• مقدمه

   سرطان به­عنوان دومین عامل مرگ در سراسر جهان در نظر گرفته می­شود (1). ایجاد سرطان شامل مجموعه­ای از وقایع است که اغلب با سلول­هایی شروع می­شود که به­دلیل تجمع جهش­های منجر به تکثیر خارج از کنترل، کنترل رشد آن­ها، از دست رفته است. این جهش­ها شامل تغییرات ژن­هایی نظیر انکوژن­ها و ژن­های سرکوب­کننده­ی تومور است که در مکانیسمهای سلولی و مولکولی مختلف درگیر در فرآیندهای تکثیر، حرکت و مهاجرت سلولی نقش دارند. متاستاز یکی از عوامل اصلی شروع و پیشرفت سرطان محسوب می­شود و مسئول بیش از 09 درصد  مرگ­های مرتبط با سرطان می­باشد (2و 3).  

معمولا تغییر بیان ژن­های مرتبط با فرایندهای اساسی سلول نظیر کنترل چرخه­ی سلولی، ترمیم اشتباهات DNA، تمایز و آپوپتوز در بافت­های سرطانی در مقایسه با بافت­های نرمال بیماران رخ می­دهد و گزارشات متعددی از نقش بیان متمایز این ژن­ها در ایجاد، گسترش، متاستاز و پیش­آگهی سرطان­ها وجود دارد. داده­ها نشان می­دهند که هر چه الگوی بیان ژن­ها از وضعیت تکوین طبیعی سلول­ها تبعیت نماید و تغییرات بیان ژ­ن­ها اندک باشد، پیش آگهی بیماری مطلوب­تر بوده و احتمال متاستاز کمتر خواهد بود. در مقابل، با تغییر قابل توجه در الگوی بیان ژن­ها نسبت به حالت نرمال، پیش­آگهی وخیم­تر بوده و احتمال متاستاز افزایش خواهد یافت (4-6). سلول­های سرطانی مکانیسم­های داخلی و خارجی جهت ایجاد و برقراری یک ریزمحیط پیش­متاستازی مناسب برای خود دارند. تغییر شکل سلول­ها از حالت اپی­تلیالی به مزانشیمی (EMT) یکی از مکانیسم­های داخلی مورد نیاز برای برقراری ریزمحیط پیش­متاستازی است و علاوه­ بر نقش در متاستاز، در تکوین طبیعی جنین و فیبروز بافتی نقش ضروری ایفا می­کند (3و 7). سلول­های اپی­تلیالی طی EMT مجموعه­ای از تغییرات فنوتیپی را نشان می­دهند که شامل از دست دادن قطبیت سلولی و ارتباط با غشای پایه­ای، به­دست آوردن پروتئین­های مزانشیمی، کسب توانایی مهاجرت بالا، توانایی تخریب ماتریکس خارج سلولی و فعالیت ضد آپوپتوزی می­باشد (8) (شکل1).

شکل 1: نمای شماتیک EMT. سلول­های اپی­تلیالی ارتباط خود را با غشای پایه­ای از دست داده و با تخریب ماتریکس خارج سلولی از هم جدا  و قادر به مهاجرت شده­­اند. همچنین پروتئین­های جدیدی نظیر پروتئین­های مزانشیمی یا ضدآپوپتوزی را بیان می­کنند.

فاکتورهای رونویسی القا­کننده­ی EMT شامل Snail1، Slug، ZEB1/2، Twist، Foxc2، TCF4 و E47 در این فرآیندها دخیل هستند. بیان چنین فاکتورهایی می­تواند از طریق پیام­رسان­های خارج سلولی مثل ECM و فاکتورهای رشد قابل حل مثل TGF-β، پروتئین­های Wnt و Notch یا از طریق عوامل درون سلولی مثل Ras یا پیام­رسانی NF-κB راه­اندازی شود 8و9). فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT منجر به خاموش­سازی ژن­های اپی­تلیالی نظیر ژن­های درگیر در اتصالات سلولی مثل E-کادهرین، دسموزوم­ها و اکلودین­ها و نیز باعث بیان ژن­ها و مارکرهای مشابه با CSCs می­شود که نشان می­دهد فعالیت EMT در ایجاد CSCs درگیر هست (3). CSCs زیر مجموعه­ای از سلول­های سرطانی می­باشند که ویژگی­های مشابه با   سلول­های بنیادی طبیعی را مثل خود تجدیدی و تمایزناهمگن به اشتراک می­گذارند و به­دلیل همین تشابهات، مارکرهای سطحی مرتبط با سلول­های بنیادی طبیعی مثل CD133 ، CD44 و CD90 را بیان می­کنند (2). این سلول­ها نقش کلیدی را در شروع و گسترش سرطان بازی می­کنند. وقوع فرآیند EMT ارتباط بالایی با CSCs و گسترش سرطان دارد. عوامل مختلفی نظیر فاکتورهای موجود در ریزمحیط تومور مثل فیبروبلاست­های مرتبط با سرطان (CAFs) و ماکروفاژهای مرتبط با تومور (TAMs)، پیری سلولی و هیپوکسی باعث القای EMT در CSCs می­شود (2و 8). به­طور خلاصه EMT توان متاستازی را افزایش داده و در فراگیر شدن فنوتیپ­های CSC شرکت می­نماید. در این مقاله­ی مروری تغییرات مولکولی در سطح مسیرهای پیام­رسانی، miRNAها، چرخه­ی سلولی و ناپایداری ژنومی و نیز تغییرات ساختاری سلولی مثل تغییرات در نواحی تلومری و کروماتین  در ارتباط با EMT مورد بررسی قرار می­گیرد. ما در این مقاله­ی مروری، به بیان چگونگی اثر فاکتورهای مولکولی مختلف و تغییرات سلولی ویژه در پیشبرد EMT خواهیم پرداخت.

• مواد و روش‌ها

   ما در این مطالعه با بهره­گیری از مطالب علمی بیان شده در مقالات معتبر سال­های اخیر به بیان مکانیسم­های مختلف درگیر در پیشرفت فرآیند EMT و درنتیجه سرطان پرداخته­ایم. تنظیم سلولی و مولکولی فرآیند EMT براساس یافته­های علمی در زمینه­ی سرطان­های مختلف بیان شده است. لذا، با هدف قرار دادن مطالب مرتبط با عوامل مختلف درگیر در انواع سرطان­ها، به وجود ویژگی­های ژنتیکی و پیچیده­ی سلول­های سرطانی و تنظیم عملکرد آن­ها پرداخته­ایم. به­کارگیری چنین روشی در بررسی اطلاعات مرتبط با فرآیند EMT می­تواند در پی بردن به نیازمندی­های علمی بیشتر در زمینه­ی پیشرفت سرطان کمک شایانی کند.

• نتایج
• مسیرهای پیام­رسانی

EMT    به­عنوان یک مکانیسم درونی جهت فرآهم کردن ریز­محیط پیش­­متاستازی باعث توسعه­ی ویژگی­های سلول بنیادی در سلول­های توموری می­شود. ارتباط بین سلول­های توموری دارای ویژگی سلول بنیادی یا CSCs و فرآیند EMT توسط بیومارکرهای EMT طی مسیرهای پیام­رسانی مختلف شامل Wnt، TGF-β، NF-κB، Notch و Hh تنظیم می­شود. مسیرهای پیام­رسانی یکی از موارد تغییرات مولکولی طی فرآیند EMT هستند که می­توانند تحت تأثیر عوامل مختلف فعال شوند و بد تنظیمی آنها به توسعه­ی CSCs منجر می­شود. این مسیرها نقش خود را در فرآیندهای مختلفی همچون شروع تومور (8)، رشد سلولی (8 و10-12)، تمایز (8و10)، حرکت و تهاجم (8 و10-12)، توانایی خود تجدیدی (10) و فعالیت­های ضد آپوپتوزی (11) ایفا می­کنند. وجود فاکتورهای عملکردی و تنظیمی مختلف در مسیرهای پیام­رسانی طی پیشرفت تومورها نقش احتمالی ارتباطات بین مسیرهای پیام­رسانی مختلف را بیان می­کند که می­توانند باعث ایجاد شبکه­های تنظیمی پیچیده­ای طی پیشرفت تومور شوند. نمونه­ای از ارتباطات بین مسیرهای پیام­رسانی، میانکنش بین دو مسیر پیام ­رسانی Hh و Wnt/β-Catenin می­باشد که اثر متقابل آن­ها می­تواند باعث تنظیم هر دوی مسیرهای EMT و CSC از طریق افزایش فاکتورهای رونویسی اصلی مثل Snail، Slug، ZEB1/2، Twist و Foxc2 و مارکرهای سلول بنیادی مثل BMI1، CD44 و CD133 شود (10). Snailها یکی از مهم­ترین فاکتورهای رونویسی درگیر در فرآیند EMT هستند که تعداد زیادی از جنبه­های مورفولوژیکی و مولکولی آن را در بر می­گیرند. خانواده­ی Snails از سه پروتئین مختلف Snail1، Snail2 و Snail3 تشکیل شده است. بیشتر مطالعات در ارتباط با EMT بر روی نقش Snail1 و Slug صورت گرفته است. این پروتئین­ها از طریق فسفریله شدن و یوبی­کوئیتینه شدن پایدار شده و از طریق فاکتورهای مختلف طی مسیرهای پیام­رسانی و RNAهای غیر کد کننده­ی کوچک مثل miRNAs تنظیم   می­شوند. در برخی مطالعات ارتباطات عملکردی و پیشبرنده­ی EMT بین Snail1 و Slug دیده شده است (13). این فاکتورها از طریق تنظیم بیان ژن­های MMP، N-کادهرین، ویمنتین، فیبرونکتین، E-کادهرین، ESRP و ... فرآیند­های مختلف درگیر در EMT را به­راه می­اندازند (14-16). القای حالت بنیادی، تنظیم حفظ طول تلومرها، فعالیت­های ضد آپوپتوزی، تنظیم فرآیندهای اپی­ژنتیکی مثل متیلاسیون هیستونی، افزایش تکثیر سلولی و تهاجم از جمله فعالیت­های بالقوه­ی Snailها می­باشند (13). مطالعات مختلف روی انواع سرطان­ها، مسیرهای پیام­رسانی متنوع و فاکتورهای مولکولی متعدد درگیر در این مسیرها را در وقوع EMT آشکار کرده­اند (جدول1).

• تلومر و کروماتین:

   کروموزوم­ها به­عنوان حاملین اطلاعات ژنتیکی سلول دارای انتهاهایی با ساختارهای تخصص­یافته بهنام تلومر هستند. تلومرها کمپلکس­های نوکلئوپروتئینی متشکل از توالی­های تکراری TTAGGG پشت سرهم و کمپلکس محافظ تلومر شامل TRF1، TRF2، POT1، TIN2،TPP1 و RAP1 هستند و به­عنوان یکی از مراحل ضروری در پیشرفت سرطان نقش ایفا می­کنند (32و33). نقش مهم پروتئین­های کمپلکس محافظ در تلومرها، محافظت تلومرها از تخریب، نوترکیبی و نیز فعالیت پاسخ آسیب  DNA (DDR) می­باشد (33و34). سلول­های سرطانی زیرمجموعه­ای از سلول­ها بوده که نیازمندِ ماندن در چرخه­ی سلولی هستند. این سلول­ها با توانایی­ حفظ DNAی تلومری، کوتاه شدن تلومرها و آپوپتوزیس یا پیری  ناشی از آن را که در چرخه­های سلولی طبیعی رخ می­دهد، بی­اثر کرده و درنهایت به توانایی همانندسازی نامحدود منجر می­شوند (32و35). سلول­های سرطانی از طریق مکانیسم­های حفاظت تلومر (TMMs) به دو صورت وساطت شده با تلومراز و نیز مکانیسم طویل شدن متناوب طول تلومر (ALT)، قادر به حفظ طول تلومرها هستند (34و35). درصد بالایی از فعالیت مکانیسم    ALT در تومورهای با منشا مزانشیمی دیده شده است و احتمالا وجود تنظیم منفی بیان تلومراز در این بافت­ها، عامل اصلی پیش­برنده­ی سلول­ها به سمت فعال کردن مکانیسم ALT باشد. مطالعات آزمایشگاهی نشان   داده­اندکه EMT در طی پیشرفت تومور می­تواند در غلبه کردن بر فرآیند پیری سلولی به سلول­ها کمک کند 35و36). اما، به­طور کلی، فعالیت بالای تلومراز در اکثر موارد تومورهای انسانی مشاهده شده است (32). طبقه­بندی تومورهای دارای مکانیسم­های حفاظتی تلومرها به دو صورت TEL+  و ALT+ نادرست است؛ چراکه وجود هر دو مکانیسم در برخی از سرطان­ها، توانایی تغییر یک مکانیسم به مکانیسم دیگر و نبود هیچ­کدام از مکانیسم­های حفظ طول تلومر در بعضی از تومورها مشاهده شده  است (35). امروزه مطالعاتی که ویژگی­های مولکولی تغییر از تلومراز به ALT را تعیین کنند، نادر هستند، با این­حال به برخی از نقایص مولکولی مرتبط با تعویض مکانیسم تلومراز به ALT اشاره خواهیم کرد (35و37). از جمله­ مارکرهای شناخته شده­ی ALT می­توان به طول ناهمگن تلومر، سطح بالای تبادلات کروماتیدهای خواهری تلومری (T-SCEs)، تکرارهای DNA تلومری مازاد بر طول کروموزوم و یک ساختار هسته­ای تلومری تخصص­یافته که تحت­عنوان اجسام PML مرتبط با ALT یا APBs مطرح شده­اند، اشاره کرد (33و35).

جدول1: مسیرهای پیام­رسانی مختلف و تأثیر آن­ها بر پیشرفت EMT

ساختار هسته­ای APBs از بخش­های تلومری DNA، پروتئین­های کمپلکس محافظ تلومر، فاکتورهای ترمیم DNA و پروتئین­های کروماتین تشکیل شده است (34-36). مطالعات زیادی روی انواع سرطان­ها حاکی از نقش وقایع سلولی-مولکولی و کروماتینی مختلف در فعالیت ALT طی پایداری سلولی و گسترش سرطان هستند. یکی از فاکتورهای درگیر در مکانیسم ALT، کمپلکس ATRX/DAXX هست که به­عنوان مهارکننده­ی کلیدی این مسیر شناخته شده است (35و38). زمانی ­که ATRX عملکرد خود را از دست میدهد، تغییراتی مثل افزایش رونویسی جزء RNA تلومراز یا TERRA، تشکیل و پایداری ساختارهای چهارگانه در تلومر، ممانعت از پیشرفت چنگال همانندسازی، افزایش احتمالی چنگال­های همانندسازی متوقف شده، شکست­های دو رشته­ای القا شده با متلاشی شدن چنگال همانندسازی و نوترکیبی در نواحی تلومری اتفاق می­افتد (33و35).  دومین فاکتور مهم درگیر در مکانیسم ALT، نقص فاکتورهای ASF1a و ASF1b است که منجر به ناپایداری نوکلئوزوم­ها در تلومر، تغییر مدل­سازی کروماتین و القای فرآیند ALT می­گردد. از آنجائی­که مکانیسم ALT جهت حفظ طول تلومرها طی گسترش سرطان بر اساس سنتز DNA تلومری وابسته به نوترکیبی هومولوگ اتفاق می­افتد، تغییرات چندین فاکتور کروماتینی می­تواند در ایجاد یک کروماتین بیشتر باز شده­ و در دسترس برای پروتئین­های HR در تلومرها نقش داشته باشد (33-35). مسیر نوترکیبی هومولوگ با ترمیم انتهاهای کروموزومی از نوع شکست­های دو رشته­ای DNA، زمینه­ی فراخوانی کمپلکس تبادلگر کروماتیدهای خواهری تحت­عنوان MRN را به نواحی تلومری فراهم می­کند (34). از این­رو سلول­های اجرا کننده­ی ALT در پاسخ به آسیب DNA، توانایی فرار از فرآیندهای آپوپتوزیس و پیری سلولی را کسب می­کنند. از طرفی، اغلب سلول­های دارای مکانیسم ALT جهش­هایی را در ژن کدکننده­ی P53 حمل می­کنند. نبود P53 عملکردی از کسب فنوتیپ پیری سلولی جلوگیری کرده و با ایجاد فعالیت ALT، به تکثیر سلولی و در نتیجه افزایش فشار همانندسازی منجر خواهد شد. به­طورکلی، جهش­های P53 به­عنوان پایه و اساس میزان بالای ناپایداری ژنومی در سلولهای دارای فعالیت ALT در نظر گرفته می­شود (34و 36). فاکتور مهم دیگر در حفظ طول تلومر کارکرد تلومراز می­باشد. تلومراز یک هترودایمر ریبونوکلئوپروتئینی متشکل از یک الگوی RNAی غیر رمزگذار (جزء RNAئی تلومراز یا TERC) برای سنتز توالی­های DNA تلومری جدید و یک زیرواحد آنزیمی تحت­عنوان ترانس کریپتاز معکوس تلومراز (TERT) می­باشد. آنزیم تلومراز با الگو قرار دادن جزء RNAئی،  تکرارهای تلومری را به انتهای 3ʹ کروموزوم اضافه کرده  و طول تلومرها را از کوتاه شدن حفاظت می­کند (35و39) (شکل2).

شکل 2: عملکرد تلومراز. مکمل شدن بازهای انتهای5ʹ TERC و انتهای 3ʹ تلومری باعث تشکیل رشته­ی غنی از سیتوزین (C) در DNA شده و از کوتاه شدن تلومرها جلوگیری می­کند.

به­طور طبیعی، سرکوب بیان زیرواحد TERT در سلول­های سوماتیکی بالغ به محدود شدن فعالیت تلومرازی و محدودیت عمر این سلول­ها منجر می­شود. اما، بیان بالای TERT و فعالیت تلومرازی افزایش یافته در 85 تا90 درصد همه­ی سرطان­ها به­دلیل جهش­هایی در پروموتور TERT مشاهده شده است که باعث مهار پاسخ آسیب DNA تلومری و تکثیر سلول­ها و پایدار ماندن آن­ها می­گردد. بیان بالای TERT و فعالیت تلومرازی افزایش یافته در سلول­های بنیادی جنینی و چند توان نیز به خصوصیات فناناپذیری سلول­های مذکور اشاره دارد (32و39). نقش جهش­های C288T و C250T به­عنوان جهش­های پروموتری رایج TERT، همچنین مکانیسم­های متنوع القای بیان TERT نظیر شبکه­های تنظیمی بسیار پیچیده شامل مهارکننده­های رونویسی( E2F1، MAD1، SP3 و ...) و فعال کننده­های رونویسی(c-Myc، β-Catenin، NF-κB، STAT و ...) و نیز مکانیسمهای اپی­ژنتیکی مختلف، از جمله­ی عوامل پیش­برنده­ی تومور مطرح شده­اند (32). TERT علاوه­بر نقش اصلی در حفظ طول تلومرها، به­طور فعال در تعداد زیادی از فرآیندهای سلولی مثل انتقال پیام، تکثیر سلولی، آپوپتوزیس و مهاجرت سلولی نیز نقش دارد. سلول­های بنیادی بالغ طبیعی، طویل­ترین تلومرها را در بافت­ها دارند که از طریق بیان بالای TERT و فعالیت آنزیمی تلومراز حاصل می­شود. در مقابل، سلول­های بنیادی سرطانی با وجود بیان بالای TERT، دارای تلومرهای کوتاهی هستند که نشان می­دهد سلول­های بنیادی سرطانی از میزان بالای TERT تنها جهت حفظ یا طویل­سازی تلومر استفاده نمی­کنند. بررسی­ها نشان دادند که بیان  TERTدر CSCs با فنوتیپ مزانشیمی مرتبط بوده و از دست دادن بیان TERT منجر به از دست دادن فنوتیپ مزانشیمی و کسب حالت اپی­تلیالی خواهد شد.  در واقع، این یافته­ها بر نقش TERT در القای فرآیند EMT در CSCs  دلالت دارد (40). اگرچه تنظیم بیان TERT در طی فرآیند EMT هنوز به­میزان زیادی ناشناخته است، اما، تعدادی از مطالعات به­وجود ارتباطات بین تنظیم رونویسی TERT و فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT اشاره می­کنند (شکل3).

شکل3: تنظیم بیان TERT طی فرآیند EMT در ارتباط با فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT. (1) TERT با اتصال به β-Cat و میانکنش با کمپلکس مدل­سازی مجدد SMARCA4 باعث بیان ژن­های هدف مسیر پیام­رسانی Wnt شامل MMP-7، VEGF و c-Myc می­شود (32و34). (2) c-Myc با اتصال به پروموتر ژن TERT باعث بیان آن می­شود (32و34). (3) TERT با اتصال به زیرواحد P65 از NF-κB مانع از راه­یابی آن به درون هسته شده و بیان ژن­های هدف آن شامل ویمنتین، Snail1 و HMGA2 را خاموش می­کند. (4) TERT در میانکنش با P65 درون هسته، بر روی پروموتر ژن­های تسهیل­کننده­ی متاستاز شامل MMPs اثر فعال­کنندگی دارد (32).

تغییرات مولکولی و ساختاری کروماتین طی فرآیند EMT

   مطالعات پیشنهاد می­کنند که ریز­محیط تومور (TME) از طریق فعال کردن فاکتورهای رونویسی مرتبط با EMT مثل Snail، Slug، ZEB1 و Twist باعث پیام­رسانی القای فرآیند EMT می­شود. از دست دادن اتصالات سلول_سلول از طریق غیرفعال­سازی E-کادهرین، به­عنوان یک پروتئین نقطه­ی اتصالات محکم، یکی از اصلی­ترین مشخصه­های فرآیند EMT بهحساب می­آید. بعلاوه، فاکتورهای رونویسی مرتبط با EMT که توسط اختلالاتی در ریز­محیط تومور القا شده­اند، جهت غیرفعال­سازی E-کادهرین و دیگر فاکتورهای درگیر در فنوتیپ اپی­تلیالی سلول­ها از طریق خاموش­سازی اپی­ژنتیکی فعالیت می­کنند. در حال حاضر، تغییرات اپی­ژنتیکی که در تعیین سرنوشت سلولی اثر می­گذارند، نظیر قابلیت قرار گرفتن تحت برنامههای EMT، به­طور کامل درک نشده­اند (41). تغییرات اپی­ژنتیکی شامل بازآرایی مجدد کروماتین، تغییرات N-ترمینال هیستونی و گوناگونی­های هیستونی، رونویسی ژن­ها را تحت تأثیر قرار داده و در تنظیم ساختار پویای کروماتین نقش دارند. در سلول­های یوکاریوتی، پیچش مولکول DNA در اطراف اکتامرهای هیستونی نوکلئوزوم­ها را ایجاد می­کند. نوکلئوزوم­ها بستهبندی شده و با تشکیل ساختارهای منظم­تر دسترسی به DNA را کاهش داده و از رونویسی ممانعت می­کنند (42). همچنین بازآرایی کروماتین می­تواند باعث تحریک CSCs به اجرای فرآیند EMT شود (41). در مرکز نوکلئوزوم، دمین­های کروی پروتئین­های هیستونی در میانکنش با یک­دیگر و فاصله­ی خیلی نزدیک با مولکول DNA متصل می­شوند، درحالی­که دمین N-ترمینال آن­ها می­تواند تحت انواع مختلف تغییرات پس از ترجمه نظیر استیلاسیون، متیلاسیون، فسفریلاسیون،    یوبی­کوئیتیناسیون و... قرار گرفته که هر کدام از آن­ها  نتایج بیولوژیکی ویژه­ای را در پی دارد. براساس انواع سلول­های سرطانی، گوناگونی بازآرایی مجدد کروماتین، انواع فاکتورهای رونویسی فراخوانی کننده و انواع فاکتورهای میانکنش­دهنده با مدل­های کروماتینی بازآرایی­یافته، تغییرات هیستونی به صورت­های متفاوت در تنظیم پویایی کروماتین نقش ایفا می­کنند. در برخی موارد، این تغییرات مستقیما در تنظیم کروماتین شرکت کرده و در بیشتر موارد، توسط پروتئین­های دارای دمین­های شناسایی کننده­ی متمایز نظیر کرومودمین(CD)، MBT، تکرار WD40، انگشت PHD، PWWP، Tudor و تکرارهای انکرینی شناسایی می­شوند (42). در حال­حاضر، چهار خانواده­ی اصلی فاکتورهای بازآرایی مجدد کروماتین شامل SWI/SNF، ISWI، CHD و INO80 تعیین ویژگی شده­اند که زیرواحد کاتالیتیکی ATPآزی آن­ها از طریق هیدرولیز ATP منجر به تغییر در اتصالات DNA-هیستون­ها و از بین بردن ساختار نوکلئوزوم­ها می­شود. از طرفی، زیرواحد غیر کاتالیتیکی این کمپلکس­ها در تنظیم متمایز فعالیت­های مکان­یابی نوکلئوزوم و برنامه­های بیان ژنی و تعیین سرنوشت سلولی نقش ایفا می­کنند. همچنین چندین پروتئین کمپلکس­های بازآرایی مجدد کروماتین که در هماهنگی با هم در تنظیم فعالیت رونویسی طی فرآیند EMT عمل   می­کنند، شناسایی و اختلالات در این کمپلکس­ها در پیشرفت بدخیمی­ها به­خوبی اثبات شده­است (43). تغییرات هیستونی به دو دسته­ی مهارکننده­های رونویسی و فعال­کننده­های رونویسی طبقه­بندی می­شوند (42).

تغییرات هیستونی فعال­کننده در EMT   

استیلاسیون هیستونی:

در اثر تغییرات هیستونی فعال کننده­، کروماتین به­حالت یوکروماتین که در آن ژنوم به­حالت باز­تر و قابل دسترس­تر برای ماشین­های رونویسی است، قرار می­گیرد. استیلاسیون هیستونی معمولا با اضافه شدن یک گروه استیل به باقی­مانده­های Lys در دم N-ترمینال هیستون­ها اتفاق می­افتد که با خنثی کردن بار مثبت هیستون­ها باعث تضعیف میانکنش­های DNA-هیستون و یا نوکلئوزوم-نوکلئوزوم و در نتیجه تقویت رونویسی می­گردد (42) (شکل4).

شکل 4:  ستیلاسیون هسیتونی. استیله شدن اسیدآمینه­های Lys بر روی هیستون­ها باعث کاهش فشردگی کروماتین و دسترسی فاکتورهای رونویسی به پروموتور ژن­های هدف و بیان آن­ها می­شود.

در سلول­های یوکاریوتی فرآیند استیلاسیون توسط چندین خانواده­ی هیستون استیل ترانسفراز (HATs) شامل PCAF، P300/CBP، TIP60 و hMOF کاتالیز می­شود. هر یک از این استیل ترانسفرازها با کاتالیز کردن استیلاسیون­های متفاوت بر روی پروموتر ژن­های هدف و نیز خود فاکتورهای رونویسی درگیر در فرآیند EMT، نتایج بیولوژیکی مختلفی  برجا می­گذارند (44و45). در مسیر EMT وابسته به Wnt، β-Catenin جای­گرفته در هسته با اتصال به فاکتور رونویسی TCF، P300/CBP را بر روی پروموترهای ژن­های هدف مسیر Wnt به­خدمت می­گیرد و درنهایت تجمع یک کمپلکس فعال رونویسی باعث       بیش­تنظیمی بیان ژن­های هدف پایین­دست Wnt خواهد شد (46). میانکنش P300 و PCAF با فاکتور رونویسی ZEB1 بر روی پروموتر miR200c/141، از طریق استیله کردن ZEB1 منجر به جدا شدن آن از پروموتر و القای بیان ژن کدکننده­ی miRNA خواهد شد (47). در چندین سلول سرطان پستان، پروتئین hMOF باعث استیلاسیون H4K16 در پروموتر چندین ژن سرکوبگر تومور مرتبط با فرآیند EMT شاملTWS1، E-کادهرین و ESR1 می­شود که منجر به حفظ بیان ژن­ها خواهد شد (42). 

متیلاسیون هیستونی:

   متیلاسیون هیستونی بر روی زنجیره­های جانبی باقی­مانده­های Lys و Arg اتفاق می­افتد. براساس جایگاه­های متیله­شدن هیستون­ها، وضعیت­های متیلاسیونی متمایز و نیز انواع سرطان­های مختلف،  در طی مسیرهای پیام­رسانی درگیر در EMT نقش و عملکردهای مختلفی برای متیلاسیون بروز پیدا می­کند (42). در مطالعه­ای بر روی سرطان پستان، متیل ترانسفراز هیستونی DOT1L  با کاتالیز تغییر هیستونی H3K79 بر روی پروموتر ژن­های Snail1 و ZEB1/2 منجر به تشکیل یک کمپلکس بین این تغییر هیستونی و فاکتورهای رونویسی c-Myc و P300 شده و با همراهی مارکرهای اپی­ژنتیکی دیگر، باعث فعال کردن بیان ژن­های Snail1 و ZEB1/2 و پیش بردن فرآیند EMT و متاستاز می­شود (48). مطالعه­ی دیگری نقش متیل ترانسفراز PRMT1 را در پیشبرد فرآیند EMT نشان می­دهد. این آنزیم با کاتالیز متیلاسیون H3R3me2 بر روی پروموتر ZEB1 باعث بیان شدن آن و پیشبرد متاستاز خواهد شد (49). همچنین در مطالعه­ای بر روی مدل­های EMT القا شده با فاکتور رشد TGF-β، افزایشی در میزان  متیلاسیون­های H3K4me3 و H3K36me3 شناسایی و نشان داد که این دو مارکر متیلاسیون فعال کننده نیز می­توانند نقش خود را در پیشبرد EMT ایفا کنند (45).

متیلاسیون هیستونی مهارکننده:

   متیلاسیون روی هیستون­های H3K9، H3K27، H4K20 و H4R3 اغلب با ژن­های مهار شده از لحاظ رونویسی مرتبط بوده­ است. هر یک از این تغییرات هیستونی توسط متیل ترانسفرازهای مختلفی کاتالیز می­شوند و این آنزیم­ها می­توانند از طریق فاکتورهای مختلف رونویسی درگیر در EMT به پروموتر ژن­های هدف فراخوانی شوند. با این­حال، مطالعاتی وجود دارند که نشان می­دهند برخی متیلاسیون­های هیستونی توسط آنزیم­های یکسان انجام می­گیرد (42). کاتالیز متیلاسیون H3K9 عمدتا توسط آنزیم­های G9a، GLP، SETDB1 و SUV39H1/2 انجام می­شود. فعالیت G9a در برخی سرطان­ها در متیلاسیون H3K9me2 به­منظور مهار پروموتر ژن E-کادهرین مشاهده شده است. در این سرطان­ها فراخوانی G9a به پروموتر ژن هدف توسط فاکتور رونویسی Snail1 انجام می­گیرد (50). در مطالعات دیگری، Snail1 با فراخوانی متیل ترانسفراز SUV39H1 به پروموتر ژن E-کادهرین باعث کاتالیز H3K9me3 شده است (51). همچنین، همکاری متیل ترانسفراز SETDB1 با فاکتورهای درگیر در مسیرهای پیام­رسانی مثل Smad2/3 به­منظور مهار EMT در متاستاز سلول­های سرطان ریه دیده شده است (45). در سلول­های سرطان پانکراس نیز متیل ترانسفراز PRC2 توسط Snail1 به پروموتر ژن E-کادهرین فراخوانی شده و تغییر  H3K27me3 را کاتالیز می­کند (42).

3) میکروRNAها (miRNAs ):

miRNA   ها دسته­ای از RNAهای غیر کد کننده­ی کوچک (ncRNAs) هستند که در فرآیندهایی مثل تغییرات پس از رونویسی mRNAها نقش دارند. اهمیت چندین کلاس از ncRNAها در تنظیم رونویسی و پیشبرد EMT مطرح شده است که در این میان،  miRNAها به­طور بهتری در رابطه با شکل­پذیری سلولی اپی­تلیال-مزانشیمال مطالعه شده و جنبه­های مختلف بیولوژی سرطان مثل شروع تومور و متاستاز را تنظیم می­کنند. با این­حال، جزئیات مولکولی مرتبط با آن­ها در تنظیمات اپیژنتیکی مورد نیاز برای EMT هنوز به­میزان زیادی ناشناخته است. miRNAها از طریق خردشدن پی­درپی رونوشت­های اولیه­ی طویل با مشارکت فاکتورهایی مثل Drosha و Dicer ایجاد و به تغییرات پس از رونویسی mRNAها از طریق تخریب، مهار ترجمه و یا ترکیبی از هر دو منجر می­شوند (42و52). بیشتر miRNAها از طریق تشکیل جفت باز بین توالی­های 2-8 نوکلئوتیدی قرار گرفته در انتهای 5ʹ خود و 3ʹ-UTR از mRNAهای هدف باعث تنظیم عملکرد آن­ها در سلول­ها می­شوند (53) (شکل5).

ارتباطات پیچیده­ی تنظیم­شده­ای بین miRNAها، فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT، مسیرهای پیام­رسانی مختلف و پروتئین­های بازآرایی مجدد کروماتین در انواع مختلف سلول­های سرطانی وجود دارد. بیشتر miRNAهای درگیر در تنظیم EMT باعث مهار این مسیر شده و به­طور رایج در سلول­های توموری کاهش بیان نشان می­دهند. با این­حال، برخی miRNAها از طریق افزایش سطح فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT مثل Snail1، ZEB1/2، Slug و Twist به پیشبرد این فرآیند کمک می­کنند. 

شکل 5: مکانیسم عملکرد miRNA. RNA پلی­مرازII با رونویسی از ژن­های miRNA، ساختارهای ثانویه­ی پیوسته به­هم تحت­عنوان Pri-miRNA تولید می­کند. اثر آنزیم Drosha بر این ساختارها منجر به تولید ساختارهای ثانویه­ی جدا از هم تحت­عنوان Pre-miRNA می­گردد. با ورود این ساختارها به درون سیتوپلاسم، آنزیم دیگری بنام Dicer بر آن­ها اثر کرده و باعث تولید miRNAهای دو رشته­ای کوچک بالغ می­شود.  کمپلکس خاموشگر القا شده با RNA با اتصال به تک­رشته­ای از miRNA، میانکنش انتهای 5ʹ‍ آن را با mRNA 3ʹ-UTR ی هدف تسهیل می­کند و به تنظیم پس از رونویسی آن منجر می­شود.

تنظیم و پیشبرد EMT از طریق miRNAها

اثر مهارکنندگی miRNAها بر فرآیند EMT :

   خانواده­ی miR-200 به­عنوان تنظیم­کننده­های ضروری تمایز و ویژگی­های اپی­تلیالی در محدوده­ی وسیعی از انواع سلول­ها و بافت­ها مطرح شده­اند (42). اعضای این خانواده­ی RNAئی شامل miR-200a، miR-200b، miR-200c، miR-429 و miR-141 می­باشد (52و 54). خانواده­ی miR-200 از طریق هدف­گیری مستقیم ناحیه­ی 3ʹ-UTR از mRNAهای ZEB1/2 باعث مهار فنوتیپ EMT می­شوند (54). وجود یک لوپ بازخورد منفی دوجانبه بین خانواده­ی miR-200 و ZEB1/2 می­تواند به­عنوان فاکتور مسئول حفظ ویژگی­های CSC در نظر گرفته شده و نشان­دهنده­ی نقش EMT در ایجاد و حفظ CSC باشد. در این لوپ بازخوردی، پروتئین­های ZEB1/2 می­توانند از طریق اتصال به پروموترهای اعضای خانواده­ی miR-200 باعث مهار بیان آن­ها شوند. این miRNAها نه­تنها از طریق هدف­گیری  ZEB1/2باعث حفظ فنوتیپ اپی­تلیالی می­شوند؛ بلکه قادرند از طریق مهار بیان فعال ژن­های مختلف درگیر در حرکت و تهاجم سلولی نقش خود را ایفا کنند (55-57). miR-200b از این خانواده نقش خود را در مهار EMT از طریق هدف­گیری ZEB2، به­وسیله­ی جای­گیری E-کادهرین در غشای پلاسمایی سلول­ها ایفا می­کند. این miRNA همچنین از طریق مهار بیان Wnt1، β-Catenin و TCF-4 نقش خود را در مهار پیشبرد EMT بازی  می­نماید (58). miR-200c علاوه­بر نقش در مهار EMT از طریق هدف­گیری ZEB1/2، از روش مهارکننده­ی دیگری جهت ایفای نقش خود بهره می­برد. این miRNA از طریق هدف­گیری پروتئین­های تنظیم­کننده­ی اکتین مثل FHOD1 و PPM1F منجر به از بین رفتن هماهنگی­های بین ساختارهای اکتینی در سلول­ها شده و نتیجه نهایی آن مهار حرکت و تهاجم سلول­ها خواهد بود (54). miR-205 نیز همانند خانواده­ی miR-200 از طریق هدف­گیری ناحیه­ی 3ʹ-UTR در mRNAهای ZEB1/2 در مهار فرآیند EMT نقش ایفا می­کند. همچنین رونویسی این miRNA  به­واسطه­ی لوپ بازخورد منفی با ZEB1/2 تحت تنظیم و کنترل قرار می­گیرد (42و 54). miRNA-666-5p و miR-183 نیز از جمله miRNAهایی ­هستند که از طریق ZEB2 باعث مهار EMT می­شوند (53). miR-200s با مهار بیان TGF-β2 و β-Catenin موجب تضعیف EMT شده و با هدف­گیری mRNAهای مربوط به چندین آنزیم بازآرایی مجدد کروماتین شامل BMI1، SUZ12 و SIRT1 منجر به تنظیم منفی EMT و ایجاد ویژگی­های شبه CSC می­گردد (42). miR-34a  به­عنوان یکی از مهارکننده­های اصلی فرآیند EMT و نیز فاکتور سرکوبگر تومور مطرح شده است که توسط فاکتور P53 دچار تنظیم مثبت رونویسی شده و از طریق هدف­گیری فاکتورهای رونویسی درگیر در EMT مثل ZEB1 و Snail1 نقش مهاری خود را ایفا می­نماید. همانند خانواده­ی miR-200، بین miR-34aو دو فاکتور رونویسی مذکور نیز  لوپ بازخوردی منفی وجود دارد (42و55). یک مطالعه بر روی سرطان کلورکتال نشان داد که فاکتور پروتئینی ZNF281 می­تواند به­عنوان تنظیم­گر حدواسط بین miR-34a و Snail1 عمل نماید. علاوه­بر Snail1، c-MET و β-Catenin  نیز به­عنوان هدف­های دیگر  miR-34aمی­باشند که در غیاب آن می­توانند در پیشبرد EMT نقش ایفا کنند (56).

اثر فعال کنندگی miRNAها بر فرآیند EMT :

   مطالعات نشان می­دهند که فعال شدن فرآیند EMT به­واسطه­ی miRNAها می­تواند از طریق تنظیم منفی miRNAهای مهارکننده­ی EMT توسط miRNAهای دیگر، فاکتورهای پیام­رسانی درگیر در مسیرهای درون سلولی و یا عواملی مثل CD44 اتفاق بیفتد. همچنین هدف­گیری مستقیم mRNAهای رمزگذار پروتئین­های درگیر در فنوتیپ اپی­تلیالی مثل E-کادهرین توسط miRNAهای فعال کننده­ی EMT همچون miR-9 انجام می­گیرد (42و59). خانواده­ی miR-103/107 با هدف­ قرار دادن فاکتور پیش­برنده­ی بیوژنز miRNAها به­نام Dicer باعث تضعیف بیوژنز خانواده­ی miR-200 و القای فرآیند EMT در سلول­های سرطان پستان می­شود. مطالعات، بیش­تنظیمی دو مورد رایج از miRNAهای القا کننده­ی EMT به­نام­های miR-22 و miR-100 را به­طور همزمان با بیان بسیار کاهش­یافته­ی اعضای خانواده­ی miR-200 نشان داده­اند.  miR-22با هدف­گیری خانواده­ی TET دی­اکسیژناز متیل_سیتوزین منجر به افزایش متیلاسیون در ناحیه­ی پروموتر ژن­های miR-200  و بیان کاهش­یافته­ی آن­ها می­شود (59). miRNAها همچنین می­توانند از طریق مسیرهای پیام­رسانی شبکه­ی تنظیمی EMT را کنترل نمایند. یکی از این مسیرها می­تواند مسیر Wnt باشد. بیش­بیان miR-27  منجر به افزایش بیان فاکتورهای ویمنتین، Slug، ZEB1 و ZEB2 و بیان پایین E-کادهرین می­شود. همچنین با اثر بر فاکتور APC، پیشرفت مسیر پیام­رسانی Wnt و القای EMT را تسهیل می­کند (58). فاکتور TGF-β باعث ­تنظیم کاهشی اعضای خانواده­ی miR-200 و تقویت سطوح mRNAی ZEB1 و ZEB2 می­شود. TGF-β همچنین از طریق تنظیم بیان miRNAهای ویژه­ای مثل miR-182 که در مهار مستقیم یک تنظیم­گر منفی NF-κB به­نام CYLD نقش دارد، منجر به فعال شدن مسیر NF-κB درون سلولی و القای EMT می­گردد (42). یک مطالعه بر روی سلول­های سرطان پستان نشان داد که تعویض CD44 از فرم V به فرم S باعث کسب فنوتیپ EMT و پیشرفت سرطان می­شود. CD44s بعد از القای EMT وساطت شده با فاکتورهای Twist و TGF-β باعث افزایش بقای سلول­ها از طریق افزایش دادن فعالیت AKT می­شود. همچنین CD44s از طریق آبشار CD44s-miR-200c-ZEB1 باعث مهار کردن miR-200c و القای EMT می­شود (53). باوجود مطالعات گسترده بر روی نقش و عملکرد miRNAها در پیشرفت فرآیند EMT و نیز کسب ویژگی­های CSC در سرطان­های مختلف، تحقیقات بیشتری نیاز است تا به­وجود شبکههای تنظیمی پیچیده­ی درگیر در فرآیند EMT از طریق شناسایی فاکتورهای دیگر و عملکرد شناخته شده­ی آن­ها پی برد.

4) تغییرات در چرخه­ی سلولی طی فرآیند EMT :

چرخه­ی سلولی مجموعه­ای از وقایع می­باشد که در آن­ها ترکیبات سلولی، به­طور دقیقی  بین سلول­های دختری تقسیم شده و می­تواند توسط فعالیت­های نوسان­کننده­ی کینازهای وابسته به سیکلین(CDKs) و کمک فعال­کننده­های آن­ها کنترل شود (60) (شکل6).

شکل6. چرخه­ی سلولی. فازهای مختلف چرخه­ی سلولی توسط کینازها و سیکلین­های مختلف تنظیم می­شود. فاکتورهای پیش­برنده­ی EMT می­توانند با اثر بر عوامل تنظیم کننده­ی چرخه­ی سلولی باعث گسترش سرطان شوند.

   تغییر در بیان و ناهنجاری­های مولکولی پروتئین­های تنظیم­کننده­ی چرخه­ی سلولی مثل CDKs، سیکلین­ها، مهارکننده­های CDKs (CDKIs)، pRB، P53 و E2F در اثر عملکرد فاکتورهای اصلی درگیر در فرآیند EMT، فاکتورهای مولکولی مرتبط با نشانگرهای EMT و نیز مسیرهای مولکولی مختلف درون سلول، نقش اساسی در شروع و پیشرفت سرطان بازی می­کند (61).

miRNAها توانایی مهار کردن مرگ سلولی و پیشبرد تکثیر سلول­ها را به­وسیله­ی اثرات متقابل با ترکیبات چرخه­ی سلولی دارا می­باشند. خوشه­ی miR-17-92 از طریق هدف­گیری فاکتور E2F1 و Cyclin D1 بر چرخه­ی سلولی اثر گذارده و در همکاری با انکوژن c-Myc از مرگ سلولی CSCها جلوگیری می­کند (62). این خوشه­ی miRNA زمان­بندی پیشرفت چرخه­ی سلولی را از طریق تنظیم بیان فاکتورهای BMI1، PTEN، RBL2 و P21 تنظیم می­نماید (61). یک خانواده­ی miRNA شامل miR-34a، miR-34b و miR-34c در رابطه با پیشرفت چرخه­ی سلولی به­خوبی مطالعه شده و تنظیم کاهشی آن­ها در چندین نوع سلول سرطانی شامل آدنوکارسینومای ریه، سرطان کلون و کارسینومای هپاتوسلولار مشاهده شده است 61و63). miR-34a  باعث القای توقف چرخه­ی سلولی در محدوده­ی G1/S و پیری سلول می­گردد. این miRNA از طریق تنظیم نمودن CDK6، Cyclin D1 و E2F  بر پیشرفت چرخه­ی سلولی در سلول­های سرطان کلون اثر منفی می­گذارد. بیش­­بیانی خانواده­ی miR-34a ممکن است باعث تجمع درصدی از سلول­ها در محدوده­ی G0/G1 و کاهش جمعیت سلول­ها در فاز S شود (61){Michelle M. J. Mens, 2018 #66;Engkvist, 2017 #68;Michelle M. J. Mens, 2018 #66}. از جمله­ی دیگر فاکتورهای مولکولی درگیر در تنظیم چرخه­ی سلولی در سرطان­ها می­توان به فاکتورهای اصلی پیش­برنده­ی فرآیند EMT شامل Snail1 و Snail2 اشاره کرد. نوسانات میزان بیان این فاکتورها و اثر تنظیمی آن­ها بر چرخه­ی سلولی  به تاثیر متفاوت آن­ها در فازهای مختلف چرخه­ی سلولی بر اساس نوع سلول سرطانی منجر خواهد شد. در یک مطالعه­، Mittal و همکاران نشان دادند که ارتباط مثبتی بین فاکتور Slug و Cyclin D1وجود داشته و تنظیم کاهشی آن باعث مهار بیان Cyclin D1 و توقف چرخه­ی سلولی در فاز G1 می­شود. از سویی دیگر، در یک مطالعه توسط Liu و همکاران بر روی سرطان پروستات اثر منفی Slug بر روی بیان Cyclin D1 نشان داده شد. به­طوری که بیان فاکتور Slug منجر به مهار بیان Cyclin D1 و توقف چرخه­ی سلولی در محدوده­ی G0/G1 گردید (64). مطالعه بر روی سلول­های کارسینومای نازوفارنکس(NPC) به­وجود فاکتور تنظیم­کننده­ی دیگری در طی فرآیند EMT به­نام FEZF1-AS1  اشاره کرد که به­عنوان یک LncRNAی عامل انکوژن و تومورزایی در سرطان NPC مطرح شده است. فاکتور FEZF1-AS1 باعث فعال شدن مسیر پیام­رسانی Wnt/β-Catenin شده و افزایش تجمع β-Catenin هسته­ای در اثر بیش بیان این فاکتور منجر به تنظیم بیان نشانگرهای فرآیند EMT می­شود. همچنین، کاهش بیان فاکتور E-کادهرین و افزایش بیان فاکتورهای N-کادهرین و ویمنتین در سلول­های سرطانی در اثر عملکرد فاکتور مذکور دیده شده است. بیش بیان فاکتور FEZF1-AS1 قادر به پیشبرد تکثیر سلول­های سرطانی از طریق کاهش بیان P21  و افزایش بیان Cyclin D1 بوده و در غیاب این فاکتور، اثر متضادی بر بیان فاکتورهای مذکور اعمال و منجر به توقف چرخه­ی سلولی در محدوده­ی G0/G1 می­شود (65). فاکتور دیگری تحت­عنوان FLASH  به­عنوان تنظیم­کننده­ی EMT و چرخه­ی سلولی در سرطان­ها شناسایی شده که اثر خود را از طریق مهار بیان ژن E-کادهرین به­واسطه­ی کنترل پس از رونویسی ZEB1 اعمال می­کند. در نبود FLASH، یوبی کوئیتیناسیون ZEB1 توسط فاکتورهای SIAH1 و FBXO45 باعث تخریب پروتئازومی آن و افزایش بیان E-کادهرین و بازگشت فرآیند EMT می­شود. همچنین، نبود این فاکتور به توقف    چرخه­ی سلولی در فاز S و ممانعت از پیشرفت آن منجر می­شود. مطالعات نشان می­دهد که این توقف در چرخه­ی سلولی نمی­تواند تنظیم ZEB1 و E-کادهرین مرتبط با FLASH را میانجی­گری نماید. در واقع تنظیم بیان ZEB1/ E-کادهرین      به­واسطه­ی FLASH مستقل از عملکرد فاکتور FLASH در پیشرفت چرخه­ی سلولی است. عملکرد این فاکتور در پیشرفت چرخه­ی سلولی از طریق اثر مثبت بر بیان ژن­های هیستونی می­باشد (66).

یوبی­کوئیتیناسیون پروتئین­ها به­عنوان یک تغییر پس از ترجمه­ای، و عامل اساسی در هومئوستازی سلولی نقش بازی  می­کند. در این فرآیند یوبی­کوئیتین لیگازهای E3 درگیر هستند که از جمله­ی آن­ها می­توان به خانواده­ی پروتئین­های TRIM اشاره کرد. بد ­تنظیمی این پروتئین­ها باعث اختلال در فرآیندهای سلولی مختلف مثل چرخه­ی سلولی و ایجاد سرطان­ها       می­شود (60). بیان و مکان­یابی پروتئین­های TRIM در طی چرخه­ی سلولی به پیشرفت و تغییر فازهای مختلف آن بستگی دارد. این پروتئین­ها می­توانند به­عنوان انکوژن­ها یا ژن­های سرکوبگر تومور باعث کنترل تکثیر سلولی و میتوز شوند. TRIM59 یکی از اعضای خانواده­ی یوبی­کوئیتین لیگاز E3، نقش خود را از طریق فعال­سازی مسیر پیام­رسانی ERK-MAPK بر روی القای فرآیند EMT در سلول­های سرطانی ریه و نیز فاکتورهای تنظیمی چرخه­ی سلولی مثل CDK6 اعمال می­کند و به­عنوان   پیش­برنده­ی اصلی پیشرفت سرطان محسوب می­شود (67). بیش­بیان TRIM44، کد کننده­ی پروتئین دیگر مسیر          یوبی­کوئیتیناسیون، به­عنوان فاکتور مهمی در فرآیند سرطان­زایی و پیشرفت بدخیمی­های انسانی مطرح شده است. این فاکتور پروتئینی از طریق تسهیل انتقال فاز G1/S و بیش­تنظیمی سیکلین­ها و CDKs باعث پیشبرد چرخه­ی سلولی و تکثیر     سلول­های سرطانی ریه می­شود (68). از جمله­ی فرآیندهای مولکولی درون سلول که در القای فرآیند  EMTو پیشرفت    چرخه­ی سلولی دخیل است، فرآیند بیوژنز ریبوزوم  می­باشد. این فرآیند در یک روش وابسته به چرخه­ی سلولی تنظیم شده است و به­طور ویژه­ای با رشد و تقسیم سلولی مرتبط است. بیش­تنظیمی این فرآیند طی توقف G1/S اتفاق می­افتد. القای رونویسی rDNA با انعطاف­پذیری سلولی، از بین رفتن تمایز سلول­ها و حالت بنیادی مرتبط می­باشد. تقریبا نیمی از اپران­های rDNA در سلول­های تمایز یافته توسط کمپلکس بازآرایی مجدد کروماتین (N-COR) خاموش شده­اند و مطالعات، تغییراتی در رونویسی rDNA را همراه با از بین رفتن تمایز یا EMT نشان می­دهند. رونویسی rDNA، به­عنوان مرحله­ی شروع کننده در بیوژنز ریبوزوم­ها با افزایش سنتز پروتئین­های موافق با رشد و تقسیم سلولی مرتبط است. با شروع فعالیت رونویسی، جدا شدن N-CoR از rDNA، فاکتورهایی مثل RNA پلی­مرازI (POLI)، UBF، Snail1 و کمپلکس mTORC2 (عامل پیش برنده­ی EMT) را به خدمت گرفته که درنهایت منجر به مهار بیان Cyclin D1 و نشانگرهای اپی­تلیالی و نیز افزایش بیان فاکتورهای فنوتیپ مزانشیمی می­گردد (69). در سلول­های یوکاریوتی طبیعی تنظیم منفی بیان فاکتور ZEB1 توسط کمپلکس مهار کننده­ی Rb1/E2F1-HDAC1 از طریق اتصال مستقیم به پروموتر آن صورت می­گیرد. بنابراین،  سلول­های سرطانی Rb-/- و E2F1-/- طی فرآیند EMT سطح بالایی از ZEB1 را بیان می­کنند. در سلول­های دارای بیان بالای ZEB1، بیان افزایش یافته­ی GADD456 مشاهده شده است که نقش ضروری در تنظیم چرخه­ی سلولی، پیری سلول و آپوپتوزیس بازی می­کند و به مهار فعالیت کینازی کمپلکس CDK1/Cyclin B1 (دخیل در پیشرفت چرخه­ی سلولی از فاز G2 به M ) منجر می­شود (70).

فرآیند EMT می­تواند باعث القای تغییرات مکانیکی سلولی در قشر اکتینی سلول­های سرطانی طی مرحله­ی میتوز شود.  سلول­های جانوری برای میتوز موفق، نیاز به کسب حالت کروی برای فرآهم نمودن فضای لازم جهت تشکیل دوک میتوزی دارند که به­واسطه­ی از بین بردن شکل نرمال سلول­های بافت اطراف از طریق انقباض اکتومیوزین غشایی خود و نیز سلول­های مجاور حاصل می­شود. در مقابل، سلول­های سرطانی به­دلیل محیط چالش بر انگیز خود که دارای جمعیت پر سلولی در حال افزایش می­باشند، توانایی گرد شدن در مرحله­ی میتوز را دارند. مطالعات نشان می­دهند که رخداد EMT از طریق افزایش نیروهای لازم جهت گرد شدن میتوزی در کسب حالت کروی و بهبود  توانایی سلول­های سرطانی برای تقسیم سلولی در محیط محدود شده­ی یک تومور کمک می­کند. باوجود فشارهای مکانیکی خارجی در اطراف سلول در حال تقسیم در محیط تومور، قشر اکتینی سلول سرطانی برخی سازگاری­های انکوژنی را جهت کسب حالت کروی و پیشرفت تومور از خود نشان می­دهد. در سلول­های سرطانی موجود در بستر اپی­تلیالی افزایش فعالیت فاکتور RhoA و فعالیت پایین Rac1 اتفاق می­افتد. طی EMT، تغییرات مکانیکی قشر سلولی رخ می­دهند؛ به­طوری­که فاکتور انکوژنی Ect2 توسط فاکتور RhoA فعال شده و باعث افزایش در Rac1 طی اینترفاز می­گردد. افزایش ترکیبی فاکتورهای LimK1 و Arp2/3 در پایین­دست Rac1 باعث کاهش در سفت شدن و منقبض شدن قشر سلولی سلول در حال تقسیم و نیز سلول­های مجاور خواهد شد که از طریق کاهش مقاومت مکانیکی  سلول­های اینترفازی مجاور شروع گرد شدن میتوزی را تسهیل می­نماید. طی میتوز کاهش قابل توجه در بیان فاکتور RhoA باعث افزایش سفت شدن و منقبض شدن قشر سلولی و افزایش مقاومت آن در برابر فشارهای خارج سلولی خواهد شد (71)(شکل7). مطالعات بر روی سلول­های اپی­تلیالی دروزوفیلا پیشنهاد می­کند که فرآیند مرگ سلولی یا آپوپتوزیس و   جهت­یابی دوک میتوزی می­توانند به­عنوان مکانیسم­های مهارکننده­ی تومور عمل نمایند. اما، این احتمال وجود دارد که  جهت­یابی نامناسب دوک میتوزی بتواند به­عنوان عامل مسبب تومورزایی به­حساب آید. مطالعه بر روی سلول­های اپی­کاردیوم موش حاکی از نقش فرآیند EMT در القای جابه­جایی جهت­یابی دوک میتوزی از حالت افقی به حالت عمودی می­باشد. همچنین، مطالعه بر روی اپی­تلیوم صفحه­ی بال دروزوفیلا، جهت­یابی نامناسب دوک میتوزی را در ایجاد سلول­هایی با فنوتیپ مزانشیمی نشان داده که این سلول­ها با تولید و ترشح سیتوکاین­های میتوژنی باعث بیش­تکثیری اپی­تلیوم و ایجاد تومورهای بدخیم می­شوند (72).

شکل7. اثر EMT بر گرد شدن میتوزی. تغییرات مکانیکی قشر سلولی در بستر اپی­تلیالی سلول­های سرطانی طی EMT، باعث تغییر فعالیت فاکتورهای درون سلولی مختلف، ارتباطات بین­سلولی مجاور و تسهیل تقسیم سلول­های توموری و گسترش آن­ها می­شود.  

5) ناپایداری ژنومی طی فرآیند EMT :

ناپایداری ژنومی سلول­ها به­عنوان عامل پیش­نیاز پیشرفت سرطان محسوب شده (73و74) و تغییر در تمامیت ژنوم از طریق تجمع جهش­ها باعث کسب فنوتیپ سرطانی سلول­ها می­گردد (75). در بیشتر سرطان­های توارثی، ناپایداری ژنومی از طریق غیر فعال شدن ژن­های ترمیم آسیب DNA مثل BRCA1، BRCA2، TP53 و ژن­های شرکت­کننده در ترمیم DNA مثل ATM و ATR حاصل می­شود (76). همچنین، مطالعات حاکی از رخداد ناپایداری ژنومی از طریق فاکتورهای درگیر در EMT هستند؛ وجود سیتوکاین­هایی در ریز­محیط تومور مثل TGF-β که توسط سلول­های توموری و سلول­های استرومایی      احاطه­کننده­ی آن­ها ترشح می­شود،  قادر به تحریک ناپایداری ژنومی می­باشند. فاکتور TGF-β اثرات متناقضی را از طریق فعال کردن پیام­رسانی ضد تکثیری سلول­ها و یا از طریق بهره­مند کردن آن­ها از ویژگی­های پیش­انکوژنی روی سرطان­ها اعمال می­کند (77). TGF-β از طریق تولید آسیب DNA القا شده با فشار اکسیداتیو در سلول­های جهش­یافته در ژن RUNX3 توان ایجاد ناپایداری ژنومی را دارد. خانواده­ی پروتئین­های RUNX دارای سه فاکتور رونویسی هترودایمر RUNX1، RUNX2 و RUNX3 می­باشدکه RUNX1 و RUNX3 در سلول­های سرطانی به­وسیله­ی جهش و یا بد تنظیمی­های اپی­ژنتیکی غیرفعال شده­اند و این یافته­ها بر نقش آن­ها به­عنوان سرکوب­کننده­های ضروری تومور تأکید می­کند. RUNX3 نقش اصلی خود را در پیشبرد سرطان در همکاری با فاکتور TGF-β ایفا می­کند و فاکتور TGF-β در سلول­های سالم از نظر ژن RUNX3 منجر به القای EMT از طریق تولید گونه­های واکنشگر اکسیژن (ROS) می­شود.  از سوی دیگر، RUNX3 با تنظیم افزایشی رونویسی HMOX1، تجمع زیاد ROS را کاهش می­دهد. در چنین شرایطی سطوح پایین آسیب DNA و ناپایداری ژنومی دیده شده و پیشرفت تومور کاهش می­یابد. اما، در سلول­های دارای نقص در ژن RUNX3، تنظیم کاهشی رونویسی HMOX1 و افزایش تجمع ROS، درنهایت به افزایش آسیب DNA از طریق فشار اکسیداتیو و تحریک پیشرفت تومور منجر می­گردد (78) (شکل8).

   همچنین در مطالعه­ای مشخص شد که فاکتور TGF-β می­تواند از طریق القای ناهنجاری­های میتوزی در سلول­هایی که متحملEMT شده بودند، به­راه اندازی آنیوپلوئیدی­ها و ناپایداری ژنومی را منجر شود (79) و ظهور نقایص میتوزی و القای ناپایداری ژنومی نیازمند تکثیر مداوم سلول­های متحمل EMT است. فاکتور TGF-β به­عنوان یکی از پیشبرنده­های فرآیند EMT نقش خود را در القای ناپایداری ژنومی ایفا می­کند. این فاکتور همراه با Snail1 باعث مهار پروتئین­های پوشش هسته­ای و کمپلکس منفذ هسته­ای می­شود؛ پروتئین­هایی که در هماهنگ و موزون کردن پیشرفت میتوز، کنترل نقاط بررسی فعالیت دوک میتوزی، تجمع آن­ها و حفظ عملکرد پوشش هسته­ای نقش اساسی ایفا می­کنند.

شکل8:  اثر RUNX3 بر پیشرفت EMT و سرطان. آسیب DNA در اثر فشار اکسیداتیو ایجاد شده با TGF-β باعث شروع فرآیندهای مولکولی پیش­برنده­ی EMT می­شود. نبود فاکتور عملکردی RUNX3 منجر به افزایش آسیب DNA و گسترش سرطان می­شود. 

به­طور ویژه، مهار شدن لامین β1 توسط فاکتورهای TGF-β و Snail1 باعث اختلال در فرآیند سیتوکینز، تجمع دوک میتوزی و فشردگی کروماتین می­گردد. ناکارآمد بودن لامین β1 منجر به برآمدگی غشای هسته­ای و شکست سیتوکینز و ایجاد سلول­های دو هسته­ای می­شود. مهار پروتئین­های پوشش هسته­ای باعث تضعیف آن و کاهش مقاومت آن در برابر فشار مکانیکی اعمال شده بر روی هسته طی فرآیند EMT خواهد شد که به­هم ریختن شکل ساختار هسته­ای باعث تراوش نوکلئوپلاسم به درون فضای سیتوپلاسمی طی اینترفاز می­شود. از سویی، فرو ریختن  پوشش هسته­ای منجر به تنظیم نامناسب مکان­یابی پروتئین­های هسته­ای و سیتوپلاسمی و به دام افتادن اندامک­های سیتوپلاسمی در هسته می­گردد. همچنین، DNA سلول در معرض اثرات آسیب­رسان سیتوپلاسم قرار گرفته که منجر به آسیب سنگین به DNA و قطعه قطعه شدن آن خواهد شد. در واقع، تهاجم سلولی می­تواند باعث از هم­گسیختن پوشش هسته و از بین رفتن بخش­بندی درون سلول گردد.  همچنین، عواقب جبران­ناپذیر آسیب­های DNA و تحریک ناپایداری­های القا شده با جهش­ها به از بین رفتن یکپارچگی ژنوم منجر می­شود (80). علاوه­بر فاکتورهای رونویسی دخیل در EMT، مکانیسم­های ترمیم آسیب DNA نیز در ایجاد ناپایداری­های ژنومی نقش دارند. فاکتوری تحت­­عنوان SIM2S از طریق فعالیت وابسته به ATM باعث بیش­تنظیمی نوترکیبی هومولوگ (HR) و جلوگیری از فرآیند EMT می­شود. طی آسیب DNA،  باقی­مانده­ی آمینواسیدی S115  این فاکتور از طریق میانکنش با ATM فسفریله شده و در همکاری با BRCA1، RAD51 را به جایگاه آسیب فرا می­خواند. جهش در جایگاه S115 از ژن SIM2S باعث کاهش عملکرد پروتئین حاصل از آن در نوترکیبی هومولوگ، از طریق شکست به ­خدمت­گیری RAD51 خواهد شد. EMT القا شده با جهش S115 با کاهش در E-کادهرین مشخص شده و باعث تهاجم و متاستاز افزایش یافته می­شود (74). مطالعات نشان می­دهند که ناپایداری ژنومی همزمان با سایر نقص­های ژنی مثل K-Ras به­عنوان مرحله­ی کلیدی در تومورزایی به­حساب می­آید. فاکتور K-Ras     می­تواند از طریق استفاده­ی نامناسب و غیرمعمول از روش­های ترمیم DNA شامل ترمیم اتصال بد (MMR)، HR و NHEJ باعث ایجاد ناپایداری ژنومی شود. فرآیند ترمیم MMR ناقص می­تواند به­عنوان عامل جهش­های فعال­کننده­ی K-Ras نقش ایفا کند. EGFR از طریق فسفریله­کردن PCNA و مهار کردن آن باعث مهار ترمیم MMR شده و در­نهایت منجر به افزایش  جهش­ها در ژن K-Ras خواهد شد. فاکتور K-Ras از طریق القا کردن ترکیبات درگیر در روش ترمیم NHEJ مثل DNA لیگاز 3α، پلی ADP-ریبوز پلی­مراز1 و XRCC4 باعث پیشبرد مسیر مستعد به خطای NHEJ و القای ناپایداری ژنومی طی میتوز خواهد شد. این یافته­ها نشان می­دهند که سلول­ها باوجود دارا بودن مکانیسم­های ترمیم DNA، ممکن است از طریق نقایص در روش­های ترمیم DNA دچار ناپایداری ژنومی شوند (75). علاوه­بر فاکتورهای رونویسی و عوامل درگیر در مکانیسم­های ترمیم DNA، یکپارچگی ژنوم همچنین به­ اجرای مناسب چرخه­ی سلولی وابسته است. این یکپارچگی می­تواند از طریق مسیرهای انتقال دهنده­ی پیام­های مکانیکی اطراف تومور دچار تغییر شود. فاکتور TGF-β به­عنوان یکی از مهم­ترین سیتوکاین­های ترشح شده از ریز­محیط تومور، از طریق بیان کردن پروتئین تشکیل دهنده­ی فیلامنت یا Septin-6 به­واسطه­ی فاکتور رونویسی Snail1 باعث افزایش پایداری و ماندگاری جسم میانه در طی فرآیند میتوز و چند هسته­ای شدن سلول­ها می­شود.     فیلامنت­های Septin شامل Septin2، Septin6 و Septin7 به اتصال حلقه­ی قابل انقباض اکتومیوزین به غشای پلاسمایی سلول کمک کرده و مانع از اشتباهات میتوزی، آنیوپلوئیدی و چند هسته­ای شدن سلول­ها می­شوند. عملکرد این فاکتورها بسیار مرتبط با هم بوده و نقص در یکی از آن­ها، می­تواند منجر به از دست دادن عملکرد و کارآیی مناسب بقیه شود (81). 

• بحث

 امروزه، دیدگاه­های بسیاری در مورد ارتباطات بین EMT و CSCs گسترش یافته است. نقش فاکتورهای رونویسی مختلف در پیشبرد EMT و القای فنوتیپ CSC طی مطالعات زیادی مشخص شده است. این فاکتورها در فرآیندهای درون سلولی مختلفی شرکت کرده و منجر به القای EMT می­شوند. همچنین، ارتباطات پیچیده­ای بین فاکتورهای مختلف و عملکردهای ترکیبی آن­ها دیده می­شود. مطالعات روی فاکتورهای منحصر به فرد فرآیندهای سلولی  و مولکولی ویژه­ی EMT می­تواند فهم دقیق مکانیسم­های پیش­برنده­ی سرطان را آشکار کند. همچنین، درمان­های هدف­دهی کننده­ی CSCs در خلال مکانیسم­های ویژه­ی اجرائی آن­ها جهت متاستاز و پیشرفت سرطان نیازمند مطالعات گسترده بر روی بسیاری از عوامل پیش­برنده­ی مرتبط و ارتباطات مولکولی بین آن­ها می­باشد. اگرچه تعدادی از مطالعات روی گونه­های جانوری برخی از تغییرات سلولی و مولکولی ویژه­ای را طی EMT نشان داده است، با این­حال، مطالعات روی رده­ی سلول­های انسانی جهت آشکار ساختن دقیق          مکانیسم­های اجرائی گسترش سرطان مورد نیاز است.

• نتیجه­گیری

    سرطان به­عنوان یکی از بیماری­های ژنتیکی رایج، نتیجه­ی مکانیسم­های پیش­برنده­ی پیچیده­ای در درون سلول می­باشد. باوجود مطالعات مختلف در زمینه­ی تغییرات سلولی و مولکولی دخیل در مراحل مختلف پیشرفت بیماری، شکاف­های علمی زیادی در فهم دقیق انواع مکانیسم­های پیش­برنده­ی سرطان به­چشم می­خورد. تلاش در جهت رسیدن به مسیرهای انتقال پیام در سرطان و پی بردن به ارتباطات پیچیده­ی سلولی و مولکولی می­تواند امکان طبقه­بندی تومورها را براساس معیارهای مختلف مثل مکانیسم­های نوظهور درون­سلولی سرطانی تسهیل کرده و درمان­های مبتنی بر هدف­گیری عوامل اصلی پیش­برنده­ی سرطان را تقویت نماید. بنابراین، درک بیشتر چنین مکانیسم­هایی علاوه بر غنی­سازی دانش ما از روند پیشرفت سرطان و روشن ساختن مبانی اصلی مرتبط با آن، از الزامات اصلی بهبود و توسعه­ی روش­های تشخیصی، پیش­آگهی و درمانی جهت مدیریت سرطان به شمار می­رود.

• تشکر و قدردانی

 نویسندگان این مقاله از تمامی پژوهشگران حیطه­ی سرطان که راه را برای مدیریت و درمان این بیماری هموار می­نمایند تشکر و قدردانی می­کنند.