بررسی غلاف میلین و پروتئین‌های مرتبط با آن (MAG، MOG، MBP و PLP) طی تخریب میلین القا شده توسط کوپریزون در سیستم عصبی مرکزی موش‌های نر نژاد C57BL/6

سندگل, نیما; کمیجانی, مجید

doi:10.52547/JCT.8.1.12

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

¹ دانشگاه زابل، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، زابل، سیستان و بلوچستان، ایران

² دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اراک، ایران، کدپستی 8349-8-38156

https://doi.org/10.52547/JCT.8.1.12

چکیده

هدف: هدف تحقیق، بررسی دقیق اثرات وابسته به‏زمان کوپریزون بر پروتئینهای MAG، MOG، MBp و PLp و روند تخریب میلین می‏باشد.
مواد و روش‌ها: مدل تخریب میلین با مصرف پنج هفته غذای حاوی 2/0 درصد کوپریزون ایجاد شد. ناحیه کورپوس کالوزوم مغز موش‌ها در هفته‏های 3، 4 و 5 مورد ارزیابی بافتی و مولکولی قرار گرفت و در انتهای هفته پنجم مطالعات رفتاری توسط تست میدان باز انجام شد.
نتایج: نتایج نشان داد بیان پروتئینهای غلاف میلین در مقایسه با گروه کنترل به‏صورت وابسته به‏زمان کاهش یافته است. علیرغم کاهش کلی این پروتئینها در هفته سوم، در این هفته تنها پروتئین PLp کاهش معنی‏داری با گروه کنترل نشان داد (01/0p <). همچنین سایر پروتئینها از هفته چهارم به بعد کاهش بیان معنی‏داری را نشان دادند. مطالعات میکروسکوپ الکترونی تغییرات معنی‏دار در کاهش قطر میلین در مقایسه با گروه کنترل را تنها پس از 4 هفته نشان داد (01/0p <). مطالعات رفتاری نیز نشان داد کوپریزون قادر به ایجاد اختلالات رفتاری معنی‏داری در حیوانات مورد مطالعه در مقایسه با گروه کنترل بود و این تغییرات از هفته سوم به بعد قابل مشاهده بودند.
نتیجهگیری: این تحقیق برای اولین بار به بررسی هم‏زمان پروتئین‏های اصلی میلین پرداخته و نتایج نشان می‌دهد بهترین زمان جهت بررسیهای دقیق مولکولی، بافتی و رفتاری هفتههای چهارم و پنجم میباشند.

تازه های تحقیق

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of myelin sheath and their related proteins (MAG, MOG, MBP and PLP) during cuprizone-induced demyelination in central nervous system of male C57BL/6 mice

نویسندگان [English]

l n Sanadgo ¹
i M komijan ²

¹ Department of Biology, Faculty of Science, Zabol University, Zabol, Iran

² Department of Biology, Faculty of Science, Arak University, Arak, Iran, 38156-8-8349

چکیده [English]

Aim: The aim of this study was to investigate of cuprizone time-dependent effects on MAG, MOG, MBP, and PLP proteins and demyelination process.
Materials and Methods: The myelin degradation model was created with a five week diet containing 0.2% of cuprizone. The rats brain corpus callosum region was subjected to tissue and molecular evaluation at weeks 3, 4 and 5. At the end of the fifth week, behavioral studies were performed by open field test.
Results: Results showed that the expression of myelin sheath proteins decreased time-dependently in comparison with the control group. Despite the overall reduction of these proteins in the third week, only PLP protein decreased significantly in this week comparing to control (p < /em><0.01). Other proteins also showed a significant reduction in expression after the fourth week. Electron microscopy studies showed significant changes in the reduction of myelin diameter in comparison to the control group only after 4 weeks (p < 0.01). Behavioral studies also indicated that cuprizone was able to cause significant behavioral abnormalities in the animals from the beginning of the third week compared to the control group.
Conclusion: This research was the first time to study the main myelin proteins at the same time, and the results show that the best time for accurate molecular, tissue and behavioral reviews are fourth and fifth weeks.

کلیدواژه‌ها [English]

Cuprizone
Corpus callosum
Myelin Sheath
Demyelination

اصل مقاله

مقدمه

مالتیپل اسکلروزیس (Multiple sclerosis= MS) بیماری است که در آن غلاف میلین تشکیل دهنده اکسون در نورون‏های سیستم عصبی مرکزی تخریب می‏شود. این بیماری منجر به اختلال در توانایی و صحت ارتباط سلولهای عصبی مغز و نخاع با یکدیگر میشود. در ام اس سیستم ایمنی بدن غلاف میلین را غیر خودی فرض نموده، علیه پروتئینهای اصلی میلین واکنش نشان داده و باعث تخریب آن‏ها میشود، ترمیم غلاف میلین توسط الیگودندروسیتها به کندی صورت گرفته و در نتیجه نورونها قادر به ارسال موثر سیگنال عصبی نخواهند بود (1 و 2). شیوع این بیماری در شمال اروپا 60 تا 200 نفر در هر یکصد هزار نفر و در شمال آمریکا 6 تا 20 نفر در هر یکصد هزار نفر میباشد (3). در حال حاضر در ایران از هر یکصد هزار نفر حدود 50 نفر به بیماری ام اس مبتلا هستند. شیوع این بیماری در استان‌های تهران، فارس و اصفهان بیشتر از سایر استان‌های کشور بوده و متاسفانه این میزان با سرعت زیادی رو به افزایش است (2). بیشترین علل بروز بیماری ام اس ناشی از عوامل ژنتیکی و محیطی است. مطالعات نشان می‏دهد برخی از تغییرات ژنتیکی ریسک ابتلا و پیشرفت بیماری را افزایش میدهند (4 و 5). به‏دلایل نامشخصی سلولهای ایمنی در بیماران ام اس میتوانند به‏علت اختلال در عملکرد سدخونی مغزی به مغز و نخاع هجوم آورده و باعث تخریب میلین شوند. علاوه بر تخریب ماده سفید (میلین)، کورتکس و هستههای عمقی ماده خاکستری مغز و اکسونها نیز در نتیجه انتشار آسیب تحت تاثیر قرار می‌گیرند(6-9). آسیب غلاف میلین منجربه اختلال در هدایت پیغام‌های عصبی و اختلال عملکرد بیمار شده و منجر به بروز حملات (عود) می‌شود. گاه مغز میتواند از طریق فرآیند بازآرایی نورونی (Neuroplasticity) برخی از ضایعات ایجاد شده را جبران کند. از سوی دیگر فرآیند بازسازی مجدد میلین (Remyelination) نیز می تواند نقش مهمی در ترمیم ضایعات ایجاد شده بازی کند. یکی از متداولترین راههای القای تخریب میلین در حیوانات آزمایشگاهی استفاده از کوپریزون میباشد و اولین بار توسط فردی به‏نام Blakemore مطرح شد (10).بعدها مطالعات بیشتری درباره تاثیرات کوپریزون بر تخریب میلین(Demyelination) در ناحیه رابط بین دو نیمکره یا همان کورپوسکالوزوم مغز انجام شد(11)_. تغذیه موش‌های آزمایشگاهی با کوپریزون باعث ایجاد دمیلینیشن برگشتپذیر و از بین رفتن الیگودندروسیت‌های بالغ مخصوصاً در ناحیه کورپوس‌کالوزوم می‏شود. جالب آنکه سایر سلولها در سیستم اعصاب مرکزی تحت تاثیر آن قرار نمیگیرند (12).اولیگودندروسیت‌ها مسئول تولید میلین در سیستم عصبی مرکزی هستند و دلیل این‏که چرا فقط الیگودندروسیتها نسبت به کوپریزون آسیبپذیرند هنوز مشخص نیست. در حین تغذیه با کوپریزون، دمیلینیشن رخ داده، پس از قطع کوپریزون رمیلینیشن خودبهخودی در مغز شروع می‏شود (13)_.مهم‏ترین پروتئینهای سازنده میلین شامل، گلیکوپروتئین همراه میلین (Myelin-Associated Glycoprotein=MAG)، گلیکوپروتئین الیگودندروسیتی میلین(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein=MOG)، پروتئین اصلی میلین (Myelin Basic Protein=MBP)و پروتئین پروتئولیپیدی ‌میلین(Myelin proteolipid protein=PLP) میباشند. از آن‏جایی‏که اولین تغییرات در بیان این پروتئینها نشان‏دهنده فعالیت الیگودندروسیتها و تغییر در ساختار غلاف میلین است اثرات حفاظتی ترکیبات مختلف با اندازهگیری نقش آن‏ها در افزایش بیان پروتئینهای ذکر شده ارتباط مستقیم دارد (14). هدف از این تحقیق مشخص نمودن زمان مناسب برای بررسی آسیب‏های ناشی از کوپریزون می‏باشد تا درک بهتری از روند آسیب‏ها ایجاد شده و مقایسه ترکیبات حفاظت کننده در زمان مناسب انجام پذیرد.

مواد و روشها

ایجاد مدل کوپریزون_: در این پژوهش کلیه نکات اخلاقی با توجه به موازین کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی تهران و منطبق با منشور اخلاقی این دانشگاه و در جهت به حداقل رساندن آزار به حیوانات صورت گرفت. برای ایجاد مدل کوپریزون موشهای C57BL/6 بالغ نر 8 تا 9 هفته در محدوده وزنی 20 تا 25 گرم از مرکز انستیتو پاستور ایران تهیه شد. حیوانات در خانه حیوانات با دمای 2 ± 23 درجه سانتی‏گراد و دوره تاریکی ـ روشنایی 12 ساعته به‏صورت 6 تایی در قفس نگه‏داری ‏ شدند. سپس غذای حاوی کوپریزون 2/0 درصد به‏مدت 5 هفته به حیوانات داده شد. به‏دلیل ماهیت پودری غذا برای جلوگیری از آلودگی محیط آزمایشگاه، قفسها در فضای جداگانه و در زیر هود نگهداری شدند. گروه کنترل شامل موشهای سالم بود که 5 هفته غذای پودر شده فاقد کوپریزون را دریافت کردند و گروه آزمایشیشامل موش‌های سالمی بود که به‏مدت 5 هفته با غذای حاوی کوپریزون تغذیه شدند. کلیه آزمایش‏ها بر روی هر دو گروه کنترل و آزمایشی صورت گرفت.

آماده سازی نمونهها: در پایان هفتههای 3، 4 و 5، از هر گروه تعداد 6 موش به‏صورت تصادفی انتخاب شدند. پس از بی‏هوشی عمیق توسط کتامین و زایلوزین قفسه سینه باز و سپس 15 میلیلیتر محلول PBS درون بطن چپ پرفیوژ شد تا تمامی خون موجود در عروق از دهلیز راست قلب حیوان خارج شد. جهت آزمایش‏های بافتی جهت فیکس کردن 15 میلیلیتر محلول پارافرم آلدئید 4 درصد درون بطن چپ پرفیوژ شد، پوست سر برداشته و محل اتصال استخوان بینی به جمجمه شکسته شد. سپس مغز از درون جمجمه خارج درون محلول گلوتارآلدئید 10 درصد به آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی منتقل شد.

جهت آزمایشات مولکولی پس از پرفیوژ با PBS بخش کورپوس کالوزوم مغز جدا، در میکروتیوپ RNase free قرار گرفته و تا انجام آزمایش در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگه‏داری شد.

استخراج RNA: در این مرحله طبق پروتکل کیت استخراج RNA (Accuzol, Bioneer) استخراج RNA از بافت مغز انجام شد. جهت به‏دست آوردن غلطت RNA مقدار 5 میکرولیتر از محلول RNA در 95 میکرولیتر آب مقطر حل شد و سپس OD (Optical Density) آن در طول موج 260 و 280 نانومتر توسط دستگاه نانو دراپ (DeNovix) خوانده و نسبت RNA/DNA بیشتر از 6/1 قابل قبول در نظر گرفته شد و جهت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت.

سنتز cDNA: برای رفع آلودگی قبلی با DNA، به 2 میکرولیتر از نمونه RNA، 10 میکرولیتر آب DEPC، 1 میکرولیتر بافر X 10 موجود در کیت و یک واحد آنزیم DNaseI اضافه و برای همگن شدن به‏مدت یک دقیقه سانتریفوژ شد. کلیه مراحل کار بر روی یخ صورت گرفت. سپس جهت انجام واکنش، میکروتیوپ حاوی این ترکیبات به مدت 30 دقیقه در دستگاه ترمومیکسر (Eppendorf) با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. در ادامه یک میکرولیتر از EDTA موجود در کیت به محتویات میکروتیوپ اضافه و به‏مدت 10 دقیقه در دستگاه ترمومیکسر با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس حجم نمونه با اضافه کردن 5 میکرولیتر آب دوبار تقطیر به 20 میکرولیتر رسانده شد و سنتز cDNA طبق دستورالعمل کیت (Thermo Scientific) انجام شد.

PCRReal-time:بهطور خلاصه مخلوط واکنش‏گر شامل Green Star Master Mix Solution (5/12 میکرولیتر)، پرایمرهای فوروارد و ریورس با غلظت mM 10 (هر کدام 5/0 میکرولیتر)، cDNA (3 میکرولیتر) و 5/3 میکرولیتر آب دوبار تقطیر (حجم نهایی 20 میکرولیتر) بود. این آزمایش به کمک دستگاه Real time PCR (Corbet 6000) انجام شد. از ژن GAPDH به‏عنوان Housekeeping استفاده شد. توالی پرایمرها استفاده‌شده در این مرحله در جدول1 مشخص شده است.

جدول1: توالی پرایمرهای مورد استفاده برای Real time PCR به‏همراه منابع

نام مولکول	توالی پرایمر (^/5 به ^/3)	منبع
MAG	F:CTGCCGCTGTTTTGGATAATGA R:CATCGGGGAAGTCGAAACGG	(15)
MBP	F:ACACGAGAACTACCCATTATGGC R:CCAGCTAAATCTGCTGAGGGA	(16)
MOG	F: CAAGAAGAGGCAGCAATGGAG R: CAGGAGGATCGTAGGCACAAG	(17)
PLP	F:CCAGAATGTATGGTGTTCTCCC R:GGCCCATGAGTTTAAGGACG	(18)
GAPDH	F:GTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCATGCC R:TCTTACTCCTTGGAGGCCATGTAGGCCATG	(15)

میکروسکپ الکترونی: برای بررسی اثرات کوپریزون بر میزان از دست رفتن میلین، ناحیه مدیال کورپوسکالوزوم موشها در هفتههای مختلف جداسازی و به‏کمک میکروسکوپ الکترونی TEM (Philips) مورد بررسی قرار گرفت و میزان تخریب میلین اندازهگیری شد. ابتدا بافتها با محلول گلوتارآلدئید و پارافرمآلدئید (1:1) 2 درصد فیکس شدند، سپس 3 بار با محلول بافر فسفات 1/0 مولار شستشو شدند. بافتها به‏مدت 2 ساعت در محلول اوسمیوم 2/0 مولار قرار داده شده و سپس مراحل آبگیری به‏صورت دو مرحلهای به کمک الکل ( غلظتهای 50، 70، 80، 90، 95 و 100 درصد) و هر بار 5 دقیقه انجام شد. سپس بلوکهای بافتی در رزین تهیه و به‏مدت 3 روز در انکوباتور 60 درجه سانتی‏گراد قرار گرفتند. برشهای نازک به ضخامت 50 نانومتر به‏وسیله اولترامیکروتوم و با استفاده از تیغه الماس تهیه و بر روی گریدهای مسی قرار داده شدند. نمونهها توسط اورانیل و سرب رنگآمیزی شده و اسلایدهای تهیه شده به‏وسیله میکروسکوپ الکترونی ترانسمیشن با بزرگنمایی20000 بررسی شد(19).

بررسی اثرات کوپریزون بر رفتار حیوانات مورد مطالعه: در این مرحله رفتار حیوانات مورد مطالعه بر اساس تست استاندارد میدان باز (Open Field)، در هفتههای مختلف و مورد ارزیابی قرار گرفت. دستگاه میدان باز از جعبه چوبی سفیدی با اندازه 72 در 72 سانتی‏متر با دیواری با ارتفاع 36 سانتی‏متر تشکیل شده بود. خطوط کف جعبه به شانزده مربع 18 در 18 سانتی‏متر تقسیم و یک مربع مرکزی در وسط میدان کشیده شده بود. اتاق آزمون 6/4 در 8/1متر و توسط یک لامپ قرمز 60 وات برای ایجاد نور پس زمینه روشن شده بود. این فضا پس از قرار دادن هر موش و اتمام تست به وسیله الکل اتیلن 70 درصد تمیز می‏شد (20).

آنالیز آماری

جهت انجام محاسبات آماری، از نرم افزار SPSS version 18.0 استفاده و دادهها به‏صورت میانگین-انحراف معیار یا mean±SD بیان شد. آزمونهای آماری مورد استفاده، آنالیز واریانس یک‏طرفه one-way-ANOVA بود. در هر دو آنالیز 05/0p< به‏عنوان معیار معنیدار بودن اختلاف در نظر گرفته شد.

نتایج

اثرات کوپریزون بر بیان گلیکوپروتئین وابسته به میلین (MAG)

نتایج حاصل از بررسیاثرات کوپریزون بر بیان گلیکوپروتئین وابسته به میلین در هفتههای مختلف در نمودار1 مشخص شده است. تغییر معنیداری در بیان MAG در سه هفته اول تغذیه با کوپریزون دیده نشد. همان‏طور که مشاهده میشود تفاوت معنیداری در بیان MAG بین گروه آزمایشی با گروه کنترل در هفته چهارم و پنجم وجود دارد. بیشرین کاهش بیان در هفته چهارم دیده‌شده و در هفته‌پنجم نیز به همان میزان باقی‌مانده است.

اثرات کوپریزون بر بیان گلیکوپروتئین الیگودندروسیتی میلین (MOG)

نتایج حاصل از بررسیاثرات کوپریزون بر بیان گلیکوپروتئین الیگودندروسیتی میلیندر هفتههای مختلف در نمودار 1 مشخص شده است. سه هفته تغذیه با کوپریزون قادر به تغییر معنادار بیان MOGنشد. نتایج نشان میدهد که تفاوت معنیداری در بیان MOG بین گروه آزمایشی با گروه کنترل در هفته چهارم و پنجم وجود دارد. بیشرین کاهش بیان به‏ترتیب در هفته پنجم و هفته چهارم دیده شد.

اثرات‌کوپریزون بر بیان پروتئولیپید پروتئین (PLP)

نتایج حاصل از بررسیاثرات کوپریزون بر بیان پروتئولیپید پروتئیندر هفتههای مختلف در نمودار 1 مشخص شده است. نتایج نشان میدهد که تفاوت معنیداری بین گروه آزمایشی با گروه کنترل در هفتههای سوم، چهارم و پنجم وجود دارد. سه هفته تغذیه با کوپریزون باعث تغییر معنی‏دار بیان PLPشد. بیشرین کاهش بیان PLP مربوط به هفتههای چهارم و پنجم بود.

اثرات کوپریزون‌بر بیان پروتئین‌اصلی میلین(MBP)

نتایج‌حاصل از بررسیاثرات کوپریزون بر بیان پروتئین اصلی میلیندر هفتههای مختلف در نمودار1 مشخص شده است. همان‏طور که مشاهده میشود تفاوت معنی‌داری بین گروه آزمایشی با گروه کنترل در هفتههای سوم، چهارم و پنجم وجود دارد. سه هفته تغذیه با کوپریزون باعث تغییر معنادار بیان MBPشد. بیشرین کاهش بیان MBP مربوط به هفتههای چهارم و پنجم بود.

نمودار 1: بررسی اثر کوپریزون در هفته های 3 و 4 و 5 بر بیان MAG ، MOG، PLP و MBP. با افزایش زمان، کوپریزون باعث کاهش بیان MAG ، MOG، PLP و MBP در ناحیه کورپوس کالوزوم موشها نسبت به گروه کنترل شد. علامت (*) نماد تفاوت با گروه کنترل است (001/0p< ^*** ، 01/0p< ^**، 05/0p< ^*);(3n=).

اثرات کوپریزون بر میزان تخریب میلین

تصاویر به‏دست آمده با میکروسکپ الکترونی برای ارزیابی میزان تخریب میلین در ناحیه مدیال کورپوسکالوزوم در اثر مصرف کوپریزون مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1) و نتایج در نمودار 2 نشان داده شد. همان‏طور که مشاهده میشود تفاوت معنی‏داری بین گروه کنترل با گروه آزمایشی در هفتههای سوم، چهارم و پنجم وجود دارد. در سه هفته اول تغذیه با کوپریزون تغییر معنی‏داری در تخریب میلیندیده نشد. بیشرین کاهش میلین در هفته پنجم مشاهده شد.

شکل1: تصاویر میکروسکپ الکترونی مدیال کورپوسکالوزوم حیوانات مورد مطالعه (نوار مقیاس یک میکرومتر). با افزایش زمان، کوپریزون باعث افزایش تخریب غلاف میلین در ناحیه کورپوزکالوزوم موشها نسبت به گروه کنترل شد.

نمودار 2: آنالیز کمی اثر کوپریزون در هفتههای 3 و 4 و 5 بر میزان تخریب میلین. با افزایش زمان، کوپریزون باعث افزایش تخریب میلین در ناحیه کورپوزکالوزوم موشها نسبت به گروه کنترل شد. علامت (*) نماد تفاوت با گروه کنترل است. (001/0p< ^*** ، 01/0p< ^**، 05/0p<^*);(3n=).

اثرات کوپریزون بر رفتار حیوانات در تست‌میدان باز

نتایج حاصل از بررسی اثرات کوپریزون بر رفتار حیوانات در تست اوپن فیلددر هفتههای مختلف مورد مطالعه قرار گرفت (نمودار 3). نتایج نشان داد که میزان کل حرکت (نمودار 3، الف)، مدت حرکت در ناحیه مرکزی (نمودار 3، ب)، سرعت حرکت (نمودار 3، ج) و نسبت حرکت در ناحیه مرکزی به کل حرکت (نمودار 3، د) پس از تغذیه با کوپریزون در هفتههای مختلف به‏طور معنیداری تغییر یافته است. همان‏طور که مشاهده میشود تفاوت معنی‌داری بین گروه کنترل با گروه آزمایشی در هفته‌های سوم، چهارم و پنجم وجود دارد. تغذیه حیوانات با کوپریزون قادر به تغییر معنی‏دار رفتار آن‏ها شد. بیشرین تغییرات رفتاری در هفته سوم دیده شد.

نمودار 3: بررسی اثرات کوپریزون در هفته های 3 و 4 و 5 بر رفتار حیوانات توسط تست اوپن فیلد. علامت (*) نماد تفاوت با گروه کنترل است. (001/0p< ^*** ، 01/0p< ^**، 05/0p<^*);(3n=).

بحث

در دهه 1960، کوپریزون به‏عنوان یک نوروتوکسین بر روی موش، رت و خوک شناخته شد. میزان استفاده از 5/0 درصد کوپریزون باعث ایجاد سمیت زیاد، فلج اندام‏ها، تشنج و مرگ میر بالا شد. ادم مغزی، دمیلینیشن، آستروگلیوزیس (Astrogliosis) و هیدروسفالوس (Hydrocephalus) علائم برجسته پاتولوژیک در موش‌های تغذیه شده با کوپریزون بودند. این مشخصات به‏صورت شدیدتر در ماده سفید مخچه و مغز میانی قابل مشاهده بود (21).

اولین بار دانشمندی به‏نام Blakemore اثربخشی تغذیه با کوپریزون را جهت القای مرگ الیگودندروسیتها و به‏طور ثانویه دمیلینیشن پایکهای مخچهای فوقانی مطرح نمود. طبق تحقیق او، طی 5 هفته تغذیه همراه با کوپریزون، بسیاری از اکسونها دمیلینه شده ولی الیگودندروسیتهای میلینساز نیز قابل تشخیص هستند (10). رمیلینیشن گسترده نیز فقط در زمان قطع کوپریزون از تغذیه حیوانات اتفاق میافتد. Hiremathو همکاران (22) برای اولین بار تاثیر 2/0 درصد وزنی غذای روزانه کوپریزون را بر ماده سفید مخ، به‏خصوص کورپوس‌کالوزوم که میزان دمیلینیشن به وسعت بیشتری و به آسانی قابل تشخیص است، مطرح نمودند. پس از آن، تاثیرات کوپریزون بر دمیلینیشن و رمیلینیشن به‏طور گستردهای بر روی کورپوسکالوزوم مورد بررسی قرار گرفت. در سالهای اخیر نیز مطالعات زیادی در مورد دمیلینیشن و رمیلینیشن ماده خاکستری مخ و مخچه توسط کوپریزون صورت گرفته است (11).

مکانیسم دقیق نحوه ایجاد دمیلینیشن و مرگ الیگودندروسیتها توسط کوپریزون و متعاقب آن ایجاد دمیلینیشن هنوز شناخته نشده است. کوپریزون یک شلاتور مس بوده که منجر به کمبود مس در مغز می‌گردد. با این‏حال، مکملهای مس با غلظتهای بالا نیز نتوانستند مانع از اثرات سمی کوپریزون شوند که نشان‏دهنده این است که کمبود مس مکانیسم اصلی عملکرد کوپریزون نمیباشد (23).

تغذیه با کوپریزون باعث ایجاد دمیلینیشن برگشتپذیر و از بین رفتن الیگودندروسیتهای بالغ می‏شود، حال آن‏که سایر سلولها در سیستم اعصاب مرکزی تحت تاثیر آن قرار نمیگیرند. تجویز دوزهای بالاتر این ماده، باعث تغییر در مورفولوژی میتوکندری گشته که منجر به شکلگیری میتوکندری بسیار بزرگ در کبد می‏شود (12). به‏همین دلیل، عملکرد آنزیمهای میتوکندری در مغز و کبد مانند منوآمین اکسیداز، سیتوکروم اکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز کاهش مییابد (24). از آن‏جاییکه میتوکندری باعث تولید ATP شده و جهت هومئوستازی یون کلسیم در سلول و فرایند آپوپتوزیس نقش مهمی ایفا میکند، از این‏رو اختلال عملکرد میتوکندری و متعاقب آن اختلال در متابولیسم انرژی میتواند دلیلی جهت از بین رفتن الیگودندروسیتها باشد. با این‏حال، دلیل این‏که چرا فقط الیگودندروسیتها نسبت به کوپریزون آسیب پذیرند هنوز در دست بررسی است. در حین تغذیه با کوپریزون، دمیلینیشن ایجاد شده پس از سه هفته قابل رویت بوده و به بیشترین میزان در انتهای 5 هفته می‌رسد. این در حالی است که پس از قطع کوپریزون رمیلینیشن خودبهخودی در مغز شروع میشود. آپوپتوزیس اولیه الیگودندروسیتها و فعال شدن میکروگلیا-ماکروفاژها دو مشخصه برجسته در پاتولوژی بافتی مدل حیوانی کوپریزون میباشند. سایر سازوکارهای دخیل در این مدل شامل مهار تمایز سلولهای پیشساز الیگودندروسیتها و ترشح سایتوکاینهای پیش التهابی از میکروگلیا-ماکروفاژهای فعال شده است (13).

از مزیتهای مهم مدل کوپریزون، مراحل دمیلینیشن و رمیلینشن واضح و برگشتپذیر بوده که به‏راحتی قابل تشخیص هستند. مزیت دیگر این مدل در عدم آسیب پذیریBBB بوده که باعث بررسی مراحل دمیلینیشن و رمیلینیشن در مغز بدون دخالت سیستم ایمنی می‏شود (25).

از معایب اصلی این مدل میتوان به ناشناخته بودن مکانیسم ایجاد دمیلینیشن توسط کوپریزون اشاره کرد که میتواند باعث سختی در شناسایی عوامل موثر در از بین رفتن الیگودندروسیتهای بالغ و در نتیجه ایجاد دمیلینیشن شود. به‏طور قطع، القای پلاکهای دمیلینه توسط کوپریزون با پلاکهای ایجاد شده در بیماری ام اس تا حدی متفاوت بوده و نمیتوان به‏طور دقیق این بیماری را توسط مدل کوپریزون ایجاد کرد. با این‏حال، این مدل جهت بررسی مراحل رمیلینیشن بسیار مفید میباشد (25).

پس از ایجاد دمیلینیشن توسط کوپریزون و قطع آن، ساخت مجدد میلین در طول یک هفته اتفاق میافتد. ابراز مجدد پروتئینهای میلین این امکان را فراهم میکند که مراحل رمیلینیشن و تاثیرات آن بررسی شود. این در حالی است که با وجود اینکه مدل EAE بهترین مدل جهت بررسی التهاب سیستم عصبی مرکزی است ولی بررسی رمیلینیشن در آن بسیار مشکل بوده زیرا این پدیده همزمان با ایجاد دمیلینیشن اتفاق میافتد در نتیجه امکان تمایز آن‏ها از هم به سختی امکانپذیر است (25). با توجه به گزارش‏های ضد و نقیض از مکانیسم دقیق عمل کوپریزون در روند ایجاد مدل ام اس هنوز ابهامات زیادی در مورد نقش این ترکیب در تخریب و ترمیم میلین وجود دارد. این تاثیرات دوگانه میتواند مربوط به شرایطی از قبیل میزان التهاب موجود و یا موقعیت پاتولوژیکی سلول که در آن بسیاری از پارامترهای سلولی دخیل است باشد. به‏طور کلی کوپریزون از طریق مکانیسمهای متعددی میتواند باعث تغییرات در بیان گروههای متنوعی از ژنها شود و به‏همین دلیل بررسی دقیق تاثیر مهار این فرآیند کاری بسیار دشوار مینماید.

نتیجه گیری

در این مطالعه برای اولین بار، تاثیر کوپریزون هم‏زمان بر روی بیان 4 پروتئینهای اصلی تشکیل دهنده میلین و تغییرات رفتاری در مدل توکسیک بیماری ام اس مورد بررسی قرار گرفت. کوپریزون مادهای است که منجر به بروز پاسخهای متفاوت سلولی و در راس آن‏ها آپوپتوزیس الیگودندروسیتها و تخریب میلین می‏شود. بررسی اخیر نشان داد پس از 7 روز تغذیه با کوپریزون، بیان پروتئین‌های میلین که توسط الیگودندروسیتهای بالغ ایجاد میشود شروع به کاستن کرده و پس از 5 هفته تغذیه با کوپریزون به میزان 50 درصد کاهش مییابد و بیشترین تغییرات رفتاری نیز در همین مدت مشاهده می‏شود. بر اساس مطالعات قبلی برروی مدل کوپریزون، آپوپتوزیس الیگودندروسیتها پس از چند روز تغذیه با کوپریزون آغاز میشود در حالی‏که تخریب میلین قابل رویت پس از 5 هفته و همزمان با از بین رفتن برخی پروتئینهای میلین قابل تشخیص است (26). در این تحقیق، کوپریزون بیشترین تاثیر را در کاهش PLP و نقص در عملکرد رفتاری در کوتاهترین مدت (3 هفته) در ناحیه کارپوس کالوزوم داشت ولی در این مدت تاثیری در کاهش معنادار MOG و MAGنداشت. این نتیجه بیان‏گر آن است که کوپریزون ممکن است از طریق دخالت در مکانیسمهای متفاوتی باعث تغییرات سلولی ‏شود و هم‏زمان یا اندکی پس از مشاهده تغییرات مولکولی، فرآیند نقص در عملکرد رفتاری حیوانات نیز قابل مشاهده می باشد. در مطالعات قبلی محققین اقدام به بررسی ترکیبات دارویی در هفته های مختلف نموده که این عدم تمرکز بر زمان مشخص منجر به گزارش‏های متفاوتی شده است. با توجه به تغییرات وسیع ملاحظه شده پس از پنج هفته مصرف کوپریزون توصیه می‏شود. جهت دقیق بودن نتایج حاصل از مقایسه اثرات ترکیبات حفاظتی مختلف در این مدل، ترجیها اندازهگیریها در انتهای هفته پنجم صورت گیرد تا تغییر شرایط و زمان انجام مطالعات تاثیر کمتری در نتایج داشته باشد. نتایج حاصل از این مطالعه راه را برای انجام مطالعات و برنامه ریزیهای دقیقتر جهت رسیدن به نتایجی قابل استناد فراهم میسازد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان بر خود واجب میدانند از مرکز تحقیقات علوم دارویی دانشگاه علوم پزشکی تهران، گروه زیست شناسی دانشگاه زابل و کلیه همکارانی که ما را در این پژوهش یاری نمودند تشکر و قدردانی نمایند.

منابع

1.Sanadgol N, Zahedani S, Sharifzadeh M, Khalseh R, et al. Recent
updates in imperative natural compounds for healthy brain and nerve
function: A systematic review of implications for multiple sclerosis.
Current drug targets. 2017;18 (13):1499-1517.

2. Sahraian MA, Khorramnia S, Ebrahim MM, Moinfar Z, et al. Multiple sclerosis in Iran: a demographic study of 8,000 patients and changes over time. European neurology. 2010;64(6): 331-6.

3. Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev Immunol. 2005; 23: 683-7.47

4. Ramroodi N, Niazi AA, Sanadgol N, Ganjali Z, et al. Evaluation of reactive Epstein–Barr Virus (EBV) in Iranian patient with different subtypes of multiple sclerosis (MS). The Brazilian Journal of Infectious Diseases. 2013; 17(2): 156-63.

5. Dyment DA, Ebers GC, Sadovnick AD. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 2004; 3(2): 104-10.

6. Ramroodi N, Khani M, Ganjali Z, Javan MR, et al. Prophylactic effect of BIO-1211 small-molecule antagonist of VLA-4 in the EAE mouse model of multiple sclerosis. Immunological investigations. 2015; 44(7): 694-712.

7. Ramroodi N, Sanadgol N, Ganjali Z, Niazi AA, et al. Monitoring of active human herpes virus 6 infection in Iranian patients with different subtypes of multiple sclerosis. Journal of pathogens. 2; 2013: 013.

8. Sanadgol N, Nikravesh A, Motalleb G, Roshanzamir F, et al. Evaluation of the association between ICAM-1 gene polymorphisms and sICAM-1 serum levels in multiple sclerosis (MS) patients in Southeast Iran. International Journal of Genetics and Molecular Biology. 2011; 3(6): 81-6.

9. Lassmann H, Brück W, Lucchinetti CF. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain pathology. 2007; 17(2): 210-8.

10. Blakemore W. Observations on oligodendrocyte degeneration, the resolution of status spongiosus and remyelination in cuprizone intoxication in mice. Journal of neurocytology. 1972; 1(4): 413-26.

11. Skripuletz T, Bussmann JH, Gudi V, Koutsoudaki PN, et al. Cerebellar cortical demyelination in the murine cuprizone model. Brain pathology. 2010; 20(2): 301-12.

12. Wakabayashi T, Asano M, Kurono C. Mechanism of the formation of megamitochondria induced by copper‐chelating agents. Pathology International. 1975; 25(1): 15-37.

13. Kipp M, Clarner T, Dang J, Copray S, et al. The cuprizone animal model: new insights into an old story. Acta neuropathologica. 2009; 118(6): 723-36.

14. Steinman L. The re-emergence of antigen-specific tolerance as a potential therapy for MS. Multiple Sclerosis Journal. 2015; 21(10): 1223-38.

15. Oyama F, Kotliarova S, Harada A, Ito M, et al. Gem GTPase and Tau morphological changes induced by gem GTPase in cho cells are antagonized by tau. Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(26): 27272-7.

16. Elbaz B, Traka M, Kunjamma RB, Dukala D, et al. Adenomatous polyposis coli regulates radial axonal sorting and myelination in the PNS. Development. 2016; 143(13): 2356-66.

17. Sanadgol N, Golab F, Tashakkor Z, Taki N, et al. Neuroprotective effects of ellagic acid on cuprizone-induced acute demyelination through limitation of microgliosis, adjustment of CXCL12/IL-17/IL-11 axis and restriction of mature oligodendrocytes apoptosis. Pharmaceutical Biology. 2017; 55(1): 1679-87.

18. Lang J, Maeda Y, Bannerman P, Xu J, et al. Adenomatous polyposis coli regulates oligodendroglial development. Journal of Neuroscience. 2013; 33(7): 3113-30.

19. Hussain R, Ghoumari AM, Bielecki B, Steibel J, et al. The neural androgen receptor: a therapeutic target for myelin repair in chronic demyelination. Brain. 2013; 136(1): 132-46.

20. Walker J, Fowler S, Miller D, Sun A, et al. Spatial learning and memory impairment and increased locomotion in a transgenic amyloid precursor protein mouse model of Alzheimer's disease. Behavioural brain research. 2011;222(1): 169-75.

21. Kesterson JW, Carlton WW. Cuprizone toxicosis in mice—attempts to antidote the toxicity. Toxicology and applied pharmacology. 1983; 22(1): 6-13.

22. Hiremath M, Saito Y, Knapp G, Ting J-Y, et al. Microglial/macrophage accumulation during cuprizone-induced demyelination in C57BL/6 mice. Journal of neuroimmunology. 1998; 92(1): 38-49.

23. Carlton WW. Studies on the induction of hydrocephalus and spongy degeneration by cuprizone feeding and attempts to antidote the toxicity. Life sciences. 1967; 6(1): 11-9.

24. Zhang Y, Xu H, Jiang W, Xiao L, et al. Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in the brain of C57BL/6 mouse. Schizophrenia research. 2008; 106(2): 182-91.

25. Skripuletz T, Gudi V, Hackstette D, Stangel M. De-and remyelination in the CNS white and grey matter induced by cuprizone: the old, the new, and the unexpected. Histol Histopathol. 2011; 26(12): 1585-97.

26. Pacifico F, Leonardi A. NF-κB in solid tumors. Biochemical pharmacology. 2006; 72(9): 1142-52.

مراجع