فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 استاد زیست‌شناسی سلولی تکوینی،گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

2 دانشجو کارشناسی ارشد سلولی مولکولی، گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

3 دکتری تخصصی زیست‌شناسی تکوین جانوری، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران

چکیده

هدف: در مطالعه حاضر اثرات عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر القای تمایز سلول‌های بنیادی مزانشمی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار به‏سمت استئوبلاست بررسی شد. مواد و روش‏ها: در این مطالعه سلول‌های بنیادی مشتق از بافت رت نر نژاد ویستار جدا شد و  برای تایید بنیادی بودن مارکرهای سطحی به‏روش فلوسایتومتری انجام شد و سلول‌های بنیادی با غلظت‌های 10، 20 ، 40 و 80 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان تیمار شدند. سمیت سلول عصاره مذکور به‏روش MTT و اثرات تمایزی آن با رنگ‌آمیزی الیزارین قرمز، سنجش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و سنجش میزان رسوب کلسیم بررسی شد. نتایج با استفاده از آزمون واریانس یک‏طرفه در سطح معنی‌داری 05/0p< بررسی شد. نتایج: مارکرها بنیادی شامل CD105،CD44، CD73 در این سلول‌ها بیان مثبت داشتند، و نسبت به مارکرهای سطحی CD45 وCD34  بیان منفی داشتند. نتایج حاصل از آزمون MTT  نشان داد غلظت‏های کم‏تر از 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر اثرات سمی قابل توجهی بر سلول‏ها ندارند. فعالیت آلکالین فسفاتازی بالاتر در گروه تیمار نسبت به گروه کنترل در روز 10 مشاهده شد. نتایج حاصل از رنگ‏آمیزی آلیزارین قرمز و سنجش میزان کلسیم در مدت21 روز نشان داد که این عصاره به‏صورت وابسته به غلظت منجر به تمایز سلول‌های بنیادی به استئوبلاست می‌شد. نتیجه‏گیری: یافته‌های این پژوهش نشان داد سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار تیمارشده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان در مسیر تمایز به استئوبلاست وارد می‌شوند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

dor -

عنوان مقاله [English]

Effect of differentiation of hydroalcoholic extract of berberis integrrima root on mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats

نویسندگان [English]

  • M Nabiuni 1
  • M Ghasemi Nazarabadi 2
  • T Ramezani Farzin 3

1 Developmental Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran

2 Department of Cellular and Molecular, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran

3

چکیده [English]

Aim: In the present study, the effects of hydroalcoholic extract of Berberis integrrima root on the induction of differentiation in mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats towards osteoblasts were investigated.
Material and Methods: In this study, stem cells derived from male Wistar rat tissue were isolated and flow cytometry was performed to confirm the surface markers. Stem cells were treated with 10, 20, 40 and 80 μg/ml hydroalcoholic extract of B. integrrima root. The cell toxicity of the extract was evaluated by MTT assay and its differentiated effects was evaluated by alizarin red staining and alkaline phosphatase activity, calcium deposition assay. Results were analyzed using one-way ANOVA at a significance level of P <0.05.
Results: Stem cells markers including CD105, CD44, and CD73 had positive, and CD45 and CD34 had negative expression in these cells. The results of the MTT assay showed Concentrations less than 20 µg/ml do not have significant toxic effects on cells. Higher alkaline phosphatase activity was observed in the treatment group compared to the control group on day 10. The results of Alizarin red staining and measurement of calcium content for 21days showed that this extract in a concentration dependent manner leads to the differentiation of stem cells into osteoblasts.
Conclusion: The findings of this study showed that mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of male Wistar rats treated with hydroalcoholic extract of Berberis integrrima root enter osteoblasts in the differentiation pathway.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mesenchymal stem cells
  • Berberis
  • integrrima
  • Osteoblast
  • Differentiation
  • مقدمه

با توجه به عمل‏کردهای متفاوت و چندگانه بافت استخوان در بدن، هر تغییری که به‏دنبال آسیب، ضایعه یا بیماری در ساختار آن ایجاد شود، تعادل بدن و زندگی فرد را تحت تاثیر قرار می‌دهد.  به‏طور معمول به‏دنبال ایجاد یک ضایعه، استخوان‌ها دارای توانایی ذاتی ترمیم خودبه‏خودی هستند. در شکستگی‌ها و آسیب‏‌های کوچک استخوانی روند درمان توسط بدن انجام می‌گیرد، به‏طوری‏که به‏دنبال یک آسیب استخوانی سلول‌های بنیادی و استرومایی، به‏همراه ماکروفاژها و دیگر سلول‌های موجود در بافت استخوان ازجمله استئوبلاست‏ها و استئوکلاست‏ها به‏طور هماهنگ فعالیت می‌کنند تا آبشاری از عمل‏کردهای ترمیمی را به‏منظور بهبود آسیب وارده به استخوان پیش ببرند (1). در مورد آسیب‌های وسیع و تخریب‌های ویژه گاهی سیستم ترمیم استخوان به‏تنهایی قادر به ‏بازسازی بافت به‏طور مناسب نیست در این موارد استفاده از عواملی که به بهبود و ترمیم استخوان کمک می‌کنند ضروری می‌باشد. از جمله سلول‏هایی که در ترمیم استخوان آسیب دیده نقش ویژه‏ای دارند سلول‌های بنیادی مزانشیمی هستند. که امروز در پروتوکل‏های درمانی استفاده از سلول‏های بنیادی برای ترمیم بافت‌های استخوانی مورد توجه قرار گرفته است. دسترسی به‏منبعی مناسب از سلول‌های بنیادی، یک اصل مهم در سلول درمانی است و بافت چربی، منبعی در دسترس از این سلول‌ها می‌باشد، که طبق مطالعات این بافت دارای مزیت‌های متعددی نسبت به سایر منابع استخراج سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌باشد از جمله این مزیت‌ها می‌توان به درصد بالای سلول‌های بنیادی موجود در بافت، توان تکثیری بالا و امکان تامین سلول‏های اتولوگ به‏منظور اهداف درمانی اشاره کرد (2-4). ولی استفاده مستقیم از این سلول‏ها می‏تواند خطراتی ازجمله ایجاد سرطان داشته باشد. لذا این سلول‏ها همراه با مواد تمایز دهنده برای ترمیم بافتی استفاده می‏شوند (5). یکی از این عوامل تمایز دهنده عصاره‏های گیاهی هستند، از عصاره‏های گیاهان به‏عنوان داروهای مکمل برای ترمیم استخوان استفاده می‏شود (6) هم‏چنین تاکنون اثرات عصاره گیاهان مختلف بر تمایز استخوانی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مورد مطالعه قرار گرفته است. به‏عنوان مثال Mahmoudi   همکاران اثرات ریشه گیاه باریجه را بر تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مطالعه نمودند و گزارش دادن این عصاره قادر به‏تمایز استئوژنیک سلول‏های مذکور می‏باشند (7). درتحقیقی‏دیگر توسط نشان داده شده که عصاره گیاه گل‏پر قادر به تمایز استئوژنیک سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان می‏باشند (8). گیاه زرشک زرافشان با نام علمی Berberis integerrima  نوعی گیاه دارویی با خواص آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی است (9) که در طب سنتی از عصاره ریشه آن برای ترمیم آسیب‏ دیدگی‏های استخوانی استفاده می‏شود (10). عصاره ریشه این گیاه دارای انواع فلاونوئید، بتاکارتن و انواع آلکالوئیدها می‏باشد (10، 11) ولی تاکنون اثرات این گیاه بومی بر تمایز سلول‏های بنیادی به‏سمت رده‏های استخوانی مورد مطالعه قرار نگرفته است، باتوجه به‏وجود گیاهان دارویی در کشور ما هم‏چنین پیشینه غنی استفاده از طب سنتی از یه طرف و افزایش آسیب‏های استخوانی ازجمله پوکی استخوان و تروما در جمعیت رو به‏ سالمندی ایران  بررسی علمی بیش‏تر و دقیق‏تر گیاهان موثر در تمایز و بهبود استخوان ضروری به‏نظر می‏رسد (12). لذا در این مطالعه اثرات تمایزی عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان (به‏عنوان گیاهی که در طب سنتی برای بهبود آسیب‏های استخوانی استفاده می‏شود) بر تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رت‏های نژاد ویستار به‏سمت رده‏های استخوانی بررسی شد.

  • مواد و روش‌ها

روش تحقیق: این تحقیق از نوع تجربی آزمایشگاهی در سال 1400 در دانشگاه خوارزمی-مرکز تکثیر و نگه‏داری حیوانات آزمایشگاهی انجام شد.

جمع‏آوری و شناسایی ریشه گیاه زرشک زر افشان: ریشه گیاه زرشک زرافشان Berberis Integerrima در هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد با کد -FUMH 35966 شناسایی شد.

تهیه عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: ریشه‏های جمع‏آوری شده با آب مقطر شست‏وشو و در سایه خشک شدند. سپس ریشه گیاه زرشک زرافشان به‏قطعات کوچک خرد شد و با استفاده از آسیاب صنعتی کاملا خرد شد. برای تهیه عصاره هیدروالکلی مقدار50 گرم از ریشه گیاه خرد شده را در 500 میلی‏لیتر متانول 80 درصد (متانول+آب)

(Merck, Germany) مخلوط شد و به‏مدت 48 ساعت در دمای محیط قرار داده شد. در نهایت مخلوط حاصل با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شد، با استفاده از دستگاه روتاری تغلیظ شد و در انکوباتور خلا و دمای 40 درجه سانتیگراد خشک شد. محصول به‏دست آمده برای استفاده‏های بعدی در یخچال نگه‏داری شد.

استخراج سلول بنیادی از بافت چربی رت نر نژاد ویستار و شناسایی آن‏ها با مارکرهای سطحی: سلول‏های بنیادی از چربی‏های پشت ران رت نر نژاد ویستار با سن تقریبی 6تا4 هفته با استفاده از روش آنزیمی استخراج شد. سپس سلول‏ها در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. و زمانی که تراکم سلول‏ها به 80 درصد رسید، پاساژ سلولی انجام و سلول‏ها پس از پاساژ سوم جهت کشت مورد استفاده قرار گرفتند. برای تایید بنیادی بودن سلول‏های استخراج شده از آنتی‏بادی‏های CD73، CD 44، CD105،  CD90،  CD45، CD35 و CD11b ((Abcam,Germany و روش فلوسایتومتری استفاده شد.

بررسی سمیت سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان با استفاده از آزمونMTT : برای ارزیابی میزان سمیت عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی از روش  (Sigma,Uk)3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliu bromide (MTT)استفاده شد. بدین منظور سلول‏ها با تعداد 104× 2 در پلیت 96خانه کشت داده شد، پس از گذشت 24 ساعت سلول‏ها با غلظت‏های 5، 10، 20، 40، 60 و 80 میکروگرم بر میلی‏لیتر از عصاره به‏مدت 72 ساعت تیمار شد. پس از گذشت دوره تیمار مقدار 10 میکرولیتر محیط کشت جدید به‏علاوه 10 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی‏گرم در PBS) به‏هر چاهک اضافه شد. بعد از 4 ساعت انکوباسیون در37 درجه سانتی‏گراد محلول روی سلول‏ها به‏آهستگی حذف شد و کریستال‏های فورمازان ایجاد شده در 100 میکرولیتر Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma,Uk) حل شد. پس از چند دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق و حل شدن کامل کریستال‏ها در جذب 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا (Biotake, US) محاسبه شد. پس از محاسبه درصد زنده‏مانی با فرمول زیر از غلظت‏های غیرکشنده عصاره ریشه برای تمایز سلول‏های بنیادی به‏سمت استخوان استفاده شد. 100 (تعداد کل سلول‏های شمارش شده/تعداد سلول‏های زنده) =درصد زنده‏مان

بررسی مورفولوژی سلول‏های مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‏ها با تعداد 105 عدد در پلیت‏های 24 خانه کشت داده شد بعد از گذشت 24 ساعت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلطت‏های 10 و 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر تیمار شدند و نمونه‏ها در روزهای مختلف با میکروسکوپ معکوس (Biomed, Korea) مشاهده و عکس‏برداری شدند.

تیمار سلول‏های بنیادی مزانشیمی با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان برای بررسی تمایز استخوانی: جهت بررسی اثرات تمایزی و آزمون‏های الکالین فسفاتاز و آلیزارین رد، سلول‏های بنیادی با تعداد 105 عدد در هر پاهک پلیت‏های 24 خانه کشت داده شدند بعد از گذشت 24 ساعت و اطمینان از چسبیدن سلول‏ها به کف پلیت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلظت‏های 10 و 20 میکروگرم برمیلی‏لیتر تیمار شدند. در طی تمایز استخوانی محیط کشت سلول‏های تیمار شده هر سه روز عوض شدند و مجددا با عصاره تیمار شدند.

سنجش فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‏ها به‏مدت 10 روز کشت داده شدند، بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‏ها با استفاده از PBS سرد، از سطح پلیت جدا شدند و به‏وسیله تریتون X100 لیز شدند و با استفاده از پیپتاژ، هموژنایز شدند. بعد از تعیین غلظت پروتئین، بااستفاده از کیت سنجش آلکالین فسفاتاز شرکت (Biorexfars, Iran) با روش رنگ‏سنجی فعالیت آلکالین فسفاتازی نمونه‏ها بررسی شد جذب نمونه‏ها در طول موج 405 نانومتر بااستفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر (Biorad, US) قرائت شد و با گروه کنترل مقایسه شد.

بررسی تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان به‏سلول‏های استخوانی با رنگ‏آمیزی آلیزارین قرمز: برای انجام این آزمون سلول‏ها به‏مدت 21 روز با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان تیمار شدند، بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‏ها با PBS شست‏وشو داده شدند و به‏مدت 10دقیقه با متانول (Kimia Razi,Iran)  تثبیت شد سپس رنگ‏آمیزی با محلول رنگی آلیزارین قرمز(Merck, Germany)   به‏مدت5 دقیقه صورت گرفت سپس نمونه‏ها با آب مقطر شست‏وشو داده شدند و با میکروسکوپ معکوس (Biomed, Korea) مشاهده و عکس‏برداری شدند.

سنجش میزان کلسیم سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان: برای انجام این آزمون سلول‏ها با تعداد 105 عدد در پلیت‏های 24 خانه کشت داده شند بعد از گذشت 24 ساعت با عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان در غلطت‏های 10 و 20 میکرولیتر به‏مدت 21 روز تیمار شدند. بعد از گذشت زمان مورد نظر سلول‏ها بعد از 21 روز تیمار با عصاره مورد نظر با استفاده از PBS سرد، از سطح پلیت جدا شدند و به‏وسیله تریتون X100لیز شدند و با استفاده از پیپتاژ، هموژنایز شدند. محلول حاصل، با استفاده از کیت سنجش کلسیم (Biorexfars, Iran) و با روش رنگ‏سنجی مورد آزمایش انجام گرفت.

  • آنالیز آماری

در همه موارد آزمون ها، سه بار تکرار شد، نمودارها با استفاده از نرم‏افزار اکسل رسم شد. بررسی تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها بااستفاده از آزمون واریانس یک‏طرفه  One-way ANOVA و آزمون Tukey با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16 انجام شد.

  • نتایج

نتایج حاصل از شناسایی مارکرهای سطحی سلول‏های بنیادی مشتق از بافت چربی

نتایج بررسی فلوسایتومتری مارکرهای سطحی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی بعد از پاساژ سوم نشان داد که مارکرها بنیادی شامل (9/71) CD105، (6/82) CD44، (2/86)CD73  در این سلول‏ها بیان مثبت داشتند، درحالی‏که سلول‏های ذکر شده نسبت به مارکرهای سطحی رده هماتوپویتیک شامل (73/0) CD45 و (73/0) CD34 بیان منفی داشتند (شکل 1).

 

 

 

 

شکل 1 نتایج حاصل از بررسی مارکرهای سطحی سلول‏های بنیادی استخراج شده از بافت چربی بااستفاده از روش فلوسایتومتری. این سلول ها برای مارکر CD44،CD73،CD105  مثبت و برای مارکر CD45 وCD34   منفی بود.

نتایج حاصل از بررسی سمیت سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بااستفاده از آزمونMTT

نتایج بررسی سمیت سلولی عصاره زرشک زرافشان بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی رت‏های نژاد ویستار نشان داد که سمیت عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان به‏صورت وابسته به غلظت منجر به مهار تکثیر و مرگ سلولی در سلول‏های مذکور می‏شود. غلظتی که موجب ازبین‏رفتن نیمی از جمعیت سلول‏ها می‏شود 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر بود . دوزهای پایین‏تر از این غلظت 40 میکروگرم بر میلی‏لیتر باعث مهار رشد و دوزهای بالاتر از این غلظت،60 و80 میکروگرم بر میلی‏لیتر موجب مرگ سلول‏ها در ساعات اولیه تیمار می‏شوند (نمودار 1).

 

نمودار 1  بررسی میزان سمیت سلولی  عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در مدت 72 ساعت. این نمودار نشان می‏دهد عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان به‏صورت وابسته به غلظت منجر به مهار تکثیر سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏شود) 01/0**p<،  01/0***P<)

بررسی مورفولوژی سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان

تغییرات مورفولوژی سلول‏های بنیادی تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان تحت تیمار با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر  بعد از 21 روز در مقایسه با نمونه‏ها کنترل که تیماری دریافت نکرده است، نشان داد که در روز 7 پس از تیمار جهت‏گیری سلول‏ها نسبت به گروه کنترل متفاوت شده است و به‏نظر می‏رسد سلول‏ها به‏تدریج از حالت دوکی و کشیده خارج می‏شوند. در روز 14و 21 این جهت‏گیری و تفاوت آرایش فضایی سلول‏ها در نمونه کنترل و تیمار کاملا مشخص است سلول‏ها پهن شده و حالت ستاره‏ای شکل گرفته‏اند و به‏وضوح از حالت دوکی شکل خارج شده‏اند و این تغییرات نشان دهنده تاثیر عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر تمایزسلول‏های بنیادی و تغییر مورفولوژی سلول‏ها است (شکل 3).

 

   

7 روز(B)

کنترل (A)

   

21 روز(D)

14 روز(C)

شکل3 تغییرات مورفولوژی سلول‏های بنیادی تحت تیمار با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان. A)) نمونه‏ها کنترل که تیماری دریافت نکرده است، (B)، نمونه‏ها بعد از 7 روز تیمار. C)) و (D) ، نمونه‏ها در روز 14 و 21 بعد از تیمار (بزرگ‏نمایی برابر با x200).

 

نتایج سنجش کمی آنزیم آلکالین فسفاتاز سلول‏های مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدرو الکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان

نتایج حاصل از اندازه‏گیری کمی فعالیت آلکالین فسفاتاز در روز 10 نشان داد که میزان فعالیت این آنزیم در گروه‏های تیمار، درمقایسه با گروه کنترل افزایش یافته است در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز نسبت به کنترل از نظر آماری بی‏معنی بود درحالی‏که در گروه‏های تیماری با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره ریشه گیاه زرشک زرافشان افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز از نظر آماری نسبت به نمونه تیمار نشده معنی‏دار بود (نمودار 2).

 

نمودار 2: نتایج حاصل از میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز درسلول‏های تیمار شده با دوزهای 10 و 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر در روز 10 در مقایسه با گروه کنترل (05/0>**p).

 

نتایج رنگ‏آمیزی آلیزارین قرمز سلول‏های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان

رنگ‏آمیزی آلیزارین قرمز 21 روز پس از تیمار سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی انجام شد. بررسی نتایج رنگ‏آمیزی آلیزارین قرمز نشان داد که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان، قادر به ایجاد تمایز در سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت چربی به‏سمت استئوبلاست‏ها می‏باشد. با بالارفتن غلظت عصاره، میزان رسوب‏گذاری و رنگ‏پذیری نمونه سلولی نیز بیش‏تر می شود به‏عبارتی عصاره مذکور به‏صورت وابسته به غلظت باعث تمایز سلول‏های بنیادی تحت تیمار می‏شود (شکل 4).

(C)

(B)

(A)

 

 

 

شکل 4 رنگ‏آمیزی آلیزارین رد. (A) نمونه کنترل که تحت هیچ تیماری قرار نگرفت. (B) رنگ‏آمیزی نمونه سلولی تیمار شده با غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر در مدت زمان 21 روز. (C) رنگ‏آمیزی نمونه سلولی تیمار شده با غلظت 20میکروگرم بر میلی‏لیتر در مدت زمان 21 روز (بزرگ‏نمایی برابر است با  X200)

                 

نتایج سنجش کمی میزان رسوب کلسیم درسلول‏های مزانشیمی بنیادی تیمار شده با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان

نتایج حاصل از اندازه‏گیری کمی رسوب کلسیم در روز 21 نشان داد که میزان رسوب کلسیم در گروه‏های تیمار، درمقایسه با گروه کنترل به‏صورت معنی‏دار و وابسته به غلظت افزایش یافته است (نمودار 3).

 

نمودار 3 مقایسه میزان رسوب کلسیم در سلول‏های تیمار شده با غلظت 10 و 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر از عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان در روز 21 (05/0>*P، 001/0 ***P<).

  • بحث

در این پژوهش تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه زرشک زرافشان با نام علمیBerberis Integerrima   برای القای تمایز استئوبلاستی در سلول‏های بنیادی مشتق از بافت چربی رت نر نژاد ویستار مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا سلول‏های بنیادی با روش آنزیمی استخراج شدند، سپس برای شناسایی و تایید بنیادی بودن سلول‏های استخراج شده از روش فلوسایتومتری استفاده شد و مارکر  CD44،CD73 ،  CD105 مثبت و برای مارکر CD45 و CD34 منفی بود. هم‏چنین درسایر مطالعات پیشین نیز (12، 13) سلول‏های بنیادی چربی را با روش روش آنزیمی جدا کردند و با استفاده از مارکرهای سطحی بنیادی بودن آن‏ها را اثبات نمودند. در ادامه پژوهش از عصاره ریشه زرشک زرافشان برای تمایز سلول‏های بنیادی استخراج شده استفاده شد. برای القای تمایز در سلول‏های بنیادی باید از غلظت‏های غیرکشنده عصاره استفاده نمود لذا لازم بود ابتدا سمیت عصاره ریشه زرشک زرافشان بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی بررسی شود (14). بنابراین میزان سمیت عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان بر سلول‏های بنیادی مشتق از بافت چربی با روش آزمون MTT بررسی شد. آزمون سمیت سلولی MTT یک آزمون رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال‏های زرد تترازولیوم به‏وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل بلورهای بنفش رنگ نامحلول انجام می‏شود (15، 16). نتایج این آزمون نشان داد عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک در غلظت40 میکروگرم بر میلی‏لیتر، منجر به مهار تکثیر سلول‏های بنیادی می‏شد، در این رابطهRamezani   و همکاران (17) در مطالعه‏ای اثر عصاره آبی زعفران را بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مطالعه نمودند، این گروه غلظت مناسب برای ایجاد تمایز در سلول‏های مذکور را با روش MTT مشخص نمودند، و از غلظت‏های کمتر از غلظت کشنده برای القای تمایز در سلول‏های بنیادی مزانشیمی استفاده نمودند  که در مطالعه حاضر نیز با روش MTT غلظت‏های غیرکشنده تعیین و برای ایجاد تمایز استفاده شد. بعد از تیمار سلول‏ها با عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان و القای تمایز لازم است با روش‏هایی تمایز تغییرات سلول‏ها بررسی شد از این‏رو در این پژوهش از آزمون سنجش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز برای بررسی تمایز استئوسیتی استفاده شد. مطالعات نشان داده است که سطح فعالیت این آنزیم در زمان تمایز سلول‏های بنیادی به استخوان‏ها افزایش می یابد (18-20). سطوح فعالیت این آنزیم توسط سوبسترای پارانیتروفنیل فسفات در2حالت سلول‌های بنیادی مزانشیمی تمایز نیافته و سلول‌های تمایز یافته مورد بررسی قرار گرفت (21) .سنجش این آنزیم در نمونه‏ها نشان داد  فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروه‏های تیمار شده با عصاره گیاه زرشک زر افشان نسبت به گروه کنترل به‏صورت وابسته به غلظت افزایش یافت. بنابراین طبق مطالعات پیشین و پژوهش انجام شده تمایز سلول‏های بنیادی به سلول‏های استئوبلاست با افزایش آنزیم الکالین فسفاتازی پس از گذشت 10 روز همراه است.  Masoum و همکاران (23) نیز از آزمون آلکالین فسفاتاز برای اثبات تمایز استئوژنیک در سلول‌های بنیادی مشتق از پالپ دندان شیری استفاده نمودند این گروه نشان داد، تمایز استئوژنیک منجر به افزایش فعالیت آنزیم مذکور می‏شد. هم‏چنین جهت بررسی تمایز سلول‏های بنیادی تحت تیمار با عصاره زرشک زرافشان به سلول‏های استئوبلاست از رنگ‏آمیزی الیزارین قرمز و کیت سنجش کلسیم استفاده شد. رنگ‏آمیزی آلیزارین رد برای تعیین رسوبات کلسیم در بافت ها و سلول‏ها استفاده می‏شود (25-26). نتایج حاصل از رنگ‏آمیزی آلیزارین رد و سنجش مقدار کلسیم نمونه‏ها نشان داد که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان به‏صورت وابسته به غلظت قادر به رسوب کلسیم و القای تمایز سلول‏های بنیادی به‏سلول‏های استئوبلاست می‏باشد. در این زمینه Zhang و همکاران (27) اثرات بربرین را بر تمایز استخوانی سلول‏های بنیادی مشتق از مغز استخوان بررسی نمودند، نتایج این مطالعه نشان داد که بربرین باعث افزایش بیان ژن‏های استخوان‏ساز در این سلول‏ها نسبت به گروه کنترل می‏شوند. Lee و همکاران (28) اثرات بربرین را بر استئوبلاست‏های جدا شده بررسی نمودند نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از آن بود که بربرین به‏صورت موثر باعث افزایش فعالیت استخوان‏سازی در استئو بلاست‏ها می‏شوند. در سال 2021 نیز در مطالعاتی اثرات استئوژنیک بربرین بر سلول‏های استئوبلاست نشان داده شد (29). همان‏طور که قبلا عنوان شده است ماده موثر اصلی عصاره ریشه زرشک رزافشان الکالوئیدی به‏نام بربرین است، بنابراین می‏توان عنوان کرد که بربرین موجود در عصاره اثرات استئوژنیک بر سلول‏هایی بنیادی مزانشیمی القا می‏کند و باعث تمایز موثر این سلول‏ها به‏سمت رده‏های استخوان‏ساز می‏شود.

  • نتیجه­گیری

نتایج حاصل از این پژوهش بیان‏گر آنست که عصاره هیدروالکلی ریشه گیاه زرشک زرافشان توانایی القای تمایز درسلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت چربی رت نر نژاد ویستار را دارد. مطالعات بیش‏تر برای شناخت دقیق‏تر اثرات این گیاه بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی و نیز استفاده از این گیاه برای اهداف درمانی ضروری است.

  • تشکر و قدردانی

از همکاران و مسئولین مرکز سلول‏های بنیادی و زیست‏فناوری ترکیبات طبیعی دانشگاه خوارزمی جهت حمایت از این پژوهش صمیمانه تشکر و قدردانی می‏شود.

-

  1. Jalali Jahromi A, Mirhosseini M, Molla Hoseini H. A Review on Commonly Used Scaffolds in Tissue Engineering for Bone Tissue Regeneration. J Shahid Sadoughi Univ Med Sci . 2020;28(1):2235-2254.
  2. Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cell-based therapy: current status of preclinical studies and clinical trials. Current Opin Mol Ther. 2010;12(4):442—449.
  3. Woo D-H, Hwang HS, Shim JH. Comparison of adult stem cells derived from multiple stem cell niches. Biotechnol Lett. 2016;38(5):751–9.
  4. Minteer D, Marra KG, Rubin JP. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013;129:59–71.
  5. Wong RSY. Mesenchymal Stem Cells: Angels or Demons?. J Biomed Biotechnol 2011;2011:45(95-60).
  6. Alaribe FN, Razwinani M, Maepa M, Motaung KSC. The Potential Effect of Medicinal Plants for Cartilage Regeneration. In: Nikolopoulos DD, Safos GK, Dimitrios K, editors. Cartilage Tissue Engineering and Regeneration Techniques 2019;12(158):50–70.
  7. Mahmoudi Z, Soleimani M, Saidi A, Iranshahi M. Effect of Ferula gummosa Ethanolic Extract on Osteogenesis in Human Mesenchymal Stem Cells. J Med Plants. 2013;12(46):50–9.
  8. Mahmoudi Z, Soleimani M, Saidi A, Iranshahi M. Study of the effect of methanolic extracts of Persian angelica (Hypericum persicum) on bone differentiation of mesenchymal stem cells. In: Journal of Medicinal Plants. 2011;13: 42-49.
  9. Ashkar F, Eftekhari MH, Tanideh N, Koohpeyma, et al. Effect of hydroalcoholic extract of Berberis integerrima and resveratrol on ovarian morphology and biochemical parameters in Letrozole-induced polycystic ovary syndrome rat model: An experimental study. Int J Reprod Biomed. 2020;18(8): 637-650.
  10. Neag MA, Mocan A, Echeverría J, Pop RM, et al. Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders. Front Pharmacol. 2018;9:557.
  11. Zhou R, Xiang C, Cao G, Xu H, Zhang Y, Yang H, Zhang J. Berberine accelerated wound healing by restoring TrxR1/JNK in diabetes. Clin Sci. 2021; 135(4):613-627.
  12. Bahrebar K, Mohseni Kouchesfahan H, Delavize H, Nabiuni M, Nazari Z, Havasi P. Surface Markers Expression in the Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow. Armaghan-e-Danesh. 2013; 18(7):520-529.
  13. Ling X, Wang X, Li J, Zhang T, et al. Shu-Di-Huang and Gan-Cao Herb Pair Restored the Differentiation Potentials of Mesenchymal Stem Progenitors in Treating Osteoporosis via Downregulation of NF-κB Signaling Pathway. Tamadon A, editor. Evidence-Based Complement Altern Med. 2021;20(21) 77-95.
  14. Huang Y, Liao L, Su H, Chen X, et al. Psoralen accelerates osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by activating the TGF‑β/Smad3 pathway. Exp Ther Med. 2021;22(3):940.
  15. Dutta Deb S, Patel K. D, Jin B, Choi S-I, et al . Effects of Cirsium setidens (Dunn) Nakai on the osteogenic differentiation of stem cells. Mol Med Rep. 2021;23(4):264.
  16. Park K-R, Park JE, Kim B, Kwon IK, et al. Calycosin-7-O-β-Glucoside Isolated from Astragalus membranaceus Promotes Osteogenesis and Mineralization in Human Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2021;22(21):18-25.

 

  1. Tayebe Ramezani, Javad Baharara. The Effect of Saffron Aqueous Extract (Crocus sativus L) on Osteogenic Differentiation of Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. J Birjand Univ Med Sci. 2013;2(21):169–78.
  2. Baharara J, Moshtagh S RT. The effect of Saffron extract and gold nanoparticles on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in Wistar male rat. Complement Med J. 2015;2(15):13.
  3. Sanap A, Joshi K, Shah T, Tillu G, et al. Pre-conditioning of Mesenchymal Stem Cells with Piper longum L. augments osteogenic differentiation. J Ethnopharmacol. 2021;273:113999.
  4. Yang J, Yu K, Liu D, Yang J, et al. Irisin enhances osteogenic differentiation of mouse MC3T3‑E1 cells via upregulating osteogenic genes. Exp Ther Med 2021;21(6):580.
  5. Lee H, Song Y, Park Y-H, Uddin MS. Evaluation of the Effects of Cuminum cyminum on Cellular Viability, Osteogenic Differentiation and Mineralization of Human Bone Marrow-Derived Stem Cells. Medicina (B Aires). 2021;57(38):1–12.
  6. Karadeniz F, Lee JI, Seo Y, Kong CS. Ligustrum japonicum Thunb Fruits Exert Antiosteoporotic Properties in Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells via Regulation of Adipocyte and Osteoblast Differentiation. Stem Cells Int. 2021;2021(2):188-195.
  7. Masoum T, Amiri T, Rafatjou R. Effect of chitosan on osteogenic properties of mesenchymal stem cell of exfoliated deciduous teeth. J Dent Med. 2013;26(1):55–63.
  8. Baharara J, Nejhad Shahrokhabadi Kh, Nazemi MRT. Synergism between the aqueous extract of saffron (Crocus sativus L) and vitamin D3 on osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Feyz, J Kashan Univ Med Sci. 2014;18(5):411–8.
  9. Khodabandeh Z, Haghighat S, Tanideh N, Zare S, et al.Comparing the effects of Elaegnus Angustifolia, Hypericum Perforatum and Psidium Guajava extracts on metabolic activity of dental pulp-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 2021: 158: 32-42.
  10. Kwan KKL, Dong TTX, Tsim KWK. Danggui Buxue Tang, a Chinese herbal decoction containing Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix, improves mitochrondial bioenergetics in osteoblast. Phytomedicine. 2021;8(18)15-36.
  11. Zhang R, Yang J, Wu J, Xiao L, et al. Berberine promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells with therapeutic potential in periodontal regeneration. Eur J Pharmacol. 2019;15;851:144-150.
  12. Lee HW, Suh JH, Kim H-N, Kim AY, et al. Berberine promotes osteoblast differentiation by Runx2 activation with p38 MAPK. J bone Miner Res Off J Am Soc Bone Miner Res. 2008;23(8):1227–1237.
  13. Ma L, Yu Y, Liu H, Sun W, et al. Berberine-releasing electrospun scaffold induces osteogenic differentiation of DPSCs and accelerates bone repair. Sci Rep.2021;11(1):1–12.