مقدمه

گزارش‏های سازمان بهداشت جهانی حاکی از آن است که 6 درصد از کل مرگ و میرها وابسته به مصرف الکل می‏باشد (1). مصرف الکل تغییرات مخربی را در فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی تمامی ارگانیسم ایجاد می­کند (2). اتانول موجود در مشروبات الکلی به‏طور عمده از طریق روده جذب می­شود و قبل از ورود به سیستم گردش خونی، نخست وارد کبد می­‏شود. کبد مهم‏ترین اندام جهت متابولیسم، سمیت­زدایی و ذخیره­ی و ترشح مواد گزنوبیوتیک و متابولیت­های آن­ها می­باشد. چون بسیاری از این مواد و متابولیت­های حاصل از فرآیندهای متابولیکی آسیب­زا هستند در نتیجه کبد مستعد آسیب­های مختلف می­باشد (3). اتانول نیز همچون دیگر مواد گزنوبیوتیک در کبد متابولیزه می‏شود. مکانیسمی که اتانول و متابولیت­های حاصل از آن موجب آسیب کبدی می­شوند به‏طور کامل روشن نیست. با این‏حال، مطالعات چندی نشان داده­اند که اتانول با القای تولید رادیکال­های آزاد می­تواند سبب آسیب­های بافتی و سلولی ­شود. رادیکال­های آزاد مانند گونه­های فعال اکسیژن به‏طور طبیعی در سلول­های زنده­ تولید می­شوند و نقش مهمی در فرآیند علامت رسانی سلول­ها دارند. همچنین در طبیعت عواملی وجود دارند که ممکن است رادیکال آزاد داشته باشند یا سلول­ها را برای تولید رادیکال آزاد تحریک کنند (4). مقادیر بالای این ترکیبات برای سلول­ها خطرناک می­باشند و ممکن است به کل اجزای آن از جمله: پروتئین­ها و نوکلئیک اسیدها، فسفولیپیدها، و غشاهای سلولی آسیب برسانند و نقش مهمی در پیشرفت بیماری­هایی مانند سرطان، مسمومیت کبدی و... دارند (5). در مشروبات الکلی در واقع، اکسیداسیون اتانول پس از جذب از طریق لوله گوارشی، در کبد، توسط چندین سیستم آنزیمی که مهم‏ترین آن­ها، الکل دهیدروژناز می‏باشد، صورت می­گیرد و در نهایت موجب ایجاد رادیکال­های آزاد مانند پراکسید هیدروژن، در بافت کبدی و آسیب به آن می­شود (6 و 7).  آنتی اکسیدانت­ها ترکیباتی مهمی هستند که می­توانند برای پیش‏گیری و درمان این آسیب­ها مفید باشند. تحقیقات در زمینه پیشرفت­ بر روی شناسایی و کاربرد این ترکیبات در جلوگیری و درمان بیماری­های مختلف از جمله انواع سرطان متمرکز شده است (8). آنتی ­اکسیدانت­ها ممکن است به‏عنوان یک جاروب کننده، احیا کننده و یا فعال کننده آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سلول برای جلوگیری از آسیب رادیکال­های آزاد در سیستم­های زیستی ایفای نقش کنند (9-11). گیاهان منبع طبیعی برای این ترکیبات هستند (12). آنتی اکسیدانت­های مهمی که در گیاهان وجود دارند عبارتند از: توکوفرون­ها (ویتامین E)، فولیک اسید (ویتامین B₉)، آسکوربیک اسید (ویتامین C)، کاروتنوئیدها، فنیل آکریلیک اسیدها و فلاونوئیدها مانند آنتوسیانین­ها که به‏عنوان بزرگ‏ترین گروه فنل­های طبیعی می­باشند. جنس شیرین بیان شامل 20 گونه متعلق به خانواده بقولات و بومی بیشتر نقاط جهان، مخصوصا آسیا می­باشد (13). گونه .Merstotropis xanthioides Vassilcz متعلق به جنس شیرین بیان است. این گونه شامل ترکیبات مختلفی مانند اسانس­ها، ترکیبات فنلی و ساپونین­های گلیکوزید می­باشد (14، 15). هدف از این مطالعه تعیین محتوای فنلی در عصاره گونه M. xanthioides  و نقش حفاظتی آن در برابر سمیت کبدی القا شده با الکل می­باشد.

مواد و روش­ها

موادشیمیایی: همه مواد شیمیایی و حلال­های استفاده شده در این پژوهش از شرکت مرک آلمان و سیگما (آمریکا) با درصد خلوص بالا تهیه شده است.

مواد گیاهی: گونه­های مطالعه شده از زیستگاه­های طبیعی خود (خراسان) در سال 1394 جمع آوری شد و در هرباریوم دانشگاه بوعلی سینا (BASU) نگه‏داری شدتد.

استخراج عصاره­ گیاهی: برای تهیه عصاره، بخش هوایی گونه مورد مطالعه توسط آسیاب برقی، سه بار و در هر بار به‏مدت 10 ثانیه آسیاب شد. استخراج عصاره از 25 گرم پودر خشک گیاه توسط 250 میلی­لیتر متانول خالص و به‏وسیله دستگاه استخراج کننده سوکسله به‏مدت 6 ساعت انجام شد. به‏منظور حذف ذرات ریز عصاره از کاغذ صافی وات من استفاده شد. سپس عصاره­ها تا زمان استفاده داخل فریزر (20- درجه سانتی‏گراد) ذخیره شدند.

محتوای فنل کل: 125/0 میلی­لیتر عصاره گونه مورد مطالعه شده با 5/0 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد. سپس مقدار 125/0 میلی­لیتر معرف فولین سیوکالتو همراه با 25/1 میلی­لیتر کربنات سدیم 7 درصد به نمونه اضافه شد و به‏مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری گردید. مخلوط حاصل را  با آب مقطر به حجم 3 میلی­لیتر رسانده و به‏مدت 90 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری شد و در نهایت جذب نمونه­ها در طول موج 760 نانومتر اندازه­گیری شد. مقدار فنل کل از طریق منحنی استاندارد گالیک اسید محاسبه گردید و مقادیر آن بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک عصاره گزارش شد (16).

محتوای فلاونوئید کل: 5/0 میلی­لیتر عصاره با 5/0 میلی‏لیتر کلرید آلومینیوم 2 درصد متانولی مخلوط گردید و به‏مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری شد و پس از این مدت جذب در طول موج 368 نانومتر خوانده شد. مقدار فلاونوئید کل از طریق منحنی استاندارد کوئرستین محاسبه گردید و مقادیر آن بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک عصاره گزارش شد (17).

حیوانات آزمایشگاهی و گروه­بندی حیوانات: در این مطالعه رَت نژاد ویستار با وزن تقریبی 150 تا 200 گرم استفاده شد. حیوانات در شرایط استاندارد از نظر دوره­ روشنایی-تاریکی، دما و رطوبت نگه‏داری شدند و دسترسی نامحدود به آب و غذا داشتند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق گروه زیست شناسی دانشگاه بوعلی سینا همدان بود، هنگام کار با رت­ها رعایت شد. رت­ها به سه گروه، که هر گروه شامل 6 سر بود تقسیم شدند. گروه اول (گروه کنترل): روزانه 1 میلی­لیتر آب با گاواژ دریافت نمود. گروه دوم (گروه اتانول): روزانه 1 میلی­لیتر اتانول 50 در­صد به روش گاواژ دریافت نمودند. گروه سوم (گروه اتانول و عصاره): که به‏صورت روزانه ابتدا 500 میلی­گرم به‏ازای هر کیلوگرم وزن بدن عصاره دریافت نمود و با فاصله زمانی 4 ساعت، 1 میلی­لیتراتانول 50 درصد نیز از طریق دهانی دریافت نمود. یک گروه از رَت­ها نیز به همراه اتانول 50 درصد، داروی استاندارد سیلی­مارین را با دوز 20 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن، به‏صورت دهانی دریافت نمود. پس از طی شدن دوره مطالعه (14 روز)، حیوانات با تنفس دوز بالای اتر کشته­ شدند. کبدها بلافاصله خارج شدند و پس از شستشو، وزن شدند. بخشی از کبد هر حیوان جهت مطالعات بیوشیمیایی در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد و بخش دیگر جهت مطالعات هیستوپاتولوژیکی در فرمالین 10 درصد نگه‏داری شد.

بررسی پارامترهای مورفولوژیکی: پارامترهای مورفولوژیکی مانند وزن کبد و نسبت وزن کبد به 200 گرم وزن بدن نیز به‏عنوان یکی از شاخص­های مورد نظر برای بررسی اثر حفاظتی عصاره­ گونه مورد مطالعه بر سمیت کبد ارزیابی شد.

آنالیزها بیوشیمیای

آنزیم­های کبدی: پس از بی‏هوش نمودن حیوانات با تزریق کتامین/زایلزین، نمونه­های خونی از حیوانات متعلق به تمامی گروه­ها جمع­آوری شد، سپس سرم خون جدا شد برای آنالیزهای بیوشیمیایی بلافاصله به فریزر 70- درجه سانتی­گراد منتقل شدند. پارامترهای کبدی سرم، شامل آلانین­ آمینو­ ترانسفراز (Alanine aminotransferase = ALT)، آسپارتات آمینو ترانسفراز (Spartat amino transferase = AST) و آلکالین ­فسفاتاز (Alkaline phosphatase = ALP) با استفاده از کیت­های تشخیصی مورد ارزیابی قرار گرفت و مقادیر آن­ها بر حسب واحد بین­المللی آنزیمی بر لیتر (U/L) گزارش شد.

سنجشمالون­دی­آلدئید (MDA): نمونه‌ها در هاون چینی و حاوی ازت مایع 5 دقیقه سائیده شدند. 1/0 گرم بافت کبد سائیده شده درون میکروتیوب 2 میلی­لیتری ریخته و 1 میلی­لیتر تری­کلرواستیک اسید (TCA) 1/0 درصد (w/v)  به آن اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه نمونه‌ها با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول روشناور به لوله آزمایش منتقل شد و 4 میلی­لیتر TCA 20 درصد محتوای 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید به آن اضافه شد. نمونه‌ها در بن ماری و در دما‌ی 95 درجه سانتی­گراد به‏مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. سپس بلافاصله نمونه­ها را در حمام آب یخ گذاشته و پس از سرد شدن با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. جذب نمونه‌ها در 532 نانومتر خوانده شد. مقادیر MDA بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن بافت گزارش شد (18).

سنجشپراکسیدهیدروژن:برای سنجش مقادیر پراکسید هیدروژن، 1/0 گرم از بافت کبد در 1 میلی­لیتر تری کلرو استیک اسید 1/0 مولار (TCA) سائیده شد و بعد عصاره‏های حاصل با دور 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس 5/0 میلی­لیتر از محلول سانتریفوژ شده به 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی­مولار (7pH=) و 5/0 میلی­لیتر یدید پتاسیم 1 مولار اضافه شد و جذب مخلوط واکنش در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. مقادیر پراکسید هیدروژن در هر نمونه با استفاده از ضریب خاموشی M^-1cm^-1  28/0 محاسبه گردید و بر حسب میکرو مول بر گرم وزن بافت گزارش شد (19).

 H₂O₂ غلظت = ضریب خاموشی/ تغییرات جذب نمونه

بررسی­های هیستولوژیکی: بافت کبد جدا شده با استفاده از سرم فیزیولوژیکی شستشو شد و در فرمالین 10 در­صد تثبیت شد. سپس با درجات صعودی اتانول، آبگیری و توسط پارافین قالب­گیری شد. نمونه­های قالب­گیری شده با پارافین توسط دستگاه میکروتوم با ضخامت 5 میکروگرم برش­گیری و با رنگ هماتوکسیلین-ائوزین رنگ ­آمیزی شد. برش­های رنگ ­آمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت و عکس­برداری شد. پارامترهای مانند نکروز هپاتوسیت­ها، اتساع ورید مرکزی، ارتشاح سلول­های التهابی، به­‏هم ریختگی آرایش بافتی و انباشت چربی در هپاتوسیت­ها (میکرو وزیکولار استاتوزیس) در تصاویر مورد نظر از مقاطع بافتی مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز آماری: داده­های حاصل از آزمایش با نرم افزار Excel تحلیل شد. سپس، مقایسه میانگین­ها به‏روش دانکن در سطح  05/0p<  انجام شد. نتایج حاصل از این بررسی به‏صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد.

نتایج

محتوای فنل و فلاونوئید کل

پلی­فنل­ها به‏ویژه فلاونوئیدها دارای فعالیت­های زیستی فراوانی هستند. گونه مطالعه شده دارای محتوای فنل (6/1 ± 9/9 میلی­گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک عصاره) و فلاونوئید (5/0 ± 2/3 میلی­گرم کوئرستین بر گرم وزن خشک عصاره) بالایی می­باشد (شکل 1).

شکل 1: محتوای فنل و فلاونوئید عصاره گونهM. xanthioides.

بررسی پارامترهای مورفولوژیکی

نتایج حاصل از مطالعات مورفومتریک در این تحقیق نشان داد که نسبت وزن کبد به وزن بدن در رت­های تیمار شده با اتانول، به‏طور معنی­داری نسبت به رت­های گروه کنترل و تیمار شده با عصاره و سیلی‏مارین افزایش پیدا کرده است (جدول 1).

جدول 1: تغییرات وزن کبد در رت­های کنترل و تیمار شده را نشان می­دهد.

مقادیر،میانگین3تکرار±SDاست .

این افزایش وزن می­تواند ناشی از التهاب، ارتشاح و تجمع چربی­ها در هپاتوسیت­های بافت کبد رَت­های تیمار شده با اتانول باشد.

آنالیزهای بیوشیمیایی

آنالیزهای بیوشیمیایی نشان دادند که مقادیر MDA  و پراکسید هیدروژن بافت کبد و همچنین مقادیر سه آنزیم کبدی ALT، AST و ALP در سرم خون رت­های تیمار شده با اتانول به‏طور معنی­داری (05/0p ≤ ) نسبت به گروه کنترل، گروه تیمار شده با عصاره و اتانول و همچنین گروه تیمار شده با داروی استاندارد کبدی (سیلی‏مارین)، افزایش نشان دادند (جدول 2).

جدول 2: تاثیر عصاره گیاه  M. xanthioides بر پارامترهای بیوشیمیایی بافت کبد رَت­ها در آسیب ناشی از اتانول.

مقادیر،میانگین3تکرار±SDاست .حروف یکسانبیانگرعدماختلافمعنی­داردرسطحP ≤ 0.05 است.

افزایش میزان MDA (005/0 ± 102/0 میلی­گرم بر گرم بافت) و پراکسید هیدروژن ( 09/0 ± 52/0 میکروگرم بر گرم بافت) می‏تواند نشان دهنده القا و افزایش استرس اکسیداتیو در بافت کبد رت­های تیمار شده با اتانول باشد که در نهایت منجر به تخریب هپاتوسیت­ها می­شود. به‏دنبال تخریب هپاتوسیت­ها مقادیر سرمی سه آنزیم کبدی ALT، AST و ALP نیز افزایش نشان می­د­هد (جدول 2). تیمار رت­ها با عصاره گونه مورد مطالعه در این تحقیق باعث کاهش معنی­دار مقادیر فاکتورهای بیوشیمیایی مذکور شده که نشان دهنده نقش حفاظتی عصاره در کاهش استرس اکسیداتیو و تخریب هپاتوسیت­ها می­باشد (جدول 2).

بررسی­های هیستولوژیکی

بررسی­ نتایج حاصل از مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های تیمار شده با اتانول، در مقایسه با ساختار طبیعی بافت کبد رت­های گروه کنترل (شکل2، الف و ب)، به‏­هم­ ریختگی شدید در چیدمان سلول­ها در بافت کبد، نکروز بافتی، اتساع و تخریب ونول مرکزی (علامت ستاره سیاه رنگ) و ارتشاح سلول­های التهابی (پیکان مشکی ضخیم) و همچنین انباشت چربی در هپاتوسیت­ها (با نوک پیکان) را نشان می­دهد (شکل 2، ب).  بافت کبدی تیمار شده با عصاره به‏همراه اتانول، کاهش سلول­های پیکنوتیک (پیکان باریک)، ساختار ونول نرمال (ستاره سیاه رنگ) و همچنین چیدمان طبیعی سلول­های کبدی را نشان داد (شکل 2، ب و پ)، که از این لحاظ مشابه با ساختار بافتی گروه کنترل (بدون هیچگونه تیمار) و گروه تیمار با سیلی‏مارین می­باشد (شکل 3). در مطالعات هیستولوژیکی تجمع قطرات چربی در هپاتوسیت­ها یا همان ساختارهای میکرو وزیکولار یکی از علایم مهم آسیب به کبد می­باشد که در برش­ها به شکل واکوئل­های ریزی دیده می­شوند. در این تحقیق، این‏حالت پاتولوژیکی فقط در گروه­ رت­های تیمار شده با اتانول دیده شد و عصاره از انباشت چربی در هپاتوسیت­ها ممانعت کرد، به‏صورتی‏که ساختار بافت کبد در گروه رت­های تیمار شده با عصاره مشابه با کنترل بود (شکل 2، الف و پ).

بحث

پلی­فنل­ها از جمله فلاونوئیدها در ساختار شیمیایی خود دارای گروه­های هیدروکسیل می­باشند که دهنده قوی هیدروژن به‏حساب می­آیند و به‏عنوان عوامل آنتی اکسیدانتی شناخته می­شوند. این ترکیبات با توانایی احیا کنندگی بالا می­تواند با گونه‏های فعال اکسیژن و نیتروژن واکنش دهند و از خسارات استرس اکسیداتیو در بدن جلوگیری کنند (20-22). ساختار این ترکیبات دارای پتانسیل بالایی برای واکنش دادن با پروتئین­های مختلف از جمله آنزیم­ها می­باشند. به این دلیل آن­ها می­توانند باعث ممانعت از فعالیت آنزیم­هایی مانند ایزوفرم­های مختلف سیتوکرم  P₄₅₀، سیکلواکسیژناز، الکل دهیدروژناز، لیپو اکسیژناز و زانتین اکسیداز شوند که در تولید رادیکال­های آزاد دخالت دارند (23). همچنین اثرات هم‏سو و غیر هم‏سو پلی­فنل­ها با دیگر عوامل آنتی اکسیدانتی و سطوح گلوتاتیون (به‏عنوان عامل آنتی اکسیدانتی در جانوران، گیاهان، قارچ­ها و باکتری­ها هستند) درون سلولی نیز بحث شده است (24، 25). نتایج این تحقیق نشان داد که گونه مورد مطالعه دارای محتوای فنل و فلاونوئید بالایی می­باشد (شکل 1). تاکنون مطالعه‏ای پیرامون محتویات فیتوشیمیایی عصاره گونهM. xanthioides صورت نگرفته است. اکسیدانت­­ها مانند پراکسید هیدروژن به طور طبیعی در سلول­های زنده­ تولید می­شوند و نقش مهمی در فرآیندهای مختلف سلول از جمله علامت رسانی دارند. همچنین عوامل برون سلولی ممکن است رادیکال آزاد داشته باشند یا سلول­ها را برای تولید رادیکال آزاد تحریک کنند (4). اتانول بعد از مصرف به‏عنوان عامل بیرونی و یک گزنوبیوتیک در کبد به‏وسیله آنزیم الکل دهیدروژناز متابولیزه می­‏شود و منجر به تولید رادیکال­ها­ی آزاد می­‏شود که مقادیر بالای این ترکیبات می­تواند سبب آسیب­های جدی بافتی و سلولی ­شود (6 و 7). یکی از مشخص­ترین علامت­های آسیب کبدی، افزایش آنزیم­های سلولی در سرم خون می­باشد. افزایش سطح آنزیم­های کبدی نظیر ALT، AST وALP  در سرم نشان ­دهنده تخریب ناشی از مصرف اتانول می­باشد که در نتیجه­ نکروز هپاتوسیت­ها (سلول­های پیکنوتیک) و نشت آنزیم­های درون سلولی است. در واقع آسیب غشا سلول باعث رها شدن این آنزیم­ها در خون می­شود (26-29). در این تحقیق تیمار دهانی رت­ها با عصاره­ گونه مورد مطالعه و داروی سیلی‏مارین باعث کاهش سطح آنزیم­های کبدی سرم شدند که مشابه با نمونه­های کنترل می­باشد (جدول 2). این امر ممکن است به‏واسطه­ تاثیر و بر هم کنش ترکیبات آنتی­کسیدانتی عصاره­ گونه مورد مطالعه بر فعالیت و مقادیر  آنزیم الکل دهیدروژناز کبدی و کاهش رادیکال­های آزاد مانند پراکسید هیدروژن باشد که در نهایت باعث افزایش پایداری غشا هپاتوسیت‏ها و لیزوزوم‏های حاوی آنزیم­ها می­شود (جدول 1)، (23-30، 31 و 32).

 شکل 2: مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های کنترل (بدون تیمار)، اتانول و عصاره + اتانول را نشان می­دهد. الف: ساختار بافت کبد رَت‏های گروه کنترل، ب: به‏­هم­ ریختگی شدید در چیدمان سلول­ها بافت کبد، نکروز بافتی، اتساع ونول مرکزی (با علامت ستاره سیاه رنگ)، ارتشاح سلول­های التهابی (با پیکان مشکی ضخیم)، همچنین انباشت چربی در هپاتوسیت­ها که به‏شکل واکوئل­های ریز (با نوک پیکان) و سلول­های پیکنوتیک (پیکان باریک)، را در گروه تیمار شده با اتانول نشان می­دهد. پ: بافت کبدی در گروه تیمار شده با عصاره و اتانول را نشان می­دهد.

شکل 3: مطالعات هیستولوژیکی بافت کبد در گروه رت­های کنترل (بدون تیمار) و سیلی‏مارین + اتانول را نشان می­دهد. الف: ساختار بافت کبد رَت­های گروه کنترل، ب: بافت کبدی در گروه تیمار شده با سیلی‏مارین و اتانول را نشان می­دهد.