نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 استاد زیست‌شناسی سلولی تکوینی،گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
2 دانشجو کارشناسی ارشد سلولی مولکولی، گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
3 دکتری تخصصی زیست‌شناسی تکوین جانوری، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
چکیده
هدف: در مطالعه حاضر اثرات عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر القای تمایز سلول‌های بنیادی مزانشمی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار بهسمت استئوبلاست بررسی شد. مواد و روش‌ها: در این مطالعه سلول‌های بنیادی مشتق از بافت رت نر نژاد ویستار جدا شد و برای تایید بنیادی بودن مارکرهای سطحی بهروش فلوسایتومتری انجام شد و سلول‌های بنیادی با غلظت‌های 10، 20 ، 40 و 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان تیمار شدند. سمیت سلول عصاره مذکور بهروش MTT و اثرات تمایزی آن با رنگ‌آمیزی الیزارین قرمز، سنجش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و سنجش میزان رسوب کلسیم بررسی شد. نتایج با استفاده از آزمون واریانس یکطرفه در سطح معنی‌داری 05/0p< بررسی شد. نتایج: مارکرها بنیادی شامل CD105،CD44، CD73 در این سلول‌ها بیان مثبت داشتند، و نسبت به مارکرهای سطحی CD45 وCD34 بیان منفی داشتند. نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد غلظت‌های کمتر از 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر اثرات سمی قابل توجهی بر سلول‌ها ندارند. فعالیت آلکالین فسفاتازی بالاتر در گروه تیمار نسبت به گروه کنترل در روز 10 مشاهده شد. نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز و سنجش میزان کلسیم در مدت21 روز نشان داد که این عصاره بهصورت وابسته به غلظت منجر به تمایز سلول‌های بنیادی به استئوبلاست می‌شد. نتیجهگیری: یافته‌های این پژوهش نشان داد سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار تیمارشده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان در مسیر تمایز به استئوبلاست وارد می‌شوند.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of differentiation of hydroalcoholic extract of berberis integrrima root on mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats
نویسندگان [English]
- M Nabiuni 1
- M Ghasemi Nazarabadi 2
- T Ramezani Farzin 3
1 Developmental Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
2 Department of Cellular and Molecular, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In the present study, the effects of hydroalcoholic extract of Berberis integrrima root on the induction of differentiation in mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats towards osteoblasts were investigated.
Material and Methods: In this study, stem cells derived from male Wistar rat tissue were isolated and flow cytometry was performed to confirm the surface markers. Stem cells were treated with 10, 20, 40 and 80 μg/ml hydroalcoholic extract of B. integrrima root. The cell toxicity of the extract was evaluated by MTT assay and its differentiated effects was evaluated by alizarin red staining and alkaline phosphatase activity, calcium deposition assay. Results were analyzed using one-way ANOVA at a significance level of P <0.05.
Results: Stem cells markers including CD105, CD44, and CD73 had positive, and CD45 and CD34 had negative expression in these cells. The results of the MTT assay showed Concentrations less than 20 µg/ml do not have significant toxic effects on cells. Higher alkaline phosphatase activity was observed in the treatment group compared to the control group on day 10. The results of Alizarin red staining and measurement of calcium content for 21days showed that this extract in a concentration dependent manner leads to the differentiation of stem cells into osteoblasts.
Conclusion: The findings of this study showed that mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats treated with hydroalcoholic extract of Berberis integrrima root enter osteoblasts in the differentiation pathway.
کلیدواژه‌ها [English]
- Mesenchymal stem cells
- Berberis
- integrrima
- Osteoblast
- Differentiation
- مقدمه
با توجه به عملکردهای متفاوت و چندگانه بافت استخوان در بدن، هر تغییری که بهدنبال آسیب، ضایعه یا بیماری در ساختار آن ایجاد شود، تعادل بدن و زندگی فرد را تحت تاثیر قرار می‌دهد. بهطور معمول بهدنبال ایجاد یک ضایعه، استخوان‌ها دارای توانایی ذاتی ترمیم خودبهخودی هستند. در شکستگی‌ها و آسیب‌های کوچک استخوانی روند درمان توسط بدن انجام می‌گیرد، بهطوریکه بهدنبال یک آسیب استخوانی سلول‌های بنیادی و استرومایی، بههمراه ماکروفاژها و دیگر سلول‌های موجود در بافت استخوان ازجمله استئوبلاستها و استئوکلاستها بهطور هماهنگ فعالیت می‌کنند تا آبشاری از عملکردهای ترمیمی را بهمنظور بهبود آسیب وارده به استخوان پیش ببرند (1). در مورد آسیب‌های وسیع و تخریب‌های ویژه گاهی سیستم ترمیم استخوان بهتنهایی قادر به بازسازی بافت بهطور مناسب نیست در این موارد استفاده از عواملی که به بهبود و ترمیم استخوان کمک می‌کنند ضروری می‌باشد. از جمله سلولهایی که در ترمیم استخوان آسیب دیده نقش ویژهای دارند سلول‌های بنیادی مزانشیمی هستند. که امروز در پروتوکلهای درمانی استفاده از سلول‌های بنیادی برای ترمیم بافت‌های استخوانی مورد توجه قرار گرفته است. دسترسی بهمنبعی مناسب از سلول‌های بنیادی، یک اصل مهم در سلول درمانی است و بافت چربی، منبعی در دسترس از این سلول‌ها می‌باشد، که طبق مطالعات این بافت دارای مزیت‌های متعددی نسبت به سایر منابع استخراج سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌باشد از جمله این مزیت‌ها می‌توان به درصد بالای سلول‌های بنیادی موجود در بافت، توان تکثیری بالا و امکان تامین سلول‌های اتولوگ بهمنظور اهداف درمانی اشاره کرد (2-4). ولی استفاده مستقیم از این سلول‌ها میتواند خطراتی ازجمله ایجاد سرطان داشته باشد. لذا این سلول‌ها همراه با مواد تمایز دهنده برای ترمیم بافتی استفاده می‌شوند (5). یکی از این عوامل تمایز دهنده عصارههای گیاهی هستند، از عصارههای گیاهان بهعنوان داروهای مکمل برای ترمیم استخوان استفاده میشود (6) همچنین تاکنون اثرات عصاره گیاهان مختلف بر تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مورد مطالعه قرار گرفته است. بهعنوان مثال Mahmoudi همکاران اثرات ریشه گیاه باریجه را بر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مطالعه نمودند و گزارش دادن این عصاره قادر بهتمایز استئوژنیک سلول‌های مذکور میباشند (7). درتحقیقیدیگر توسط نشان داده شده که عصاره گیاه گلپر قادر به تمایز استئوژنیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان میباشند (8). گیاه زرشک زرافشان با نام علمی Berberis integerrima نوعی گیاه دارویی با خواص آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی است (9) که در طب سنتی از عصاره ریشه آن برای ترمیم آسیب دیدگیهای استخوانی استفاده میشود (10). عصاره ریشه این گیاه دارای انواع فلاونوئید، بتاکارتن و انواع آلکالوئیدها می‌باشد (10، 11) ولی تاکنون اثرات این گیاه بومی بر تمایز سلول‌های بنیادی بهسمت ردههای استخوانی مورد مطالعه قرار نگرفته است، باتوجه بهوجود گیاهان دارویی در کشور ما همچنین پیشینه غنی استفاده از طب سنتی از یه طرف و افزایش آسیب‌های استخوانی ازجمله پوکی استخوان و تروما در جمعیت رو به سالمندی ایران بررسی علمی بیشتر و دقیقتر گیاهان موثر در تمایز و بهبود استخوان ضروری بهنظر میرسد (12). لذا در این مطالعه اثرات تمایزی عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان (بهعنوان گیاهی که در طب سنتی برای بهبود آسیب‌های استخوانی استفاده میشود) بر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رتهای نژاد ویستار بهسمت ردههای استخوانی بررسی شد.
- مواد و روش‌ها
روش تحقیق: این تحقیق از نوع تجربی آزمایشگاهی در سال 1400 در دانشگاه خوارزمی-مرکز تکثیر و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی انجام شد.
جمعآوری و شناسایی ریشه گیاه زرشک زر افشان: ریشه گیاه زرشک زرافشان Berberis Integerrima در هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد با کد -FUMH 35966 شناسایی شد.
تهیه عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: ریشههای جمعآوری شده با آب مقطر شستوشو و در سایه خشک شدند. سپس ریشه گیاه زرشک زرافشان بهقطعات کوچک خرد شد و با استفاده از آسیاب صنعتی کاملا خرد شد. برای تهیه عصاره هیدروالکلی مقدار50 گرم از ریشه گیاه خرد شده را در 500 میلی‌لیتر متانول 80 درصد (متانول+آب)
(Merck, Germany) مخلوط شد و بهمدت 48 ساعت در دمای محیط قرار داده شد. در نهایت مخلوط حاصل با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شد، با استفاده از دستگاه روتاری تغلیظ شد و در انکوباتور خلا و دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد. محصول بهدست آمده برای استفادههای بعدی در یخچال نگهداری شد.
استخراج سلول بنیادی از بافت چربی رت نر نژاد ویستار و شناسایی آنها با مارکرهای سطحی: سلول‌های بنیادی از چربیهای پشت ران رت نر نژاد ویستار با سن تقریبی 6تا4 هفته با استفاده از روش آنزیمی استخراج شد. سپس سلول‌ها در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. و زمانی که تراکم سلول‌ها به 80 درصد رسید، پاساژ سلولی انجام و سلول‌ها پس از پاساژ سوم جهت کشت مورد استفاده قرار گرفتند. برای تایید بنیادی بودن سلول‌های استخراج شده از آنتیبادیهای CD73، CD 44، CD105، CD90، CD45، CD35 و CD11b ((Abcam,Germany و روش فلوسایتومتری استفاده شد.
بررسی سمیت سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان با استفاده از آزمونMTT : برای ارزیابی میزان سمیت عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی از روش (Sigma,Uk)3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliu bromide (MTT)استفاده شد. بدین منظور سلول‌ها با تعداد 104× 2 در پلیت 96خانه کشت داده شد، پس از گذشت 24 ساعت سلول‌ها با غلظت‌های 5، 10، 20، 40، 60 و 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره بهمدت 72 ساعت تیمار شد. پس از گذشت دوره تیمار مقدار 10 میکرولیتر محیط کشت جدید بهعلاوه 10 میکرولیتر محلول MTT (5 میلیگرم در PBS) بههر چاهک اضافه شد. بعد از 4 ساعت انکوباسیون در37 درجه سانتیگراد محلول روی سلول‌ها بهآهستگی حذف شد و کریستالهای فورمازان ایجاد شده در 100 میکرولیتر Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma,Uk) حل شد. پس از چند دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق و حل شدن کامل کریستالها در جذب 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا (Biotake, US) محاسبه شد. پس از محاسبه درصد زندهمانی با فرمول زیر از غلظت‌های غیرکشنده عصاره ریشه برای تمایز سلول‌های بنیادی بهسمت استخوان استفاده شد. 100 (تعداد کل سلول‌های شمارش شده/تعداد سلول‌های زنده) =درصد زندهمان
بررسی مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‌ها با تعداد 105 عدد در پلیتهای 24 خانه کشت داده شد بعد از گذشت 24 ساعت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلطتهای 10 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر تیمار شدند و نمونهها در روزهای مختلف با میکروسکوپ معکوس (Biomed, Korea) مشاهده و عکسبرداری شدند.
تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیمی با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان برای بررسی تمایز استخوانی: جهت بررسی اثرات تمایزی و آزمونهای الکالین فسفاتاز و آلیزارین رد، سلول‌های بنیادی با تعداد 105 عدد در هر پاهک پلیتهای 24 خانه کشت داده شدند بعد از گذشت 24 ساعت و اطمینان از چسبیدن سلول‌ها به کف پلیت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم برمیلیلیتر تیمار شدند. در طی تمایز استخوانی محیط کشت سلول‌های تیمار شده هر سه روز عوض شدند و مجددا با عصاره تیمار شدند.
سنجش فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‌ها بهمدت 10 روز کشت داده شدند، بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‌ها با استفاده از PBS سرد، از سطح پلیت جدا شدند و بهوسیله تریتون X100 لیز شدند و با استفاده از پیپتاژ، هموژنایز شدند. بعد از تعیین غلظت پروتئین، بااستفاده از کیت سنجش آلکالین فسفاتاز شرکت (Biorexfars, Iran) با روش رنگسنجی فعالیت آلکالین فسفاتازی نمونهها بررسی شد جذب نمونهها در طول موج 405 نانومتر بااستفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر (Biorad, US) قرائت شد و با گروه کنترل مقایسه شد.
بررسی تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بهسلولهای استخوانی با رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز: برای انجام این آزمون سلول‌ها بهمدت 21 روز با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان تیمار شدند، بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‌ها با PBS شستوشو داده شدند و بهمدت 10دقیقه با متانول (Kimia Razi,Iran) تثبیت شد سپس رنگ‌آمیزی با محلول رنگی آلیزارین قرمز(Merck, Germany) بهمدت5 دقیقه صورت گرفت سپس نمونهها با آب مقطر شستوشو داده شدند و با میکروسکوپ معکوس (Biomed, Korea) مشاهده و عکسبرداری شدند.
سنجش میزان کلسیم سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‌ها با تعداد 105 عدد در پلیتهای 24 خانه کشت داده شند بعد از گذشت 24 ساعت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلطتهای 10 و 20 میکرولیتر بهمدت 21 روز تیمار شدند. بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‌ها بعد از 21 روز تیمار با عصاره مورد نظر با استفاده از PBS سرد، از سطح پلیت جدا شدند و بهوسیله تریتون X100لیز شدند و با استفاده از پیپتاژ، هموژنایز شدند. محلول حاصل، با استفاده از کیت سنجش کلسیم (Biorexfars, Iran) و با روش رنگسنجی مورد آزمایش انجام گرفت.
- آنالیز آماری
در همه موارد آزمون ها، سه بار تکرار شد، نمودارها با استفاده از نرمافزار اکسل رسم شد. بررسی تجزیه و تحلیل آماری دادهها بااستفاده از آزمون واریانس یکطرفه One-way ANOVA و آزمون Tukey با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16 انجام شد.
- نتایج
نتایج حاصل از شناسایی مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی
نتایج بررسی فلوسایتومتری مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی بعد از پاساژ سوم نشان داد که مارکرها بنیادی شامل (9/71) CD105، (6/82) CD44، (2/86)CD73 در این سلول‌ها بیان مثبت داشتند، درحالیکه سلول‌های ذکر شده نسبت به مارکرهای سطحی رده هماتوپویتیک شامل (73/0) CD45 و (73/0) CD34 بیان منفی داشتند (شکل 1).
|
|
|
|
|
|
|
شکل 1 نتایج حاصل از بررسی مارکرهای سطحی سلول‌های بنیادی استخراج شده از بافت چربی بااستفاده از روش فلوسایتومتری. این سلول ها برای مارکر CD44،CD73،CD105 مثبت و برای مارکر CD45 وCD34 منفی بود. |
|
نتایج حاصل از بررسی سمیت سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بااستفاده از آزمونMTT
نتایج بررسی سمیت سلولی عصاره زرشک زرافشان بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رتهای نژاد ویستار نشان داد که سمیت عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بهصورت وابسته به غلظت منجر به مهار تکثیر و مرگ سلولی در سلول‌های مذکور میشود. غلظتی که موجب ازبینرفتن نیمی از جمعیت سلول‌ها میشود 40 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود . دوزهای پایینتر از این غلظت 40 میکروگرم بر میلی‌لیتر باعث مهار رشد و دوزهای بالاتر از این غلظت،60 و80 میکروگرم بر میلی‌لیتر موجب مرگ سلول‌ها در ساعات اولیه تیمار می‌شوند (نمودار 1).
|
|
|
نمودار 1 بررسی میزان سمیت سلولی عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در مدت 72 ساعت. این نمودار نشان می‌دهد عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بهصورت وابسته به غلظت منجر به مهار تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی میشود) 01/0**p<، 01/0***P<) |
بررسی مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان
تغییرات مورفولوژی سلول‌های بنیادی تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان تحت تیمار با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر بعد از 21 روز در مقایسه با نمونهها کنترل که تیماری دریافت نکرده است، نشان داد که در روز 7 پس از تیمار جهتگیری سلول‌ها نسبت به گروه کنترل متفاوت شده است و بهنظر میرسد سلول‌ها بهتدریج از حالت دوکی و کشیده خارج می‌شوند. در روز 14و 21 این جهتگیری و تفاوت آرایش فضایی سلول‌ها در نمونه کنترل و تیمار کاملا مشخص است سلول‌ها پهن شده و حالت ستارهای شکل گرفتهاند و بهوضوح از حالت دوکی شکل خارج شدهاند و این تغییرات نشان دهنده تاثیر عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر تمایزسلولهای بنیادی و تغییر مورفولوژی سلول‌ها است (شکل 3).
|
7 روز(B) |
کنترل (A) |
|
21 روز(D) |
14 روز(C) |
|
شکل3 تغییرات مورفولوژی سلول‌های بنیادی تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان. A)) نمونهها کنترل که تیماری دریافت نکرده است، (B)، نمونهها بعد از 7 روز تیمار. C)) و (D) ، نمونهها در روز 14 و 21 بعد از تیمار (بزرگنمایی برابر با x200). |
|
نتایج سنجش کمی آنزیم آلکالین فسفاتاز سلول‌های مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان
نتایج حاصل از اندازهگیری کمی فعالیت آلکالین فسفاتاز در روز 10 نشان داد که میزان فعالیت این آنزیم در گروههای تیمار، درمقایسه با گروه کنترل افزایش یافته است در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز نسبت به کنترل از نظر آماری بیمعنی بود درحالیکه در گروههای تیماری با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز از نظر آماری نسبت به نمونه تیمار نشده معنیدار بود (نمودار 2).
|
|
|
نمودار 2: نتایج حاصل از میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز درسلولهای تیمار شده با دوزهای 10 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر در روز 10 در مقایسه با گروه کنترل (05/0>**p). |
نتایج رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز سلول‌های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان
رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز 21 روز پس از تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی انجام شد. بررسی نتایج رنگ‌آمیزی آلیزارین قرمز نشان داد که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان، قادر به ایجاد تمایز در سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت چربی بهسمت استئوبلاستها می‌باشد. با بالارفتن غلظت عصاره، میزان رسوبگذاری و رنگپذیری نمونه سلولی نیز بیشتر می شود بهعبارتی عصاره مذکور بهصورت وابسته به غلظت باعث تمایز سلول‌های بنیادی تحت تیمار میشود (شکل 4).
|
(C) |
(B) |
(A) |
|
|
|
|
|
شکل 4 رنگ‌آمیزی آلیزارین رد. (A) نمونه کنترل که تحت هیچ تیماری قرار نگرفت. (B) رنگ‌آمیزی نمونه سلولی تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر در مدت زمان 21 روز. (C) رنگ‌آمیزی نمونه سلولی تیمار شده با غلظت 20میکروگرم بر میلی‌لیتر در مدت زمان 21 روز (بزرگنمایی برابر است با X200) |
||
نتایج سنجش کمی میزان رسوب کلسیم درسلولهای مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان
نتایج حاصل از اندازهگیری کمی رسوب کلسیم در روز 21 نشان داد که میزان رسوب کلسیم در گروههای تیمار، درمقایسه با گروه کنترل بهصورت معنیدار و وابسته به غلظت افزایش یافته است (نمودار 3).
|
|
|
نمودار 3 مقایسه میزان رسوب کلسیم در سلول‌های تیمار شده با غلظت 10 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان در روز 21 (05/0>*P، 001/0 ***P<). |
- بحث
در این پژوهش تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه زرشک زرافشان با نام علمیBerberis Integerrima برای القای تمایز استئوبلاستی در سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا سلول‌های بنیادی با روش آنزیمی استخراج شدند، سپس برای شناسایی و تایید بنیادی بودن سلول‌های استخراج شده از روش فلوسایتومتری استفاده شد و مارکر CD44،CD73 ، CD105 مثبت و برای مارکر CD45 و CD34 منفی بود. همچنین درسایر مطالعات پیشین نیز (12، 13) سلول‌های بنیادی چربی را با روش روش آنزیمی جدا کردند و با استفاده از مارکرهای سطحی بنیادی بودن آنها را اثبات نمودند. در ادامه پژوهش از عصاره ریشه زرشک زرافشان برای تمایز سلول‌های بنیادی استخراج شده استفاده شد. برای القای تمایز در سلول‌های بنیادی باید از غلظت‌های غیرکشنده عصاره استفاده نمود لذا لازم بود ابتدا سمیت عصاره ریشه زرشک زرافشان بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی بررسی شود (14). بنابراین میزان سمیت عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی با روش آزمون MTT بررسی شد. آزمون سمیت سلولی MTT یک آزمون رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستالهای زرد تترازولیوم بهوسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل بلورهای بنفش رنگ نامحلول انجام میشود (15، 16). نتایج این آزمون نشان داد عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک در غلظت40 میکروگرم بر میلی‌لیتر، منجر به مهار تکثیر سلول‌های بنیادی می‌شد، در این رابطهRamezani و همکاران (17) در مطالعهای اثر عصاره آبی زعفران را بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مطالعه نمودند، این گروه غلظت مناسب برای ایجاد تمایز در سلول‌های مذکور را با روش MTT مشخص نمودند، و از غلظت‌های کمتر از غلظت کشنده برای القای تمایز در سلول‌های بنیادی مزانشیمی استفاده نمودند که در مطالعه حاضر نیز با روش MTT غلظت‌های غیرکشنده تعیین و برای ایجاد تمایز استفاده شد. بعد از تیمار سلول‌ها با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان و القای تمایز لازم است با روشهایی تمایز تغییرات سلول‌ها بررسی شد از اینرو در این پژوهش از آزمون سنجش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز برای بررسی تمایز استئوسیتی استفاده شد. مطالعات نشان داده است که سطح فعالیت این آنزیم در زمان تمایز سلول‌های بنیادی به استخوان‌ها افزایش می یابد (18-20). سطوح فعالیت این آنزیم توسط سوبسترای پارانیتروفنیل فسفات در2حالت سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته و سلول‌های تمایز یافته مورد بررسی قرار گرفت (21) .سنجش این آنزیم در نمونهها نشان داد فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروههای تیمار شده با عصاره گیاه زرشک زر افشان نسبت به گروه کنترل بهصورت وابسته به غلظت افزایش یافت. بنابراین طبق مطالعات پیشین و پژوهش انجام شده تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های استئوبلاست با افزایش آنزیم الکالین فسفاتازی پس از گذشت 10 روز همراه است. Masoum و همکاران (23) نیز از آزمون آلکالین فسفاتاز برای اثبات تمایز استئوژنیک در سلول‌های بنیادی مشتق از پالپ دندان شیری استفاده نمودند این گروه نشان داد، تمایز استئوژنیک منجر به افزایش فعالیت آنزیم مذکور می‌شد. همچنین جهت بررسی تمایز سلول‌های بنیادی تحت تیمار با عصاره زرشک زرافشان به سلول‌های استئوبلاست از رنگ‌آمیزی الیزارین قرمز و کیت سنجش کلسیم استفاده شد. رنگ‌آمیزی آلیزارین رد برای تعیین رسوبات کلسیم در بافت ها و سلول‌ها استفاده میشود (25-26). نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و سنجش مقدار کلسیم نمونهها نشان داد که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بهصورت وابسته به غلظت قادر به رسوب کلسیم و القای تمایز سلول‌های بنیادی بهسلولهای استئوبلاست می‌باشد. در این زمینه Zhang و همکاران (27) اثرات بربرین را بر تمایز استخوانی سلول‌های بنیادی مشتق از مغز استخوان بررسی نمودند، نتایج این مطالعه نشان داد که بربرین باعث افزایش بیان ژنهای استخوانساز در این سلول‌ها نسبت به گروه کنترل می‌شوند. Lee و همکاران (28) اثرات بربرین را بر استئوبلاستهای جدا شده بررسی نمودند نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از آن بود که بربرین بهصورت موثر باعث افزایش فعالیت استخوانسازی در استئو بلاستها می‌شوند. در سال 2021 نیز در مطالعاتی اثرات استئوژنیک بربرین بر سلول‌های استئوبلاست نشان داده شد (29). همانطور که قبلا عنوان شده است ماده موثر اصلی عصاره ریشه زرشک رزافشان الکالوئیدی بهنام بربرین است، بنابراین می‌توان عنوان کرد که بربرین موجود در عصاره اثرات استئوژنیک بر سلولهایی بنیادی مزانشیمی القا میکند و باعث تمایز موثر این سلول‌ها بهسمت ردههای استخوانساز میشود.
- نتیجهگیری
نتایج حاصل از این پژوهش بیانگر آنست که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان توانایی القای تمایز درسلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت چربی رت نر نژاد ویستار را دارد. مطالعات بیشتر برای شناخت دقیقتر اثرات این گیاه بر سلول‌های بنیادی مزانشیمی و نیز استفاده از این گیاه برای اهداف درمانی ضروری است.
- تشکر و قدردانی
از همکاران و مسئولین مرکز سلول‌های بنیادی و زیستفناوری ترکیبات طبیعی دانشگاه خوارزمی جهت حمایت از این پژوهش صمیمانه تشکر و قدردانی میشود.
-
- Jalali Jahromi A, Mirhosseini M, Molla Hoseini H. A Review on Commonly Used Scaffolds in Tissue Engineering for Bone Tissue Regeneration. J Shahid Sadoughi Univ Med Sci . 2020;28(1):2235-2254.
- Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cell-based therapy: current status of preclinical studies and clinical trials. Current Opin Mol Ther. 2010;12(4):442—449.
- Woo D-H, Hwang HS, Shim JH. Comparison of adult stem cells derived from multiple stem cell niches. Biotechnol Lett. 2016;38(5):751–9.
- Minteer D, Marra KG, Rubin JP. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013;129:59–71.
- Wong RSY. Mesenchymal Stem Cells: Angels or Demons?. J Biomed Biotechnol 2011;2011:45(95-60).
- Alaribe FN, Razwinani M, Maepa M, Motaung KSC. The Potential Effect of Medicinal Plants for Cartilage Regeneration. In: Nikolopoulos DD, Safos GK, Dimitrios K, editors. Cartilage Tissue Engineering and Regeneration Techniques 2019;12(158):50–70.
- Mahmoudi Z, Soleimani M, Saidi A, Iranshahi M. Effect of Ferula gummosa Ethanolic Extract on Osteogenesis in Human Mesenchymal Stem Cells. J Med Plants. 2013;12(46):50–9.
- Mahmoudi Z, Soleimani M, Saidi A, Iranshahi M. Study of the effect of methanolic extracts of Persian angelica (Hypericum persicum) on bone differentiation of mesenchymal stem cells. In: Journal of Medicinal Plants. 2011;13: 42-49.
- Ashkar F, Eftekhari MH, Tanideh N, Koohpeyma, et al. Effect of hydroalcoholic extract of Berberis integerrima and resveratrol on ovarian morphology and biochemical parameters in Letrozole-induced polycystic ovary syndrome rat model: An experimental study. Int J Reprod Biomed. 2020;18(8): 637-650.
- Neag MA, Mocan A, Echeverría J, Pop RM, et al. Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders. Front Pharmacol. 2018;9:557.
- Zhou R, Xiang C, Cao G, Xu H, Zhang Y, Yang H, Zhang J. Berberine accelerated wound healing by restoring TrxR1/JNK in diabetes. Clin Sci. 2021; 135(4):613-627.
- Bahrebar K, Mohseni Kouchesfahan H, Delavize H, Nabiuni M, Nazari Z, Havasi P. Surface Markers Expression in the Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow. Armaghan-e-Danesh. 2013; 18(7):520-529.
- Ling X, Wang X, Li J, Zhang T, et al. Shu-Di-Huang and Gan-Cao Herb Pair Restored the Differentiation Potentials of Mesenchymal Stem Progenitors in Treating Osteoporosis via Downregulation of NF-κB Signaling Pathway. Tamadon A, editor. Evidence-Based Complement Altern Med. 2021;20(21) 77-95.
- Huang Y, Liao L, Su H, Chen X, et al. Psoralen accelerates osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by activating the TGF‑β/Smad3 pathway. Exp Ther Med. 2021;22(3):940.
- Dutta Deb S, Patel K. D, Jin B, Choi S-I, et al . Effects of Cirsium setidens (Dunn) Nakai on the osteogenic differentiation of stem cells. Mol Med Rep. 2021;23(4):264.
- Park K-R, Park JE, Kim B, Kwon IK, et al. Calycosin-7-O-β-Glucoside Isolated from Astragalus membranaceus Promotes Osteogenesis and Mineralization in Human Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2021;22(21):18-25.
- Tayebe Ramezani, Javad Baharara. The Effect of Saffron Aqueous Extract (Crocus sativus L) on Osteogenic Differentiation of Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. J Birjand Univ Med Sci. 2013;2(21):169–78.
- Baharara J, Moshtagh S RT. The effect of Saffron extract and gold nanoparticles on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in Wistar male rat. Complement Med J. 2015;2(15):13.
- Sanap A, Joshi K, Shah T, Tillu G, et al. Pre-conditioning of Mesenchymal Stem Cells with Piper longum L. augments osteogenic differentiation. J Ethnopharmacol. 2021;273:113999.
- Yang J, Yu K, Liu D, Yang J, et al. Irisin enhances osteogenic differentiation of mouse MC3T3‑E1 cells via upregulating osteogenic genes. Exp Ther Med 2021;21(6):580.
- Lee H, Song Y, Park Y-H, Uddin MS. Evaluation of the Effects of Cuminum cyminum on Cellular Viability, Osteogenic Differentiation and Mineralization of Human Bone Marrow-Derived Stem Cells. Medicina (B Aires). 2021;57(38):1–12.
- Karadeniz F, Lee JI, Seo Y, Kong CS. Ligustrum japonicum Thunb Fruits Exert Antiosteoporotic Properties in Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells via Regulation of Adipocyte and Osteoblast Differentiation. Stem Cells Int. 2021;2021(2):188-195.
- Masoum T, Amiri T, Rafatjou R. Effect of chitosan on osteogenic properties of mesenchymal stem cell of exfoliated deciduous teeth. J Dent Med. 2013;26(1):55–63.
- Baharara J, Nejhad Shahrokhabadi Kh, Nazemi MRT. Synergism between the aqueous extract of saffron (Crocus sativus L) and vitamin D3 on osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Feyz, J Kashan Univ Med Sci. 2014;18(5):411–8.
- Khodabandeh Z, Haghighat S, Tanideh N, Zare S, et al.Comparing the effects of Elaegnus Angustifolia, Hypericum Perforatum and Psidium Guajava extracts on metabolic activity of dental pulp-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 2021: 158: 32-42.
- Kwan KKL, Dong TTX, Tsim KWK. Danggui Buxue Tang, a Chinese herbal decoction containing Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix, improves mitochrondial bioenergetics in osteoblast. Phytomedicine. 2021;8(18)15-36.
- Zhang R, Yang J, Wu J, Xiao L, et al. Berberine promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells with therapeutic potential in periodontal regeneration. Eur J Pharmacol. 2019;15;851:144-150.
- Lee HW, Suh JH, Kim H-N, Kim AY, et al. Berberine promotes osteoblast differentiation by Runx2 activation with p38 MAPK. J bone Miner Res Off J Am Soc Bone Miner Res. 2008;23(8):1227–1237.
- Ma L, Yu Y, Liu H, Sun W, et al. Berberine-releasing electrospun scaffold induces osteogenic differentiation of DPSCs and accelerates bone repair. Sci Rep.2021;11(1):1–12.
)