سلول و بافت

فصلنامه

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

اعضای هیات تحریریه

اصول اخلاقی انتشار مقاله

بانک ها و نمایه نامه ها

پیوندهای مفید

فرایند پذیرش مقالات

بیانیه حریم خصوصی

بیانیه حق مولف

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

اطلاعات آماری نشریه

خط مشی داوری

راهنمای داوران

فهرست داوران

اثرات سیلیمارین روی تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند به ‌دودمان استخوان‮ساز‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته‌ی دکتری عمومی دامپزشکی، دانشگاه رازی، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم پایه و پاتوبیولوژی، کرمانشاه، ایران

2 استادیار، دانشگاه رازی، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم پایه و پاتوبیولوژی، کرمانشاه، ایران

3 استادیار، دانشگاه رازی، دانشکده پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، کرمانشاه، ایران

چکیده

هدف: سلول درمانی با استفاده از سلول­های بنیادی مزانشیمی (MSCs) می تواند ابزاری امیدوار کننده به عنوان طب بازساختی باشد. یکی از غنی ترین منابع سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جنین است. سیلیمارین دارای فعالیت های آنتی اکسیدانی و ضد التهابی قوی با تأثیر مثبت بر تکثیر برخی از سلول ها و همچنین خاصیت ضد پوکی استخوان است. این مطالعه با هدف نشان دادن اثر سیلیمارین بر تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند به رده  استئوژنیک انجام شد. مواد و روش­ها: سلول­های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جنین گوسفند جدا شدند. آزمون MTT جهت بررسی سمیت سلولی سیلیمارین روی سلول­ها درغلظت ­های مختلف در زمان­های 24 و 72 ساعت انجام شد. سپس، سلول‌ها در یکی از 8 گروه 1: شاهد منفی؛ 2: تیمار شده با 10 میکرومول بر لیتر سیلیمارین در محیط معمول، 3: تیمار شده با 20 میکرومول بر لیتر سیلیمارین در محیط معمول، 4: تیمار شده با 100 میکرومول بر لیتر استرادیول در محیط معمول، 5: شاهد مثبت، 6: تیمار شده با 10 میکرومول بر لیتر سیلیمارین در محیط تمایزی، 7: تیمار شده با 20 میکرومول بر لیتر سیلیمارین در محیط تمایزی، 8: تیمار شده با 100 میکرومول بر لیتر در محیط تمایزی، به‌مدت 21 روز کشت شدند.جهت تعیین تمایز استئوژنیک سلول­ها، با استفاده از رنگ آمیزی آلیزارین رد رسوب یون هیدروکسی آپاتیت بررسی شد  و همچنین میزان ترشح آنزیم ALP در گروه های مورد مطالعه اندازه گیری شد. نتایج: مقایسه میانگین جذب نوری سلول­ها در غلظت­های مختلف بین زمان­های 24 و 72 ساعت پس از تیمار نشان داد که میانگین جذب نوری سلول­ها در غلظت صفر سیلیمارین، 72 ساعت پس از تیمار نسبت به زمان 24 ساعت پس از تیمار کاهش نشان داد(05/0P<) اما در سایر غلظت­ها تفاوت معنی دار مشاهده نشد(05/0P>).  بررسی میزان ترشح آنزیم ALP ، 21 روز پس از تیمار در گروه­های مورد مطالعه نشان داد که در مجموع بیشترین میزان ترشح آنزیم در گروه 8 بود (05/0P≤). کمترین میزان ترشح آنزیم در گروه 1 (کنترل منفی) و پس از آن به ترتیب در گروه­ 2 و گروه 3 مشاهد شد(05/0P<). بین گروه­های 4، 5 و  6 تفاوت معنی دار مشاهده نشد(P>0.05). بر اساس نتایج حاصل از رنگ آمیزی آلیزارین رد، رسوب املاح کلسیم در تمام گروه­های مربوط به محیط کشت تمایزی مشاهده شد که به ترتیب در گروه­های 8، 7، 6 و 5 افزایش یافت. در گروه­های کشت شده در محیط معمول، در گروه 1 رسوبی مشاهده نشد و میزان رسوب به ترتیب در گروه­های 2، 3 و 4 افزایش نشان داد. در مجموع میزان رسوب در گروه­های محیط تمایزی بیشتر از محیط معمول بود. نتیجه گیری: سیلیمارین در غلظت­های مورد بررسی روی سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند، اثر سمیت ندارد و همچنین در غلظت­های مورد بررسی باعث افزایش تمایز سلول­ها به رده ی استخوانساز می شود که این افزایش وابسته به غلظت است. از این رو، به نظر می رسد با مطالعات بیشتر و شناسایی مسیرهای مولکولی اثر گذاری سیلیمارین، می­توان از آن در سلول درمانی جهت ترمیم ضایعات استخوانی استفاده کرد. 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Silymarin Effects on Ovine Fetal Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Differentiation into Osteogenic Lineage

نویسندگان [English]

  • I Morovati 1
  • T Mohammadi 2
  • M Pooyanmehr 2
  • L Soltani 3

1 A DVM graduate, Basic Sciences and Pathobiology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Razi University, Kermanshah, Iran

2 Assistant Professor, Basic Sciences and Pathobiology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Razi University, Kermanshah, Iran

3 Assistant Professor, Department of Animal Sciences, College of Agriculture and Natural Resources, Razi University, Kermanshah, Iran

چکیده [English]

Aim: Cell therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) can be a promising tool in regenerative medicine. One of the richest sources of mesenchymal stem cells is fetal bone marrow. Silymarin has strong antioxidant and anti-inflammatory activities with a positive effect on the proliferation of some cells as well as anti-osteoporosis properties. This study aimed to show the effect of silymarin on the differentiation of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of sheep embryos into the osteogenic line.
Materials and Methods: Mesenchymal stem cells were isolated from the bone marrow of sheep embryos. MTT test was performed to investigate the cytotoxicity of silymarin on cells at different concentrations for 24 and 72 hours. Then, cells in one of 8 groups 1: negative control; 2: treated with 10 μmol/liter silymarin in the usual environment, 3: treated with 20 μmol/liter silymarin in the usual environment, 4: treated with 100 μmol/liter estradiol in the usual environment, 5: positive control, 6: treatment treated with 10 μmol/liter silymarin in the differentiation medium, 7: treated with 20 μmol/liter silymarin in the differentiation medium, 8: treated with 100 μmol/liter in the differentiation medium, were cultured for 21 days. To determine the osteogenic differentiation of cells, the deposition of hydroxyapatite ions was examined using alizarin staining, and also, the amount of ALP enzyme secretion was also measured in the studied groups. Results: Comparing the average optical absorption of cells at different concentrations between 24 and 72 hours after treatment showed that the average optical absorption of cells at zero concentration of silymarin after 72 hours of treatment decreased in comparison with those treated for 24 hours (P<0.05), but no significant difference was observed in other concentrations (P>0.05). Examining the level of ALP enzyme secretion, 21 days after treatment with silymarin in the studied groups showed that the highest level of enzyme secretion was in group 8 (P≤0.05). The lowest amount of enzyme secretion was observed in group 1 (negative control) and then in group 2 and group 3 respectively (P<0.05). No significant difference was observed between groups 4, 5, and 6 (P>0.05). Based on the alizarin red staining results, calcium ions deposition was observed in all the groups related to the differentiation medium, which increased in groups 8, 7, 6, and 5, respectively. In the groups cultured in the usual environment, there was no calcification in group 1 and the amount of calcification increased in groups 2, 3, and 4, respectively. In total, the amount of calcification in the differentiation environment groups was higher in comparison with the usual environment.
Conclusion: During this study, Silymarin had no toxic effect on the mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of sheep embryos in the studied concentrations after 24 and 72 hours of treatment. It increased the differentiation of the cells into the osteogenic lineage in a concentration-dependent manner. Therefore, it seems that with further studies and identification of the molecular pathways of silymarin's effect, it can be used in cell therapy in order to repair bone lesions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mesenchymal stem cells
  • differentiation
  • osteogenic
  • silymarin
  • ALP
اصل مقاله
  • مقدمه

   استخوان در سراسر زندگی فرد به­طور پیوسته با فعالیت استئوکلاست­ها و استئوبلاست­ها بازسازی می­شود درحالی‌که به‌وسیله‌ی فعالیت سلول‌های فرمانده­ی مکانوسنسوری، سلول‌های استئوسایت، کنترل می­شود (1، 2). از نظر فرآیند تکوینی، استخوانی شدن با جمع شدن سلول‌های مزانشیمی آغاز می­شود، به‌عبارت‌دیگر، استئوسیت به‌عنوان یک سلول استخوانی کاملا تمایزیافته از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان شناخته می­شود. سلول‌های بنیادی مزانشیمی سلول‌های پیش­ساز چندتوانی هستند که قادر به‌تمایز به سلول‌های مختلفی از قبیل استئوبلاست، کوندروسیت، آدیپوسیت و میوسیت هستند (3-5). بعد ازاین‌که استئوبلاست­ها اجزای ماتریکس­ استخوانی مثل کلاژن نوع 1 و آلکالین فسفاتاز، در طول فرآیند بازسازی استخوان را می­سازند (6، 7)، با یکی از سرنوشت­های زیر مواجه می­شوند (1) تبدیل‌شدن به سلول‌های پوشاننده­ی استخوان، (2) تبدیل‌شدن به استئوسایت­های تعبیه‌شده در استخوان و (3) طی کردن فرآیند آپوپتوزیس (8).

در مطالعات تمایز به استخوان و مینراله شدن آن، محققان مختلف پروتکل­های استاندارد طلایی را در راستای القای آزمایشگاهی تمایز استئوژنیک، با به‌کارگیری مکمل­های شیمیایی استخوان­ساز ازقبیل آسکوربیک­اسید و بتا-گلیسرول فسفات را به‌دست آورده­اند (9، 10). ازطرف‌دیگر، تمایز آزمایشگاهی استئوسایت نیز در مطالعات بسیاری موردبررسی قرارگرفته است. بعد ازاین‌که سلول‌های پیش ساز استئوبلاست پس از دوره­ی طولانی کشت در محیط کشت استاندارد طلایی در ظرف کشت تشکیل شدند، ساختارهای گنبدی سه­بعدی از نودول­های استخوانی را ایجاد می­کنند (11، 12). اگرچه سلول‌های شبه استئوسایت درنهایت چند هفته در داخل ندول­ها پدیدار می­شوند، روش کارآمد برای دستیابی تمایز مستقیم استئوسایت­ها به سلول‌های پیش­ساز یا سلول‌های بنیادی ثابت نشده است، زیرا که سلول‌های شبه استئوسایت به‌طور تصادفی بعد از کشت طولانی‌مدت در ندول­ها پدیدار می­شوند.

سیلیمارین کمپلکسی طبیعی مشتق از گیاه خارمریم Silybum marianum است. فعالیت سیلیمارین شامل افزایش گلوتاتیون کبدی و تحریک فعالیت آنزیم RNA پلیمرازی I است. به‌علاوه، به‌واسطه فعالیت آنتی اکسیدانتی در محافظت کبد نیز مشارکت دارد (13). در نتیجه فعالیت حفاظت کبدی و آنتی ­اکسیدانتی سیلیمارین، تولید رادیکال‌های آزاد ناشی از متابولیسم مواد سمی از قبیل تتراکلرید کربن و اتانول مهار می­شود (13). در برخی موارد فیبروز کبدی، سیلیمارین اثرات ضد فیبروزی را در طول القای سیگنال دارد و هم‌چنین پروتئین کینازها را مهار می­کند. علاه­براین، با چرخه­های هدایتی داخل سلولی نیز واکنش اثرمتقابل دارد (14). هم‌چنین سیلیمارین اثرات بالقوه­ی استئوبلاستوژنز خود را از طریق چرخه­های هدایتی BMP/SMAD/Runx2 اعمال می­کند و سبب ترمیم استخوان در موش می­شد (15). هم‌چنین، در مطالعه دیگری، تجویز خوراکی عصاره گیاه خارمریم در موش­های اواریکتومی شده، تراکم مواد معدنی استخوان ران را بهبود داده است و کاهش تراکم استخوان ناشی از نبود هورمون استروژن را کاهش داده است (16). در مطالعه دیگری، تجویز سیلیمارین از راه آب آشامیدنی موش­ها، اثر ترمیم‌کنندگی داربست حامل سلول­های بنیادی مزانشیمی را افزایش داده است (17). با توجه به‌ مطالب ذکر شده چنین به‌نظر می‌رسد که سیلیمارین تمایز سلول‌های مزانشیمی به دودمان استخوانی را افزایش دهد. تاجایی‌که اطلاع داریم تاکنون مطالعه­ای در خصوص اثر سیلیمارین روی تمایز سلول­های مزانشیمی جداشده از مغز استخوان جنین گوسفند به سلول استخوان‌ساز انجام ‌نشده است. ازاین‌رو در این مطالعه، اثر سیلیمارین روی تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی جداشده از مغز استخوان جنین گوسفند به سلول­های استئوبلاست بررسی شد.

  • مواد و روش‌ها

   مواد: تمامی مواد مورداستفاده در این مطالعه از شرکت سیگما خریداری شد به‌جز در مواردی که در متن به آنها اشاره شده است.

جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جنین گوسفند: مطالعه حاضر با شناسه IR.RAZI.REC.1399.057 در جلسه کمیته اخلاق دانشگاه رازی تصویب شده است. جنین­های گوسفند از کشتارگاه بیستون کرمانشاه، پس از ذبح دام و مشاهده­ی آبستنی حیوان به‌صورت سالم همراه با بافت رحم و جفت به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه پس از جداسازی بافت‌های رحم و جفت و شست‌وشوی جنین، در زیر هود لامینار استخوان­های ران و درشت­نی جنین از بافت‌های مختلف کاملا جداسازی شد. سپس دو سر استخوان قطع شد و محیط DMEM غنی شده با سرم گوساله­ی جنینی و آنتی­بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین با روش آسپیراسیون از یک سر استخوان وارد و از سر دیگر خارج شد. در ادامه، محیط آسپیراسیون حاوی مغز استخوان از موش (70 میکرومتر) عبور داده شد و به فلاسک­های T-25 منتقل و در انکوباتور 37 درجه­ی سانتی­گراد، هوای اتمسفری مرطوب و 5 درصد دی­اکسیدکربن برای مدت‌ زمان 48 ساعت کشت شد. پس از طی این مدت‌زمان، فلاسک کشت با بافر DPBS چندین مرتبه شست‌وشو داده شد. در ادامه، محیط کشت DMEM غنی شده با 10 درصد سرم و 1 درصد آنتی­بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین اضافه و به انکوباتور منتقل شد و هر 48 ساعت یک‌بار تعویض محیط صورت گرفت. پس ‌از آن‌که حدود 80 درصد از کف فلاسک به‌وسیله‌ی سلول‌های دوکی ‌شکل پر شد محیط رویی سلول‌ها حذف شد و با کمک آنزیم تریپسین سلول‌ها از کف فلاسک جداسازی شدند. بخشی از آن‌ها فریز و بخش دیگر، مجددا کشت داده شدند که به‌آن‌ها سلول‌های پاساژ اول اطلاق می­شود. جهت شناسایی سلول‌های بنیادی مزانشیمی سلول‌های پاساژ سوم مورد استفاده قرارگرفت.

شناسایی سلول‌های بنیادی مزانشیمی

تمایز به سلول‌های استخوانی و چربی: برای این آزمون، سلول­ها در پلیت چهار چاهکی کشت شدند. دو چاهک برای    گروه­های کنترل، یک چاهک برای گروه­ تیمار شده با محیط تمایزی استخوان‌ساز و یک چاهک برای گروه­ تیمار شده با محیط تمایزی چربی­ساز در نظر گرفته شد. در هر چاهک به‌میزان 10000 سلول کشت داده شد و به‌هر چاهک 500 میکرولیتر محیط کشت DMEM با گلوکز بالا غنی شده با 10 درصد سرم و 1 درصد آنتی‌بیوتیک اضافه شد. 48 ساعت بعد تعویض محیط انجام شد. پس‌ازآن محیط تمایزی چربی و استخوانی به چاهک­های مربوط اضافه شد و در مورد چاهک­های کنترل، تعویض محیط با محیط معمول انجام شد. عمل تعویض محیط با محیط‌های تمایزی هر 3 روز یک‌بار به‌مدت سه هفته انجام گرفت. ولی پلیت گروه کنترل تا پایان دوره فقط با محیط معمولی تعویض محیط می‌شد. بعد از سه هفته وقوع تمایز استخوان­ساز با استفاده از رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و تمایز چربی ساز با رنگ‌آمیزی اویل رد مورد ارزیابی قرار گرفت.

بیان مارکرهای سطحی: سلول‌های پاساژ سوم جداسازی شده از بافت مغز استخوان جنین گوسفند برای بررسی بیان مارکرهای سطحی باکمک آزمون فلوسایتومتری مورداستفاده قرار گرفتند. آنالیز فلوسایتومتری با به‌کارگیری FITC اتصال یافته به (-)CD34 و (+)CD44 صورت گرفت. به‌طور خلاصه، 106 سلول شمارش و در محلول پارافرمالدئید تثبیت شدند و سپس در میکروتیوب­های حاوی DPBS برروی یخ به آزمایشگاه سازمان انتقال خون تهران منتقل شدند. در آنجا، آنتی‌بادی اولیه کونژوگه به آنتی‌بادی‌های ثانویه اضافه شد. پس از انکوباسیون 03 دقیقه­ای در دمای یخچال و تاریکی، با دستگاه فلوسایتومتری (partec cy-flow) خوانش انجام گرفت و نتایج با استفاده از نرم‌افزار FloMax مورد بررسی قرار گرفت.

ارزیابی بقای سلول‌ها: برای سنجش میزان بقای سلول‌های کشت‌شده از آزمون3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT)  استفاده شد. در سنجش متیل تیازول تترازولیوم ( (MTTفعالیت آنزیم دهیدروژنازهای میتوکندریایی در سلول‌های زنده مورد سنجش قرار می‌گیرد. برای انجام این آزمون سلول‌های بنیادی مزانشیمی به‌چندین گروه به‌شرح ذیل تقسیم شدند: 1-شاهد: در محیط کشت معمول فاقد سیلیمارین (غلظت صفر) کشت داده شدند. 2-تیمار 1: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 1/0 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند، 3-تیمار 2: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 2/0 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند، 4- تیمار 3: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 1 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند، 5- تیمار 4: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 2 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند، 6- تیمار 5: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 5 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند؛ 7- تیمار 6: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 10 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند و 8- تیمار 7: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 20 میکرومول بر لیتر کشت داده شدند.

حدود 10 هزار سلول­ برای هر گروه تیماری در 3 تکرار در پلیت 96 خانه کشت شدند. بعد از گذشت 24 ساعت و اطمینان از چسبیدن سلول‌ها به ظرف کشت، محیط رویی برداشته شد و با محیط جدید در گروه‌های تیماری ذکرشده در بالا برای 24 و 72 ساعت کشت شدند. بعد از اتمام دوره کشت، به‌ازای هر 100 میکرولیتر محیط کشت 20 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بافر DPBS) به‌هر چاهک از پلیت 96 خانه اضافه و پلیت­ها به‌مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد. سپس، محیط رویی به‌آرامی تخلیه و به چاهک­ها، محلول دی متیل سولفوکسید حلال (DMSO) اضافه و جذب نوری محلول حاصله با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج 570 نـانومتر قرائت شد.

القای تمایز استئوژنیک در سلول­های بنیادی مزانشیمی: برای بررسی اثر تمایزی عصاره‌ی سیلیمارین روی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند به سلول‌های استئوبلاستی (رده استخوان‌ساز)، تعداد 106 سلول­ پاساژ سوم به پلیت­های شش چاهکی انتقال داده شد. در سه روز ابتدایی همه‌ی سلول‌ها در محیط کشت معمول بودند. پس از پر شدن کف چاهک­ها، محیط کشت مناسب با گروه‌های مورد مطالعه به‌هر چاهک اضافه شد.

گروه­های موردمطالعه به شرح ذیل بودند: 1-کنترل منفی: در محیط کشت معمول کشت داده شد، 2-کنترل مثبت: در محیط کشت تمایزی کشت داده شد، 3-تیمار 1: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 10 میکرومول بر لیتر کشت داده شد، 4-تیمار 2: در محیط کشت معمول حاوی سیلیمارین 20 میکرومول بر لیتر کشت داده شد، 5-تیمار 3: در محیط کشت تمایزی حاوی سیلیمارین 10 میکرومول بر لیتر کشت داده شد، 6- تیمار 4: در محیط کشت تمایزی حاوی سیلیمارین 20 میکرومول بر لیتر کشت داده شد، 7- تیمار 5: در محیط کشت معمول حاوی استرادایول 100 نانومول بر لیتر کشت داده شد و 8- تیمار 6: در محیط کشت تمایزی حاوی استرادایول 100 نانومول بر لیتر کشت داده شد. طول مدت تیمار 21 روز بود. طی این مدت، پلیت­های گروه‌های تحت بررسی در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 با 90 درصد رطوبت و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شدند و هر سه روز یک‌بار تعویض محیط انجام می‌گرفت.

اثبات ماهیت استئوبلاستی سلول‌های تمایزیافته

رنگ‌آمیزی اختصاصی آلیزارین رد: به‌منظور اثبات ماهیت استئوبلاستی سلول­های تمایزیافته، رنگ‌آمیزی اختصاصی آلیزارین رد صورت گرفت که میزان معدنی شدن (رسوب املاح) را نشان می‌دهد.

سنجش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز: میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در مطالعه حاضر در محیط رویی کشت  سلول­ها با استفاده از کیت آلکالین فسفاتاز خریداری‌ شده از شرکت (پادکو، ایران) و از روش تک محلوله آن طبق دستورالعمل شرکت مذکور انجام شد. خوانش جذب نوری سلول­ها در طول‌ موج 405 نانومتر در سه زمان 1، 3 و 30 دقیقه با دستگاه الایزا ریدر انجام شد. در پایان میانگین جذب نوری سلول­های هرکدام از گروه­ها محاسبه شد.

  • آنالیز آماری

   تجزیه‌وتحلیل آماری بـا استفاده از نرم‌افزار SPSS و براساس آزمون­های T-student و آنالیز واریانس یک­‌طرفه (one way ANOVA) و پس آزمون ال اس دی (LSD) انجام و 05/0p<  به‌عنوان سطح معنی‌داری در نظر گرفته شد.

  • نتایج

شناسایی سلول­های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان جنین گوسفند

مورفولوژی

   بررسی سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان جنین گوسفند باکمک میکروسکوپ نوری معکوس در این مطالعه نشان داد که مورفولوژی سلول‌ها شبیه سلول‌های فیبروبلاست و دوکی‌شکل بود، سیتوپلاسم به‌شکل زوائدی در اطراف هسته سلول قابل‌مشاهده بود. سلول­ها به پلاستیک کف فلاسک کشت چسبیده بودند. در روزهای ابتدایی که تراکم سلول­ها کم‌تر بود زوائد سلول­ها باریک­تر و کشیده‌تر بودند و مرز سلولی به‌خوبی مشخص بود. با افزایش تراکم سلول­ها زوائد سیتوپلاسمی کوتاه‌تر شدند و وضوح مرز بین سلول­ها کاهش یافت (شکل 1). براین‌اساس، مورفولوژی سلول­ها جداشده در این مطالعه باتوجه به ویژگی­هایی که ذکر شد تاییدکننده سلول‌های بنیادی مزانشیمی است.

 

شکل 1: مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی جداشده از مغز استخوان جنین گوسفند( بزرگنمایی 400×) در تراکم کم (الف) و تراکم زیاد (ب).

 

تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به سلول­های چربی و استخوان

 یکی از ویژگی­های سلول‌های بنیادی مزانشیمی توانایی آن‌ها برای تمایز به رده­های سلولی مزودرمی چون استخوان، چربی و غضروف است. به‌منظور تایید بنیادی بودن سلول‌های جداسازی شده از مغز استخوان جنین­های گوسفند در مطالعه حاضر، در محیط تمایزی استخوان و چربی کشت شدند و پس از 21 روز تیمار، تمایز به استخوان و چربی، به‌ترتیب با رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و اویل رد اُ مورد ارزیابی قرار گرفت. در محیط تمایزی استخوان، سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان جنین گوسفند از حالت دوکی ‌شکل به‌سمت چندوجهی تغییر شکل دادند و کانون‌های معدنی شدن به‌صورت نقاط خال‌دار قرمز پس از رنگ‌آمیزی با آلیزارین رد در زیر میکروسکوپ قابل‌مشاهده بودند. در خصوص تمایز به چربی، ظهور واکوئول­های حاوی قطرات چربی پس از رنگ‌آمیزی با اویل رد اُ قابل‌ مشاهده بود (شکل‌های 2 و 3).

شکل 2: تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان جنین گوسفند به‌دودمان­ استخوان­ساز(بزرگنمایی 400×). الف- گروه کنترل و ب- گروه تمایز؛ رسوبات هیدروکسی­آپاتیت قرمز رنگ بعد از رنگ­آمیزی آلیزارین رد مشاهده می­شود.

 

 

شکل 3: تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان جنین گوسفند به‌دودمان­ چربی ساز(بزرگنمایی 400×). الف- گروه کنترل و ب- گروه تمایز؛ قطرات قرمز چربی بعد از رنگ­آمیزی اویل رد مشاهده می­شود.

بیان نشانگرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی

برای تایید بنیادی بودن سلول‌های جداسازی شده از بافت مغز استخوان جنین گوسفند، علاوه‌بر مورفولوژی سلولی و تمایز به دودمان­های استخوان‌ساز و چربی ساز، بیان دو نشان‌گر سطحی نیز با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت. سلول‌های بنیادی مزانشیمی برخی از آنتی‌ژن‌های سطحی را بیان می­کنند. در این مطالعه، نشانگر مزانشیمی CD44، بیان بالایی را از خود نشان داد (38/99 درصد). این در حالی است که در همین مطالعه، نشانگر CD34 بیان پایینی (52/6 درصد) را نشان داد (شکل 4).

 

 

شکل 4: نتایج فلوسایتومتری برای آنتی‌بادی‌های CD44، CD34 و کنترل منفی NC.

 

بقای سلولی

نتایج حاصل از آنالیز آماری آزمون MTT در مطالعه حاضر نشان داد که میانگین جذب نوری سلول­ها پس از 24 ساعت تیمار با سیلیمارین به‌ترتیب برای غلظت 0، 018/258±0/0، غلظت 1/0 میکرومولار بر لیتر، 023/0±261/0، غلظت 2/0 میکرومولار بر لیتر، 012/0±269/0، غلظت µM/l 1، 021/0±259/0، غلظت µM/l 2، 003/0±244/0، غلظت µM/l 5، 003/0±256/0، غلظت µM/l 10، 009/0±276/0 و غلظت µM/l 017،20/0±249/0 بودکه فاقد تفاوت معنی‌دار بودند (05/0p<). (نمودار1).

 

نمودار 1: مقایسه میانگین جذب نوری سلول­ها پس از 24 ساعت تیمار با غلظت­های مختلف سیلیمارین

 

میانگین جذب نوری سلول­ها پس از 72 ساعت تیمار با سیلیمارین هم به‌ترتیب برای غلظت 0، 008/0±212/0، غلظت µM/l 1/0، 012/0±192/0، غلظت µM/l 2/0، 018/0±226/0، غلظت µM/l 1، 008/0±200/0، غلظت µM/l 2، 026/0±251/0، غلظت µM/l 5، 018/0±266/0، غلظت µM/l 10، 030/0±218/0 و غلظت µM/l 026،20/0±199/0 بود که فاقد تفاوت معنی‌دار بودند (05/0p<) (نمودار2).

 

نمودار 2: مقایسه میانگین جذب نوری سلول­ها پس از 72 ساعت تیمار با غلظت­های مختلف سیلیمارین

هم‌چنین مقایسه میانگین جذب نوری سلول­ها در غلظت­های مختلف بین زمان­های 24 و 72 ساعت پس از تیمار نشان داد که میانگین جذب نوری سلول­ها در غلظت صفر سیلیمارین، 72 ساعت پس از تیمار نسبت به زمان 24 ساعت پس از تیمار کاهش نشان داد (05/0p<) اما در سایر غلظت­ها تفاوت معنی‌دار مشاهده نشد (05/0p>) (نمودار 3).

 

 

نمودار 3: مقایسه میانگین جذب نوری سلول­ها بین زمان‌های 24 و 72 ساعت

 

سنجش آنزیم آلکالین فسفاتاز

همان‌گونه که در نمودار 4 نشان داده‌شده است، بررسی میزان ترشح آنزیم 21 روز پس از تیمار در گروه­های کشت‌شده در محیط کشت معمول و تمایزی نشان داد که درمجموع بیش‌ترین میزان ترشح آنزیم در گروه 8 با میانگین جذب (0107/0 ±3116/0) بود که به‌صورت معنی‌دار از تمام گروه­ها بیش‌تر بود (05/0p<). پس‌ازآن، در گروه 7 با میانگین جذب (0049/0±2683/0) بیش‌تر بود (05/0p<). کم‌ترین میزان ترشح آنزیم در گروه 1 (کنترل منفی) با میانگین جذب (0033/0±0513/0) و پس‌ازآن به‌ترتیب در گروه­ 2 با میانگین جذب (0014/0±1113/0) و گروه 4 با میانگین جذب (006/0±15243/0) مشاهده شد (05/0p<). بین گروه­های 4 با میانگین جذب (0022/0±1876/0)، 5 با میانگین جذب (0084/0±1920/0) و 6 با میانگین جذب (0127/0±1910/0) تفاوت معنی‌دار مشاهده نشد (05/0p>).

 

نمودار 4: میانگین (SD± SEM) میزان تولید آنزیم آلکالین فسفاتاز 21 روز پس از تیمار در محیط کشت معمولی (4-1) و تمایزی (8-5). (حروف مختلف نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0≥p هست).

 

رنگ‌آمیزی آلیزارین رد

پس از رنگ‌آمیزی سلول‌های کشت شده در محیط معمول توسط آلیزارین رد در روز 21 (شکل 5)، رسوب یونهای هیدورکسی اپاتیت به‌صورت نواحی قرمز رنگی در گروه­های تیمار مشاهده شد درحالی‌که در گروه کنترل مشاهده نشد. همان‌گونه که در شکل نشان داده شده است، میزان رسوبات قرمز رنگ در گروه تیمار شده با استرادیول بیش‌تر از گروه­های تیماره شده با سیلیمارین بود. هم‌چنین میزان رسوبات در گروه تیمار شده با سیلیمارین 20 بیش‌تر از گروه  تیمار شده با سیلیمارین 10 بود.

نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی سلول‌های کشت‌شده در محیط کشت تمایزی استخوان توسط آلیزارین رد در روز 21 (شکل 6)، نشان داد که رسوبات قرمز رنگ هیدروکسی آپاتیت در همه گروه­ها ازجمله گروه کنترل مشاهده شد. بااین‌حال مقایسه ظاهری فنوتیپ گروه­های موردبررسی نشان داد که مقدار نواحی قرمز رنگ در گروه تیمار شده با استرادایول بیش‌ترین بود. هم‌چنین، گروه­ تیمار شده با سیلیمارین 20 در مقایسه با گروه تیمار شده با سیلیمارین 10 رسوبات بیش‌تری داشت. مقایسه گروه کنترل و گروه تیمار شده با سیلیمارین 10 نیز نشان داد که میزان رسوبات در این دو گروه تقریبا مشابه هم‌دیگر بود.

 

 

شکل 5: مورفولوژی سلول­ها در گروه­های مختلف 21 روز پس از تیمار (بزرگنمایی 400×) در محیط معمول الف) گروه کنترل (بدون تیمار)، ب) گروه تیمار شده با غلظت 10 میکرومولار بر لیتر سیلیمارین، ج) گروه تیمار 2 شده با غلظت 20 میکرومولار بر لیتر سیلیمارین، د) گروه تیمار شده با غلظت 100 نانومولار بر لیتر استرادایول.

 

 

شکل 6: مورفولوژی سلول­ها در گروه­های مختلف 21 روز پس از تیمار (بزرگنمایی 400×) در محیط استخوان‌ساز الف) گروه کنترل (بدون تیمار)، ب) گروه تیمارشده با غلظت 10 میکرومولار بر لیتر سیلیمارین، ج) گروه تیمار 2 شده با غلظت 20 میکرومولار بر لیتر سیلیمارین، د) گروه تیمار شده با غلظت 100 نانومولار بر لیتر استرادایول.

  • بحث

گزارشات Kim و همکاران  نشان داد که سیلیمارین دارای اثرات تقویت­کننده بر تمایز استئوبلاست، رونویسی ژن مارکر استخوانی و مینرالیزیشن ماتریکس خارج سلولی بود. در مطالعه آنها، استئوبلاست‌ها با 1 تا 20 میلی‌مول در میلی‌لیتر سیلیمارین به‌مدت 15 روز در یک محیط کشت تمایزی تحت تیمار قرار گرفتند. سیلیمارین باعث تحریک فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP) و تشکیل ندول کلسیم به‌ طریق وابسته به غلظت شد. هم‌چنین سیلیمارین باعث افزایش ترشح کلاژن، رونویسی استئوکلسین و بیان پروتئین مورفوژنتیک استخوان(Bone morphogenetic protein: BMP) شد به طوری که مکمل سیلیمارین با افزایش تراکم مواد معدنی استخوان و سطح سرمی ALP و استئوکلسین استئوژنیک، استحکام استخوان را بهبود بخشید(15). در مطالعه‌ی دیگری که توسط Kim و همکاران انجام شد، عصاره خارمریم غنی از سیلیمارین (Milk thistle extract: MTE) و سیلیبینین فعالیت آلکالن فسفاتاز قلیایی استئوبلاست­ها را افزایش داد اما فعالیت فسفاتاز اسیدی مقاوم به تارتارات (TRAP) استئوکلاست‌ها را کاهش داد. اثرات محافظت استخوانی MTE با ایزوفلاون استروژنیک (Estrogenic isoflavone) قابل‌مقایسه بود. در این مطالعه ترکیبی از دوز کم MTE و ایزوفلاون دارای یک هم افزایی داروشناختی (Pharmacological synergy) بود که ممکن است برای فعالیت­های استئوژنیک مفید باشد(16). مطالعه‌ی Kim و همکاران تلاشی برای نشان دادن اثرات سرکوب‌‌گری MTE روی تحلیل استخوانی بود. درمان موش­های اواریکتومی با MTE غیرتوکسیک و سیلی‌بینین باعث بهبود تراکم مواد معدنی استخوان ران و نسبت لیگاند فعال­کننده­ی گیرنده‌ی هسته‌ای فاکتور کاپا بتاسرمی/ استئوپروتگرین (Serum receptor activator of nuclear factor-B ligand/osteoprotegerin ratio)، شاخص محرک استئوکلاستوژنیک شد. علاوه‌براین، تجویز MTE یا سیلی‌بینین باعث مهار تحلیل استخوان ران ناشی از اواریکتمی و سرکوب فعالیت TRAP ران و القای کاتپسین K مسئول استئوکلاستوژنز و تحلیل استخوان می‌شود. درمجموع، دوز خوراکی MTE حاوی سیلی‌بینین در شرایط پرکلینیکال در جلوگیری از تحلیل رفتن استخوان ناشی از کمبود استروژن موثر بود(16). در مطالعه Khoobi و همکاران، توانایی سیلیمارین در بهبود نقایص مهم استخوانی کالواریای موش صحرایی با کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی جداشده از ژل وارتون انسانی (HWJMSC: Human Wharton's jelly Mesenchymal Stem Cell) روی داربست الکتروریسی (پلی اسید لاکتیک/نانولوله کربن) Electrospun scaffold of poly (lactic acid)/carbon nanotube (PLA/CNT))، بررسی‌ شده است. نتایج آنها نشان داد که داربستelectrospun PLA/CNT یک داربست زیست سازگار است و HWJMSC می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی روی این داربست چسبیده و تکثیر شود و داربست نیز گزینه مناسبی برای بهبود روند ترمیم استخوان است. از یان رو، استفاده از سیلیمارین به‌علاوه HWJMSCهای کشت‌شده روی داربست PLA/CNT می‌تواند به‌عنوان یک روش مناسب برای فرایند استئوژنز و ترمیم استخوان استفاده شود(17). سیلیمارین مخلوط استاندارد شده‌ای از فلاونولینگان­ها است که به‌طور گسترده‌ای استفاده می‌شود و ماده اصلی آن سیلی‌بینین به گیرنده‌های استروژنی سیتوزولی متصل می‌شود(18). Seidlová-Wuttke و همکاران در مطالعه خود نشان دادند که این اتصال منحصر به گیرنده استروژن β (ERβ) است. تیمار موش‌های صحرایی اواریکتومی شده  با سیلیمارین یا استرادایول (E2) ممکن است اجازه دهد که اثرات بیولوژیکی تمایز باواسطه ERα یا ERβ ایجاد شود. E2 باعث مهار تجمع‌ LH، کلسترول، LDL و HDL سرمی در خون و افزایش بیان ژن IGF1, HbEGF و C3 در رحم می‌شود، درحالی‌که سیلیمارین در تغییر این پارامترها کاملا بی‌اثر یا آنتاگونیست بود (19). هم E2 و هم سیلیمارین بیان ژن ERβ رحم را مهار می‌کنند. ازاین‌رو، در هیپوفیز، کبد (جایی‌که لیپوپروتئین‌ها سنتز می‌شوند) و رحم،  E2 اساسا ازطریق ERα عمل می‌کند. اثرات استروژنیک انحصاری سیلیمارین در متافیز استخوان ران، برروی پارامترهای استئوبلاستی؛ بیان ژن IGF1، TGFβ1، استئوپروتگرین، کلاژن-1α1، استئوکلسین و بیان ژن اسید فسفاتاز مقاوم در برابر تارتارات مارکر فعالیت استئوکلاستی (TRAP) موش‌های صحرایی بالغ اواریکتمی شده مشاهده شد. بیان ژن ERβ  در تمام اندام‌ها ازجمله استخوان‌های درحال رشد اما نه در متافیز استخوان ران موش‌های صحرایی بالغ اواریکتمی شده تشخیص داده شده است، بنابراین می­توان نتیجه گرفت که اثرات سیلیمارین در این قسمت از استخوان را نمی‌توان از طریق ERα اعمال کرد، زیرا به‌این زیرگروه گیرنده متصل نمی‌شود(19). باوجود عدم شناسایی mRNA گیرنده‌ی استروژنی نوع بتا در متافیز استخوان ران در حیواناتی که Seidlová-Wuttke و همکاران مورد آزمایش قراردادند، احتمال این‌که پروتئین ERβ وجود داشته باشد وجود دارد و ممکن است واسطه‌ی اثرات سیلیمارین باشد. هیچ تاثیری از درمان E2 با ماندگاری یک هفته بر تری‌گلیسیرید سرمی در حیوان تحت درمان با E2 دیده نشد درحالی‌که این لیپیدها به‌میزان قابل‌توجهی توسط سیلیمارین کاهش یافتند، از این‌رو به‌نظر می‌رسد این اثرات باواسطه ERβ انجام می‌شود(19). طی مطالعاتی Seidlová-Wuttke و همکاران نشان دادند که متافیز استخوان ران موش‌های صحرایی اواریکتمی شده ژن ERβ را بیان نمی‌کند. ازاین‌رو آن‌ها انتظار نداشتند که اثری به‌واسطه‌ی سیلیمارین در استخوان مشاهده کنند و از مشاهده اثرات ضد استئوپروتیک استروژنی (Estrogenic antiosteoporotic effects) واضح در این ساختار استخوانی متعجب شدند(19). مشخص ‌شده است که بسیاری از اثرات E2 در استخوان به‌واسطه‌ی IGF1 و TGFβ1 است. احتمال دیگر ممکن است این باشد که اثر سیلیمارین و یا امکان دارد که E2 در متافیز استخوان ران از طریق گیرنده‌هایی ناشناخته یا از طریق یک نوع اتصال به‌گیرنده‌ی استروژنی نوع بتا که با روش PCR مورداستفاده در مطالعه آنها، تشخیص داده نمی‌شد، واسطه شود. هم‌چنین سیلیمارین معیارهای یک تعدیل‌کننده‌ی انتخابی گیرنده‌ی استروژن (Selective estrogen receptor modulator (SERM)) با خواص مشابه رالوکسیفن (Raloxifene) را دارد. سیلیمارین یک آنتی ‌اکسیدانت قوی و یک ترکیب ضد التهابی است و تاثیر مثبت آن بر بقا و رشد تاکنون در رده‌های سلولی مختلفی به‌اثبات رسیده است(20). در مطالعه‌ی آشتیانی و همکاران  درصد بقا در گروه‌های تیمار شده با دوزهای 50، 75 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر به‌ترتیب 89، 93، و 96 درصد محاسبه شد که در مقایسه با گروه کنترل (83 درصد) افزایش معنی‌داری داشت. بـا مقایسه‌ی میزان تکثیر hBMSCs در روزهای 2، 7 و 14 بـا دوزهای ذکرشده‌ی سیلیمارین، شاهد افزایش درصد رشد سلول‌های تیمار شده در مقایسه با گروه کنترل در روزهای دوم تا هفتم و کاهش درصد رشد از روز هفتم تا چهاردهم در حضور سیلیمارین در مقایسه با گروه کنترل بودند. مطالعه‌ی آنها نشان داد که تیمار سلول‌ها با سیلیمارین در مدت‌زمان مشخص، می‌تواند با افزایش میزان بقای سلول‌های بنیادی و هم‌چنـین افزایش سرعت رشد، کارایی این سلول‌ها در حیطه بالینی را افزایش دهد(21). مطالعه­ی Ying و همکاران  نشان داد که سیلی‌بینین می‌تواند اثر استئوژنیک را با تحریک بیان ژن‌های استئوژنیک در سلول‌های بنیادی مغز استخوان انسان (Human bone marrow stem cells: hBMSCs)، افزایش دهد. سیلیمارین باعث تقویت تکثیر استئوبلاست و مهار تکثیر استئوکلاست می‌شود و بر بازسازی استخوان تاثیر مثبت می‌گذارد. تجویز سیستمی سیلیمارین باعث افزایش استحکام استخوان و توده‌ی استخوان اسفنجی و کورتیکال یا متراکم (Cancellous and cortical bone mass) می‌شود(22). سیلیمارین سیستمیک می‌تواند یک راه‌کار مؤثر برای افزایش ادغام استخوانی اولیه ایمپلنت پوشش داده‌شده با هیدروکسی آپاتیت در مکان‌های استخوانی با استئوپورز یا استئوپنی تثبیت‌شده باشد. (23). مطالعه‌ی مرادی و همکاران  برای ارزیابی اثرات سیلیمارین بر وضعیت اکسیداتیو، خصوصیات استخوانی و برخی از پارامترهای خون در بلدرچین‌های ژاپنی تحت استرس اکسیداتیو ناشی از تتراکلریدکربن (CCl4) انجام شد. در این مطالعه به‌صورت یک طرح کاملا تصادفی با چهار تکرار، هرکدام با 30 پرنده، با استفاده از آزمایش فاکتوریل 2 × 2 با دو دوز سیلیمارین (صفر و 1 میلی‌لیتر در کیلوگرم وزن بدن) و CCl4 (صفر و 1 میلی‌لیتر در کیلوگرم وزن بدن) انجام شد. نتایج نشان داد که اثر متقابل سیلیمارین و CCl4 در غلظت کلسترول تام، تری‌گلیسیریدها، گلوکز، آلبومین، کلسیم و آلکالین فسفاتاز معنی‌دار بود (05/0p<). در مقابل، غلظت فسفر، پروتئین تام و لیپوپروتئین-کلسترول با دانسیته­ی بالا در سرم خون بین تیمارهای تجربی تفاوتی نداشت. تیمارهای آزمایشی تاثیر مهمی بر فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (Superoxide dismutase) در سرم خون داشتند (05/0p<)، اما بر فعالیت گلوتاتیون پراکسید و غلظت مالون‌دی‌آلدئید تاثیر نداشت. تیمارهای تجربی به‌طور قابل‌توجهی بر وزن، ضخامت و قطرهای خارجی و داخلی استخوان ساق، اما نه بر طول، خاکستر، حجم و تراکم آن تاثیر گذاشتند (05/0p<). ضخامت ساق در بلدرچین‌های تحت تیمار با سیلیمارین افزایش یافت، اما CCl4 تاثیری نداشت (05/0p<). قطر خارجی و داخلی استخوان ساق در پرندگانی که هر دو روش درمانی را دریافت کردند افزایش یافت (05/0p<). CCl4 منجر به تراکم کم‌تر و درصد کم‌تر خاکستر استخوان ساق شد (05/0p<). مطالعه آنها نشان داد که سیلیمارین اثرات مثبت بیش‌تری بر ضخامت ساق نسبت به CCl4 داشت که ممکن است به‌دلیل شباهت سیلی‌بین و استروژن در مینرالیزیشن بافت استخوان باشد. همچنین، سیلیمارین هم توانایی کاهش اثرات بد استرس اکسیداتیو ناشی از CCl4 و هم بهبود خصوصیات استخوانی در بلدرچین‌های ژاپنی را داشت(24) که  تاییدکننده نتایج حاصل از مطالعه‌ی ما می‌باشد.  

  • نتیجه­گیری

   درمجموع، مطالعه حاضر نشان داد که عصاره‌ی سیلیمارین در غلظت­های مورد بررسی روی سلول­های مزانشیمی جداشده از مغز استخوان جنین گوسفند اثر سمیت سلولی نداشت. هم‌چنین براساس نتایج حاصل از سنجش آنزیم ALP و رنگ‌آمیزی آلیزارین رد حضور سیلیمارین در محیط کشت معمول سلول­ها باعث القای تمایز آن‌ها به‌سمت رده استخوان‌ساز شد و در محیط کشت تمایز استئوژنیک نیز باعث افزایش پتانسیل تمایز سلول­ها به‌سمت رده استخوان‌ساز شد. درمجموع سیلیمارین در غلظت­های مورد بررسی باعث افزایش تمایز سلول­ها به‌رده‌ی استخوان‌ساز شد که این افزایش وابسته به غلظت بود. ازاین‌رو، به‌نظر می‌رسد با مطالعات بیش‌تر، می­توان از آن در سلول درمانی جهت ترمیم ضایعات استخوانی استفاده کرد.

  • تشکر و قدردانی

   نویسندگان مراتب قدردانی خود را از حوزه معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه رازی برای حمایت‏های مالی و در اختیار قرار دادن امکانات لازم جهت انجام این تحقیق اعلام می­دارند.

-

مراجع
  1. Adachi T, Aonuma Y, Ito S, Tanaka M, et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. J Biomech. 2009; 42(15):2507-2512.
  2. Robling AG, Bonewald LF. The Osteocyte: New Insights. Annu Rev Physiol. 2020; 10(82):485-506.
  3. Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991;9(5):641-650. 

4- Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284(5411):143-147.

  1. Pittenger MF, Discher DE, Péault BM, Phinney DG, et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regen Med. 2019; 4:22. 4:22. doi: 10.1038/s41536-019-0083-6.
  2. Parfitt A. M. The bone remodeling compartment: A circulatory function for bone lining cells. J. Bone Miner. Res. 2001;16(9):1583–1585.
  3. Rutkovskiy A, Stensløkken KO, Vaage IJ. Osteoblast Differentiation at a Glance. Med Sci Monit Basic Res. 2016; 26(22):95-106.
  4. Manolagas SC. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocr Rev. 2000;21(2):115-137.
  5. Coelho MJ, Fernandes MH. Human bone cell cultures in biocompatibility testing. Part II: effect of ascorbic acid, beta-glycerophosphate and dexamethasone on osteoblastic differentiation. Biomaterials. 2000;21(11):1095-1102.
  6. Buttery LD, Bourne S, Xynos JD, Wood H, et al. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. Tissue Eng. 2001;7(1):89-99.
  7. Kawai S, Yoshitomi H, Sunaga J, Alev C, et al. In vitro bone-like nodules generated from patient-derived iPSCs recapitulate pathological bone phenotypes. Nat Biomed Eng. 2019; 3(7): 558–70.
  8. Mechiche Alami S, Gangloff SC, Laurent-Maquin D, Wang Y, et al. Concise Review: In Vitro Formation of Bone-Like Nodules Sheds Light on the Application of Stem Cells for Bone Regeneration. Stem Cells Transl Med. 2016;5(11):1587-1593.
  9. Vargas-Mendoza N, Madrigal-Santillán E, MoralesGonzález Á, Esquivel-Soto J, et al. Hepatoprotective effect of silymarin. World J hepatol 2014;6(3):144-149.
  10. Abenavoli L, Capasso R, Milic N, Capasso F. Milk thistle in liver diseases: past, present, future. Phytother Res. 2010;24(10):1423-1432.
  11. Kim JL, Park SH, Jeong D, Nam JS, et al. Osteogenic activity of silymarin through enhancement of alkaline phosphatase and osteocalcin in osteoblasts and tibia-fractured mice. Exp Biol Med (Maywood). 2012;237(4):417-428.
  12. Kim JL, Kim YH, Kang MK, Gong JH, et al. Antiosteoclastic activity of milk thistle extract after ovariectomy to suppress estrogen deficiency-induced osteoporosis. Biomed Res Int. 2013 :1-11.
  13. Khoobi MM, Naddaf H, Hoveizi E, Mohammadi T. Silymarin effect on experimental bone defect repair in rat following implantation of the electrospun PLA/carbon nanotubes scaffold associated with Wharton's jelly mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A 2020;108 ( 9) :1944-1954.

18- El-Shitany, Nagla A., Sahar Hegazy, and Karema El-Desoky. "Evidences for antiosteoporotic and selective estrogen receptor modulator activity of silymarin compared with ethinylestradiol in ovariectomized rats." Phytomedicine. 2010; 17(2): 116-125.

19- Seidlová-Wuttke D, Becker T, Christoffel V, Jarry H, et al. Silymarin is a selective estrogen receptor beta (ERbeta) agonist and has estrogenic effects in the metaphysis of the femur but no or antiestrogenic effects in the uterus of ovariectomized (ovx) rats. J Steroid Biochem Mol Biol. 2003 ;86(2):179-188.

20- Dixit N, Baboota S, Kolhli K, Ahmad S, Ali J. Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioviability enhancement approaches. Indian J Pharmacol. 2007; 39: 172-179.

  1. Ahmadi Ashtiani H, Allameh A, Hamidipour N, Rastegar H, et al. Increasing Rate of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Proliferation in the Presence of Silymarin. J. Med. Plants. 2010; 9 (34) :156-164.
  2. Ying X, Chen X, Liu H, Nie P, et al. Silibinin alleviates high glucose-suppressed osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells via antioxidant effect and PI3K/Akt signaling. Eur J Pharmacol. 2015;765: 394-401.
  3. Tao ZS, Wu XJ, Yang M, Xu HG. Local administration with silymarin could increase osseointegration of hydroxyapatite-coated titanium implants in ovariectomized rats. J Biomater Appl. 2019; 34(5): 664-672.‏

24- Moradi F, Samadi F, Dastar B, Samadi S. The effects of silymarin on oxidative status and bone characteristics in Japanese quail subjected to oxidative stress induced by carbon tetrachloride. Poultry Sci J, 2017; 5(2): 97-104.‏

سلول و بافت
دوره 13، شماره 2
تیر 1401
صفحه 135-150
فایل ها
سابقه مقاله
  • تاریخ دریافت: 09 شهریور 1401
  • تاریخ پذیرش: 09 شهریور 1401
هم رسانی
ارجاع به این مقاله
آمار