی به قفس­های پلاستیکی منتقل شدند و اجازه داده شد تا یک هفته قبل از شروع آزمایش با محیط خو بگیرند. محیط آزمایشگاه دارای شرایط استاندارد با دمای آزمایشگاه 2 ± 23 درجه سانتی‏گراد، رطوبت نسبی 45 تا 65 درصد و چرخه نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی بود و غذا و آب همیشه در دسترس موش­ها فراهم بود.

پودر نانو ذرات مغناطیسی آهن از شرکت پیشگامان نانومواد مشهد تهیه شد. برای تهیه محلول نانو ذرات، پودر سیاهرنگ نانو ذرات مغناطیسی آهن با اندازه 15 تا 20 نانومتر در آب مقطر حل شد. دوزهای متفاوت با فرمولC1V1=C2V2  تهیه شد.

موش­ها به‏طور تصادفی به سه گروه شش­تایی تقسیم شدند: گروه صفر یا کنترل که نانو ذرات را دریافت نکردند؛ گروه تجربی 1 و گروه تجربی 2 که به‏ترتیب نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن را به‏میزان 1000 و 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر به‏طریق استنشاقی دریافت کردند. موش­های سوری روزانه به‏مدت 45 دقیقه این نانو ذرات را در نبولایزر، استنشاق کردند. نبولایزر نانوذرات مصرفی را که به صورت محلول است، به ذرات ریز تقسیم می‌کند. این کار توسط پمپ هوای داخل دستگاه که برای کمپرس کردن هوای داخل دستگاه تعبیه شده صورت می­گیرد. گاز از طریق یک روزنه خارج شده و از بالای یک لوله موئین حاوی محلول نانوذرات عبور می‌کند. بعلت فشار منفی ایجاد شده از حرکت هوای فشرده شده، محلول از دیواره مویین محفظه به بالا کشیده شده و از قسمت انتهایی نبولایز خارج می‌شود. این نانوذرات به مدت هشت روز به حیوانات داده شد.

بعد از هشت روز، موش­ها توسط کلروفرم بی‏هوش شده و تشریح شدند. سپس بافت بیضه جدا گردیده و در فرمالین 10 درصد فیکس شد. به‏دنبال آن، بافت­ها آبگیری و در پارافین قالب­گیری شدند. بعد از مقطع­گیری با دستگاه میکروتوم و انتقال نمونه­ها بر روی لام، رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی با تکنیک آویدین ـ بیوتین (Avidin-Biotin) صورت گرفت. بدین ترتیب که پارافین­زدایی لام­ها و آب‏دهی با درجات نزولی الکل انجام شد و لام­ها در سه مرحله پنج دقیقه­ای با محلول PBS شستشو شدند. سپس در محلول بلاک­کننده و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در ظرف مرطوب به‏مدت یک ساعت قرار داده شدند. نمونه­ها به‏مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی­گراد در آنتی­بادی قرار گرفته، لام­ها با PBS شسته شده سپس در محلول H₂O₂ به‏مدت 30 دقیقه قرار گرفته و مجددا با PBS شسته شدند. به‏ترتیب از محلول بیوتین و آویدین به‏مدت 30 دقیقه استفاده شد و شستشو با PBS انجام شد. سپس از DAB رقیق شده به‏مدت 10 دقیقه در تاریکی استفاده شد.

سپس نمونه‏ها با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتند. سلول­های مثبت که نشان­دهنده تجمع پروتئین p53 بودند به‏رنگ قهوه­ای درآمدند.

برای هر کدام از گروه­ها، سلول­های رنگ­­آمیزی شده (به رنگ قهوه­ای) و کل سلول­ها در هشت اسلاید شمارش شد.

 بعد از جمع­آوری اطلاعات، جهت تجزیه و تحلیل آماری داده­ها از نرم­افزارهایMicrosoft Excel ،SPSS  (آزمون t تست مستقل) و Prism با سطح معنی­داری 05/0>p و 01/0 >p استفاده شد.

نتایج

نتایج حاصل از رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی نشان داد که میزان بیان پروتئین p53 در بافت بیضه موش­هایی که تحت تاثیر استنشاقی نانوذرات اکسید آهن قرار گرفته بودند، در هر دو غلظت 1000 و 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر به‏طور چشم­گیری افزایش یافته بود. در گروه کنترل، تجمع این پروتئین در سلول­ها مشاهده نشد (شکل 1).

شکل 1: بافت بیضه موش در حالت طبیعی (گروه کنترل). رنگ آمیزی آویدین ـ بیوتین، بزرگ­نمایی ×400

در دوزهای 1000 و 2000  میکروگرم بر میلی­لیتر تجمع پروتئین در سلول­ها به رنگ قهوه­ای مشاهده شد (شکل‏های 2 و 3).

شکل 2: بافت بیضه موش تحت تاثیر استنشاق نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن با غلظت 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر. نوک فلش نشان‏دهنده سلول­های بیان­کننده پروتئین (به رنگ قهوه­ای)، رنگ­آمیزی آویدین ـ بیوتین، بزرگ­نمایی ×100

شکل 3: بافت بیضه موش تحت تاثیر استنشاق نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن با غلظت 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر. نوک فلش نشان‏دهنده سلول­های بیان­کننده پروتئین (به رنگ قهوه­ای)، رنگ­آمیزی آویدین ـ بیوتین، بزرگ­نمایی ×400

نمودار 1 نشان می‏دهد که تغییر معنی­داری در میزان بیان پروتئین p53 در گروه 1 (1000 میکروگرم بر میلی­لیتر) نسبت به گروه کنترل مشاهده می­شود (05/0p <). همچنین نمودار 1 بیانگر این است که افزایش معنی­داری در میزان بیان پروتئین p53 با افزایش میزان نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن از گروه تجربی 1 (1000 میکروگرم بر میلی­لیتر) به گروه تجربی 2 (2000 میکروگرم بر میلی­لیتر) وجود دارد (01/0 > p).

نمودار 1: بیان پروتئین p53 در بافت بیضه موش تحت تاثیر نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن.  داده­ها بصورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. از آنالیز آماری t-test استفاده شده است. **: نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 05/0 > p در گروه کنترل (غلظت صفر) با گروه تجربی 1 (غلظت 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر). ***: نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 01/0 >p  در گروه­ تجربی 1 (غلظت 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر) با گروه تجربی 2 (غلظت 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر).

بحث

طی مطالعه­ی دیگری بر روی اثر استنشاقی نانو ذرات انجام شد مشخص شد که این ذرات می­توانند برای بدن سمی باشند (22). همچنین در مطالعه­ای دیگر که بر روی موش­ها انجام شد مشخص شد که نانو ذرات مغناطیسی پوشش داده شده با دکستران بعد از تزریق به حیوانات پس از گذشت پنج دقیقه در کبد و طحال تجمع پیدا می­کنند (23).

طی مطالعاتی که بر روی موش سوری توسط نانو ذرات مغناطیسی اکسید آهن با پوشش DMSA انجام دادند، مشاهده کردند که تجمع نانو ذرات در ریه­ها منجر به ایجاد پاسخ التهابی در این اندام­ها می­شود (24). همچنین مشخص شد که این نانو ذرات باعث افزایش نفوذپذیری سلول­های اندوتلیال عروق ریز می­شوند (25).

در تحقیقات دیگر، نشان داده شد که تزریق نانو ذرات مغناطیسی پوشش­دار شده با پلی­آسپارتیک اسید به موش­ها، در طی گذشت سی روز از تیمار منجر به کاهش تعداد لنفوسیت­ها و افزایش همزمان مونوسیت­ها می‏شودد که احتمال دارد نشانگر پاسخ التهابی بدن به عوامل خارجی باشد (26). نتایج مطالعات فوق تا حدودی با نتایج مطالعه حاضر در خصوص تجمع نانوذرات و آسیب بافتی حاصل از دوزهای بالا مطابقت دارد.

ژن  P53و پروتئین حاصل از آن بطور طبیعی تقسیم و رشد سلول را تحت نظارت دارد. وظایف پروتئین P53 در حال طبیعی تنظیم تقسیم سلول­ها، مسن شدن سلول­ها، جلوگیری از ساختن عروق تازه، تمایز یافتن سلول­ها، و متابولیسم DNA است. همکاری پروتئین P53 با دو پروتئینCDC2  وCDK1-P2، سلول­های سرطانی را در مراحل G1 و G2 تقسیم سلول نگه می­دارد. پروتئین P53 پس از صدمات ژن­های دیگر به DNA متصل می­شود و باعث تولید پروتئین P21 می­شود که خود به پروتئین CDK2 می­چسبد و اجازه ورود چرخه سلولی به مرحله بعدی تقسیم را نمی­دهد. اعمال ضد سرطانی این پروتئین از مسیرهای زیر انجام می­شود: 1- زمانی که DNA آسیب دیده است پروتئین p53 می­تواند پروتئین­های ترمیم­کننده DNA را فعال کند. 2- پروتئین P53 تقسیم سلولی را در مرحله G1/S نگه می­دارد تا فرصتی برای تعمیر باشد. 3- در صورتی که آسیب DNA زیاد و غیرقابل تعمیر باشد می­تواند مرگ برنامه­ریزی شده سلول را آغاز کند. در یک سلول معمولی P53  توسط یک تنظیم کننده به نام MDM2 غیرفعال می­شود. در هنگام آسیب DNA یا استرس­های دیگر، P53 فسفوریله شده و خاصیت چسبیدن به MDM2 را از دست می­دهد. بنابراین کمپلکس P53 و MDM2 از هم جدا شده و P53 باعث توقف چرخه سلولی می­شود. این توقف یا باعث ترمیم و بقای سلول شده یا باعث مرگ و حذف شدن سلول آسیب دیده می­شود. P53 بعد از فعال شدن بهDNA  متصل می­شود و بیان چندین ژن مانند WAF1 و CIP1 که پروتئین P21 را کد می­کنند، فعال می­کند. P21 کمک می­کند تا چرخه سلولی در مرحله G1 به S متوقف شود. P53 در صورت جهش یافتن به DNA نمی­چسبد و در نتیجه پروتئین P21 نخواهد توانست به عنوان یک علامت برای توقف تقسیم سلول ایفای نقش کند. بنابراین سلول­ها به طور غیرقابل کنترل تقسیم می­شوند و تومور تشکیل می­دهند. آسیب سلولی باعث افزایش نیمه عمر پروتئین P53 و تجمع سریع این پروتئین در سلول­های تنش دیده می­شود و همچنین باعث ایجاد یک تغییر ساختاری و فعال شدن این پروتئین به عنوان تنظیم­کننده نسخه­برداری می­شود. فعال شدن P53 مربوط به فسفوریلاسیون جایگاه نیتروژن انتهایی (N ترمینال) آن است. این جایگاه شامل تعداد زیادی از بخش­های فسفوریلاسیون است که می­توانند به عنوان هدف اولیه برای پروتئین­کینازها در نظر گرفته شوند که علایم تنش را منتقل می­کنند (27 و 28). 

مطالعه حاضر که بررسی اثر نانو ذرات با روش استنشاقی می­باشد، نتایج مشابهی در راستای تحریک سلول­ها و افزایش بیان پروتئین p53 در بافت بیضه را نشان می­دهد. استنشاق نانوذرات اکسید آهن در هر دو غلظت 1000 و 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر باعث افزایش بیان این پروتئین در سلول­های بافت بیضه شده است.

به طور کلی، شواهد موجود برای خطرناک ارزیابی کردن بالقوه نانوذرات اکسید آهن برای سلامت انسان کافی نمی­باشد و تحقیقات بیشتری در این زمینه از جمله مطالعات در مورد اثرات درازمدت و دوزهای متفاوت این نانوذرات مورد نیاز است.

نتیجه‌گیری

نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که تغییر معنی­داری در بیان پروتئین مذکور در بافت بیضه نسبت به گروه شاهد وجود داشت. این نانو ذرات می­توانند سبب تغییرات چشم‏گیری در بیان پروتئین p53 در بافت بیضه در هر دو غلظت 1000 و 2000 میکروگرم بر میلی­لیتر شوند. افزایش بیان پروتئین p53 در بافت بیضه نشانه ورود و ماندگاری (عدم دفع) نانو ذرات آهن به‏مدت طولانی و آسیب به بافت بیضه می­باشد. افزایش بیان پروتئین p53 با افزایش غلظت نانو ذرات تنفسی، نشانگر افزایش صدمه نانو ذرات اکسید آهن به بافت­های بیضه همراه با افزایش غلظت آن‏ها می­باشد.

منابع

1. Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011; 61(2): 69-90.

2. Heath JR, Davis ME. Nanotechnology and cancer. Annu Rev Med. 2008; 59: 251-265.

3. Stone V, Johnston H, Clift MJD. Air pollution, ultrafine and nanoparticle toxicology: cellular and molecular interactions. IEEE Trans Nanobiosci. 2007; 56(6): 331-340.

4. Szalay B. Iron oxide nanoparticles and their toxicological effects: in vivo and in vitro studies: szte. PhD Thesis. Department of Public Health, Faculty of Medicine, University of Szeged. 2012; 1-18.

5. Peng XH, Qian X, Mao H, Wang AY, et al. Targeted magnetic iron oxide nanoparticles for tumor imaging and therapy. Int J Nanomedicine. 2008; 3(3): 311-21.

6. Das M, Saxena N, Dwivedi PD. Emerging trends of nanoparticles application in food technology: Safety paradigms. Nanotoxicol. 2009; 3(1): 10-18.

7. Iavicoli I, Leso V, Bergamaschi A. Toxicological Effects of Titanium Dioxide Nanoparticles: Eur Review Med Pharmacol Sci. 2011; 15(5): 481-508.

8. Mao HY, Laurent S, Chen W, Akhavan O, et al. Graphene: promises,facts, opportunities, and challenges in nanomedicine. Chem Rev. 2013; 113(2013): 3407-3424.

9. Foley S, Crowley C, Smaihi M, Bonfils C, et al. Cellular localization of a water-soluble fullerene derivative. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294(2002): 116-119.

10. Johnston HS. Atmospheric ozone. Annu Rev Phys Chem. 1992; 43: 1-31.

11. Kim WY, Kim J, Park JD, Ryu HY, et al. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of fischer 344 rats. J Toxicol Environ. 2009; 72(21-22): 1279-1284.

12. Sampson EJ, Whitner VS, Burtis CA, McKneally SS, et al. An interlaboratory evaluation of the IFCC method for aspartate aminotransferase with use of purified enzyme materials. Clin Chem. 1980; 26(8): 1156-1164.

13. McBride OW, Merry D, Givol D. The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13). PNAS. 1986; 83(1): 130-134.

14. Hartmann A, Blaszyk H, Kovach JS, Sommer SS. The molecular epidemiology of p53 gene mutations in human breast cancer. TIG. 1997; 13(1): 27-33.

15. Ye W, Xu P, Jen R, Feng E, et al. Zeranol Down-Regulates p53Expression in Primary Cultured Human Breast Cancer Epithelial Cells through Epigenetic Modification. IJMS. 2011; 12: 1519-1532.

16. Sharpless NE, Alson S, Chan S, Silver DP, et al. p16INK4a and p53 deficiency cooperate in tumorigenesis. Cancer Res. 2002; 62: 2761-2765.

17. Wu J, Sun J. Investigation on mechanism of growth arrest induced by iron oxide nanoparticles in PC12 cells. J Nanosci Nanotechnol. 2011; 11(5):11079-11083.

18. Card JW, Zeldin DC, Bonner JC, Nestmann, ER. Pulmonary applications and toxicity of engineered nanoparticles. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008; 295(3): L400-411

.