مقدمه

پارکینسون دومین بیماری مخرب عصبی شایع در جهان است که در 1درصد از افراد بالای60 سال و 4 درصد از افراد بالای 85 سال شیوع دارد (1). یکی از شاخص‏­های اصلی این بیماری مرگ نورون‏های دوپامین­ساز مغز میانی است(2). این سلول‏ها با تولید دوپامین، که یک انتقال دهنده عصبی است (3)، یکی از مهم‏ترین مسیرهای انتقال دوپامین در مغز میانی یعنی مسیر نیگرو- استریاتال را راه اندازی و نقش اصلی را در کنترل و اجرای حرکات بدن ایفا می­کنند (4 و 5). با مرگ این سلول‏ها و عدم تولید دوپامین، علایم پاتولوژیکی این بیماری از جمله: سفت شدن عضلات و انقباض طولانی مدت آن‏ها، کند شدن حرکات و ناتوانی در شروع و طراحی آن‏ها، انقباض و انبساط ریتمیک عضلات و عدم تعادل بدن، در فرد بیمار بروز می­کند (6 و 7).

بیماری پارکینسون به‏عنوان یک بیماری چندعاملی که هم عوامل ژنتیکی و هم عوامل محیطی در آن دخیل هستند، شناخته می­شود. عوامل محیطی بیشترین نقش را در ایجاد این بیماری ایفا می­کنند که از مهم‏ترین آن‏ها می‏توان به فاکتورهای محیطی ایجاد کننده استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی اشاره کرد. نورون‏های دوپامین‌ساز ناحیه­ی سابستنشیا نیگرا (SN) بسیار مستعد رویارویی با پدیده­ی استرس اکسیداتیو هستند. زیرا هم مصرف اکسیژن بالایی دارند و هم سطح آنزیم­های آنتی‏اکسیدانت در این سلول‏ها پایین است (8). التهاب مزمن ایجاد شده در مغز التهاب عصبی نامیده می­شود. در اکثر بیماری‌های مخرب عصبی از جمله پارکینسون هم التهاب مزمن موضعی ناشی از سلول‏های ایمنی ساکن در مغز، میکروگلیاها، و هم التهاب ناشی از نفوذ لوکوسیت­ها از دیواره­ی رگ­ها به داخل بافت مغزی دیده شده است (9 و 10). انتقال ژن‏های کدکننده­ی فاکتورهای ضد استرس و ضد التهاب از روش‏های جدید و رو به جلو در تحقیقات روی بیماریهای مخرب عصبی هم‏چون پارکینسون است و بدین منظور انتقال از طریق وکتورهای لنتی ویروسی از پرکاربردترین و مطلوب ترین روش‏ها می‏باشد.

هدف از مطالعه حاضر، بررسی پتانسیل فاکتور Nurr1(Nuclear receptor related protein 1) که قبلا خاصیت ضدالتهابی آن در سلول‏های میکروگلیا و آستروگلیا از طریق سرکوب بیان آن به اثبات رسیده(11) و نیز فاکتورGDNF (Glial cell line derived neurotrophic factor)، که اثر ترمیمی آن بر نورون‏های دوپامین­ساز در بیماری پارکینسون اثبات شده است (12-15)، به صورت توام بر حفاظت نورون‏های دوپامین ساز می­باشد. وجود ارتباط بین دو فاکتور Nurr1 و GDNF (تنظیم بیان ژن گیرنده­ی GDNF (رسپتورRet) توسط  Nurr1) (16 و 17)، عدم بررسی اثر بیش­بیان فاکتور Nurr1 بر نورون‏های دوپامین ساز و نیز عدم کاربرد توام این دو فاکتور برای بررسی التهاب عصبی در نورون‏های دوپامین­ساز، اهمیت و ضرورت تحقیق حاضر را مشخص می‏سازد. به این منظور فاکتورهای مزبور از طریق وکتورهای لنتی ویروسی، به‏ترتیب در سلول‏های نورونی دوپامین‌ساز و سلول‏های آستروسیتوما بیش بیان شدند و از طرف‌دیگر سلول‏های میکروگلیا جداسازی و به‏عنوان منبع فاکتورهای پیش‌التهابی مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین از توکسین6-OHDA(6-hydroxydopamine) به‏عنوان منبع استرس اکسیداتیو استفاده شد. این توکسین که آنالوگ دوپامین می‏باشد از طریق رسپتور DAT(dopamine transferase) جذب سلول نورونی شده و سپس با تبدیل شدن به رادیکال‏های آزاد و نیز تداخل در زنجیره تنفسی میتوکندری منجر به نارسایی آن و ایجاد استرس اکسیداتیو در سلول می‏شود (18-20). نتایج ما نشان داد که دو فاکتورNurr1و GDNF هم به تنهایی و هم به‏صورت توأم با اثر هم افزایی، سلول‏های دوپامین‌ساز را در مقابل فاکتورهای التهابی و نیز استرس اکسیداتیو به‏میزان قابل ملاحظه‌ای، در مقایسه با سلول‏های شاهد، محافظت می‏کنند.

مواد و روش‏ها

محلول 2X HBS(HEPES Buffered Saline) برای ترانسفکشن:این محلول طبق روشمذکور در گزارش قبلی گروه ما (21) تهیه و پس از استریل کردن با فیلتر 2/0 میکرومتر برای ماندگاری بیشتر در دمای 20- درجه سانتی‏گرادنگه‏داری شد.

محلول :(3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) MTTاین محلول در غلظت 5 میلی‏گرم بر میکرولیتربا حل کردن پودر MTT (ساخت شرکت سیگما آلمان) در PBS و سپس استریل کردن با فیلتر 2/0 میکرومتر، تهیه و برای ماندگاری طولانی مدت در دمای 20-درجه سانتی‏گرادنگه‏داری شد.

محلول گریس (Griess): شامل دو محلول A و B می‌باشد. محلول A : مقدار 5/0 گرم از پودر سولفانیل­آمید (sulfonyl amide) در50 میلی‏لیتر اسیدفسفریک 5 درصد حل و برای ماندگاری طولانی مدت در یخچال نگه‏داری شد.محلول B: مقدار 50 میلی گرم از پودر NED (N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride)  در 50 میلی‏لیتر آب تزریقی حل و برای ماندگاری طولانی مدت در یخچال نگه‏داری شد.

 :(Lipopolysaccaride) LPSپودر لیپوپلی­ساکارید (L8274) (ساخت شرکت سیگما آلمان)، غلظت اولیه 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر­ از آن در بافر نمکی فسفات (PBS) تهیه و از طریق فیلتراسیون با فیلتر 2/0 میکرلیتر استریل و برای نگه‏داری طولانی­مدت در 20- درجه سانتی‏گرادنگه­داری شد.

روش‏های سلولی و مولکولی

تهیه­ی سلول‏های مخلوط گلیال و جداسازی سلول‏های میکروگلیا:این کار عینا مطابق گزارش قبلی ما انجام شد (22). به‏طور خلاصه مغز نوزادان رت 1 تا 3 روزه جداسازی و پس از برداشتن پرده­ مننژ و خرد کردن بافت مغز، در محیطDMEMDolbeco Modified Eagle Medium)) حاوی 10 درصد FBS(Fetal Bovine Serum) و 1 درصد آنتی­بیوتیک Pen/Strep(Penicillin/Streptomycin)، هر سه ساخت شرکت GIBCOآمریکا، در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد وCO₂،5 درصد کشت داده شدند.پس از 10 الی 13 روزسلول‏های معلق یا نیمه­چسبیده، میکروگلیا، با شیک دستی فلاسک­ها از دیگر سلول‏های گلیال جدا و پس از شمارش به تعداد 10⁴×8 سلول در هر چاهک از پلیت 24 خانه­ای جدید کشت داده شدند.

فعال­سازی سلول‏های میکروگلیا: سلول‏های میکروگلیا 24 ساعت پس از جداسازی از سلول‏های مخلوط گلیال، در معرض غلظتهای نهایی 1 و 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر از LPS قرار گرفته و به‏مدت 48 ساعت با آن انکوبه شدند. سپس محیط مشروط این سلول‏ها جمع­آوری و با هدف ذخیره­سازی طولانی­مدت در  20-درجه سانتی‏گرادنگه­داری شد.

تست گریس: برای تایید فعال­سازی سلول‏های میکروگلیا، میزان NO (Nitric Oxide) تولیدی با استفاده از تست رنگ‏سنجی گریس مورد سنجش قرار گرفت. 50 میکرولیتر از محیط مشروط سلول‏های میکروگلیا جدا و به‏صورت سه بار تکراربه میکروپلیت 96­ خانه­ای منتقل شد، سپس محلول­های A و B مخصوص تست گریس به حجم 50 میکرولیتر به آن اضافه و در آخر میزان NO موجود در این محیط، با سنجش میزان جذب آن در طول موج 540 نانومتربا دستگاه ELISA reader تعیین شد.

ترانسفورماسیون باکتریهای مستعد با ناقل­های پلاسمیدی و استخراج پلاسمید در سطح انبوه:باکتری E.coli سویه­ی DH5α  مستعد، به‏عنوان باکتری میزبان جهت تکثیر ناقل‏های پلاسمیدی استفاده شد. باکتری‏های مزبور با استفاده از روش شوک حرارتی، با پلاسمیدهای ترانسفر (pLV-EGFP ، pLV-hNurr1-EGFP ، pLV-mGDNF-Jred) و پلاسمید پوشش ویروسی (pLTR-G) و نیز پلاسمید بسته بندی (pCDNL-BHDDD) به‏طور جداگانه ترانسفورم شدند.پس از اطمینان از صحت انجام ترانسفورماسیون، پلاسمیدهای مزبور به‏روش استخراج پلاسمید در مقیاس انبوه ( (Maxi prep با استفاده از کیتکیاژنطبق دستورالعمل سازنده استخراج و برای نگه‏داری طولانی مدت در دمای 20- درجه سانتی‏گراد حفظ شدند(21).

کشت رده های سلولی:رده­­ی سلول‏های نورونی دوپامین­ساز SH-SY5Y (ATCC CRL-2266)، رده­ی سلولی آستروسیتوما (1321N1 Human Astrocytoma cell line.European collection of cell culture) و رده­ی سلولی (ATCC CRL-11268) HEK-293T از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری و طبق شرایط مذکور در کشت سلول‏های مخلوط گلیال، کشت داده شدند.

ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T با پلاسمیدهای مربوطه با هدف تولید لنتی­ویروس‏های نوترکیب: این مرحله مشابه روش مذکور در گزارشات قبلی ما انجام شد (23 و 24). به‏طور خلاصه 16 میکروگرم از هر یک از ناقلین ترانسفر، به‏طور جداگانه، با  12 میکروگرم  ناقل بسته­بندی و 10 میکروگرم ناقل غشایی ترکیب و سپس 50 میکرو لیتر از 5/2 مولCaCL₂ به آن‏ها اضافه و در نهایت تا حجم نهایی 500 میکرولیتر به آن‏ها آب تزریقی اضافه و با ورتکس و اسپین کاملا با هم مخلوط شدند. سپس500 میکرولیتراز محلول 2X HBS به آن اضافه و پس از 20 الی30 دقیقه انکوبه شدن در دمای اتاق، به سلول‏های HEK-293Tبه‏صورت قطره قطره اضافه شد. پس از 12 الی 15 ساعت محیط سلول‏ها تعویض ودر نهایت24، 48 و 72 ساعت پس از آن، عکس­برداری فلوئورسنت از سلول‏ها انجام و محیط آن‏ها به‏عنوان محیط حاوی ذرات لنتی‏ویروسی نوترکیب جمع­آوری و در دمای4 درجه سانتی‏گراد نگه­داری شد.

تغلیظ لنتی­ویروس­های نوترکیب:محیط حاوی لنتی‌ویروس­های نوترکیب، در ابتدا به‏منظور ته نشین شدن بقایای سلولی مرده، در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 10 دقیقه با دور rpm2000سانتریفیوژ و سپس از فیلتر 45/0 میکرومتر عبور داده شد و در آخر به ستون‏های  تغلیظ پروتئین آمیکون (ساخت شرکت Millipor، آلمان) با سایز منافذ  KD100منتقل و در آن به‏مدت 15 الی 20 دقیقه با دور  rpm3500 در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد تا زمانی‏که محیط اولیه به‏میزان 50 الی 60 برابر تغلیظ شد.

تعیین تیتر لنتی­ویروس­های نوترکیب:سلول‏هایHEK-293T به‏دلیل دارا بودن قابلیت بالا برای آلوده شدن به ذرات ویروسی، به‏منظور تعیین واحد ترانسداکسیون در میلی­لیتر (TU/ml) استفاده شدند. به‏طور خلاصه سلول‏های مزبور به تعداد 10⁵ 3 در چاهک از پلیت 6 خانه­ای کشت و پس از 24 ساعت، استوک­ تغلیظ شده­ لنتی­ویروس­ نوترکیب pLV-EGFP با نسبت­های رقیق شده 2، 4 ، 10، 20 و 40 برابر در  DMEMو با حجم 100 میکرولیتر، به محیط آن‏ها اضافه و به‏مدت 24 ساعت با آن انکوبه شدند. پس از گذشت 48 ساعت، عکس­برداری فلوئورسنت از سلول‏ها صورت گرفت و در آخر میزان فلوئورسنت حاصل از بیان ترانس­ژن EGFP در نمونه­ها، با فلوسایتومتری سنجش و با استفاده از فرمول روبرو میزان TU/ml محاسبه شد:  TU/ml = (F N D 1000)/V کهF درصد سلول‏های GFP⁺،  Nتعداد سلول‏ها در لحظه­ ترانسداکسیون، D ضریب رقت ویروس و V حجم ویروس اضافه شده به هر نمونه می‏باشد(25 و 26). در آخر به‏منظور ترانسداکسیون سلول‏های هدف، از معیار MOI(Multiplicity of infection)که معادل است با تعداد ذرات ویروسی و تعداد سلول‏ها استفاده شد.

ترانسداکسیون سلول‏های هدف با ناقل­های لنتی‌ویروسی نوترکیب:رده­ی سلولی  SH-SY5Y 24 ساعت قبل از ترانسداکسیون به تعداد 10⁵ 2 در چاهک در پلیت 6 خانه­ای کشت داده شد. سلول‏های کنترل به‏صورت دست نخورده، اما چاهک‏های سلولی­ دیگر به‏صورت دوبار تکرار به ترتیب با لنتی­ویروس­های نوترکیب pLV-EGFP (به‏عنوان کنترل منفی) و  pLV-hNurr1-EGFP (به‏منظور افزایش بیان ژن Nurr1) با نسبتMOI = 120ترانسداکت شدند. سلول‏های آستروسیتوما نیز به‏همین روش تهیه و به‏ترتیب با لنتی­ویروس­های نوترکیب pLV-EGFP (به‏عنوان کنترل منفی) و  pLV-mGDNF-Jred  (به‏منظور افزایش بیان فاکتور GDNF) با نسبتMOI = 120 آلوده­ شدند. 24 ساعت پس از ترانسداکسیون محیط سلول‏ها تعویض و به‏دنبال آن، 48 و 72 ساعت پس از ترانسداکسیون بیان ترانس­ژن‏های EGFP و Jred با میکروسکوپ فلوئورسنت مورد بررسی قرار گرفت. همچنین 72 ساعت پس از ترانسداکسیون، محیط مشروط سلول‏های آستروسیتوما به‏عنوان محیط حاوی فاکتور GDNF جمع­آوری و در دمای  20- درجه سانتی‏گراد نگه­داری شد.

ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T با هدف افزایش بیان :GDNFبه‏منظور تولید مقادیر انبوهی از فاکتورGDNF، علاوه برترانسدوکسیون سلول‏های آستروسیتوما، از ترانسفکشن سلول‏های HEK-293Tنیز استفاده شد. 24 ساعت قبل از ترانسفکشن، سلول‏های مزبور به تعداد 10⁶×5/2 در سه پلیت­ 10 سانتی‏مترتهیه و سپس به‏ترتیب به‏صورت دست نخورده به‏عنوان کنترل، ترانسفکت با 25 میکروگرم از ناقل pLV-EGFP (به‏عنوان کنترل منفی) و ترانسفکت با 25 میکروگرم از ناقل  pLV-mGDNF-Jred (به‏منظور افزایش بیان GDNF) تیمار شدند. 24، 48 و 72 ساعت پس از ترانسفکشن عکس­برداری فلوئورسنت انجام و در نهایت محیط مشروط سلول‏ها در روزهای دوم و سوم پس از ترانسفکشن به‏عنوان محیط حاوی GDNF جمع­آوری و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه­داری شد.

تعیین دوز کشنده­ی محیط مشروط میکروگلیا و توکسین 6-OHDA:به‏منظور تعیین میزانLD₅₀ (Lethal Dose 50 )محیط مشروط میکروگلیا و توکسین 6-OHDA، سلول‏های SH-SY5Y به تعداد 10³×4 در هر چاهکمیکروپلیت 96 خانه­ای کشت و پس از 24 ساعت با مقادیر حجمی10، 20، 40، 60، 80 و 100 میکرولیتر از محیط مشروط میکروگلیا و نیز به‏طور جداگانه با غلظت­های 25/0، 375/0، 5/0، 75/0 و 1میلی مولار از توکسین6-OHDA تیمار و به‏مدت 48 ساعت با این محیط انکوبه شدند. میزان بقای سلول‏ها با استفاده از تست MTT مورد سنجش قرار گرفت. در این تست،MTT که یک نمک تترازولیوم و محلول در آب است در اثر احیا شدن در میتوکندری فعال یک سلول زنده به کریستال­های نامحلول فورمازان تبدیل شده و سپس این کریستال­ها در یک حلال غیر قطبی مانند DMSO(Dimethyl sulfoxide) حل و تولید یک محلول بنفش رنگ می­کنند. هر چه سلول‏های زنده­ی بیشتری موجود باشد مقدار بیشتری از  MTT احیا و کریستال‏های فورمازان بیشتری تولید و به‏دنبال آن شدت رنگ بنفش حاصل از حل شدن این کریستال­ها نیز بیشتر خواهد بود. میزان غلظت رنگ مزبور با استفاده از دستگاه ELISA reader در طول مو­ج‏های 580 و 620 نانومتر نعیین می‏شود.

تیمار سلول‏های SH-SY5Y با محیط مشروط سلول‏های  HEK-293Tو محیط مشروط میکروگلیا:سلول‏های SH-SY5Y کنترل، آلوده شده با لنتی­ویروس EGFP و آلوده­ شده با لنتی­ویروس Nurr1، به تعداد 10³×4 در چاهک در میکروپلیت­ 96 خانه­ای کشت و پس از 24 ساعت با 100 میکرولیتراز محیط مشروط سلول‏های  HEK-293Tترانسفکت نشده، ترانسفکت شده با ناقل پلاسمیدی pLV-EGFP و ترانسفکت شده با ناقل پلاسمیدی pLV-mGDNF-Jred (حاوی فاکتور GDNF) تیمار و 24 ساعت با آن انکوبه و در آخر با دوز کشنده­ی محیط مشروط میکروگلیا تیمار و به‏مدت 48 ساعت دیگر با آن انکوبه شدند. در آخر میزان بقای سلولی با استفاده از تست MTT سنجیده شد.

تیمار سلول‏های SH-SY5Y با محیط مشروط سلول‏های  HEK-293Tو توکسین 6-OHDA:این تیمار نیز عینا مطابق روشمذکور در بخش قبل روی سلول‏های SH-SY5Y انجام شد.با این تفاوت که اینجا سلول‏ها به‏جای محیط مشروط میکروگلیا، با دوز کشنده­ی توکسین 6-OHDA به‏مدت 24 ساعت تیمار شدند.

استخراج RNA وRT-PCR : از تمامی سلول‏های آلوده­ شده با لنتی­ویروس­های مزبور، سلول‏های ترانسفکت شده با هدف تولید فاکتور GDNF و سلول‏های میکروگلیا پس از انجام تیمارهای موردنظر، استخراج RNA با استفاده از کیتRNX-Plus  (ساخت شرکت سیناژن) طبق دستورالعمل سازنده انجام گرفت. پس از سنجش غلظت نمونه­های  RNAبا دستگاه نانودراپ، مقدار 2 میکروگرم از هر یک از آن‏ها به‏منظور تهیه­cDNA، با استفاده از کیتRevertAid^TM First  Strand cDNA Synthesis  (ساخت شرکت فرمنتاز) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. در آخر پرایمرهای اختصاصی برای ژن­های  GAPDH(Glycer Aldehyde Phosphate Dehydrogenase) به‏عنوان کنترل، (Tumor Necrosis Factor-α) TNF-α، iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase )، Nurr1 ،GDNF، (Gluthatione peroxidase 1) GPX1،SOD1 (SuperOxide Dismutase1) ، p53 و BCL2 به‏منظور بررسی سطح بیان ژن‏های مزبور در سلول‏های مربوطه، به‏شرح زیر مورد استفاده قرار گرفت:

GAPDH:

Forward:5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'

Reverse:5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'

TNF-α:

Forward: 5'-GCTCCCTCTCATCAGTTCCA-3'

Reverse:5'-TTGGTGGTTTGCTACGACC-3'

iNOS:

Forward:5'-GACATCGACCAGAAGCTGTC-3'

Reverse:5'-GGGCTCTGTTGAGGTCTAAAG-3'

Nurr1:

Forward: 5'-CGACATTTCTGCCTTCTCCT-3'

Reverse:5'-GAAAGGTAAGGTGTCCAGGA-3'

GDNF:

Forward: 5' -CACCAGATAAACAAATGGCAGTGC-3'

Reverse: 5'-CGACAGGTCATCATCAAAGGCG-3'

GPX1:

Forward: 5'-CTTATCGAGAATGTGGCGTCCC -3'

Reverse: 5'-GCCCACCAGGAACTTCTCAAAG -3'

SOD1:

Forward: 5'- AGGGCATCATCAATTTCGAG -3'

Reverse: 5'- TGCCTCTCTTCATCCTTTGG -3'

P53:

Forward: 5'- CCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTC -3'

Reverse: 5'- GCAGCGCCTCACAACCTCCGTCAT -3'

BCL2:

Forward: 5'- CTGCACCTGACGCCCTTCACC -3'

Reverse: 5'- CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA -3

آنالیز آماری:

داده‏های به‏دست آمده نتیجه سه آزمایش مجزا است که هر کدام به‏صورت تریپلیکیت انجام شدند. آنالیز آماری داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS version 16 انجام گرفت و برای آنالیز تفاوت بین گروه­های مختلف سلولی، از آنالیز یک سویه­ی واریانس (One-way analysis of variance, ANOVA) و تست دانکن (post-hoc Duncan Multiple-comparisons Test)استفاده شد. ارزش 05/0p< به‏صورت معنی­دار و ارزش­01/0p< به‏صورت بسیار معنی­دار تفسیر شد.

نتایج

جداسازی و کشت موفقیت­آمیز سلول‏های مخلوط گلیال

پس از گذشت 11 روز از کشت سلول‏های مخلوط گلیال و عکس­برداری متوالی از آن‏ها، نتایج حاصله در شکل 1 گزارش شده است.بیش از 80 درصد این کشت مخلوط را سلول‏های آستروسیت به‏خود اختصاص می‏دهند که ظاهری مکعبی شکل دارند  و بیشترین بخش زمینه عکس را به‏خود اختصاص داده اند. سلول‏های الیگودندروسیت ظاهری ستاره ای شکل دارند و سلول‏های میکروگلیا به‏صورت سلول‏های گرد و شفاف با اتصالات سست در سطحی­ترین بخش کشت و روی لایه­های آستروسیت قرار گرفته اندکه با شیک دستی فلاسک‏ها قابل جداسازی هستند.

شکل 1: سلول‏های مخلوط گلیال روز اول (A)، روز پنجم (B) و روز یازدهم (C) پس از جداسازی از مغز.بزرگنمایی : 100X

فعال­سازی وتغییر مورفولوژیک در سلول‏های میکروگلیا با تیمار LPS

سلول‏های میکروگلیا 24 ساعت پس از جداسازی با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست مورد تصویربرداری قرار گرفتند. این تصاویر ظاهر دوکی شامل سلول‏های فوق را نشان می‏دهد (شکل 2، A,C). همچنین تصویر سلول‏های مزبور بعد از تیمار با LPS به مدت 48 ساعت جمع آوری شد که در این فرایند تغییر مورفولوژیک آن‏ها از فرم دوکی  به‏فرم آمیبی شکل (ameboid) نمایان می‏باشد.

(شکل 2، B,D). گرم بر میلی‏لیتر لیپوپلی ساکارید (LPS)  نشان می‏دهد (B,D). سلول‏های میکروگلیا در حالت غیرفعال ظاهری دوکی شکل و منشعب دارند اما زمانی که فعال می‏شوند، مثل سلول ماکروفاژی فعال شده به‏روش کلاسیک که توانایی تولید سیتوکین‏های التهابی و ایجاد انفجار تنفسی را دارد، فرمی متورم و تخم مرغی شکل می‏گیرند که این پدیده در شکل 2 نیز کاملا مشهود است و فعال شدن سلول‏های میکروگلیا را پس از تیمار  با لیپوپلی ساکارید LPS)) تایید می‏کند.

شکل2: سلول‏های میکروگلیا قبل (A) و بعد از تیمار(B) با 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر لیپوپلی ساکارید ( ( LPS. قبل (C) و بعد از تیمار(D) با 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر LPS به‏مدت 48 ساعت. بزرگنمایی: × 200

تولید نیتریک اکسید(NO) توسط میکروگلیای تیمار شده باLPS

تست گریس طبق دستورالعمل ارائه شده در بخش مواد و روش­ها انجام شد که نتیجه­ی آن در شکل 3 ارائه شده است. علامت­*** اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) نمونه­های تیمار شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) را در مقایسه با نمونه­ کنترل نشان می‏دهد، درحالی‏که اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) نمونه تیمار شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) 10µg/ml در مقایسه با نمونه تیمار شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) 1µg/ml، با علامت ## نشان داده شده است. همان‏طور که از نمودار پیداست میزان نیتریک اکسید (NO) تولیدی از نمونه­های تیمار شده با LPS، بسیار بیشتر از نمونه­ی کنترل (تیمار نشده) است که تاییدی بر القای بیان ژن iNOS در سطح پروتئین، در نمونه­های تیمار شده میباشد. همچنین میزان NO تولیدی از نمونه­ی تیمار شده با 10µg/ml LPS، بیشتر از نمونه­ی تیمار شده با LPS 1µg/ml است. پس این تست نیز فعال شدن سلول‏های میکروگلیا را پس از تیمار با LPS اثبات می‏کند.

شکل3: تست گریس. تیمار سلول‏های میکروگلیا با لیپوپلی ساکارید  0µg/m l( LPS)(کنترل- ستون چپ)، LPS1µg/ml (ستون وسط) و لیپوپلی ساکارید ((LPS10µg/ml (ستون راست) و سنجش میزان NO تولیدی توسط سلول‏های مزبور. علامت­*** اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) نمونه‏های تیمار شده با لیپوپلی ساکارید LPS)) رادر مقایسه با نمونه­ کنترل نشان می‏دهد، درحالی‏که اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) نمونه تیمار شده با لیپوپلی ساکارید ((LPS10µg/ml در مقایسه با نمونه تیمار شده با LPS1µg/ml، با علامت ##  نشان داده شده است.

بیان ژن­های التهابی توسط سلول‏های میکروگلیای فعال­ شده

در روند فعال شدن میکروگلیا، فاکتورهای التهابی بیان می‏شوند که با استفاده از تکنیکRT-PCR، بیان ژنGAPDH (به‏‏عنوان کنترل) و ژن­های التهابیiNOS و TNF-α ردیابی شد که نتیجه آن در شکل 4 قابل مشاهده است.سنجش کمی شدت باندهای مربوطه با نرم­افزار GelAnalyzer 2010a نشان داد که میزان بیان ژن TNF-α در نمونه­های تیمار شده با مقادیر1 و 10 میکروگرم بر میلی‏لیترازLPS نسبت به این میزان در نمونه­ی کنترل، به‏ترتیب 97 و 105 برابر می­باشد. همچنین میزان بیان ژن iNOS در نمونه­های تیمار شده با 1 و10 میکروگرم بر میلی‏لیتر از LPS نسبت به این میزان در نمونه­ی کنترل، به‏ترتیب 25 و 200 برابر می‏باشد. نتایج مربوطه در شکل 5 آمده است. علامت‏های ** و *** اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) میزان بیان ژن iNOS را در گروه­های دوم و سوم نسبت به گروه­ کنترل نشان می­دهد، در حالی‏که علامت ##  اختلاف بسیار معنی­دار (01/0p<) میزان بیان ژن TNF-a را در گروه­های دوم و سوم نسبت به گروه کنترل نشان می­دهد. (این شکل بنا به درخواست داور اول اضافه شد و به این ترتیب به شماره عکسهای پس از آن یک واحد اضافه شد).

شکل 4. محصولات PCR  ژن­های GAPDH ،TNF-α  و iNOS با پرایمرهای اختصاصی. در هر کدام به ترتیب از چپ به راست: میکروگلیای شاهد (تیمار نشده)، میکروگلیای تیمار شده باLPS1µg/ml و میکروگلیای تیمار شده با LPS10µg/ml

شکل 5. آنالیز کمی میزان بیان ژن­های GAPDH،TNF-  و  iNOSدر نمونه کنترل (گروه اول- سمت چپ)، نمونه تیمار شده با  1  ازلیپوپلی ساکارید ( LPS) (گروه دوم- وسط) و نمونه تیمار شده با   10 ازLPS (گروه سوم- سمت راست).علامت­های ** و *** اختلاف بسیار معنی­دار (P<0.01) میزان بیان ژن iNOS را در گروه­های سوم و دوم نسبت به گروه­ کنترل نشان می­دهد، در حالی‏که علامت ##  اختلاف بسیار معنی­دار (P<0.01) میزان بیان ژن TNF-a را در گروه­های دوم و سوم نسبت به گروه کنترل نشان می­دهد

شکل 6: پلاسمیدهای استخراج شده در مقیاس بالا

1-   مارکر یک کیلو بازی(GeneRuler)

2-   پلاسمید بسته بندی(pCDNL-BHDDD)- 9.6 kb

3-   پلاسمید پوشش ویروسی(pLTR-G)-6.8 kb

4-   پلاسمید ترانسفر pLV-EGFP–10.5 kb

5-   پلاسمید ترانسفر pLV-hNurr1-EGFP–12.9 kb

6-   پلاسمید ترانسفر  pLV-mGDNF-Jred - 10.7 kb

میزان LD₅₀ محیط مشروط میکروگلیا و توکسین 6-OHDA

نتایج حاصل از این تست به‏ترتیب 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر برای محیط مشروط میکروگلیای تیمار شده با 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر LPS  و غلظت نهایی 5/0 میلی‏مول برای توکسین 6-OHDAبه‏دست آمد.

تهیه و انبوه سازی ناقل های پلاسمیدی به‏صورت خالص

ناقل‏های پلاسمیدی موردنیاز برای ترانسفکشن و تهیه وکتورهای لنتی ویروسی نوترکیب، تخلیص و انبوه سازی شدند که نتایج آن‏ پس از الکتروفورز نمونه ها روی ژل آگاروز 7/0 درصد، در شکل 6 قابل مشاهده است.

تولید  لنتی ویروس­های نوترکیب در سلول‏های HEK-293T

شکل­های 7 و 8  بیان ژن گزارش‏گر EGFP را به‏ترتیب توسط ناقل لنتی­ویروسی pLV-EGFP و pLV-hNurr1-EGFP در سلول‏های HEK-293T، 24 و 48 ساعت پس از ترانسفکشن نشان می‏دهند. همچنین شکل 9 نمایانگر بیان ژن گزارش‏گر Jred توسط ناقل لنتی­ویروسی pLV-mGDNF-Jred در 24 و 48 ساعت پس از ترانسفکشن است. با توجه به این‏که ژن گزارش‏گر به‏وسیله توالی IRES در کنار ترانسژن مربوطه در فرودست آن قرار دارد، پس تایید بیان بالای آن توسط میکروسکوپ فلوئورسنس (که در تصاویر B و D از شکلهای 7 الی 9 کاملا مشهود است) یقینا نشان از بیان مطلوب ترانسژن و نیز تولید ذرات لنتی ویروسی نوترکیب با کارایی بالا، در سلول‏های مولد ویروس دارد.

شکل 7: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های HEK-293T کوترانسفکت شده با پلاسمید ترانسفر pLV-EGFP و پلاسمیدهای بسته‌بندی و پوشش ویروسی: 24ساعت (A,B) و 48 ساعت (C,D) پس از ترانسفکشن. بیان بالای ژن گزارشگرEGFP کاملا در تصاویرB و D مشهود است. بزرگنمایی: ×100.

شکل 8: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های HEK-293T کوترانسفکت شده با پلاسمید ترانسفر pLV-hNurr1-EGFP و پلاسمیدهای بسته بندی و پوشش ویروسی: : 24ساعت (A,B) و 48 ساعت (C,D) پس از ترانسفکشن. بیان بالای ژن گزارشگرEGFP کاملا در تصاویرB و D مشهود است بزرگنمایی: ×100.

شکل 9: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های HEK-293T کوترانسفکت شده با پلاسمید ترانسفر pLV-mGDNF-Jred و پلاسمیدهای بسته بندی و پوشش ویروسی : 24ساعت (A,B) و 48 ساعت (C,D) پس از ترانسفکشن. . بیان ژن گزارشگر Jredکاملا در تصاویرB و D مشهود است بزرگنمایی: ×100

تیتراسیون لنتی ویروس‏های نوترکیب

لنتی­ویروس‏های نوترکیب طبق روش مذکور در بخش مواد و روشها تعیین غلظت شدند که مقدار میانگین آن،184×10⁶ TU/ml برای لنتی ­ویروس نوترکیب pLV-EGFP به‏دست آمد. با توجه به یکسان بودن شرایط  

آزمایش در تولید هر سه نوع لنتی­ویروس نوترکیب، مقدار مذکور برای لنتی­ ویروس­های دیگر نیز مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل از فلوسایتومتری در شکل 10 قابل مشاهده است.

شکل 10 : سنجش میزان فلوئورسنت به روش فلوسایتومتری. به‏ترتیب از چپ به راست: سلول­های  HEK-293Tترانسدوکت شده با نسبت­های 2، 4، 10، 20 و 40 برابر رقت از استوک لنتی ویروسنوترکیب pLV-EGFP

ترانسداکسیون سلول‏های HEK-293T و سلول‏های هدف با لنتی ویروس‏های نوترکیب

بیان ترانسژن‏های گزارش‏گر در سلول‏های ترانسداکت شده، نشان از صحت تولید ویروس‏ها و قابلیت آلوده کنندگی آن‏ها دارد. بدین منظور در بدو امر سلول‏های HEK-293T به‏عنوان سلول‏های کنترل (به‏دلیل قابلیت بالای آن‏ها در آلوده شدن به‏وسیله ویروس‏ها) با لنتی‌‌ویروس‏های نوترکیب آلوده شدند که نتایج آن همان‏طور که در تصاویر B وD و Fاز شکل 11 مشهود است، کاملا نشان از صحت تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب و قابلیت آن‏ها در آلوده­سازی سلولهای HEK-293T دارد. پس از اطمینان از صحت تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، اینبار سلول‏های SH-SY5Y و سلول‏های آستروسیتوما با لنتی ویروس­های مربوطه آلوده شدند که نتایج آن به‏ترتیب در شکل‏های 12، 13 و 14 آمده است. همان‏طور که از شکل‏های 12 و 13 پیداست سلول‏های SH-SY5Y در حد مطلوبی توسط ویروس‏های مربوطه آلوده شده­اند، در حالی‏که سلول‏های آستروسیتوما پاسخ‏دهی مناسبی به ویروس نداشته­اند و سطح ترانسداکسیون در آن‏ها بسیار پایین بوده است (شکل 14). به‏همین دلیل پس از آن، از ترانسفکشن مستقیم سلول‏های HEK-293T به منظور تولید انبوه فاکتور GDNF استفاده شد.

شکل 11: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلولهایHEK-293Tترانسدوکت شده با لنتی ویروس‏های نوترکیب pLV-EGFP (A,B) ، pLV-hNurr1-EGFP (C,D) و pLV-mGDNF-Jred (E,F) 48 ساعت پس از ترانسدوکسیون. بیان بالای ژنهای گزارشگر در سلول‏های ترانسدوکت شده کاملا در تصاویر B وDو Fمشهود است که نشان از صحت تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب و قابلیت آنها در آلوده­سازی سلولهای HEK-293T دارد.بزرگنمایی : ×100.

شکل 12:  تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های SH-SY5Y ترانسدوکت شده با لنتی ویروس نوترکیب pLV-EGFP . 48 ( A,B) و 72 ساعت (C,D) پس از ترانسدوکسیون. . بیان مطلوب ژن گزارش‏گر EGFP در سلو‏‏ل‏های ترانسدوکت شده کاملا در تصاویر B وDمشهود است. بزرگنمایی: ×100.

شکل 13: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های SH-SY5Y ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس نوترکیب pLV-hNurr1-EGFP . 48ساعت(A,B) و 72 ساعت (C,D) پس از ترانسدوکسیون. . بیان ژن گزارش‏گر EGFP در سلولهای ترانسدوکت شده، در تصاویر B وDکاملا قابل مشاهده است که نشان از بیان مطلوب ترانسژن hNurr1 دارد. بزرگنمایی: ×100.

شکل 14: تصاویر فاز کنتراست و فلوئورسنت از سلول­های آستروسیتومای ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس نوترکیب pLV-mGDNF-Jred . 48ساعت (A,B) و 72 ساعت (C,D) پس از ترانسدوکسیون. بیان کم ژن گزارشگر  Jredدر تصاویر B وD، نشان از بیان کم و نامطلوب ترانسژنmGDNFدر سلولهای ترانسدوکت شده دارد.  بزرگنمایی: ×100.

بیش بیان ژن‏های مورد نظر در سلول‏های ترانسدوکت شده و ترانسفکت شده

بیش­بیان ژنهای Nurr1 و GDNF در سطح mRNA در سلول‏های ترانسدوکت شده، با استفاده از تکنیک RT-PCR بررسی شد که نتایج آن در شکل‏های 15 و 16 آمده است. بیش­بیان ژن‏های مزبور در سلول‏های ترانسدوکت شده با لنتی ویروس‏های حامل این ژن‏ها، در مقایسه با نمونه های کنترل کاملا مشهود است. همچنین بیش بیان ژن GDNF در سلول‏های HEK-293T ترانسفکت شده با ناقل ژن مزبور، با RT-PCR اثبات شد که نتیجه آن در شکل 17 آمده است.از مقایسه شکل‏های 16 و 17چنین نتیجه­گیری می‏شود که میزان بیش بیان ژن GDNF در روش ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T بیشتر از بیش­ بیان آن در روش ترانسدوکسیون سلول‏های آستروسیتوما با ناقل لنتی­ویروسی مربوطه است. از این رو در تیمارهای مدنظر از محیط مشروط سلول‏های HEK-293T ترانسفکت شده با ناقل پلاسمیدی حامل ژن GDNF، به‏عنوان محیط حاوی فاکتور GDNF استفاده شد.

شکل 15: محصولات PCR  ژن­های  GAPDH(به‏عنوان کنترل) و Nurr1  با پرایمرهای اختصاصی. در هر گروه به‏ترتیب از چپ به راست: سلول SH-SY5Yکنترل، سلول ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-EGFP و  سلول ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-hNurr1-EGFP. (به توضیحات متن مراجعه شود)                                                  

شکل 16: محصولات PCR  ژن­های GAPDH (به عنوان کنترل)و GDNF   با پرایمرهای اختصاصی. در هر گروه به‏ترتیب از چپ به راست: سلول آستروسیتومای کنترل، سلول ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-EGFP و سلول ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس .pLV-mGDNF-Jred(به توضیحات متن مراجعه شود)                                                        

شکل 17: محصولات PCR  ژن­های GAPDH و GDNF با پرایمرهای اختصاصی. در هر کدام به‏ترتیب از چپ به راست: سلول HEK-293T کنترل، سلول ترانسفکت شده با پلاسمید pLV-EGFP و سلول ترانسفکت شده با پلاسمید pLV-mGDNF-Jred. بیان بالای ژن mGDNF در نمونه ترانسفکت شده با پلاسمید حامل ژن mGDNF در مقایسه با نمونه های کنترل، کاملا مشهود است.

حفاظت نورونی  توسط  فاکتورهای Nurr1 و GDNF

نتایج حاصل از تست  MTT، بیانگر تاثیر مثبت بیش ­بیان دو فاکتور Nurr1 و GDNF بر حفاظت سلول‏های SH-SY5Y است که در شکل‏های 18 و 19 قابل مشاهده است. علامت­ **  اختلاف معنی­دار بین نمونه­های موجود در هر گروه را نشان می­دهد. در حالی‏که علامت ## اختلاف معنی­دار هر گروه با گروه قبلی را نشان می­دهد. همچنین اختلاف معنی­دار گروه چهارم با گروه دوم با علامت† نشان داده می­شود. اختلاف معنی دار به‏صورت 05/0p< تعریف شده است. همان‏طور که از نمودارها پیداست، دو فاکتور Nurr1 و GDNF هر کدام به‏تنهایی در حفاظت سلول‏های SH-SY5Y در مقابل فاکتورهای التهابی میکروگلیا و نیز توکسین 6-OHDA نقش دارند. همچنین این دو فاکتور در حالت توام، به‏صورت سینرژیک عمل کرده و اثر حفاظتی بیشتری را بر این سلول‏ها اعمال می­کنند.

شکل 18: تیمار سلول­های SH-SY5Y شاهد(CTL)، آلوده شده با ویروس pLV-EGFP و آلوده شده با ویروس pLV-hNurr1-EGFP ، با دو فاکتور GDNF (GDNF-CM) و محیط مشروط میکروگلیای فعال شده با LPS (MCM-LPS). علامت­ **  اختلاف معنی­دار بین نمونه­های موجود در هر گروه را نشان می­دهد. در حالی‏که علامت ## اختلاف معنی­دار هر گروه با گروه قبلی را نشان می­دهد. همچنین اختلاف معنی­دار گروه چهارم با گروه دوم با علامت† نشان داده می­شود. اختلاف معنی دار به‏صورت p<0.05 تعریف شده است. همانطور که از نمودار مشهود است، دو فاکتور Nurr1 و GDNF هر کدام به تنهایی و نیز به‏صورت توأم در حفاظت سلول‏های SH-SY5Y در مقابل فاکتورهای التهابی میکروگلیا نقش دارند.

شکل 19: تیمار سلول­های SH-SY5Y شاهد (CTL)، آلوده شده با ویروس pLV-EGFP و آلوده شده با ویروس pLV-hNurr1-EGFP، با دو فاکتور GDNF (GDNF CM) و توکسین 6-OHDA. علامت­ **  اختلاف معنی­دار بین نمونه­های داخل هر گروه را نشان می­دهد. در حالیکه علامت ## اختلاف معنی­دار هر گروه با گروه قبلی را نشان می­دهد. همچنین اختلاف معنی­دار گروه چهارم با گروه دوم با علامت † نشان داده شده است. اختلاف معنی دار به صورت p<0.05 تعریف شده است. همان‏طور که از نمودار مشهود است، دو فاکتور Nurr1 و GDNF هر کدام به‏تنهایی و نیز به‏صورت توأم در حفاظت سلول‏های SH-SY5Y در مقابل توکسین 6-OHDA  نقش دارند.

بررسی تغییرات بیان ژنی برای تشخیص مسیرهای سیگنالینگ حفاظتی مربوطه

به‏منظور تشخیص مسیرهای سیگنالینگ احتمالی که در اثر بیش بیان فاکتورهای Nurr1 و GDNF، دست‏خوش تغییر شده و منجر به حفاظت سلول‏های نورونی SH-SY5Y در مقابل فاکتورهای التهابی و استرس اکسیداتیو ناشی از توکسین 6-OHDA می‏شوند، RT-PCR برای دو ژن‏ ضد استرس اکسیداتیو شامل GPX1 وSOD1 و نیز دو ژن کنترل کننده آپوپتوزیس شامل P53 و BCL2 انجام شد که نتایج آن به‏ترتیب در شکل‏های 20 و 21  قابل مشاهده است. همان‏طور که از شکل‏ها پیداست، تغییر محسوسی در بیان این ژن‏ها در مقایسه با سلول‏های کنترل مشاهده نمیشود. با توجه به غیرکمی بودن  RT-PCR معمولی، این تکنیک روش مناسبی برای سنجش میزان تغییرات بیان ژن‏ها نیست و باید از تکنیک quantitative real time-PCR استفاده شود.

شکل 20: محصولات PCR  ژن­های  GPX1 و SOD1  با پرایمرهای اختصاصی. در هر گروه به‏ترتیب از چپ به راست: سلول SH-SY5Y کنترل، ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-EGFP و ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-hNurr1-EGFP. تغییر محسوسی در بیان ژنهای مزبور در سلول‏های SH-SY5Yترانسدوکت شده با لنتی ویروس pLV-hNurr1-EGFP، در مقایسه با سلول‏های کنترل مشاهده نمی‏شود.

شکل 21: محصولات PCR  ژن­های P53 و BCL2با پرایمرهای اختصاصی. در هر گروه به‏ترتیب از چپ به راست: سلولSH-SY5Y کنترل، ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-EGFP و ترانسدوکت شده با لنتی­ویروس pLV-hNurr1-EGFP. تغییر محسوسی در بیان ژن‏های مزبور در سلو‏‏ل‏های SH-SY5Yترانسدوکت شده با لنتی ویروس pLV-hNurr1-EGFP، در مقایسه با سلول‏های کنترل مشاهده نمی‏شود.

بحث

حفاظت نورون‏ها در برابر سیگنال­های مرگ یکی از استراتژی­های مهم برای مقابله با بروز و پیشرفت بیماری‌های نورودژنراتیو از جمله پارکینسون به‏شمار می‌رود(27). منابع ایجاد سیگنال­های مرگ را می­توان در دو گروه التهاب عصبی و استرس اکسیداتیو دسته‌بندی کرد. سلول‏های میکروگلیا، ماکروفاژهایCNS، علاوه بر حفاظت عصبی در تکامل عصبی نیز نقش دارند(28). این سلول‏ها در شرایط نرمال مسئول حفاظت و نظارت بر عمل‏کرد نورون‏ها، در حالی‏که در شرایط التهابیمرتبط با بیماری­های مخرب عصبی هستند (29). به‏منظور شبیه‌سازی شرایط التهاب نورونی در محیط in vitro، غالبا از سلول‏های مخلوط گلیال که از مغز نوزادان موش یا رت تهیه شده و غنی از سلول‏های میکروگلیا می‏باشند استفاده می‏شود. در این تحقیق به‏منظور حفاظت نورون‏های دوپامین­ساز SH-SY5Y در مقابل التهاب عصبی حاصل از میکروگلیای فعال و نیز مسمومیت ناشی از 6-OHDA، از بیش بیان دو فاکتور Nurr1 و GDNF بهرهگرفته شد. زیرا اگرچه به ترتیب پتانسیل ضدالتهابی و ترمیمی آن‏ها قبلاً اثبات شده بود، اما در زمان انجام این تحقیق هنوز هیچ مطالعه‌ای در زمینه تاثیر بیش­بیان فاکتور Nurr1 بر حفاظت نورون‏های دوپامین ساز و نیز تاثیر هم‏زمان این دو فاکتور روی این نورون‏ها منتشر نشده بود. نتایج تحقیق ما نشان داد که سلول‏های SH-SY5Yبا بیان فزاینده­ فاکتورNurr1  و یا در حضور فاکتور GDNF، مقاومت قابل ملاحظه ای را در برابر فاکتورهای التهابی میکروگلیا و نیز مسمومیت ناشی از 6-OHDA نشان می‏دهند. همچنین دو فاکتور GDNF و Nurr1 با هم به صورت سینرژیکعمل کرده و مقاومت بیشتری را به سلول‏های نورونی عطا می‏کنند. طبق گزارش‏هایقبلی، سرکوب بیان فاکتورNurr1 در سلول‏های گلیال منجر به ایجاد التهاب می‏شود که بیانگر نقش ضدالتهابی فاکتور است(11). بیان Nurr1نه تنها برای القای تمایزنورون‏های دوپامین­ساز در مغز میانی، بلکه برای حفظ بقای آن‏ها نیز ضروری است(30-34). طبق نتایج ما افزایش بیان این فاکتور در سلول‏های دوپامین­ساز SH-SY5Y، نه تنها اثر منفی ندارد بلکه منجر به حفاظت آن‏ها در مقابل فاکتورهای التهابی و نیز مسمومیت ناشی از توکسین 6-OHDA می‏‏شود. توکسین 6-OHDAبا ایجاد نارسایی میتوکندریایی و استرس اکسیداتیو به مرگ سلولی دامن می‏زند(35) در حالی‏که فاکتور Nurr1 از طریق تنظیم بیان دسته­ای از پروتئین‏های میتوکندریایی کد شونده توسط هسته، همچون­ آنزیمSOD1، به حفظ فسفریلاسیون اکسیداتیو در میتوکندری کمک می‏کند (36). احتمالا افزایش بیان Nurr1 در سلول‏های نورونی منجر به افزایش بیان آنزیم­ مزبور و در نتیجه مقابله با اثرمهاری توکسین 6-OHDAمی‏شود. به علاوهNurr1 در مسیر سیگنالینگ ضداسترس اکسیداتیو وابسته به CREB نیز شرکت دارد(37). احتمالا اثر حفاظتیNurr1 در مقابل6-OHDA، از طریق تحریک هر چه بیشتر این مسیر باشد. بدین منظور میزان بیان دو ژن آنتی اکسیدانتSOD1 و GPX1در سلول‏های نورونی با کمک تکنیکRT-PCR ارزیابی شد اما با توجه به غیر کمی بودن این تکنیک، تغییر محسوسی در بیان ژن‏های مزبور در مقایسه با سلول‏های کنترل مشاهده نشد (شکل 20).

از طرف دیگر نتایج RT-PCR و تست گریس روی سلول‏های میکروگلیا، تولید سطح بالاتری از فاکتورهای التهابی ( iNOS و TNF-α) را در میکروگلیای تیمار شده با 10 میکروگرم بر میلی‏لیترLPS ، نسبت به انواع تیمار شده با 1 میکروگرم بر میلی‏لیترLPS  نشان داد. با توجه به میزان LD₅₀ (100 میکروگرم بر میلی‏لیتراز محیط مشروط میکروگلیای تیمار شده با10 میکروگرم بر میلی‏لیترLPS )، رابطه­ مستقیم سطح فاکتورهای ­التهابی با سطح التهاب عصبی قابل مشاهده است. میکروگلیای فعال انواعی از فاکتورهای التهابی شامل TNF-α، IL-1β، متابولیت­های اسید چرب و رادیکال­های آزاد NO و سوپر اکسید (O₂^-) را تولید می‏کند (38 و 39). NO که توسط آنزیم iNOS تولید می‏شود، با مهار سیتوکروم اکسیداز تنفس میتوکندریایی را مختل، و نیز در اثر واکنش با O₂^-  گونه رادیکالی پروکسی نیتریت را تولید می‏کند که به‏شدت به مرگ سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو دامن می‏زند (40 و 41). احتمالاً اثر حفاظتی Nurr1 در برابر 6-OHDA ، اینجا نیز در مقابله با NO تولیدی از میکروگلیا به‏کار رفته و در سلول‏های SH-SY5Y مقاومت ایجاد می‏کند.  TNF-αنیز با اثر روی رسپتورش (TNFR1) می‏تواند آپوپتوزیس خارجی را در سلول‏های نورونی القا کند که احتمالا Nurr1 با پتانسیل ضدآپوپتوزیس خود می‏تواند مسیر مزبور را مهار کند. بدین‏منظور میزان بیان دو ژن مرتبط با فرآیند آپوپتوزیس، P53 و BCL2، با استفاده از RT-PCR در سلول‏های مزبور ارزیابی شد (شکل21) . با توجه به غیرکمی بودن این روش تغییر قابل ملاحظه ای در میزان بیان آن‏ها در سلول‏های تیمار شده در مقایسه با سلول‏های کنترل مشاهده نشد. در این راستا پیشنهاد می‏شود از روش کمی quantitative real time-PCR به‏منظور بررسی دقیق تغییرات بیان ژن‏های مزبور استفاده شود.

فاکتور دیگر استفاده شده در تحقیق جاری به‏منظور ایجاد حفاظت نورونی، GDNF بود. در ابتدا هدف ما استفاده از سلول‏های آستروسیتوما به‏عنوان سلول‏های مولد فاکتور GDNF به‏صورت انبوه بود، زیرا این سلول‏ها در حالت نرمال نیز GDNF را ترشح می‏کنند و نیز با این کار فضای in vivo به‏شکل بهتری بازسازی می‏شد. اما همان‏طور که از شکل‏های 14 و 16 پیداست، GDNF در سلول‏های آستروسیتوما بیان قابل ملاحظه­ای نداشت و نیز تیمار سلول‏های SH-SY5Y با محیط مشروط سلول‏های آستروسیتوما حفاظت قابل توجهی را اعمال نکرد. پس از آستروسیتوما، سلول‏های HEK-293T بهترین کاندید برای تولید انبوه فاکتور GDNF هستند زیرا آن‏ها نیز در حالت نرمال فاکتور مزبور را تولید می‏کنند و از طرف دیگر با داشتن قابلیت ترانسفکشن بالا، توانستند GDNF را حتی به مقدار بیشتری نسبت به سلول‏های آستروسیتوما تولید کنند. بنابراین در تیمارهای بعدی، فقط محیط مشروط سلول‏های HEK-293T به‏عنوان منبع GDNF مورد استفاده قرار گرفت. نتایج ما نشان داد که اثر حفاظتی GDNF بر نورون‏های دوپامین­ساز هم در مقابل فاکتورهای التهابی میکروگلیا و هم در مقابل توکسین 6-OHDA، تقریبا با اثر حفاظتی Nurr1  قابل مقایسه است. GDNF با اتصال به کمپلکس رسپتوری GFR  و Ret روی سلول‏های هدفش، مسیرهای سیگنالینگی همچون Ras/ERK1/2 و PI3K را فعال کرده و در نتیجه منجر به رشد و حفاظت سلولی می‏شود (42 و 43). احتمالا اثر حفاظتی  GDNF در مقابل فاکتورهای التهابی میکروگلیا، از طریق تحریک بیشتر مسیرهای رشد و غلبه­ آن‏ها بر مسیرهای مرگ باشد. تحقیق جاری و نیز گزارش‏های پیشین نشان از اثر حفاظتی فاکتور GDNF روی سلول‏های نورونی، در مقابل توکسین 6-OHDA دارند (44). همچنین نتایج ما نشان داد که حضور هم‏زمان دو فاکتور Nurr1  و GDNF، حفاظت بیشتری را نسبت به حالت تنها به سلول‏های دوپامین­ساز عطا می‏کند. فاکتور Nurr1 در تنظیم بیان رسپتور GDNF (Ret) نقش دارد (17).. احتمالا افزایش بیان فاکتور Nurr1 منجر به افزایش بیان رسپتور Ret شده و از طرف دیگر حضور GDNF در محیط، منجر به تحریک بیشتر مسیر سیگنالینگ  GDNF و به‏دنبال آن تحریک بیشتر مسیرهای رشد و ترمیم سلولی شده و در نهایت حفاظت سلولی بیشتری را در مقابل فاکتورهای التهابی میکروگلیا و توکسین 6-OHDA به سلول‏های نورونی عطا می‏کند. موضوعی که لازم است در سطح مولکولی به‏دقت بررسی شود.

نتیجه‌گیری

نتایج تحقیق ما نشان داد که بیش­بیان فاکتور Nurr1 در سلول‏های نورونی دوپامین ساز SH-SY5Y و یا تیمار سلول‏های SH-SY5Y با محیط مشروط حاوی فاکتور GDNF به‏طور جداگانه، نورون‏های مزبور را در برابر فاکتورهای التهابی و استرس اکسیداتیو حفاظت می‏کند. همچنین حضور سطوح بالا و توام این دو فاکتور در سلول‏هایSH-SY5Y، اثر سینرژیک داشته و حفاظت بسیار بیشتری را به این سلول‏ها عطا می‏کند.

تشکر و قدردانی

کلیه حقوق و مزایای این تحقیق متعلق به پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری می‏باشد و هزینه آن در قالب پروپوزال دانشجویی و توسط این سازمان تامین شده است.

منابع