سلول و بافت

فصلنامه

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

اعضای هیات تحریریه

اصول اخلاقی انتشار مقاله

بانک ها و نمایه نامه ها

پیوندهای مفید

فرایند پذیرش مقالات

بیانیه حریم خصوصی

بیانیه حق مولف

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

اطلاعات آماری نشریه

خط مشی داوری

راهنمای داوران

فهرست داوران

اثر لوواستاتین بر تکثیر سلولی و بیان فاکتور نوروتروفیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی ارشد، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه دامغان

2 دانشیار، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه دامغان

3 دانشجوی دکتری و کارشناس گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه دامغان

چکیده

هدف: در سال های اخیر استفاده از سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان (BMSCs) در پزشکی بازساختی، مهندسی بافت و ژن درمانی بسیار مورد توجه محققان قرار گرفته است. دسترسی آسان، قابلیت تکثیر و ظرفیت تمایز BMSC بههمراه قابلیت چسبندگی به سطح پلاستیکی و رشد و گسترش در شرایط کشت آزمایشگاهی از ویژگی های این سلول ها به شمار می رود. سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سلول­های بزرگسالی هستند که توانایی تمایز به دودمان مزودرمی دارند و در میان سایر سلول­های بزرگسال، می­توانند در مهندسی بافت استفاده شوند و کاندیدای مناسبی برای پیوند هستند. داروی لوواستاتین به عنوان یک عامل کاهش­دهنده کلسترول و با اثرات آنتی­اکسیدانت و به ویژه نوروتروفیک و ضد­التهابی می­تواند در درمان اختلالات عصبی موثر واقع شود. هدف از این مطالعه بررسی بقا، تکثیر و بیان    ژن­های GDNF و oct4 با دوزهای مختلف داروی لوواستاتین در سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان است. فرض بر این است که لواستاتین اثرات محافظت کننده عصبی خود را با القای بیان ژن فاکتور نوروتروفیک و ژن فاکتور نسخه برداری تکثیر سلولی اعمال می کند.  مواد و روش­ها: در این مطالعه تجربی از موش صحرایی بالغ نژاد ویستار (wistar) استفاده گردید. در مطالعه حاضر سلول­های بنیادی مزانشیمی از استخوان ران و ساق موش صحرایی استخراج و در محیط α-MEM  کشت شد. BMSCsپس از استخراج در محیط α-MEM  (Gibco) غنی شده با 10 درصد سرم (Gibco) و پنی سیلین-استرپتومایسین (Gibco) یک درصد در فلاسک 25cm2 و تراکم 104×2 کشت داده شده و در شرایط دمایی 37 درجه سانتیگراد و CO2 5 درصد نگهداری شدند. سلول­های بنیادی مزانشیمی به مدت 24 ساعت در معرض 1 میکرومولار، 5 میکرومولار ، 10 میکرومولار و 15 میکرومولار لوواستاتین بهعنوان تیمار قرار داده شدند. میزان بقا و حیات با روش MTT و تکثیر سلولی با شمارش سلولی توسط رنگ­آمیزی با DAPI ارزیابی شد. همچنین با روش RT-PCR بیان فاکتور نسخه­برداری تکثیر سلول­های بنیادی Oct4 و فاکتور نوروتروفیکGDNF  بررسی شد. نتایج: سلول های بنیادی مزانشیمی به کف ظرف کشت پلاستیکی چسبیدند و به سرعت تکثیر شدند. در ظرف کشت، این سلول ها معمولاً به سه شکل سلول­های کروی کوچک، دوکی شکل و فیبروبلاست مانند ظاهر شدند. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که میزان تکثیر در غلظت‌های 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاتین نسبت به گروه‌های کنترل افزایش معنی‌داری را نشان می‌دهد(05/0p<). بیان نیمه کمی ژن فاکتورهای نوروتروفیک مشتق از گلیال(GDNF) و ژن‌های oct4 نشان داد که بین گروه‌های تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیمی و گروه کنترل تفاوت معنی‌داری وجود دارد. بنابراین داروی لوواستاتین موجب افزایش حیات و تکثیر سلولی و همچنین بیان mRNA ژن Oct4 و GDNF در گروه لوواستاتین نسبت به گروه کنترل، گردید (05/0p<). نتیجه­گیری: بنابراین استفاده از داروی لوواستاتین برای بهبود شرایط کشت سلول­های بنیادی مزانشیمی که برای پیوند و سلول درمانی به­کار می­رود، پیشنهاد می­شود. نتیجه دیگر این است که سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان برای درمان بیماری­های تحلیل برنده مغز (نورودژنرتیو) مفید خواهند بود.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

The effect of lovastatin on cell proliferation and neurotrophic factor expression of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

نویسندگان [English]

  • bageri A 1
  • MT Ghorbanian 2
  • A Kosha 3

1 MSc Student in Department of Cellular and Molecular Biology

2 Associate Professor, Department of Cellular and Molecular Biology

3 PhD Student and Laboratory employee in Department of Cellular and Molecular Biology

چکیده [English]

Aim: In recent years using of Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) in regenerative medicine, tissue engineering and gene therapy is highly regarded. Convenient access, ability to expand and MSC differentiation capacity along with the ability of adhesion to plastic surfaces and in-vitro growth and development are considered as the characteristic feature of these cells. Bone marrow mesenchymal stem cells possess the ability to differentiate into mesodermal lineage, among other adult cells, can be used in tissue engineering and are good candidates for transplantation. Lovastatin as a lowering cholesterol agent and reducing inflammation, as well as antioxidant and, in particular, neuroprotective effects can be effective in the treatment of neurogenic diseases. The aim of this study was to evaluate the effect of lovastatin on survival, proliferation and expression of GDNF and oct4 genes of Bone marrow mesenchymal stem cells. Lovastatin is presumed to exert their neuroprotective effects by inducing neurotrophic factor gene expression and cell proliferation. Material and methods: In this experimental study, we used 4-6 week adult Wistar rats. The BMSCs were isolated from rat femurs and tibias and cultured in α-MEM. The cell pellet was resuspended in α-MEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin and streptomycin and cultured in 25-cm2 culture flasks at a density of 2 × 104 cells and incubated at 37°C and 5% CO2.  For lovastatin treatment, we exposed MSCs to 1 μM, 5 μm, 10 μm and 15 μm of lovastatin for 24 h. The survival rate of cells was measured by MTT assay. The growth rate and proliferation of cells at 24 hours after culture were assessed by staining with DAPI. The expression of Oct4 and GDNF factors was also evaluated by RT-PCR.
 Results: MSCs were attached to culture plate and were quickly proliferated. In the culture plate, these cells were usually appeared in three forms: small spherical, fusiform and fibroblast-like and flattened. The results of this study indicate that the proliferation rate at 5, 10 and 15 µM lovastatin showed a significant increase compared to control groups (P<0.5). Gene expression density of gelial derived neurotrophic factors (GDNF) and oct4 genes showed that, there were significant differences between MSCs treatment groups and control group (P<0.5). Cell viability and proliferation rate indicate that experimental groups has a higher proliferation rate than control group. Moreover, results showed an increase in mRNA expression for GDNF and Oct4 compared to the control group (P <0.05).
 Conclusion:Therefore, lovastatin can be used to improve the culture of mesenchymal stem cells, which is used for transplantation and cell therapy. BMSCs may be a useful therapeutic agent for the treatment of neurodegenerative disorders.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mesenchymal stem cells
  • Berberis
  • integrrima
  • Osteoblast
  • Differentiation
اصل مقاله
  • مقدمه

  در بین داروهای مطالعه شده داروی لوواستاتین بهعنوان یک عامل کاهش دهنده کلسترول می تواند با اثر نوروتروفیک، تعدیل کننده پاسخ ایمنی و اثر ضد­التهابی در بیماری­های نوروژنواتیو (تحلیل­برنده عصبی) مانند آلزایمر کاربرد داشته باشد (1). تحقیقات نشان می­دهد که لوواستاتین با مهار سیتوکین­های التهابی قادر به محافظت از عصب می­باشد و شواهد نشان داده است که کاربرد بالقوه استاتین برای درمان بیماری­های عصبی و عضلانی لازم و مفید است. همانطور که پیش­تر اشاره شد استاتین­ها عوامل کاهش دهنده کلسترول هستند، اما اثرات دیگر  استاتین­ها، محافظت از عصب، ایمن­سازی و ضد التهاب بودن آنهاست ( 1 و 2). گزارش شده است که استاتین­ها اثرات آنابولیک (cilobanA) بر روی استخوان دارند و ممکن است تاثیرات مثبتی بر روی تمایز و معدنی شدن سلول­های پیش­ساز  استئوبلاستی  داشته باشند (3-5). استاتین­ها را می­توان از قارچ و یا به صورت مصنوعی تولید نمود. لوواستاتین، پراواستاتین و سیمواستاتین، استاتین­های مشتق شده از قارچ هستند، در حالی که آتورواستاتین، سریواستاتین، فلوواستاتین، پراواستاتین، پیتاواستاتین و روزوواستاتین ترکیبات کاملا مصنوعی به­شمار می­آیند. استاتین­ها اثرات متفاوتی بر روی پروفایل لیپیدی دارند که به دوز و نوع استاتین بستگی دارد (6).

سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (Bone marrow mesenchymal stem cells - BMSCs) سلول­های بزرگسالی هستند که به دودمان مزودرمی تعلق دارند در میان سایر سلول­های بنیادی بزرگسال، قابلیت استفاده شدن در مهندسی بافت را دارند، کاندیدای مناسبی برای پیوند هستند. این سلول­ها مشخصه­های ویژه­ای برای استفاده درمانی دارند، از جمله: سهولت استخراج، تکثیر سریع، ظرفیت بالای تمایزی، ترشح طیف گسترده­ای از فاکتورهای رشد، خواص ضد­آپوپتوز، ضد التهاب و فعالیت ایمنی پایین پس از پیوند آلوژنیک است. همچنین این سلول­ها به سهولت در شرایط کشت تکثیر می­شوند. سلول­های بنیادی دارای ظرفیت قابل توجهی در درمان بیماری­ها است و بهعنوان نوعی سیستم ترمیمی داخلی عمل می­کند، در نتیجه سلول درمانی با استفاده از این سلول­ها یک رویکرد مثبت برای جایگزینی و ترمیم بافت­های آسیب دیده می­باشد (7-9).

تکثیر و نگهداری MSCs در محیط آزمایشگاهی به شرایط محیط کشت خاص با فاکتورهای رشد اختصاصی فراهم شده، نیاز دارد تا سلول­ها بتوانند، مورفولوژی فیبروبلاستی (fibroblastoid) و ویژگی­های اساسی MSCs، از جمله پتانسیل تمایزی خود را حفظ و ارتقا بخشند (10). انتخاب یک محیط کشت پایه بهینه به طور گسترده در مقالات مورد بحث قرار گرفته است، اما فقدان مطالعاتی در خصوص بقا و تکثیر در کنار بیان فاکتور نوروتروفیک در سلول­­های بنیادی مزانشیم وجود دارد. هدف این مطالعه بررسی اثر دوزهای مختلف داروی لوواستاتین بر MSCs برای تعیین میزان بقا و تکثیر سلولی در کنار قابلیت نوروتروفیک MSCs، می­باشد.

  • مواد و روش‌ها

   به­منظور رعایت اصول اخلاقى کار بر روى حیوانات، کلیه مراحل تحقیق حاضر براساس دستور کار کمیته اخلاقی دانشکده زیست شناسی دانشگاه دامغان انجام شد (کد اخلاق: 2037-11/2/97 ). در این مطالعه تجربی از موش صحرایی بالغ نژاد ویستار (wistar) استفاده شد.    موش ها تحت شرایط کنترل شده، دوازده ساعت روشنائی و دوازده ساعت تاریکی قرار داشتند و در دمای ۲۰ تا ۲۵ درجه سانتی‪گراد و رطوبت، آب و غذای کافی نگه داری شدند. سپس حیوانات توسط کلروفرم (Merck) به­صورت عمیق بیهوش شده و با رعایت شرایط استریل MSCs از مغز استخوان­های ران (Femur) و ساق (Tibia) استخراج شد (11).  BMSCsپس از استخراج در محیط α-MEM  (Gibco) غنی شده با 10 درصد سرم (Gibco) و پنی سیلین-استرپتومایسین (Gibco) یک درصد در فلاسک 25cm2 کشت داده شده و به انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و 2OC 5 درصد انتقال داده شد. پس از  72 ساعت با تعویض محیط سلول­های شناور از سلول­های چسبیده به کف فلاسک جدا شدند. پس از رسیدن سلول­ها به تراکم 08 تا 09 درصد، به­کمک تریپسین 52/0 درصد همراه با ATDE 20/0 درصد (kcreM(   سلول­ها از کف فلاسک جدا شده و با تراکم 015×5 در کشت­های بعدی تکثیر شدند. ارزیابی حیات سلولی به­روش هموسایتومتر انجام شد (11و 21).

گروه­های مورد بررسی عبارتند از گروه کنترل و چهار گروه تیمار با دوزهای 1، 5، 10 و 15 میکرومولار داروی لوواستاتین که بهمدت ۲۴ ساعت در معرض سلول­ها قرار داده  شدند. برای تیمار سلولی با داروی لوواستاتین، سلول­های پاساژ چهارم برای ارزیابی حیات سلولی (MTT) به پلیت ­96 خانه و برای رنگ­آمیزی DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) به پلیت 24 خانه و برای ارزیابی RT-PCR به ظرف کشت منتقل شده پس از چسبیدن سلول به کف ظرف، داروی لوواستاتین با غلظت­های مذکور به محیط کشت فاقد سرم اضافه شد. با گذشت 24 ساعت محیط حاوی دارو برداشته شده و محیط کشتα-MEM  فاقد سرم اضافه گردید و 24 ساعت بعد ارزیابی­های سلولی انجام شد.

ارزیابی بقا و تکثیر سلولی به روش MTT: پس از انتقال 104×2 سلول­ به پلیت 96 خانه و تیمار سلول­ها با داروی لوواستاتین، محیط قبلی برداشته شد و به هر کدام از چاهک یا خانه­ها 100 میکرولیتر محیط کشتα-MEM  فاقد سرم       به همراه 10 میکرولیتر محلول (sigma)  mg/ml MTT 5 افزوده و در شرایط 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پس از 4 ساعت 85 میکرولیتر از محیط رویی را برداشته و 50 میکرولیتر دی­متیل­سولفوکساید (DMSO) اضافه شد. مدت10دقیقه انکوبه شده و سپس جذب نمونه­ها در طول موج nm540 با دستگاه(BioTek ELISA reader)   اندازه گیری و پس از آن برای رسم منحنی بقای سلولی، محاسبه شد. درصد بقای سلولی به صورت(مقدار جذب نوری گروه تیمار شده / مقدار جذب نوری گروه کنترل) × 100 محاسبـه شد (12).

شمارش سلولی با DAPI : برای رنگ­آمیزی با DAPI سلول­های کشت شده در پلیت­های 24 خانه با  PBSشستشو داده شده و سپس توسط پارافرمالدئید     4 درصد ثبوت انجام شد. سلول­ها با میکروسکوپ فلورسنس  (Nikon Eclipse, E 600, Japan) و بهکمک سیستم تصویر برداری دوربین دیجیتال (Nikon, DXM 120, USA) مشاهده و در بیست میدان دید میکروسکوپی شمارش شدند. DAPI یک نوع رنگ فلورسنت است که به نواحی غنی از آدنوزین-تیمیدین در  DNAمتصل می­شود. DAPI می­تواند از غشای سلول­های سالم عبور کرده و بنابراین برای رنگ­آمیزی سلول­های زنده و ثابت شده مورد استفاده قرار گیرد. برای شمارش سلول­ها از این روش رنگ­آمیزی استفاده شد (13).

بیان ژن: برای بررسى ژن­هـا، از روش (Reverse transcription polymerase chain reaction) RT-PCR استفاده شد. بـه این منظور  RNA کل سلول­های مورد نظر بـا استفاده از  RNX- Plusو مطابق با دستور کـار سـیناژن جداسـازی شد. پس از اطمینان از کیفیت RNA استخراج شـده بـا انجـام الکتروفورز روی ژل آگارز و اسپکتروفتومترى، بـرای تهیـه cDNA تک زنجیرهای با  نیم میکروگرم  RNA و با اسـتفاده از پرایمـر oligo(dt) و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس[Revert Aid First Strand cDNA synthesis Kit(K1622, Fermentas, EU)] تهیه شد. در ادامـه واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شده و جهت تهیـه حجم مذکور، علاوه بر  DNA الگو از کیـت PCR سیناکلون و 10 پیکومولار پرایمرهاى بالادست و پایین­دست استفاده شد. پس از آماده ساختن حجم مورد نظـر بـرای ادامـه کـار، واکنش PCR با شرایط باز شدن اولیه 94 درجه سانتیگراد به­مدت 2 دقیقه، و سیکل­های با شرایط باز شدن 49 درجه سانتیگراد بـه­مـدت 03 ثانیه، اتصال 55 درجه سانتیگراد به­مدت 03 ثانیـه، گـسترش 27 درجه سانتیگراد به­مدت 03 ثانیه و پس از اتمام 43 سـیکل، مرحلـه گسترش نهایی در دمای 27 درجه سانتیگراد به­مدت 5 دقیقـه انجـام شد.

 بعد از اتمام واکـنش، 8 میکرولیتـر از محـصول واکـنش PCR توسط الکتروفورز ژل آگار c5/1 درصد بررسـى شـد. شدت باندهای ژنی با استفاده از نرم افزار Image J آنالیز شد. ژن GAPDH به­عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شـد. تـوالی و شماره دستیابی پرایمرها در جدول شماره 1 آمده است (14). تـوالی و شماره دستیابی پرایمرها در جدول 1 آمده است.

 

دمای آنیلینگ

اندازه(bp)

توالی پرایمر

نام ژن

ردیف

60

280

5-TgT-TcT-TAA-ggC-TgA-gCT-gCA--3        

Oct4 Reverse

1

60

280

5-CCT-gCA-gAA-ggA-gCT-AgA-g--3           

Oct4 forward

2

55

242

5-TAG-CCC-AAA-CCC-AAG-TCA-GT-3             

Gdnf Reverse

3

55

242

5-GAC TCC AAT ATG CCC GAA GA-3              

Gdnf Forward

4

55

203

5-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT c-3             

GAPDH Reverse

5

55

203

5-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA GC-3        

GAPDH Forward

6

جدول 1: پرایمرهای استفاده شده در RT-PCR

 

  • آنالیز آماری

  تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده ازنرم­افزارSPSS  نسخه 16 و برای مقایسه بین گروهی و بررسی اختلاف بین گروه­ها از آزمون واریانس یک­طرفه (One Way ANOVA) و به ­دنبال آن آزمون تکمیلی Tukeyاستفاده شد، داده به صورت میانگین و انحراف استاندارد از میانگین Mean±S.E.M ارایه شد و سطح معنیداری 50/0

  • نتایج

 سلول­های MSCs در پاساژ چهارم در زیر میکروسکوپ به صورت کروی شکل و دوکی شکل و فیبرو بلاستی مانند دیده ­شدند. بیشتر سلول­ها دوکی و با زوائد کشیده و یا ستاره­ای شکل مشاهده ­شدند. با تیمار توسط لوواستاتین تعداد سلول­ها با افزایش غلظت دارو در هر میدان دید افزایش یافت و ظاهر سلول­ها یکدست­تر ­شد. مورفولوژی سلول­های مزانشیمی در گروه­های کنترل و تیمار با لوواستاتین در شکل 1 دیده می­شود.

B

C

D

E

A

شکل1: نمای میکروسکوپ فازکنتراست سلولهای بنیادی مزانشیمی. در گروه­های مختلف. A: گروه کنترل در شرایط کشت بدون تیمار، B: گروه سلولی تیمار با دوز 1 میکرومولار لوواستاتین C: گروه سلولی تیمار با دوز 5 میکرومولار لوواستاتین D: گروه سلولی تیمار با دوز 10 میکرومولار لوواستاتین E: گروه سلولی تیمار با دوز 15 میکرومولار لوواستاتین. گروه­های تیمار شده با داروی لوواستاتین تکثیر سلولی بیشتری را نشان می­دهد.

 

بقا و تکثیر سلولی به روش MTT

بقا و حیات سلولی توسط روش MTT ارزیابی و نتایج آن در جدول 1 نشان می­دهد که همه گروه­های تیمار بجز غلظت 1 میکرومولار لوواستاتین با یکدیگر و با گروه کنترل اختلاف معنی­داری دارند (05/0p<). این نشان دهنده افزایش بقا سلولی و نیز تعداد سلول­ها در طی زمان آزمایش و همچنین ارتباط با افزایش دوز دارو است.

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: مقایسه تکثیر سلول­های سلولهای بنیادی مزانشیمی به روشMTT در گروه های تیمار و کنترل. گروه­های تیمار در معرض دوز های 1، 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاین بوده­اند. با افزایش دوز دارو بر تعداد سلول­ها افزوده میشود. گروه­های 5، 01 و 51 میکرومولار لوواستاتین  با یکدیگر و با گروه کنترل اختلاف معنی­دار دارند(05/0<p). ستون­های a،  b و c با یکدیگر و با ستون­های فاقد علامت معنی دارند. مقایسه بین گروهی و بررسی اختلاف بین گروه­ها با آزمون واریانس یک­طرفه انجام شده است.

 

نتایج تکثیر سلولی به روش رنگ­آمیزی با DAPI

نمای میکروسکوپ فلورسنس رنگ­آمیزی هسته سلول­ها با DAPI در شکل 2 مشاهده می­شود. این رنگ از غشای سلول عبور می­کند و هسته سلول­های زنده به رنگ آبی دیده می­شود. میزان تکثیر و رشد سلول­های MSC در گروه­های کنترل و تیمار شده نشان می­دهد که همه گروه­های تیمار نسبت به گروه کنترل افزایش داشته و غلظت­های 10 و 15 میکرومولار نسب به سایر گروه­ها اختلاف معنی­داری را نشان می­دهد (05/0p<). همانگونه که در شکل 2 و نمودار 2 مشاهده می­شود با افزایش دوز داروی لوواستاتین بر تعداد سلول­ها افزوده می­شود. مطالعه حاضر نشان داد که داروی لوواستاتین موجب افزایش بقا، تکثیر MSCs می­شود.

 

 

 

 

 

 

A

B

C

D

E

شکل2: نمای میکروسکوپ فلورسنس سلولهای بنیادی مزانشیمی در گروه­های مختلف. A: گروه کنترل در شرایط کشت بدون تیمار، B: گروه سلولی تیمار با دوز 1 میکرومولار لوواستاتین C: گروه سلولی تیمار با دوز 5 میکرومولار لوواستاتین D: گروه سلولی تیمار با دوز 10 میکرومولار لوواستاتین E: گروه سلولی تیمار با دوز 15 میکرومولار لوواستاتین. گروه­های تیمار شده با داروی لوواستاتین تعداد سلولی بیشتری را در هر میدان دید نشان می­دهد.

 

 

 

نمودار 2 : مقایسه تکثیر سلول­های BMSC رنگ شده با DAPI در گروه­های تیمار و کنترل. گروه­های تیمار در معرض دوز های 1، 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاین بوده­اند. گروه­های 10 و 15 میکرومولار با گروه کنترل اختلاف معنی دار دارند(05/0p<). افزایش دوز دارو با افزایش تعداد سلولی ارتباط دارد. ستون­های a و b با یکدیگر و با ستون­های فاقد علامت معنی دارند(05/0p<). مقایسه بین گروهی و بررسی اختلاف بین گروه­ها با آزمون واریانس یک­طرفه انجام شده است.

 

نتایج RT-PCR

نتایج الکتروفورز محصول PCR گروه­ها در شکل 3 نشان می­دهد که علاوه بر بیان فاکتور نوروترفیک GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) و فاکتور نسخه­برداری تکثیر سلول­های بنیادیOct4  (octamer-binding transcription factor 4) در همه گروه­های مورد آزمایش، تاثیر دوز دارو لوواستاتین بر میزان بیان مشاهده شد. بیان نیمه کمی ژن GDND در  گروه­های 5، 10 و 15  میکرومولار نسبت به گروه کنترل معنی دار است(05/0p<). همچنین بیان ژن Oct4 در مقایسه با یکدیگر و گروه کنترل فقط در دوز 10 میکرومولار اختلاف معنی­دار دارد (05/0p<) (نمودار 3). 

L  1    2    3   4    5   6

L  1   2    3   4    5    6

A

B

 

 

 

 

 

 

شکل 3: ژل الکتروفورز محصول بیان ژن GDNF (A) و ژن Oct4  (B) در گروه­های سلولی کنترل و تیمار با دوز های 1، 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاین به ترتیب از چپ به راست با 1، 2، 3، 4 و 5 شماره گذاری شده است. ستون اول Ladder با اندازه 100bp انتخاب شده و ستون 6 ژن خانگی (housekeeping gene) است. میزان بیان متناسب با شدت باندها در تصویر مشاهده می­شود.

 

نمودار 3: مقایسه نیمه کمی بیان ژن GDNF  و ژن Oct4   در گروه­های، کنترل و تیمار با دوز های 1، 5، 10 و 15 میکرومولار لوواستاین در سلول­های BMSC. برای ژن GDNF دوز 10 میکرومولار نسبت به سایر گروه­ها و دوز 5 و 15 با گروه کنترل و دوز 1 میکرومولار اختلاف معنی­دار دارد. برای ژن oct4 دوز 10 میکرومولار نسبت به سایر گروه­ها اختلاف معنیداری را نشان می­دهد (50/0<p). ستون­های a و b با یکدیگر و با ستون­های فاقد علامت معنی دارند(05/0p<). مقایسه بین گروهی و بررسی اختلاف بین گروه­ها با آزمون واریانس یک­طرفه انجام شده است.

 

  • بحث

   در مطالعات قبلی ماهیت سلول­های بنیادی مزانشیمی با نشاگرهای سطحی اختصاصی سلولی و نیز ظرفیت تمایز آن­ها به رده­های سلولی مزانشیمی تایید و گزارش شد[11، 12]. در مطاله حاضر نیز سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بر­­روی سطح پلاستیک فلاسک چسبیده (کشت چسبنده) و به صورت یکدست و نمای مورفولوژیکی دوکی شکل تکثیر نمودند. همچنین در این مطالعه بهبود شرایط کشت، یکدست بودن سلول­ها و افزایش قابلیت تکثیر سلولی با استفاده از دوزهای مختلف داروی لوواستاتین، نشان داده شد. بقا و حیات سلولی (به روش MTT ) در حضور لوواستاتین به صورت وابسته به دوز افزایش معنی­دار نشان داده و تکثیر سلولی به صورت وابسته به دوز رشد داشت که در غلظت­های 5 و 10 میکرومولار افزایش معنی­داری نشان داد (نمودار 1 و 2).

Kim و همکاران (15) بیان داشتند که لوواستاتین به عنوان یک عامل کاهش دهنده کلسترول اثر تکثیر سلولی و آپوپتوزیس دارد. آن­ها در مطالعه خود اثرات لوواستاتین بر تکثیر و تمایز استخوانی اشکال کروی سلولی در کشت سه بعدی تشکیل شده از سلول های بنیادی مشتق (gingiva‑derived stem cells -GDSCs) از لثه انسانی را بررسی کردند. نتایج آن­ها نشان داد که لوواستاتین در غلظت 2 و 6 میکرومولار، بقای سلولی و قطر اشکال کروی (diameters of the cell spheroids) سلول­های بنیادی را افزایش داد. در مقابل، Kupcsik و همکاران (16) بقا و تکثیر سلولی را در محیط آزمایشگاهی (in vitro) بر روی    سلول­های بنیادی مزانشیمی انسانی با روش MTT و سنجش مقدار DNA (DNA content)  بررسی و گزارش کردند که لوواستاتین در دوز 1 و 5 میکرومولار در کشت طولانی مدت اثر مهاری بر بقا و تکثیر سلولی دارد. در مطالعه ما علاوه بر بقا و تکثیر MSCs در شرایط کشت با دو روش MTT و شمارش سلول­های رنگ­شده، بیان GDNF و Oct4 نیز با روش مولکولی RT-PCR در سطح mRNA ارزیابی شد.

Oct4 یک فاکتور نسخه­برداری مهم در تعیین سرنوشت سلول و حفظ پرتوانی سلولی و شبکه تنظیم کننده ژن در سلول­های بنیادی پرتوان است (17). در مطالعه حاضر بیان آن برای ارزیابی حفظ ظرفیت تکثیر MSCs پس از تیمار با لوواستاتین ضروری به نظر می­رسید. از طرفی هدف این پژوهش بهبود شرایط کشت آزمایشگاهی است و برخی گزارش­ها نشان می­دهد که افزایش بیان این فاکتور در دست­ورزی­ها می­تواند موجب تومورزایی شود (18)، نتایج بیان نیمه کمی محصول PCR نشان داد که لوواستاتین در دوز 10 میکرومولار، توانسته میزان بیان ژن Oct4  در سطح mRNA را افزایش دهد(شکل 3 و نمودار 3).

استاتین‌ها آسیب‌های مغزی را بهبود می‌بخشند و در پیشگیری از بیماری آلزایمر نتایج امیدوارکننده­ای نشان دادند. با این حال، مکانیسم­هایی که استاتین­ها توسط آن موجب درمان بیماری­های عصبی می­شوند، بهطور کامل شناخته نشده­اند. در یک مطالعه، شواهد اولیه نشان داد که سیمواستاتین نورون­زایی را در سلول­های پیش ساز عصبی بالغ کشت شده و همچنین در شکنج دندانه­ای موش های بالغ افزایش می­دهد (19). نتایج مطالعه دیگری نشان داد که اثر نورولوژیک سیمواستاتین می تواند از طریق فعال شدن مسیر پیام رسانی Akt، پس از آن افزایش بیان فاکتورهای رشد و القای نورون­زایی در شکنج دندانه­ای هیپوکامپ منجر به بازسازی عملکرد شناختی موش صحرایی مبتلا به آسیب مغزی می شود (20 و 21). نتایج مطالعه دیگری در سال 2019 بر روی مدل بیماری صرع در موش صحرایی که با لوواستاتین تحت درمان قرارگرفته بودند، افزایش بیان فاکتورهای نوروتروفیک GDNF و CNT و بدنبال آن کاهش مرگ سلول­های هیپوکامپ و افزایش تعداد نورون­ها و بهبود بیماری را نشان دادند (22).

نتایج RT-PCR برای دو ژن GDNF و oct4 نشان داد که داروی لوواساتین بر بیان این دو فاکتور اثر القایی داشته و بیشترین بیان در دوز 10 میکرومولار دیده شد. یکی از اهداف پژوهش در حوزه سلول­های بنیادی، بهبود شرایط کشت MSCs برای حفظ و تقویت توان خودتکثیری و قابلیت نوروترفیک سلول­ها پیش از استفاده برای مقاصد درمانی است. اخیرا گزارش شده که استاتین­ها اثرات ضد التهابی و محافظتی عصبی دارند. نورون‌های دستگاه عصبی در زمان تکوین به عوامل نوروتروفیک برای رشد و بقا نیاز دارند (2، 23، 24). مطالعات بیشماری گزارش کردند که فاکتورهای نوروتروفیک بهطور گسترده در بقا، تکثیر و بلوغ جمعیت­های سلول­های عصبی، نقش حمایتی ایفا می­کنند. این نقش حمایتی موجب بازسازی عصبی در بیماری­های مانند آلزایمر، پارکینسون و هانتینگتون می­شود (25-27). GDNF با افزایش میلینه­شدن آکسون­های آسیب دیده، نقش مهمی در بقای نورون­ها بازی می­کند و موجب ترمیم طناب نخاعی می­گردد. اثرات درمانی GDNFدر بیماری­های مختلف سیستم عصبی مرکزی مانند پارکینسون، سکته مغزی و صرع، تایید شده است (28، 29). ما نیز در این مطالعه مشاهده کردیم که لوواستاتین بر بیان GDNF در سلول­های بنیادی مزانشیمی، اثر القایی داشته و مقدار بیان را در دوزهای 5، 10 و 15 میکرومولار افزایش داده است. در مطالعه­ای مشابه در شرایط آزمایشگاهی لوواستاتین با غلظت­های 2، 4، 6، 8 و 10 میکرومولار بر سلول­های بنیادی عصبی بررسی و علاوه بر افزایش بقا سلولی، افزایش بیان mRNA فاکتورهای نوروتروفیک گزارش شد (1). همانگونه که پیشتر گفته شد، طراحی شرایط کشت بهینه برای MSCs قبل از پیوند، یکی از اهداف و برنامه­های مهم بسیاری از پژوهش­های سال­های اخیر محسوب می­شود (1، 10، 30). Mukhamedshina و همکاران (10) به منظور درمان آسیب طناب نخاعی (spinal cord injury-SCI) توسط پیوند MSCs با ایجاد شرایط کشت بهینه­، قابلیت تکثیر و مهاجرت این سلول­ها را در روند درمانی سرعت بخشیدند (10). رشد و تکثیر مطلوب MSCs به همراه مورفولوژی یکدست فیبروبلاست مانند و نیز حفظ ویژگی­های اصلی MSCs در شرایط in vitro نیاز به محیط کشت اختصاصی به همراه فاکتور­های رشد اختصاصی دارد.

 

  • نتیجه­گیری

   نتایج این مطالعه نشان داد که داروی لوواستاتین قادر است شرایط کشت MSCs را بهبود بخشیده و علاوه بر افزایش قابلیت بقا و تکثیر سلولی، ظرفیت نوروتروفیک MSCs را تقویت نماید. این نتایج در کنار شواهد گزارش شده قبلی به اثر سودمند و موثر ترکیب دارویی لوواستاتین برای درمان بیماری­های تحلیل­برنده عصبی مانند آلزایمر تاکید می­نماید.

 

  • تشکر و قدردانی

از دانشگاه دامغان بابت تامین هزینه و امکانات آزمایشگاهی تشکر می­گردد.

-

مراجع
  1. Fakheri F, Abdanipour A, Parivar K, Anarkooli IJ, Rastegar H. Lovastatin alters neurotrophin expression in rat hippocampus‑derived neural stem cells in vitro. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2019; 79(4): 413-420.

2.Dolga AM, Nijholt IM, Ostroveanu A, Ten Bosch Q, Luiten PG, Eisel UL. Lovastatin induces neuroprotection through tumor necrosis factor receptor 2 signaling pathways. Journal of Alzheimer's Disease. 2008; 13(2): 111-22.

  1. Kim BB, Tae JY, Ko Y, Park JB. Lovastatin increases the proliferation and osteoblastic differentiation of human gingiva-derived stem cells in three-dimensional cultures. Exp Ther Med. 2019; 18(5): 3425-3430. 
  2. Houshmand B. Hassanizade R. Eslami B. Amouei S. Dashti G. Morad G. Khojasteh A. Simvastatin and Lovastatin Induce Ectopic Bone Formation in Rat Subcutaneous Tissue. J Periodontol Implant Dent. 2010;2(1): 12-16.
  3. Park, J.-B., et al., Simvastatin maintains osteoblastic viability while promoting differentiation by partially regulating the expressions of estrogen receptors α. Journal of Surgical Research, 2012. 174(2): p. 278-283.
  4. Meor Anuar Shuhaili MFR, et al. Effects of Different Types of Statins on Lipid Profile: A Perspective on Asians. Int J Endocrinol Metab. 2017; 15(2):e43319.
  5. Han Y, Li X, Zhang Y, Han Y, Chang F, Ding J. Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Cells. 2019; 8(8): 886. 
  6. Dave JR, Tomar GB. Dental Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells: Applications in Tissue Engineering. Crit Rev Biomed Eng. 2018; 46(5): 429-468.
  7. Samsonraj RM, Raghunath M, Nurcombe V, Hui JH, van Wijnen AJ, Cool SM. Concise Review: Multifaceted Characterization of Human Mesenchymal Stem Cells for Use in Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. 2017; 6(12): 2173-2185.
  8. Mukhamedshina Y, et al. Improving Culture Conditions, Proliferation, and Migration of Porcine Mesenchymal Stem Cells on Spinal Cord Contusion Injury Model in vitro. Cells Tissues Organs. 2020;209(4-6):236-247.
  9. Mirzaeiyan L, Ghorbanian M T, Lashkarbolouki T, Haji-Ghasem-Kashani M, Dehghan R. Examination of antioxidant enzymes andmatrix metalloproteinases in conditional medium of bone marrow mesenchymal stem cells and adipose-derived stem cells in vitro. Koomesh, 2014; 15 (3): 350-358.
  10. Nikoozad Z, Ghorbanian MT, Rezaei A. Comparison of the liver function and hepatic specific genes expression in cultured mesenchymal stem cells and hepatocytes. Iranian journal of basic medical sciences. 2014; 17 (1), 27-33.
  11. Azari M, Ghorbanian MT, Elah Dadi Salmani M Effect of exogenous estrogen treatment on hippocampal neurogenesis in ovariectomized mice. Journal of Gorgan University of Medical Sciences 2018; 20: 35-41.
  12. Ghorbanian M T, Haji-Ghasem-Kashani M, Hossein-Pour L, Mirzaiyan L. Expression of nestin and nerve growth factors in adipose-derived mesenchymal stem cells . Feyz. 2011; 15 (4) :322-330.
  13. Kim BB, Tae JY, Ko Y, Park JB. Lovastatin increases the proliferation and osteoblastic differentiation of human gingiva-derived stem cells in three-dimensional cultures. Exp Ther Med. 2019; 18(5): 3425-3430. 
  14. Kupcsik L, Meurya T, Flury M, Stoddart M, Alini M.J. Statin-induced calcification in human mesenchymal stem cells is cell death related. Cell Mol Med. 2009;13(11-12): 4465-73. 
  15. Balboa D, Weltner J, Novik Y, Eurola S, Wartiovaara K, Otonkoski T Generation of an OCT4 reporter human induced pluripotent stem cell line using CRISPR/SpCas9. Stem Cell Res. 2017; 23: 105-108. 
  16. Mohiuddin IS, Wei SJ, Kang MH. Role of OCT4 in cancer stem-like cells and chemotherapy resistance. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020 ;1866(4):165432.
  17. Robin NC, Agoston Z, Biechele TL, James RG, Berndt JD, Moon RT. Simvastatin promotes adult hippocampal neurogenesis by enhancing Wnt/beta-catenin signaling. Stem Cell Reports. 2013; 2(1): 9-17.
  18. Wang C, Chen T, Li G, Zhou L, Sha S, Chen L. Simvastatin prevents beta-amyloid(25-35)-impaired neurogenesis in hippocampal dentate gyrus through alpha7nAChR-dependent cascading PI3K-Akt and increasing BDNF via reduction of farnesyl pyrophosphate. Neuropharmacology. 2015; 97: 122-32.
  19. Lu D, Qu C, Goussev A, Jiang H, Lu C, Schallert and et al. Statins increase neurogenesis in the dentate gyrus, reduce delayed neuronal death in the hippocampal CA3 region, and improve spatial learning in rat after traumatic brain injury. Neurotrauma. 2007; 24(7):1132-46.
  20. Moradi P, Ganjkhani M, Anarkooli IJ, Abdanipour A. Neuroprotective effects of lovastatin in the pilocarpine rat model of epilepsy according to the expression of neurotrophic factors. Metab Brain Dis. 2019; 34(4):1061-1069.
  21. Ghayour MB, Abdolmaleki A, Rassouli MB. Neuroprotective effect of Lovastatin on motor deficit induced by sciatic nerve crush in the rat. Eur J Pharmacol. 2017; 812: 121-127.
  22. Yan JQ, Ma YJ, Sun JC, Bai SF, Huang LN. Neuroprotective effect of lovastatin by inhibiting NMDA receptor1 in 6-hydroxydopamine treated PC12 cells. Int J Clin Exp Med. 2014; 7(10): 3313-9.
  23. Xiao N, Le QT. Neurotrophic Factors and Their Potential Applications in Tissue Regeneration. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2016; 64(2): 89-99.
  24. Harvey AR, Lovett SJ, Majda BT, Yoon JH, Wheeler LP, Hodgetts SI. Neurotrophic factors for spinal cord repair: Which, where, how and when to apply, and for what period of time? Brain Res. 2015; 1619: 36-71.
  25. Xiao N, Quynh Thu L Neurotrophic factors and their potential applications in tissue regeneration. Arch Immunol Ther Exp. 2016; 64: 89–99.
  26. Gao K, Wang G, Wang Y, Han D, Bi J, Yuan Y, Yao T, Wan Z, Li H, Mei X. Neuroprotective efect of simvastatin via inducing the autophagy on spinal cord injury in the rat model. Biomed Res Int. 2015: 260161.
  27. Razavi S, Ghasemi N, Mardani M, Salehi H. Remyelination improvement after neurotrophic factors secreting cells transplantation in rat spinal cord injury. Iran J Basic Med Sci . 2017 20: 392–398.
  28. Sun L, Zhang Y, Zhang J, Wang J, Xing S. Atorvastatin improves the proliferation and migration of endothelial progenitor cells via the miR-221/VEGFA axis. Biosci Rep. 2020; 40(11): BSR20193053.
سلول و بافت
دوره 13، شماره 2
تیر 1401
صفحه 107-120
فایل ها
سابقه مقاله
  • تاریخ دریافت: 02 شهریور 1401
  • تاریخ پذیرش: 02 شهریور 1401
  • تاریخ اولین انتشار: 02 شهریور 1401
اشتراک گذاری
ارجاع به این مقاله
آمار