نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری تخصصی زیست شناسی تکوین جانوری، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
3 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، مشهد، ایران
چکیده
هدف: در مطالعه حاضر اثر، نانوذرات نقره پوشش دار شده با کورکومین بر القای مرگ سلولی بر رده سلولهای سرطان تخمدان A2780 بررسی شده است.
مواد و روشها: در این مطالعه تجربی آزمایشگاهی سنتز سبز نانو ذرات نقره با استفاده ازکورکومین انجام شد. سپس سلولهای رده A2780 با غلظتهای مختلف نانو ذرات نقره تیمار شدند. اثرات سمی نانو ذرات نقره با روش MTT و اثرات آپوپتوزیس این نانو ذرات با روشهای رنگ آمیزی DAPI و اکردین اورنج-ﭘﺮوﭘوﺪﻳﻮم یداید و اندازه گیری فعالیت کاسپاز 3 و 9 بررسی شد. تغییرات بیان ژنهای Bax وBcl-2 با روش Real Time PCR آنالیز شد.
نتایج: نتایج نشان داد این نانو ذرات باعث مهار تکثیر سلولهای A2780 بهطور وابسته به غلظت شدهاند، غلظت 8 میکروگرم بر میلیلیتر منجر به مرگ پنجاه درصد سلولها در 24 ساعت شد. نتایج رنگ آمیزی DAPI و اکردین اورنج-ﭘﺮوﭘودﻳﻮم ﻳﺪاﻳﺪ نشان دهنده افزایش درصد سلولهای آپوپتوزیس در گروههای تیماری بود. مطابق نتایج حاصل از Real Time PCR بیان ژنBax در سلول تحت تیمار افزایش در حالیکه بیان ژن Bcl-2 در این سلولها کاهش نشان داد.
نتیجه گیری: نانوذرات نقره پوشش دار شده با کورکومین باعث القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی A2780 میشود و استفاده از این نانو ذرات میتواند بهعنوان استراتژی امیدوارکننده در درمان سرطان تخمدان مورد توجه قرار گیرد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Anti-cancerous effects of silver nanoparticles coated with curcmin on A2780 ovarian cancerous cells
نویسندگان [English]
- T Ramezani 1
- i M Nabiun 2
- Baharar J 3
- Parivar K 2
- F Namvar 3
1 دانشجوی دکتری تخصصی زیست شناسی تکوین جانوری، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
3 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، مشهد، ایران
چکیده [English]
Aim: In this study, the effects of curcumin- coated silver nanoparticles were examined on induction of apoptosis in ovarian cancer A2780 cell.
Material and Methods: Silver nanoparticles coated with curcumin were biosynthesized, then A2780 cells were treated with different concentration of silver nanoparticles. Cytotoxicity effects of silver nanoparticles in A2780 cells were assessed by MTT assay and apoptotic effects of these nanoparticles were examined using DAPI and acridine orange/ propidium iodide staining and caspase 3/9 activation assay. Changes in Bax and Bcl-2 gene expression were analyzed by Real Time PCR.
Results: Findings showed that silver nanoparticles inhibit A2780 cells proliferation in a dose dependent manner. 8 µg/ml 50% decreased cell viability at 24 hours, DAPI and, acridine orange propidium iodide staining represent that percentage of apoptotic cells in the treated groups was increased. The results of Real Time PCR showed that Bax gene expression in cells treated with silver nanoparticles increased, while Bcl-2 gene expression in the treated cells was decreased.
Conclusion: Silver nanoparticles coated with curcumin induce apoptosis in A2780 cancer cells. The use of the nanoparticles should be considered a promising strategy for the treatment of ovarian cancer.
کلیدواژه‌ها [English]
- Silver nanoparticles
- Cancer
- Apoptosis
- curcumin
مقدمه
با وجود پیشرفتهای فراوان در زمینه کنترل و درمان بیماریها، مسئله سرطان هنوز یکی ازچالشهای جهانی در زمینه سلامت انسان ها باقی مانده است. معمولترین روش برای درمان سرطانها شیمی درمانی میباشد. نکته مهم در درمان سرطان با روشهای شیمی درمانی، مقاومت اکتسابی تومور به داروهای است و این مسئله مشکلات عمده ای را برای درمان سرطان بهوجود آورده است. از آنجا که میزان جهش و ناپایداری ژنتیکی در سلولهای سرطانی بسیار بالاست و تغییرات ژنی بهسرعت در آنها انجام میگیرد، این سلولها نسبت به داروها مقاومت پیدا میکنند. بنابراین پژوهش بیشتر در زمینه کشف استراتژیهای درمانی نوین برای غلبه بر مقاومت دارویی سرطانها ضروری بهنظر می رسد (1). در این میان نانو تکنولوژی زمینه امیدوار کنندهای درحیطه درمان سرطان بهوجود آورده است. در سالهای اخیر اثرات ضد سرطانی و ضد رگزایی نانو ذرات نقره مورد توجه قرار گرفته است و نتایج نشان داده است که نانو ذرات نقره میتواند بهعنوان عامل بالقوه ضد سرطانی محسوب گردد (2 و 3). اما حلالهای آلی مورد استفاده برای تولید این نانو ذرات سمی هستند و میتوانند اثرات زیست محیطی مخربی داشته باشند. از اینرو تمایل زیادی برای استفاده از روشهای سالم برای سنتز نانو ذرات نقره وجود دارد (4). اخیرا مطالعات تحت عنوان شیمی سبز آغاز شده است که به جستجوی روش سازگار با محیط زیست برای سنتز نانو ذرات میپردازد. در سالهای اخیر، نانو ذرات نقره بهروش خارج سلولی و با استفاده از عصارههای مختلف گیاهی و میکروبی سنتز گردیده است. بهعنوان نمونه نانو ذرات نقره با استفاده از عصارههای گیاهانی مانند زیتون، بومادران و آلوورا با موفقیت سنتز شده است (5، 6 و 7). بهعلاوه مطالعات زیادی در زمینه بررسی خواص ضد باکتری، آنتی اکسیدانت و فعالیتهای ضد تومور این محصولات طبیعی در جریان است. در این راستا Sathish و همکاران اثرات آنتی باکتریایی نانو ذرات نقره، سنتز شده با روش زیستی را بررسی نمودند (8). همچنین Reddy و همکاران اثرات آنتی اکسیدانتی، آنتی باکتریال وضد سرطانی نانوذرات نقره تولید شده با استفاده از عصاره گیاه Piper longum را بررسی نمودند (9). کورکومین یکی از پلی فنلهای غذایی شناخته شده است که از ریزوم گیاه زرد چوبه (Curcuma longa) بهدست میآید. این پودر زرد رنگ سالها در طب سنتی برای درمان آکنه، پسوریازیس، آماس پوست استفاده میشود. اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانتی و ضد میکروبی کورکومین بهخوبی شناخته شده است. همچنین این ماده مجموعه ای از اهداف مولکولی و مسیرهای سیگنالینگ، مانند: NF-JB، AKT / mTOR و HIF-1A را تحت تاثیر قرار میدهد و در نتیجه در مهار تکثیر سلولهای سرطانی، متاستاز، رگزایی و هم چنین القای آپوپتوزیس نیز نقش ایفا میکند (10). بنابراین دراین تحقیق جهت افزایش اثر گذاری نانو ذرات نقره، همچنین افزایش دسترسی زیستی کورکومین از این ماده بهعنوان کاهنده و پایدارکننده نانو ذرات نقره استفاده شد. سپس اثرات ضد سرطانی آن بر سلولهای سرطان تخمدان A278 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
این مطالعه تجربی- آزمایشگاهی در سال 95-94 در مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی- تکوین جانوری وابسته به دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد انجام شد.
سنتز زیستی نانو ذرات نقره و شناسایی آن: تولید نانوذرات نقره با روش زیستی: محلول 5/0 مولار نیترات نقره (Merck, Germany) در آب با حجم 1000 میلیلیتر تهیه شد و میزان 1 میلیلیتر کورکومین ( (Sigma, Uk با غلظت 10 میلی مولاری در DMSO در دمای اتاق و
2/7 pH= به آن اضافه شد. تغییر رنگ محلول از بیرنگ به قهوهای نشان دهنده آغاز تشکیل نانو ذرات در نظر گرفته شد.
طیف سنجی نور مرئی- فرابنفش: برای ثبت طیف جذبی نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین در ناحیه نور مرئی- فرابنفش، 100 میکرولیتر از نمونه را در یک پلیت 96 قرار داده شد و جذب نمونهها در دامنه 400 تا 700 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (Biotek, US) اندازهگیری شد. همچنین برای شناسایی شکل و ابعاد نانو ذرات تولید شده از میکروسکوپ الکترونی گذاره (Hitachi, Japan) استفاده شد. این مشاهدات با قرار دادن یک قطره از نمونه بر گرید مس پوشش داده شده با یک فیلم کربن، انجام گرفت (11).
طیف سنجی نور پویا (Dynamic light scattering (DLS)): اندازه متوسط نانو ذرات با استفاده از دستگاه DLS (Cordovan, Vaso particle, France) تعیین شد. بر پایه نتایج طیف سنجی نور مرئی- فرابنفش بهترین نمونه برای آنالیز DLS انتخاب شد. این بررسی در شرایط دمای 25 درجه سانتیگراد، با استفاده از زاویه ثابت 90 درجه و در طول موج 657 نانومتر انجام شد.
طیف مادون قرمز برای نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین و کورکومین تجاری به تنهایی با استفاده از دستگاه (Perkin Elmer, US) انجام گرفت. قبل از انجام آنالیز بهمنظور حذف هر گونه باقی مانده کورکومین آزاد بدون اتصال به نانو ذرات، نانو ذرات نقره 3 بار با آب مقطر شسته و محصول در 12000 دور بر دقیقه بهمدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد و سپس با دستگاه انجماد خشک پودر شدند. نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین با پودر KBr (Merck, Germany) مخلوط و طیف مادون قرمز در محدوده 4000 تا 400 نانومتر به دست آمد ثبت شد (11).
بررسی اثرات ضد سرطانی نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین: رده سلولی سرطان تخمدان A2780 از انیسیتوپاستور تهران تهیه و با محیط کشتRMPI1640 ((Sigma, UK حاوی سرم جنین گاوی 10 درصد ( (Sigma, Uk و یک واحد پنیسیلین –استرپتومایسین (Sigma, (UK در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
سنجش سمیت نانوذراتنقره با روشآزمون (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) : تعداد 104 ×5 سلولدر چاهک پلیت 96 خانه کشت داده شد پس از گذشت 24 ساعت با غلظتهای 4،1 ، 8، 12، 25 و 50 میکروگرم بر میلیلیتر از نانو ذرات نقره تیمار شدند. سلولهای تیمار شده بهمدت 24 ساعت در انکوباتور قرار گرفت. پس از این مدت به هر پلیت 20 میکرولیتر رنگ MTT )5 میلیگرم بر میلیلیتر) (Merck, Germany) اضافه شد و بهمدت 3 ساعت دیگر انکوبه شدند. سپس به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO اضافه شد تا بلورهای فورمازان حاصل حل شد. جذب نوری توسط دستگاه میکرواسپکتوفتومتر (Biotek, US) در 570 نانومتر ثبت شد. تمامی مراحل آزمایش 3 بار تکرار و درصد سلول های زنده از فرمول زیر محاسبه شد.
100× (میانگین جذب نمونه کنترل/میانگین جذب نمونه تیمار) = درصد زنده های سلول
بررسی مورفولوژیک تغییرات سلولهای تحت تیمار با رنگ آمیزی آکریدین اورنج/ پروپودیوم یداید:برای این رنگ آمیزی، سلولهای سرطانی در پلیتهای 6 خانه کشت داده شدند و با غلظت 8 میکروگرم برمیلیلیتر نانوذرات نقره تیمار شدند. پس از گذشت 24 ساعت سلولها با تریپسین از چاهکها جدا و سانتریفیوژ شدند سپس با 10 میکروگرم محلول آکردین اورنج و 10 میکروگرم پروپودیوم یداید(Merck, Germany) به سلولها اضافه شد. پس از گذشت 3 تا 5 دقیقه 100 میکرو لیتراز محلول سلولی بر داشته و بر روی اسلاید قرار داده شد و با میکروسکوپ فلوئوروسانس (Biomed, Korea) آنالیز شد. در هربار مشاهده حداقل 100 سلول شمارش و درصد سلولها ی آپوپتوتیک با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
100×تعداد کل سلولهای آپوپتوزیس و نرمال /تعداد کل سلولهای آپوپتوزیس = درصد سلولهای آپوپتوزیس
بررسی تغییرات مورفولوژی هسته در سلولهای تیماری با رنگ آمیزی هستهای DAPI: برای بررسی اثرات نانو ذره نقره سنتز شده با کورکومین بر روی هسته سلولهای سرطان تخمدانA2780 از رنگ آمیزی DAPI ((Sigma, UK استفاده شد. سلولها بعد از کشت بر روی لاملهای کوت شده با کلاژن در پلیت 6 خانه کشت داده شدند و با غلظت 8 میکروگرم بر میلی لیتر نانو ذرات نقره بهمدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس با پارا فرم آلدئید 4 درصد بهمدت 15 دقیقه در دمای اتاق فیکس شد و بهمدت 10 دقیقه در دمای اتاق تحت اثر رنگ DAPI قرار داده شدند در نهایت پس از شستشو با میکروسکوپ فلورسانس (Biomed, Korea) بررسی شدند.
تعیین مسیر آپوپتوزیس با استفاده از کیت کاسپاز 3 و 9:سلولهای A2780 در2 فلاسک کشت سلول متوسط کشت داده شدند. سپس با نانو ذرات نقره سنتز شده با کورکومین با غلظت 8 میکروگرم بر میلیلیتر تیمار و بهمدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس سلولها تریپسینه و سانتریفوژ شدند و پس از آن محتوی پروتئین سلولها استخراج شد. غلظت پروتئینی باروش بردفورد اندازهگیری شد. سپس50 میکروگرم پروتئین از هر نمونه جدا و بر اساس پروتوکل کیت کاسپاز 3 و9 (Abcam, Germany) فعالیت کاسپاز 3 و 9 اندارهگیری شد. تمامی مراحل ازمایش 3 بار تکرار شد.
بررسی تغییرات بیان ژنهایBax و Bcl-2: سلولهای A2780 در2 فلاسک کشت سلول متوسط کشت داده شدند و با نانو ذره نقره سنتز شده با کورکومین با غلظت 8 میکروگرم برمیلی لیتر تیمار و بهمدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس سلولها تریپسین و سانتریفوژ شدند. برای استخراج، RNA با توجه به پروتکل کیت(Roche, Germany) لیز سلولها انجام شد. بعد از لیز شدن کامل سلولها، استخراج بهکمک کلروفرم و ایزوپروپانل انجام گرفت تا رسوب RNA بهدست آید. در نهایت پس از شستشو با اتانول 75 درصد، RNA حاصل در آب حل شد. برای تهیه cDNA بر اساس پروتکل شرکت (Thermo, Germany)، 10میکرولیتر از محلول RNA را در65 درجه سانتیگراد بهمدت 5 تا 10 دقیقه انکوبه شد سپس بافر PCR به آن اضافه شد. محلول حاصله را 10 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد قرار داده و سپس بهمدت یک ساعت در 42 درجه سانتیگراد انکوبه شد برای توقف واکنش، نمونه در دمای 70 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه قرار گرفت. جهت انجام مراحل PCR کیفی از پرایمرهای اختصاصی (جدول1) و مسترمیکس حاوی رنگ سایبرگرین(Pars tous, Iran) استفاده شد. چرخه PCR 40 مرحله و توسط دستگاه Real Time PCR (Bio rad, US) انجام شد.
جدول 1: توالی پرایمرهای مورد استفاده
|
Genes |
Sequence |
|
BCL-2F |
CATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC |
|
BCL-2R |
CAGATAGGCACCCAGGGTGAT |
|
BAXF |
TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA |
|
BAXR |
CTCCATGTTACTGTCCAGTTCGT |
|
GAPDHF |
TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC |
|
GAPDHR |
CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC |
آنالیز آماری: جهت مشخص نمودن اختلاف بین گروهها از آزمون واریانس یکطرفه و تست Tukey استفاده شد. نتایج توسط نرم افزار SPSS 16 آنالیز و نمودارها با نرم افزار Excell ترسیم شدند.
نتایج
سنتز نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین و تعیین مشخصات آن
سنتز نانوذرات نقره درحضور کورکومین در زمان 24 ساعت صورت گرفت. اندازه متوسط این نانو ذرات در حدود 2 ± 40 بود و ماکریمم جذب نوری در 450 نانومتر مشخص شد. مطالعات طیف سنجی نور مادون قرمز نشان داد که نمودارهای حاصل از کورکومین تجاری و نانو ذرات الگوی یکسانی را در پیکهای جذبی در ناحیه 400 تا 4000 دارند. این موضوع نشان میدهد که کورکومین سطح نانوذرات نقره را پوشش داده است (شکل1، ب و ج).
نتایج حاصل از سنجش سمیت نانو ذرات نقره با روش آزمون MTT
نانوذرات نفره تا غلظت 1 میکروگرم بر میلی لیتر فاقد هر گونه اثر معنیداری در زیست پذیری سلولها بودند، در حالیکه در غلظتهای 4 میکروگرم بر میلیلیتر سطح معنیداری بین کنترل و نمونههای تیمار افزایش مییابد و غلظت 8 میکروگرم بر میلیلیتر 50 درصد سلولها (IC50) دچار مرگ سلولی شده اند و از نظر زیست شناسی میتوان عنوان کرد که در غلظتهای زیر 1 مهار تکثیر سلولها رخ میدهد و غلظتهای بیشتر منجر به مرگ سلولها میشود. در حالیکه در غلظت 50 میکروگرم بر میلی لیتر لیز سلولی در اکثر سلولها نشان میدهد (شکل 2).
|
پ |
شکل 1: الف) میکروسکوپ الکترونی گذاره از نانوذرات نقره سنتز شده به روش سبز، ب) میزان جذب نوری را برای نمونههای نانو ذرات سنتز شده با کورکومین که نشان دهنده حداکثر جذب نانو ذرات در 450 نانومتر میباشد، پ) نمودار توزیع نانوذره از نظر اندازه با توجه به آنالیز سایز نانوذرات نقره با دستگاه DLS ، ج) نتایج حاصل از طیف مادون قرمز از کورکومین (1) ونانو ذرات سنتز شده (2) این دو طیف بسیار به یکدیگر شباهت دارند که نشان میدهد کورکومین برسطح نانوذرات نقره اتصال یافتهاند.
شکل 2: درصد زیست پذیری سلولهای A2780 را در حضور غلظتهای مختلف نانوذرات نقره نشان میدهد (Mean±S.D 001/0< ***p ، 01/0**p< ).
بررسی مورفولوژیک تغییرات سلولهای تیمار شده با نانو ذرات نقره با رنگ آمیزی آکریدین اورنج/ پروپودیوم یداید
در رنگ آمیزی اکردین اورنج سلولهای زنده به رنگ سبز دیده میشود. در حالیکه سلولهایی که در مرحله آپوپتوزیس قرار دارند نارنجی رنگ مشاهده میشوند. در گروههای تحت تیمار با نانوذرات درصد سلولها با رنگ نارنجی افزایش چشمگیری در مقایسه با کنترل داشتند. شمارش سلولهای زنده در مقابل سلولهای آپوپتوزیس نشان داد که درصد سلولهای آپوپتوزیس درگروه تیمار درحدود 56 درصد بود، درحالیکه این درصد در گروه کنترل کمتر از 2 درصد کل سلولها بود (شکل 3).
|
پ |
|
الف |
|
ب |
شکل 3: الف) شکل حاصل از رنگ آمیزی آکردین اورنج/ پروپودیوم یداید. در گروه کنترل بیشتر سلولها سبز رنگ میباشند و در خالت نرمال قرار دارند، ب) (در حالیکه درگروه تیماری بیشتر سلولها بهرنگ نارنجی هستند و در مراحله آپوپتوریس قرار دارند، پ) شمارش تعداد سلولهای زنده و آپوپتوریس در گروه کنترل و تیمار نشان داد که درصد سلولهای آپوپتوزیس درگروه تیمار نسبت به گروه کنترل افرایش داشته است، (بزرگنمایی×400).
بررسی تغییرات مورفولوژی هسته با رنگ آمیزی هستهای DAPI
سلولهای که تحت تیمار با 8 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات نقره بودند بعد از 24 ساعت دارای کروماتین فشرده و یا قطعه قطعه میباشند. این تغییرات که از خصوصیات سلولهای آپوپتوزیس میباشد نشان دهنده آغاز روند مرگ سلولها در گروه تیماری میباشد (شکل 4).
شکل 4: الف) شکل حاصل از رنگ آمیزیDAPI، گروه کنترل با هسته، ب) گروه تیمار با نانو ذرات نقره که کروماتین قطعه قطعه شده در آن نمایان می باشد. (بزرگنمایی×400).
تعیین مسیر آپوپتوزیس با استفاده از کیت کاسپاز 3 و 9
خانواده آنزیمی کاسپاز از واسطههای اصلی آپوپتوزیس هستند و در طی روند آپوپتوزیس فعالیت آنها افرایش میبابد. نتایج بررسی فعالیت کاسپاز نشان داد که فعالیت کاسپاز 3 و 9 در گروه تیمار شده با 8 میکرو گرم بر میلیلیتر نسبت به گروه تیمارنشده افزایش یافته است. بنا براین میتوان گفت که نانوذرات نقره منجر به آغاز روند مرگ سلولی در سلولهای A278 از مسیر وابسته به کاسپاز شده است (شکل5 ).
شکل 5: مقایسه فعالیت کاسپار 3 و 9 در گروه تیمار با نانو ذرات نقره و کنترل. فعالیت این آنزیم در گروههای تیماری نسبت به کنترل افزایش معنیداری داشته است (Mean±S.D، 001/0p< ***).
بررسی تغییرات بیان ژنهای Bax و Bcl-2 : در این جهت مطالعه تغییرات بیان ژنهای آپوپتوزیس در سلولهای تیمار و کنترل از روش PCR کمی استفاده شد. نتایج نشان داد که بیان ژن پرو آپوپتوتیک Bax درگروه تیمار نسبت به کنترل افزایش یافته است، در حالیکه بیان ژن آنتی آپوپتتوتیک Bcl-2 نسبت به کنترل کاهش یافته است (شکل 6).
شکل 6: تغییرات بیان ژنهای Bax و Bcl-2 در گروه تیمار با نانو ذرات نقره و گروه کنترل. نتایج نشان داد که بیان ژن Bax اقرایش و بیان ژن Bcl-2 نسبت به کنترل بهصورت معنیداری کاهش یافته است. (Mean±S.D، 001/0p< ***).
بحث
استفاده از ترکیبات طبیعی برای تولید نانو ذرات رویکرد جدیدی است که توجهات زیادی را بهخصوص برای تولید نانو ذرات فلزی جلب نموده است تاکنون گزارشهای زیادی مبنی بر استفاده از عصارههای گیاهی، قارچی و باکتریایی برای تولید نانو ذرات فلزی از جمله نانو ذرات نقره منتشر شده است. بهعنوان مثال بهارآرا و همکاران (12) از عصاره گیاه مریم گلی برای سنتز نانو ذرات نقره استفاده نمودند. همچنین در مطالعه دیگری از برگهای زیتون برای سنتز نانو ذرات نقره استفاده نمودند (13). در این پژوهش تجربی نیز، نانو ذرات نقره با استفاده از کورکومین خالص تهیه شد. کورکومین ترکیب فنولی است که توانایی احیا یونهای نقره به نانو ذرات نقره را دارد. همچنین کورکومین بهعنوان عامل پوشش دهنده و پایدار کننده نانو ذرات نقره عمل نیز میکند. سپس اثرات نانو ذرات نقره تولید شده با روش سبز بر القای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی رده A2780 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی سمیت سلولی نشان داد که این نانو ذرات میتوانند بهصورت وابسته به غلظت، منجر به کاهش زیست پذیری سلولها شوند. با محاسبه IC50 مشخص شد که غلظت 8 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت منجر به مرگ 50 درصد از سلولها شده است. در این زمینه بهارآرا و همکاران (6) نانو ذرات نقره را با استفاده از عصاره گیاه بومادران زرد تولید نمودند و سپس اثرات سمی آن بر رده سلولی سرطانی MCF-7 مورد بررسی قرار دادند. نتایج مطالعات این گروه نشان داد که نانو ذرات نقره با پوشش گیاهی قادر به مهار تکثیر سلولی سرطانی سینه بهصورت وابسته به دوز بودند. IC50 گزارش شده توسط این گروه برابر با 20 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت بود که این عدد از IC50 (8 میکروگرم بر میلی لیتر) گزارش شده در تحقیق حاضر بیشتر بود که میتواند بهعلت قرار گرفتن کورکومین بر سطح نانو ذرات و در نتیجه افزایش اثر گذاری نانو ذرات باشد. همانطور که قبلا اشاره شد، کورکومین دارای اثرات ضد سرطانی قوی میباشد و قرار گیری آن بر سطح نانو ذرات میتواند علت افزایش اثر گذاری آنها قلمداد شود. این فرضیه نیاز به بررسیهای بیشتر دارد. با توجه به این موضوع که آپوپتوزیس یا مرگ برنامه ریزی شده سلولی روند مهمی در جهت کنترل تکثیر سلولها، حفظ هوموستاز طبیعی بدن و از بین بردن سلولهای مضر و سرطانی میباشد (14). در مرحله بعد توانایی ایجاد آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی رده A2780 توسط غلظت IC50 از نانوذرات نقره بررسی شد. تغییرات ظاهری هسته و ایجاد شکست در کروماتین سلول یکی از نشانههای بارز آغاز روند مرگ سلولی است. در این پژوهش تغییرات مورفولوژیک هسته، در سلولهای تیمار شده با نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین با رنگ آمیزی هستهای DAPI بررسی شد. نتایج نشان داد که در سلولهای تیماری تغییرات هستهای از جمله فشرده شدن کروماتین و قطعه قطعه شدن آن نسبت به گروه کنترل افزایش یافت. همچنین در این مطالعه برای تعیین نوع مرگ سلولی القا شده توسط نانوذرات نقره از روش رنگآمیزی اکریدین اورنج- پروپودیوم یداید استفاده شد. نتایج نشان داد که در سلولها تیمار شده با نانوذرات نقره تعداد سلولهای آپوپتوزیس افزایش یافت. از مجموعه بررسیهای مورفولوژی با رنگ امیزی DAPI و اکریدین اورنج/ پروپودیوم یداید میتوان دریافت که نانو ذرات نقره با پوشش کورکومین منجر به فعال شدن روند آپوپتوزیس در سلولهای A2780 میشوند (15). همچنین کاسپازها از واسطههای مهم در فرآیند آپوپتوزیس هستند. در طی فرآیند مرگ سلولی برنامه ریزی شده ابتدا در اثر محرک آپوپتوزیس کاسپاز 3 فعال میشود سپس این کاسپاز با شکستهای پروتئولیتیک منجر به فعال شدن کاسپاز 8 و 9 میشود که این کاسپازها مسئول آغاز فعالیت مولکولهای افکتور دیگر برای پیشرفت روند آپوپتوزیس هستند. در این تحقیق نشان داده شد که تیمار سلولهای سرطانی A2780 با نانو ذرات تقره پوششدار با کورکومین منجر به افزایش فعالیت کاسپاز 3 و 9 میشوند. در مطالعات گذشته نیز اثرات آپوپتوزیس نانو ذرات نقره تولید شده با روش زیستی بر ردههای سلولی مختلف بررسی شده است به عنوان مثال اثرات نانو ذرات تقره سنتز شده با عصاره گیاهAlbizia adianthifolia بر سلولهای سرطانی ریه بررسی شد. نتایج این مطالعات نشان داد که نانوذرات نقره موجب مهار تکثیر و افزایش میزان آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی ریه میشود. این نانو ذرات از طریق مسیر درونی (میتوکندری) مرگ برنامه ریزی شده سلولی را آغاز میکنند (15). همچنین حکمت و همکاران (16) اثرات نانو ذرات نقره در القای آپوپتوزیس در رده سلولهای T-47D و MCF-7 را بررسی و گزارش نمودند که نانو ذرات نقره منجر به افزایش تراکم هسته و شکست کروموزومی در هستههای سلولهای تیماری میشوند. Jeyaraj و همکاران (4) اثرات نانو ذرات نقره سنتز شده با واسطه عصاره گیاهPodophyllum hexandrum را بر روند آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی دهانه رحم بررسی نمودند و نتایج تحقیقات این گروه نشان داد که این نانو ذرات منجر به القای مرگ سلولی در سلولهای مذکور بهصورت وابسته به کاسپاز میشوند. این یافتهها با نتایج تحقیق حاضر همسو میباشد. همچنین در این مطالعه جهت بررسی مسیر مولکولی وابسته به مرگ سلولی تغییرات بیان ژنهای آپوپتوزیس Bax و Bcl-2 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیان ژن پرو آپوپتوزیس Bax در سلولهای تیماری افزایش یافت. در حالیکه بیان ژن آنتی آپوپتوزیس Bcl-2 کاهش یافت. در تحقیقی مشابه نیز نشان داده شد که نانو ذرات نقره سنتز شده با روش سبز منجر به مهار ژنهای Bcl-2 و افزایش بیان ژن Bax میشود (6). این نتایج همسو با یافتههای پژوهش حاضر میباشد.
نتیجه گیری
نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که نانوذرات نقره پوشش دار شده با کورکومین منجر به مهار تکثیر و القای آپوپتوزیس از مسیر وابسته به کاسپاز در سلولهای A2780 میشود.
تشکر و قدردانی
از همکاران مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی- تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، صمیمانه سپاسگزاری میشود.
)