بررسی چرخه سلولی، بیان ژنهای میوژنیک و کنترل کننده رشد سلولهای میوبلاست جنینی گوسفند با ازدیاد بیان ژن فولیستاتین

نظری, محمود; ثعلبی, فاطمه; دو, لیشین

doi:10.52547/JCT.8.1.1

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

¹ دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، گروه علوم دامی، اهواز، ایران

² سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، اهواز، ایران

³ مرکز ملی ژنتیک و اصلاح دام، آکادامی علوم کشاورزی، پکن، چین.

https://doi.org/10.52547/JCT.8.1.1

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثرات ازدیاد بیان ژن فولیستاتین بر چرخة سلولی، بیان ژن‌های میوژنیک و فاکتور رشد سلول‌های میوبلاست جنینی گوسفند در محیط آزمایشگاه بود که با استفاده از ویروس AAV سروتیپ 2 حمل‌کنندة فولستاتین انجام شد.
مواد و روش‌ها: سلول‌های میوبلاست جنینی به‏دست آمده از جنین های 60 روزه گوسفند در محیط رشد و تمایز، کشت داده شدند. میزان جذب نوری در طول موج 450 نانومتر، به‏عنوان شاخص تکثیردر سلول‌های ترانسفکت شده با ویروس AAV2 حمل‌کنندة فولیستاتین، بررسی شد. در نهایت بیان ژن‌های میوژنین، Myo D ، CDK2، Myf 5، p57 و p21 با استفاده از تکنیک ریل تایم qPCR اندازه‌گیری شد.
نتایج: میزان جذب نور (در 450 نانومتر) در سلول‌های آلوده شده با ویروس به طور معنی داری افزایش یافت که این موضوع نشان‏می دهد که فولیستاتین می‌تواند تکثیر را افزایش دهد. ازدیاد فولیستاتین سبب افزایش معنی‌دار بیان ژن‌های Akt 1 و CDK2 و کاهش بیان ژن p21 در شرایط تکثیر شد. نتایج ریل تایم نشان داد که بیان ژن‌های میوژنین، Myo D، Myf 5، p57 و p21 تحت شرایط تمایز با ازدیاد فولیستاتین افزایش یافت.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد که ازدیاد فولیستاتین سبب افزایش تکثیر سلول میوبلاست از طریق بیان ژن p21 و افزایش تمایز سلول‌های میوبلاست از طریق افزایش بیان ژن‌های میوژنیک می‏شود.

تازه های تحقیق

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Investigation of Cell Cycle, Myogenic and Growth Factor Genes Expression in Ovine Primary Myoblast Cells by Follistatin Overexpression

نویسندگان [English]

M Nazari ¹
F Salabi ²
L Du ³

¹ 1. Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Food Technology, Ramin Agriculture and Natural Resources University of Khuzestan, Ahvaz-Iran

² Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz-Iran

³ National Center for Molecular Genetics and Breeding of Animal, Chinese Academy of Agricultural Sciences, People’s Republic of China

چکیده [English]

Aim: The aim of this study was investigation of Follistatin gene over-expression effects on cell cycle, myogenic and growth factor genes expression of ovine primary myoblast (OPM) cells in lab that was done using AAV serotype 2 virus (rAAV2) carrying Follistatin (FST).
Material and Methods: Obtained primary myoblasts cells from 60-day-old sheep fetuses were cultured in the growth and differentiation media. The optical density at 450 nm was measured as an indicator of proliferation in transfected cells with AAV serotype 2 (rAAV2) carrying Follistatin. Finally, Myogenic, Myo D, CDK2, Myf5, p57 and p21 genes expressions were measured using Real-Time qPCR.
Results: The optical density (at 450 nm) was significantly increased in virus infected cells that shows Follistatin can increase proliferation. Follistatin proliferation significantly increased the expression of Akt1 and CDK2 genes and decreased the p21 expression gene under proliferation conditions. Real-Time results showed that the expression of myoincin, Myo D, Myf5, p57 and p21 genes increased under conditions of differentiation with Folistatin elevation.
Conclusions: The results showed that proliferation of Follistatin increased the myoblast cells proliferation by p21 gene expressing and increasing the differentiation of myoblast cells by increasing the myogenic genes expression.

کلیدواژه‌ها [English]

-Real Time qPCR
Follistatin
myogenic genes
ovine primary myoblast

اصل مقاله

مقدمه

در گذشته از روش‌هایی همچون تزریق درون پیش هسته و انتقال هسته سلول سوماتیک جهت تولید حیوانات تراریخته استفاده می‌شد. این روش‌ها در بعضی گونه‌ها کارآمد نیستند و ریسک و هزینه بالایی دارند و فرزندان غیر نرمال در این روش‌ها ایجاد شده است (1). اخیرا انتقال ژن به‏واسطه ویروس‌ها برای تولید حیوانات تراریخته استفاده می‏شود و ناقل‌های ویروسی یک مکانیسم کارآمد و جایگزین برای انتقال ژن را فراهم می‌آورند. اگرچه هنوز مباحث جنجال‌برانگیزی در مورد استفاده از رترو ویروس‌ها، لنتی ویروس‌ها و آدنوویروس‌ها جهت انتقال ژن وجود دارد (2). در مقایسه با دیگر ویروس‌ها، ناقل‏های نوترکیب بوجود آمده بر پایه آدنوویروس‌ها کارآیی بیشتری داشته و قادرند سلول‌های تقسیم شونده و غیر تقسیم شونده را آلوده کنند و ریسک کمتری دارند (3). ویروس‌های وابسته به آدنوویروس‌های(AAV) انسانی در سال 1965 به‏عنوان یک آلودگی در محتویات حاوی آدنوویروس‌ها کشف شدند (4). آدنوویروس‌ها برای آلوده نمودن، نیاز به یک کمک یار (Helper) دارند و به‏همین دلیل سروتیپ‏های AAV در یک جنس جداگانه از خانواده پاروو ویریده (Parvoviridae family) به‏نام دیپندو ویروس (Dependovirus) تقسیم‌بندی می‌شوند. این ویروس‌ها دارای یک ژنوم DNA خطی تک رشته ای به‏طول تقریبی 7/4 کیلوباز می‌باشند که می‌توانند در کروموزوم 19 انسان در یک جایگاه اختصاصی به‏صورت تکراری یا غیرتکراری وارد شوند (5). آدنوویروس‌ها می‌توانند برای آلوده نمودن محدوده زیادی از میزبان‌ها بدون تحریک سیستم ایمنی مورد استفاده قرار گیرند (6). چون AAV یک ویروس وابسته است، محدودیت‏های رترو ویروس‏ها و لنتی ویروس‏ها را ندارد. به‏همین دلیل از AAV جهت ژن درمانی در انسان استفاده شده است (7). ژنوم نوترکیب AAV می‌تواند در داخل کروموزوم میزبان وارد شده و یک روش انتقال ژن طولانی مدت پایدار را ایجاد کند (8). ناقل‏های تولیدی بر پایه AAV، بافت های سوماتیکی زیادی همچون ماهیچه‌های اسکلتی را آلوده می‏کنند (9).

ویروس AAV دارای سروتیپ‏های زیادی است. تاکنون 11 سروتیپ از این ویروس شناسایی شده است (10). مشهورترین سروتیپ این ویروس سروتیپ نوع 2 است (AAV2) که به‏طور وسیعی جهت انتقال ژن در سلول‌های ماهیچه‌ای صاف (11) و سلول‌های ماهیچه‌ای اسکلتی (12) به‏کارگرفته شده است. گزارش‏های اخیر نشان داده که AAV قادر است که ژن فولیستاتین را در کروموزوم میزبان وارد کرده و در طولانی مدت آن را بیان کند (13-14). فولیستاتین به‏عنوان یک ممانعت کننده قوی برای خانواده TGF-β از جمله میوستاتین شناخته می‌شود (15). مطالعات نشان داده که فولیستاتین قادر است با سد کردن مسیر میوستاتین سبب افزایش جرم ماهیچه ‏شود (16). همچنین میوستاتین می‌تواند با فعال کردن مسیر p21 و smad سبب کاهش تکثیر و تمایز میوبلاست شود (17-18). مطالعات اخیر به‏طور قابل توجهی بر مهار میوستاتین متمرکز شده‌اند که در نتیجه سبب تولید گاوهایی با ماهیچه‌های بیشتر (19) و موش‌هایی با ماهیچه‌های بزرگ دارای میوستاتین معیوب (20) شده است. چون گوسفند یک حیوان مهم اقتصادی است تولید گوسفندان دارای ماهیچه بیشتر می‌تواند ارزش اقتصادی زیادی داشته باشد. انتقال ژن فولیستاتین در گوسفند با استفاده از ناقل لنتی ویروس گزارش شده است (21) اما به‏واسطه ویروس AAV گزارش نشده است. هدف از این مطالعه تولید یک ناقل ویروس AAV نوترکیب سروتیپ2 حمل‌کننده فولیستاتین جهت بررسی اثرات فولیستاتین بر تکثیر و تمایز سلول‌های میوبلاست جنینی گوسفند در شرایط آزمایشگاهی بود. در مطالعه حاضر، این فرضیه که ویروس AAV حمل‌کننده فولیستاتین می‌تواند سبب تحریک تکثیر و تمایز سلولی شود مورد آزمایش قرار گرفت.

مواد و روش‌ها

سلول‌های میوبلاست جنینی از یک جنین 60 روزه به‏دست آمد که جهت تهیه این سلول‌ها از دستورالعمل Hembree و همکاران (22) استفاده شد. محیط کشت عمومی مورد استفاده DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) بود که جهت تهیه محیط کشت رشد (Growth Media)، 10 درصد سرم جنین گاوی (Fetal bovine serum)به‏همراه آنتی بیوتیک مناسب اضافه شد. جهت‌تهیه محیط کشت‌تمایز(Differentiation Media)2 درصد سرم اسب (Horse serum ) به‏همراه آنتی بیوتیک مناسب اضافه شد. جهت کلون سازی فولیستاتین در ناقل pAAV-IRES-GFP (خریداری شده از شرکت Agilent Technologies) از پرایمرهای پیشرو AAGAATTCCCTCAGGATGGCCCGTCCTA-3’5’ دارای جایگاه برش برای آنزیم EcoR I و پیرو 5’-GCTCGAGGGTTTTCCACTCTAGAATGGA -3’ دارای جایگاه برش برای آنزیم XhoIاستفاده شد. این دو جایگاه برش جهت کلون سازی قطعه‏ای به‏طول 1035 جفت بازی در ناقل لازم است. وکتور نهایی دارای فولیستاتین، pAAV-CFS-FLAG نام‏گذاری شده است. این وکتور هم دارای توالی کدکننده GFP است که برای شناسایی سلول توسط میکروسکوپ فلورسنت دار مناسب

است و هم دارای دم FLAG می‌باشد که برای شناسایی پروتئین تولیدشده توسط این وکتور با استفاده از تکنیک وسترن بلات مناسب می‌باشد. در این آزمایش سلول‌های ترانسفکت نشده به‏عنوان کنترل و سلول‌های ترانسفکت شده با ناقل pAAV-GFP به‏عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از تهیه ناقل پلاسمیدی، با استفاده از کیت ViraBind™ Adeno-Associated Virus Purification Mega Kit، ذرات ویروس در سلول‌های HEK 293 تهیه و خالص‌سازی شد. پس از تهیه ذرات ویروس، جهت آلوده سازی سلول‌ها با ویروس از کیت ViraDuctin™ AAV Transduction Kit شرکت Cell Biolabs استفاده شد. استخراج RNA با استفاده از کیت GeneJETRNA Purification Kit شرکت فرمنتاز انجام شد. غلظت RNA با استفاده از قرائت جذب نمونه‌ها در طول موج 260 نانومتر توسط اسپکتروفوتومتر نانودراپ (ترمو) محاسبه شد و چنانچه نسبت جذب 280/260 بالای 8/1 بود نمونه‌ها برای ساخت cDNA مورد استفاده قرار می‌گرفتند. برای ساخت cDNA، از کیت Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit شرکت فرمنتاز استفاده شد. توالی و خصوصیات آغازگر ژن اختصاصی و ژن خانه‌دار در جدول 1 ارائه شده است.

جدول 1: نام، توالی و مشخصات ژن اختصاصی و ژن خانگی برای انجام Real time qPCR.

ژن	آغازگرها	طول محصول	دمای اتصال
P21	F: 5′-GCAGACCAGCATGACAGATTT-3′ R: 5′-GGATTAGGGCTTCCTCTTGGA-3′	70	58
P57	F: 5′-CGCCGCACCTTTCCCATG-3′ R: 5′-CCCGCAGTGGCATGTCCA-3′	166	59
Myo D	F: 5′-CGACTCGGACGCTTCCAGT-3′ R: 5′-GATGCTGGACAGGCAGTCGA-3′	181	60
Akt I	F: 5′-CAGCATCGTGTGGCAGGAC-3′ R: 5′-TCTTGGTCAGGTGGCGTAA-3′	138	60
CDK2	F: 5′-CATGGATGCCTCTGCACTCACTG-3′ R: 5′-AGGACCCGATGAGAGTGGCAGAA-3′	102	60
Myf5	F: 5′-ACCAGCCCCACCTCAAGTTG-3′ R: 5′-GCAATCCAAGCTGGATAAGGAG-3′	150	60
Myogenin	F: 5′- GTGCCCAGTGAATGCAGCTC-3′ R: 5′- GTCTGTAGGGTCCGCTGGGA-3′	111	60
Myo D	F: 5′-CGACTCGGACGCTTCCAGT-3′ R: 5′-GATGCTGGACAGGCAGTCGA-3′	181	60
GAPDH	F: 5′-CAAGTTCCACGGCACAGTCA-3′ R: 5′-TGGTTCACGCCCATCACAA-3′	249	60

برای انجامReal time PCR از دستگاه BIO-RAD iQ5 ساخت شرکتApplied Biosystem آمریکا استفاده شد. واکنش‏ها در حجم نهایی 25 میکرولیتر ازMaster mix SYBER Green ساخت شرکت ABI آمریکا صورت گرفت. در این ازمایش qPCRطبق دستورالعمل جدول 2 در 40 سیکل انجام شد. روش بررسی تغییرات بیان ژن در این پژوهش روش ΔΔCT (آستانه مقایسه‌ای) و نسبت به بیان ژن GAPDH بود. در روش مقایسه‌ی نسبی تفاوت نسبی نمونه مورد آزمایش در مقابل نمونه کنترل با فرمول: ^{- ΔΔCT} 2 انجام شد (23). بررسی آماری داده‌ها توسط نرم افزار SAS و آزمون t در سطح معنی‌داری 1 درصد انجام شد.

جدول2: دستورالعمل دمایی qPCR Real- time

نام سیکل	تعداد چرخه	زمان	دما (درجه سانتیگراد)	توضیح
سیکل اول	1 X	2 دقیقه	55
سیکل دوم	1 X	10 دقیقه	95
سیکل سوم
	40 X	15 ثانیه	95	دناتوره شدن
		30 ثانیه	متغیر	اتصال
		30 ثانیه	72	تکثیر
سیکل چهارم	51 X	10 ثانیه	95-70	تهیه نمودار ذوب

جهت آنالیز چرخه سلولی، سلول‌ها ابتدا در محیط رشد، کشت شدند. سپس رنگ آمیزی با استفاده از پروپیدیوم یدید انجام گرفت. با استفاده از دستگاه فلوسایتومتر FACS Calibur flow cytometer از شرکت BD Biosciences میزان سلول‌ها در مرحله G1، S و G2 اندازه‌گیری شد.

جهت بررسی تکثیر سلولی میزان جذب نوری در 450 نانومتر با استفاده از دستگاه Spectra Max M5 microplate reader ثبت می‌شود. ابتدا سلول‌ها کشت داده می‌شوند و پس از گذشت 16 ساعت با ویروس آلوده می‌شوند. سلول‌های آلوده شده به‏مدت 48، 72 و 96 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و میزان 5 درصد دی اکسید کربن نگه‏داری می‌شوند و میزان جذب نوری در طول این دوره‏ها با کمک Cell-Counting Kit-8 (CCK-8) reagents اندازه‌گیری می‌شود. جهت تهیه تصاویر از رنگ‌آمیزی به‏وسیله گیمسا استفاده شد و توسط میکروسکوپ فلورسنس (ECLIPSE TE2000-U) شرکت نیکون (توکیو، ژاپن) تصاویر تهیه شد.

جهت بررسی میزان ادغام هسته سلولی و تمایز سلولی نیز از رنگ‌آمیزی گیمسا استفاده شد. در این روش درصد ادغام هسته‌ای به‏صورت نسبت تعداد هسته‌هایی که برای تشکیل لوله‏های ماهیچه‌ای با هم ادغام می‌شوند به کل هسته‌ها تعریف می‌شود.

نتایج

تکثیر سلولی

نتایج توالی یابی ذکر شده در شکل1 نشان داد که ژن فولیستاتین در ساختار ناقل قرار گرفته است و نتایج وسترن بلات (نتایج ارائه نشده است) نشان داد که فولیستاتین در سلول میوبلاست گوسفند بیان می‌شود. همان‏طور که در شکل2 نشان داده شده است، میزان جذب نوری در 450 نانومتر برای تیمار ترانسفکت شده با ویروس در مقایسه با گروه کنترل بعد از 48، 72 و 96 ساعت افزایش یافته است.

شکل 1: نقشه ژنتیکی ناقل پلاسمیدی نوترکیب pAAV-CFS-FLAG شامل فولیستاتین (FST)

شکل 2: میزان جذب نوری در 450 نانومتر برای گروه کنترل (رنگ آبی)، گروه کنترل منفی (رنگ قرمز) و گروه ترانسفکت شده با ویروس AAV-CFS-FLAG (رنگ سبز) بعد از 48، 72 و 96 ساعت رشد در محیط کشت نشان داده شده است. داده‏ها در سطح معنی‌داری یک درصد آنالیز شدند و دو ستاره نشان‏دهنده سطح معنی‌داری یک درصد و NS نشان دهنده عدم معنی‌داری است.

در این آزمایش، RNA‏ی کل از سلول‌های میوبلاست جنینی گوسفند آلودن شده با ویروس AAV حامل فولیستاتین، استخراج شد تا اثر ازدیاد فولیستاتین بر میزان بیان ژن‌هایp21 ،p57 ،Myo D ،AktI ،CDK2 و Myf5 با استفاده از تکنیک ریل تایم qPCR در سطح رونویسی مورد بررسی قرار گیرد. نتایج نشان داد که فولیستاتین سبب کاهش بیان ژن p21 به‏میزان 5/12 برابر و افزایش 1/6 برابری در ژن CDK2 شد. همچنین مشخص شد که بیان ژن Akt I به‏طور چشم‏گیری به‏میزان 41 برابر افزایش یافت (شکل 3). این در حالی است که نتایج ریل تایم نشان داد که بیان ژن Myf5 به‏میزان 5/2 برابر در مقایسه با کنترل کاهش یافته است. همچنین، افزودن فولیستاتین تاثیر معنی‌داری بر بیان ژن‌های Myo D و p57 نداشت.

شکل 3: اثر ازدیاد فولیستاتین بر بیان ژن‌های Cdk 2،Myf 5 ، Myo D ،Akt I، Myf 5، p57 و p21 در محیط کشت رشد با استفاده از تکنیک ریل تایم qPCR. داده‌ها در سطح معنی‌داری یک درصد آنالیز شدند و دو ستاره نشان دهنده سطح معنی‌داری یک درصد می‌باشد.

چرخه سلولی

نتایج ارائه شده در جدول 3 نشان داد که درصد سلول‌ها در تیمارهای آلوده شده با AAV2 حمل‌کننده فولیستاتین نسبت به گروه کنترل در مرحله G1 (مرحله رشد) به‏طور معنی‌داری کاهش و در مرحله S (مرحله سنتز) افزایش یافته است.

جدول 3: درصد سلول‌های آلوده شده با ویروس AAV حمل‌کننده فولیستاتین در مرحله G1، G2/M و S

S (%)	G2 /M (%)	G1 (%)	تیمار
9.23± 1.60 ^c	5.32± 0.87 ^b	85.45± 2.12 ^a	کنترل
11.49± 1.34 ^c	6.86± 1.12 ^ab	81.65± 2.41^a	کنترل منفی (آلوده شده با AAV-GFP)
27.10± 1.81 ^a	9.47± 0.93 ^a	63.43± 1.95 ^c	سلول‌های آلوده شده با ویروس AAV حمل‌کننده فولیستاتین

حروف غیر مشترک در در هر ردیف و برای هر فاکتور جدول دارای اختلاف معنی داری در سطح (01/0 p<) می‏باشد

تمایز سلولی

میزان درصد ادغام در سلول‌های آلوده شده با ناقل ویروس AAV2 حاوی فولیستاتین 11/47 درصد بود در حالی‏که این رقم در ادغام هسته‌ای در کشت سلولی کنترل، 05/32 درصد بود.

نتایج ریل تایم qPCR نشان داد که بیان زیاد ژن فولیستاتین منجر به افزایش 8/7، 3/5، 6/3، 5/4 و 7/2 برابری بیان ژن‌های میوژنین، Myo D، Myf 5، p57 و p21 در سطح رونویسی شد. در حالی‏که اثری بر بیان ژن میوستاتین و ActRII B در شرایط تمایز ندشت.

بحث

فولیستاتین به‏عنوان یک ممانعت کننده قوی برای خانواده TGF-β از جمله میوستاتین شناخته شده است (15). مطالعات نشان داده که فولیستاتین قادر است با سد کردن مسیر میوستاتین سبب افزایش جرم ماهیچه شود (16). میوستاتین نیز می‌تواند با فعال کردن مسیر p21 و مسیر smad سبب کاهش تکثیر و تمایز میوبلاست شود. همان‏طور که در شکل 2 نشان داده شد، میزان جذب نوری در 450 نانومتر برای تیمار ترانسفکت شده با ویروس در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافته است و این نشان دهنده این است که فولیستاتین سبب افزایش تکثیر سلولی شده است. نتایج این آزمایش، با مطالعات دیگر محققین همخوانی داشت (13 و 14). آن‏ها بیان کردند که فولیستاتین سبب تکثیر سلول‌های میوبلاست و افزایش ماهیچه در موش می‌‏شود.

جهت بررسی اثر فولیستاتین بر بیان ژن‌های کنترل‌کننده رشد، پس از آلوده سازی سلول‌های کشت داده شده در محیط رشد با ویروس AAV2، RNAی کل استخراج و از آن cDNA تهیه شد. تغییرات بیان ژن با استفاده از تکنیک ریل تایم qPCR اندازه‌گیری شد. نتایج به‏دست آمده از ریل تایم نیز با نتایج محققین دیگر هم‏خوانی دارد (24 و 25). محققین نشان دادند که افزایش فولیستاتین در سلول‌های ماهیچه موش سبب کاهش بیان ژن p21 گردید و اثری بر بیان ژن p57 نداشت. آن‏ها بیان کردند که فولیستاتین با بلوکه کردن مسیر p21 سیگنال های مسیر میوستاتین را بلوکه می‌کند و با این عمل سبب افزایش تکثیر این سول‏ها می‌‏شود (24 و 25). همان‏طور که مشخص شده است میوستاتین یک تنظیم کننده و مهارکننده رشد ماهیچه است (17) و فولیستاتین با متصل شدن به میوستاتین و جلوگیری از ورود آن به سلول، سبب افزایش تکثیر سلولی می‌‏شود (16).

همان‏طور که آزمایش‏های چرخه سلولی نشان داد تعداد سلول‌ها در مرحله S در تیمارهای آلوده شده با ویروس AAV2 حمل‌کننده فولیستاتین افزایش یافته است. این نتایج تاییدکننده این موضوع است که فولیستاتین سبب افزایش رشد سلول‌های میوبلاست از طریق انتقال سلول‌ها از مرحله رشد به مرحله سنتز سلولی شده است. میوستاتین با افزایش بیان ژن p21 سبب گیر افتادن سلول‌ها در مرحله رشد (G1) و طولانی شدن این مرحله می‌‏شود (24). در مقابل، پروتئین فولیستاتین با اتصال به میوستاتین از این عمل جلوگیری می‌کند.

نتایج رنگ آمیزی سلول‌ها با رنگ گیمسا (شکل 4) نشان داد که تمایز سلولی در تیمارهای آلوده شده با ویروس AAV2 حمل‌کننده فولیستاتین افزایش یافته است. این نتایج نشان دهنده این موضوع است که حضور فولیستاتین منجر به افزایش تمایز سلول‌های میوبلاست جنینی در گوسفند شده‌است. افزایش بیان ژن‌های میوژنین، Myo D، Myf 5، p57 و p21 در سطح رونویسی موید این موضوع است (شکل 5). پروتئین Myo D یک تنظیم کننده مرکزی در ماهیچه سازی است. در نتیجه افزایش پروتئین می‏توان انتظار افزایش تمایز سلولی را داشت. میوژنین نیز از تنظیم کننده‌های شاخص در تمایز سلول‌های ماهیچه است. فولیستاتین با افزایش بیان این دو ژن تنظیم کننده و مهم در تمایز سلول‌های ماهیچه‌ای سبب افزایش تمایز سلول‌های ماهیچه‌ای‌جنینی در گوسفند می‌‏شود. افزایش Myo D هم‏زمان با افزایش بیان میوژنین در فاز G1 سلولی، علائم تمایز سلولی را ایجاد می‌کند(26). ادامه افزایش بیان Myo D منجر به افزایش بیان ژن‌های p21 و p57 می‌گردد که در این زمان لوله‏های تک هسته‌ای به هم چسبیده و لوله‌های چند هسته‌ای ایجاد می‏کنند(27). این نتایج تایید می‌کند که فولیستاتین تمایز سلول‌های میوبلاست را با افزایش بیان ژن‌های میوژنیک تنظیم می‌کند.

		کنترل (بدون آلودگی ویروسی)

کنترل منفی (آلودن شده با AAV-GFP )

		آلودن شده با AAV-CFS-FLAG

48 h	72 h	96 h

الف)

ب)

شکل4: الف) سلول‌های میوبلاست جنینی در محیط کشت تمایز (حاوی 2 درصد سرم اسب) برای مدت 48، 72 و 96 ساعت کشت داده شده و سپس با ویروس AAV-CFS-FLAG ترانسفکت شده است. از سلول‌های ترانسفکت شده با AAV-GFP به‏عنوان کنترل منفی استفاده شده است. در نهایت سلول‌ها با رنگ گیمسا رنگ آمیزی شده‌اند. ب) میزان درصد ادغام هسته برای گروه کنترل (رنگ آبی)، گروه کنترل منفی (رنگ قرمز) و گروه ترانسفکت شده با ویروس AAV-CFS-FLAG (رنگ سبز) بعد از 48، 72 و 96 ساعت نشان داده شده است. داده‌ها در سطح معنی‌داری یک درصد آنالیز شدند و دو ستاره نشان دهنده سطح معنی‌داری یک درصد و NS نشان دهنده عدم معنی‌داری است.

شکل 5: اثر ازدیاد فولیستاتین بر بیان ژن‌های میوژنین، میوستاتین، Myo D، ActRIIB، Myf 5، p57 و p21 در محیط کشت تمایز با استفاده از تکنیک ریل تایم qPCR. داده‌ها در سطح معنی‌داری یک درصد آنالیز شدند و دو ستاره نشان‏دهنده سطح معنی‌داری یک درصد می‌باشد.

نتیجه‌گیری

نتایج این آزمایش برای اولین بار بیان شدن ژن فولیستاتین توسط ویروس AAV2 در سلول‌های گوسفندی را ارائه می‌دهد. نتایج نشان داد که می‏توان ژن فولیستاتین را با موفقیت به‏کمک AAV در سلول‌های گوسفندی بیان کرد. یافته‌های این آزمایش نشان داد که فولیستاتین می‌تواند با کاهش بیان ژن p21 در سطح رونویسی سبب افزایش تکثیر سلول میوبلاست در گوسفند شود. به‏نظر می‌رسد که فولیستاتین با اتصال به میوستاتین و توقف سیگنال مرتبط با آن منجر به افزایش تکثیر سلولی می‌‏شود. همچنین،‌ فولیستاتین با افزایش بیان Myo D و میوژنین (ژن‌های تنظیم کننده و مهم در تمایز سلول‌های ماهیچه‌ای) سبب افزایش تمایز سلول‌های ماهیچه‌ای جنینی در گوسفند می‌‏شود. نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از آن است که می‏توان از ویروس AAV جهت تولید سلول‌های ترانس ژنیک گوسفند استفاده کرد.

منابع

Honaramooz A, Megee S, Zeng W, Destrempes M, et al. Adeno-associated virus (AAV)-mediated transduction of male germ line stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation. The FASEB J. 2008; 22(2): 374–382.
Naldini L, Blomer P, Gallay D, Ory R, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996; 272(52-59): 263–267.
Ragot T, Vincent N, Chafey P, Vigne E, et al. Efficient adenovirus-mediated transfer of a human minidystrophin gene to skeletal muscle of mdx mice. Nature (London). 1993; 361: 647–650.
Atchison RW, Castro BC, Hammon WM. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 1965; 149(3685): 754-756.
Srivastava A. Obstacles to human hematopoietic stem cell transduction by recombinant adeno-associated virus 2 vectors. J. Cell. Biochem. 2002; 38: 39–45.
Bartlett JS, Kleinschmidt J, Boucher RC, Samulski RJ. Targeted adeno-associated virus vector transduction of non-permissive cells mediated by a bispecific Fantibody. Nature Biotech. 1999; 17(2): 181–186.
Trobridge G, Hirata RK, Russell DW. Gene targeting by adeno-associated virus vectors is cell-cycle dependent. Hum. Gene Ther. 2005; 16: 522–526.
Flotte TR, Barraza X, Solow R, Afione SA, et al. An improved system for packaging recombinant adeno-associated virus vectors capable of in vivo transduction. Gene Ther. 1995; 2(1): 29-37.
Xiao X, Li J, Samulski RJ. Efficient long-term gene transfers into muscle tissue of immune-competent mice by adeno-associated virus vector. Journal of Virology. 1996; 70(11): 8098-8108.
10. Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology. 2004; 330 (2): 375–83.

11. Richter M, Iwata A, Nyhuis J, Nitta Y, et al. Adeno-associated virus vector transduction of vascular smooth muscle cells in vivo. Physiological Genomics. 2000; 2(3): 117–27.

12. Manno CS, Chew AJ, Hutchison S, et al. AAV-mediated factor IX gene transfer to skeletal muscle in patients with severe hemophilia B. Blood. 2003; 101(8): 2963–2972.

13. Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, et al. Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(11): 4318–4322.

14. Kota J, Handy CR, Haidet AM, Montgomery CL, et al. Follistatingene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2010: 1(6): 1-17.

15. Amthor H, Nicholas G, McKinnell I, Kemp CF, et al. Follistatin complexes myostatin and antagonizes myostatin-mediated inhibition of myogenesis. Devel Biol. 2004; 270(1): 19–30.

16. Lee SJ. Sprinting without myostatin: a genetic determinant of athletic prowess. Trends Genet. 2007; 23(10): 475-477.

17. Han DS, Huang HP, Wang TG, Hung MY. Transcription activation of myostatin by trichostatin A in differentiated C2C12 myocytes via ASK1-MKK3/4/6-JNK and p38 mitogen-activated protein kinase pathways. J Cell Biochem. 2010; 111: 564-573.

18. Philip B, Lu Z, Gao Y. Regulation of GDF-8 signaling by the p38 MAPK. Cellular Signalling. 2005; 17(3): 365-75.

19. Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, Pirottin D. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double muscled phenotype in cattle. Nature Genetic. 1997; 17(1): 71–74.

20. Wagner KR, McPherron AC, Winik N, Lee SJ. Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol. 2002; 52(6): 832–836.

21. Zhang N, Zhang X, Liu M, Tan L. Ovine Follistatin gene expression and functional analysis of Follistatin domains. Chin J Biotech. 2010; 26(8): 1050−1056.

22. Hembree JR, Hathaway MR, Dayton WR. Isolation and culture of fetal porcine myogenic cells and the effect of insulin, IGF-1, and sera on protein turnover in porcine myotube cultures. J. Animal Science. 1991; 69: 3241-3250.

23. Pfaffl MW, Horgan GW. Dempfle, L. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research.2002; 30(9): 1-10.

24. Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, et al. Myostatin, a Negative Regulator of Muscle Growth, Functions by Inhibiting Myoblast Proliferation. Journal of Biological Chemistry. 2000; 275(51): 40235–40243.

25. Benabdallah BF, Bouchentouf M, Rousseau J, Tremblay JP. Overexpression of Follistatin in human myoblasts increases their proliferation and differentiation, and improves the graft success in SCID mice. Cell Transplantation. 2009; 18(7): 709-718.

26. Perry RL, Rudnick MA. Molecular mechanisms regulating myogenic determination and differentiation. Front. Biosci 2000; 5: D750–D767.

27. Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, et al. Kambadur R.myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating Myo D expression. Journal of Biological Chemistry. 2002; 277: 49831–49840.

مراجع

Honaramooz A, Megee S, Zeng W, Destrempes M, et al. Adeno-associated virus (AAV)-mediated transduction of male germ line stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation. The FASEB J. 2008; 22(2): 374–382.
Naldini L, Blomer P, Gallay D, Ory R, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996; 272(52-59): 263–267.
Ragot T, Vincent N, Chafey P, Vigne E, et al. Efficient adenovirus-mediated transfer of a human minidystrophin gene to skeletal muscle of mdx mice. Nature (London). 1993; 361: 647–650.
Atchison RW, Castro BC, Hammon WM. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 1965; 149(3685): 754-756.
Srivastava A. Obstacles to human hematopoietic stem cell transduction by recombinant adeno-associated virus 2 vectors. J. Cell. Biochem. 2002; 38: 39–45.
Bartlett JS, Kleinschmidt J, Boucher RC, Samulski RJ. Targeted adeno-associated virus vector transduction of non-permissive cells mediated by a bispecific Fantibody. Nature Biotech. 1999; 17(2): 181–186.
Trobridge G, Hirata RK, Russell DW. Gene targeting by adeno-associated virus vectors is cell-cycle dependent. Hum. Gene Ther. 2005; 16: 522–526.
Flotte TR, Barraza X, Solow R, Afione SA, et al. An improved system for packaging recombinant adeno-associated virus vectors capable of in vivo transduction. Gene Ther. 1995; 2(1): 29-37.
Xiao X, Li J, Samulski RJ. Efficient long-term gene transfers into muscle tissue of immune-competent mice by adeno-associated virus vector. Journal of Virology. 1996; 70(11): 8098-8108.
10. Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. Virology. 2004; 330 (2): 375–83.