سلول و بافت
فصلنامه

تمایز عصبی سلول‌های بنیادی کارسینومای جنینی در سیستم کشت سه‌بعدی

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

فائزه عزیزی 1
حمیدرضا جلیل 1
سیدجمال مشتاقیان 1
علی دوست‌محمدی 2
فریبا اسماعیلی 3

1 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441

2 2- دانشگاه شهرکرد، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی مواد، شهرکرد، ایران

3 1- دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441

10.52547/JCT.7.3.301
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه استفاده از داربست نانولوله کربنی ترکیب شده با پلی­وینیل­الکل/کیتوزان  (CS/PVA/CNT)الکتروریسی شده  به‏ منظور تمایز عصبی سلول­های بنیادی برای کاربردهای بالقوه مهندسی بافت عصبی بود.
مواد و روش‏ها: به‏منظور القای تمایز عصبی، سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 روی داربست CS/PVA/CNT کشت داده شدند. جهت بررسی فنوتیپ عصبی از رنگ ­آمیزی کرزیل ­ویوله و برای ارزیابی بیان نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین از روش ایمنوفلورسنس استفاده شد.
نتایج: شکل ظاهری عصبی سلول­های متمایز شده به‏­وسیله رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله تایید شد. سلول­های مذکور به نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین واکنش ایمنی دادند.
نتیجه­گیری: این بررسی استفاده بالقوه از ترکیب مهندسی بافت و درمان با سلول بنیادی را به‏منظور بهبود بیماری­های زوال عصبی پیشنهاد می­کند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

زیست ­مواد
تمایز عصبی
سلول­های کارسینومای جنینی
نشانگرهای ویژه عصبی
کیتوسان/پلی­وینیل ­الکل/نانولوله­کربنی

عنوان مقاله English

Neuronal differentiation of embryonal carcinoma stem cells in three-dimensional culture system

نویسندگان English

F Azizi 1
H.R Jalil 1
S.J Moshtaghian 1
A Doostmohammadi 2
F Esmaeili 3
1 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441
2 دانشگاه شهرکرد، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی مواد، شهرکرد، ایران
3 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، اصفهان، ایران، کد پستی: 8174673441
چکیده English

Aim: The aim of this study was to use carbon nanotube incorporated electrospun chitosan/polyvinyl alcohol (CS/PVA/CNT) to induce neural differentiation of the stem cells for potential neural tissue engineering applications.
Material and Methods: P19 embryonal carcinoma (EC) stem cells were cultured on the CS/PVA/CNT scaffold to induce neuronal differentiation. Cresyl violet staining was used to investigate neuronal phenotype and immunoflourescence technique was carried out to evaluate expression of β-tubulin, a neural specific marker.
Results: Cresyl violet staining confirmed the neuronal morphology of the differentiated cells. These cells were immunoreactive to neuron specific marker, β-tubulin.
Conclusion: the findings suggested the potential use of combined tissue engineering and stem cell therapy to improve deficits in neurodegenerative diseases.
 

کلیدواژه‌ها English

Biomaterials
Neuronal differentiation
Embryonal carcinoma cells
Neural specific markers
Chitosan/polyvinyl alcohol/carbon nanotube

مقدمه

آسیب­های سیستم عصبی از علل عمده مرگ و میر در جهان محسوب می­شوند. تاکنون روش­های مختلفی برای درمان بیماری­های عصبی کشف شده است. برخی از این روش­ها عبارتست از کاهش سطح پروتئین­های تجمع یافته با استفاده از محدودسازی نفوذپذیری سد خونی-مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به‏منظور حمایت از نورون­های آسیب دیده و همچنین دارو درمانی (1-3). از جمله روش­های درمانی دیگر استفاده از سلول­های بنیادی است که امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت‏های عصبی مرکزی آسیب دیده فراهم آورده است. تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی نیاز به تحقیق و پژوهش فراوان دارد. در سال­های اخیر روش­های بسیاری برای تولید سلول­های عصبی از سلول­های چند توان در محیط آزمایشگاه به‏کار گرفته شده است (4-6). مهندسی بافت عصب یکی از امیدوار کننده­ترین روش­ها برای درمان ضایعات سیستم عصبی مرکزی است. در سیستم کشت ­سه­بعدی، کشت و رشد سلول روی بستری که ماتریکس خارج سلولی (ECM) Extracellular) matrix) را شبیه­سازی می­کند و داربست نامیده می­شود، انجام می­گیرد. توزیع سه­ بعدی و رشد سلول­ها درون داربست متخلخل از اهمیت بالینی بسیاری برای مهندسی بافت عصب برخوردار است. در این زمینه داربست­های قابل کاشت در درمان بسیاری از بیماری­های سیستم عصبی مرکزی از جمله پارکینسون، آلزایمر و آسیب­های وارده به مغز به‏کار برده شده­اند (7). ساختار و خواص داربست به اهمیت و حساسیت بافت و بارهایی که در بدن موجود زنده روی آن وارد می­شود وابسته است. از آنجایی‏که داربست به‏عنوان زمینه متخلخل مصنوعی و موقت برای هدایت رشد ­سه­بعدی بافت به‏کار می­رود، موادی که شباهت زیادی با بافت آسیب دیده دارند به‏عنوان مهم­ترین کاندید برای تعویض بافت مطرح می­شوند (8). چالشی که در برابر مهندسین بافت قرار دارد مربوط به ترکیب پیچیده خواص مورد نیاز برای داربست‏های ایده­آل است. این مسئله به‏خصوص در مهندسی بافت استخوان یعنی جایی‏که توان داربست و قابلیت تحمل بار مکانیکی مورد نیاز است اهمیت دارد (9). استفاده از مواد طبیعی به‏عنوان داربست مشکلاتی مثل خطرات عفونت­زایی، پایداری زیستی و مکانیکی، زیست ­سازگاری و تحمیل هزینه­ را در پی دارد. مواد و سرامیک­های متخلخل استفاده­های زیادی در کاربردهای زیستی- پزشکی از جمله بازسازی بافت استخوان پیدا کرده­اند. اما با وجود پیشرفت­های فراوانی که در زمینه تولید داربست­های زیست­سازگار برای تکثیر انواع سلول‏های موجود در بافت­های مختلف حاصل شده است، تولید داربستی که قادر باشد کلیه­ی شرایط ماتریکس ­خارج ­سلولی طبیعی را درسیستم عصبی مرکزی به‏طور مصنوعی ایجاد کند هنوز با مشکلات بیشماری روبه­روست. در این میان، ظهور و گسترش علوم و فناوری نانو موجب شده است تا راهکارهای موثری برای ساخت داربست­های سه­بعدی با پایه نانوکامپوزیت پلیمرهای زیست­تخریب‏‏پذیر زیست­سازگار به‏وجود آید. نانومواد ساختارهایی با اندازه یک تا صد نانومتر هستند که در صورت طراحی درست قادرند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مناسب ارائه دهند. خواص ایده­آل داربست برای بازسازی عصب
زیست­سازگاری، التهاب کمتر، زیست ­تخریب­پذیری قابل کنترل، تولید محصولات غیرسمی، تخلخل برای عروق و مهاجرت سلول و ماتریکس سه­بعدی با خواص مکانیکی مناسب مشابه ماتریکس خارج سلولی است (10و11). در این پژوهش از میان طیف وسیع پلیمرهای قابل استفاده در مهندسی بافت عصبی، ترکیب کیتوسان / پلی­وینیل الکل / نانولوله کربنی (CS/PVA/CNT) (Chitosan/polyvinyl alcohol/carbon nanotube  به‏عنوان داربست انتخاب شد. استفاده از ترکیب پلیمری دو ماده مذکور به علت تشکیل ساختار هیدروژلی (Hydrogel structure) مشابه ECM و نرخ مناسب زیست­ تخریب­پذیری از اهمیت بی‏شماری برخوردار است. با استفاده از نانوکامپوزیت CS/PVA به‏دلیل زیست­سازگاری مناسب و عدم سمیت، امکان رشد سلول­های U373 و اتصال مناسب آن‏ها به نانوکامپوزیت برای ترمیم آسیب وارده به اعصاب محیطی فراهم شده ­است (12). کیتوسان پلیمری خطی با ساختاری ساکاریدی است که از هیدرولیز پلیمر طبیعی کیتین  به‏دست می­آید. به‏دلیل وجود گروه­های آمینی در کیتوسان این پلیمر دارای خصوصیات منحصر به‏فردی است که از آن جمله می­توان به قابلیت زیستی، غیرسمی بودن و سازگاری با سلول­ها و بافت­ها اشاره نمود (13و 14). با وجود این، به‏دلیل نامناسب بودن پاره­ای از خصوصیات فیزیکی این پلیمر از جمله قابلیت کششی و ارتجاعی، استفاده از کیتوسان در برخی از زمینه­های مهندسی بافت با محدودیت‏‏هایی مواجه است. از این رو می­بایست برای ارتقای خصوصیات  فیزیکی و شیمیایی آن از ترکیب کیتوزان و نوعی پلیمر سنتتیک همچون PVA استفاده شود. از PVA به‏دلیل نرخ زیست­سازگاری/زیست­تخریب­پذیری مناسب می­توان در زمینه­های مختلف پزشکی بهره گرفت. PVA دارای خصوصیات آب­دوستی مناسب بوده و قابلیت بالایی در تشکیل فیبر دارد. سلول کشت شده روی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در این پژوهش، سلول­های سرطانی جنینی P19 بود. سلول­های کارسینومای جنینی (EC)(Embryonal carcinoma cells) مانند دیگر سلول­های بنیادی نامیرا بوده و قدرت تکثیر بالایی در محیط کشت دارند (15). از ویژگی­های بارز این سلول­ها پرتوان (Pluripotent) بودن و همچنین تکثیر و تمایز آن‏ها در محیط کشت است. بنابراین سلول‏های P19 کاندید خوبی برای تمایز عصبی هستند. هدف از این مطالعه استفاده از داربست کیتوسان/پلی‏وینیل­الکل/نانولوله­کربنی به‏منظور تمایز عصبی سلول­های بنیادی برای کاربردهای بالقوه مهندسی بافت عصبی بود. سلول­های تمایز یافته سپس از نظر بروز فنوتیپ عصبی و بیان نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین بررسی شدند.

مواد و روش­ها

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19: رده سلولی P19 در محیط کشت α-MEM ( α-modified Eagle's medium:Gibco, 11900- 073) و غلظت ده درصد سرم جنینی گاو (fetal bovine serum: Sigma, 10270-106) و مخلوط آنتی­بیوتیکی پنی­سیلین /استرپتومایسین (Penicillin G: Sigma, P3032/ Streptomycin: Sigma, S1277) کشت و در دمای 37 درجه سانتی­گراد و فشار پنج درصد CO2  انکوبه شد. سلول­ها­ پس از رسیدن به تراکم مناسب واکشت شدند.

تولید اجسام شبه­جنینی: برای تولید اجسام شبه­جنینی (Embryoid bodies) از روش کشت معلق استفاده شد. بدین‏منظور سلول­های P19 در پتری ­دیش­های باکتریولوژی محتوی محیط کشت α-MEM همراه با ده درصد سرم کشت داده شدند (104×5/2 سلول در یک میلی­لیتر)(6). از آنجایی‏که در این پتری­دیش­ها سلول به بستر کشت نمی­چسبد، سلول­ها تمایل دارند به یکدیگر چسبیده و تجمعات سلولی یا اجسام شبه­جنینی تشکیل دهند.

تمایز عصبی سلول­های P19 با استفاده از سیستم کشت  ­سه­بعدی: رده سلول بنیادی P19 در محیط کشت α-MEM همراه با سه درصد سرم جنینی گاو روی داربست کشت داده شد. تشکیل اجسام شبه­جنینی گامی ضروری در پروتکل‌های تمایزی سلول‌های بنیادی است. به‏همین دلیل در ابتدا سلول‌ها به‏صورت معلق و بدون حضور داربست کشت شدند تا این اجسام تولید شوند. سپس تعداد سه تا پنج جسم شبه­جنینی روی هر داربست منتقل و تحت شرایط میزان 5 درصد، CO2و دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوباتور نگه‏داری شد. بعد از اطمینان از چسبندگی اجسام شبه­جنینی، محیط کشت با محیط حاوی سه درصد سرم تعویض شد. نگه‏داری از سلول‌ها تا رسیدن تراکم سلولی به هفتاد تا هشتاد درصد ادامه داشت.

رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله: به‏‌منظور بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی حاصل از تمایز سلول­های بنیادی در کشت سه­بعدی از رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل ­ویوله (cresyl violet: Merck, 3653684) که اجسام نیسل (Nissl bodies) را در سلول­های عصبی رنگ‌آمیزی می‏کند، استفاده شد. پس از شستشو با PBS سلول­ها با استفاده از اتانول 70 درصد به‏مدت ده دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس به‏مدت سه تا ده دقیقه در محلول کرزیل­ ویوله (کرزیل ­ویوله 25/0 درصد، اسید استیک­ گلاسیال 8/0 درصد، استات­سدیم 6/0 میلی­مولار، آب مقطر 100 سانتی­مترمکعب) انکوبه شدند. برای مشاهده مستقیم و تصویربرداری سلول­های رنگ شده از میکروسکوپ واژگون (Inverted microscope) استفاده شد. پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به صورت میانگین± انحراف معیار گزارش شد.

ایمنوفلورسنس: ایمنوفلورسنس روشی دیگر جهت شناسایی نشانگرهای اختصاصی سلول­های عصبی در محیط کشت است. آنتی­بادی­ اولیه مورد استفاده در این روش آنتی­بادی مونوکلونال ضد بتاتوبولین­III موش (mouse anti β-III tubulin monoclonal antibody: Abcam, ab7751) بود. ایمنوگلوبولینIgG) G) کونژوگه شده با فلورسئین­ایزوتیوسیانات (FITC-conjugated anti-mouse IgG: Sigma, F9137FITC: ) به‏عنوان آنتی­بادی­ ثانویه استفاده شد. برای انجام ایمنوفلورسنس در ابتدا سلول­ها در پلیت­های 12 خانه­ای حاوی داربست کشت شدند. سپس با استفاده از محلول چهار درصد پارافرمالدئید به‏مدت نیم ساعت در درجه حرارت اطاق تثبیت و بعد از آن سه بار با محلول PBS ایمنوهیستوشیمی شستشو شدند. از محلول بلاک­کننده برای پوشاندن جایگاه­های آنتی­ژن­ غیراختصاصی استفاده شد. جهت ایجاد نفوذپذیری، سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول 3/0 درصد تریتون X-100 در PBS و در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، انکوباسیون سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول ده درصد سرم نرمال بز در PBS انجام شد. نمونه­ها بعد از چسباندن با گلیسرول 70 درصد در محلول PBS با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شدند. جهت اطمینان از درستی نتایج حاصله، در نمونه­های کنترل آنتی­بادی­ اولیه حذف شد.

نتایج

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19

سلول­های P19 پس از انتقال به ظروف مخصوص کشت به کف آن چسبیده و به سرعت شروع به تکثیر نمودند. این سلول­ها که دارای شکل چندوجهی هستند (شکل 1 الف و ب) حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت تشکیل کلونی‏های سلولی را آغاز کردند (شکل 1 ج و د). پس از رسیدن کلونی­ها به نقطه تلاقی با هم، سلول‏ها واکشت شدند.

 

 شکل 1: تصویر میکروسکوپ نوری واژگون از کشت و تکثیر تدریجی سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 (پیکان) در محیط کشت 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. سلول­ها بلافاصله بعد از کشت به‏صورت انفرادی به بستر کشت می‏چسبند. الف: بعد از مدتی سلول­ها شروع به تکثیر می­کنند، ب: کلونی­هایی که پس از تکثیر سلول­های P19 در محیط کشت ظاهر می­شوند، ج و د: کلونی سلولی حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت حاوی 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. بزرگنمایی: الف و ب، ×400، ج، ×100، ، د، ×250،

تولید اجسام شبه­جنینی

کشت معلق سلول­های سرطانی جنینی P19 در پتری دیش­های باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه­جنینی شد. سلول‏های P19 در محیط کشت α-MEM ده درصد سرم به بستر کشت نمی­چسبند، بلکه به یکدیگر ­چسبیده و تجمعات سلولی تحت عنوان اجسام شبه­جنینی ایجاد می­کنند (شکل2).

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از تجمعات سلولی یا جسم شبه­جنینی (پیکان) تشکیل شده از سلول­های P19 در محیط کشت  𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. الف: یک جسم شبه­جنینی پیش از چسبیدن به بستر کشت، ب: یک جسم شبه­جنینی پس از چسبیدن به بستر کشت. سر پیکان سلول­هایی را که از اطراف جسم جنینی در حال تکثیر هستند نشان می‏دهد. بزرگنمایی: الف، ×40، ب، ×100.

 

داربست  

داربست­های مورد استفاده در مهندسی بافت به‏عنوان مشابهی از ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی ایفا می‏کنند. مهندسی بافت به معنی استفاده از داربستی است که می­تواند در محل نقص کاشته شده و بافت آسیب دیده را در مکان ترمیم کند. این داربست­ باید به‏عنوان الگوی سه­بعدی موقتی برای چسبیدن سلول­ها، تکثیر و مهاجرت آن­ها و سرانجام شکل­گیری بافت جدید عمل نماید. برای ساخت داربست از روش الکتروریسی استفاده شد. تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 3 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 3: تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ از نمونه داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/ نانولوله­کربنی در دو بزرگنمایی­ مختلف. نانولوله­کربنی در داربست­های مهندسی بافت عصب به‏عنوان جزء رسانا و هدایت­کننده پیام عصبی نقش ایفا می­کند.

 

 

کشت سه­بعدی سلول­های بنیادی P19

سلول­های بنیادی P19 در پتری­دیش­ محتوی داربست در محیط کشتα-MEM  و سه درصد سرم جنینی گاو کشت داده شدند. شکل 4 الف اتصال و چسبندگی اجسام شبه­جنینی روی داربست نانوکامپوزیتی و سلول­هایی که از اطراف این اجسام در حال تکثیر هستند را نشان می­دهد. تصویر سلول­های بنیادی کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 4 ب نشان داده شده است. گستردگی و شیوه قرارگیری سلول­ها بر روی داربست دلیل بر مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول­ها است. این نتایج نشان می­دهد داربست­های تهیه شده محیط و بستر بسیار مطلوبی را برای اتصال و رشد سلول­ها فراهم کرده­اند.

 

 

 

شکل 4: تصویر میکروسکوپ نوری از اتصال و چسبندگی الف: جسم شبه­جنینی (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره). سلول­هایی­که از اطراف جسم شبه­جنینی در حال تکثیر هستند به‏خوبی درون داربست جای گرفتند (سر پیکان)، ب: سلول­های بنیادی P19 (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره) که به‏خوبی درون داربست جای گرفتند. بزرگنمایی: الف، ×100، ب، ×250.

 

 

 

بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی توسط رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله

جهت شناسایی سلول­های عصبی حاصل از تمایز از روش‏های مختلف استفاده می­شود. از جمله این روش­ها رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله است که اجسام نیسل سلول­های عصبی را به رنگ بنفش در می­آورد (شکل 5). پس از رنگ­آمیزی با کرزیل­ ویوله، سلول­های عصبی همراه با زواید سلولی خود به‏رنگ بنفش درآمدند. سلول­های کشت روی داربست که به این رنگ پاسخ مثبت داده­اند با دو بزرگنمایی پایین (شکل 5 الف) و بالا (شکل 5 ب) نشان داده شده­اند.

 

 

شکل 5: تصویر میکروسکوپ نوری از رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله جهت شناسایی سلول­های عصبی (پیکان) و غیرعصبی (سرپیکان) در داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی. بزرگنمایی: الف، ×100، ، ب، ×400.

 

 

پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد (نمودار 1).نتایج نشان داد که میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیت (CNT) بیشتر از  میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (WS) بوده و این اختلاف از نظر آماری معنادار است (3=n و 5/0>ρ).

 

 

نمودار 1: مقایسه­ی درصد سلول­های عصبی در داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی (CNT) و بدون داربست (WS) توسط رنگ‏آمیزی کرزیل­ویوله. میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت سه­بعدی بیشتر از میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (بدون داربست) بود و از نظر آماری اختلاف معناداری نشان داد (3=n و 5/0>ρ). حروف کوچک انگلیسی نشان دهنده اختلاف معنی‏دار بین گروه­های مختلف است.

 

 

بررسی بیان پروتئین­های اختصاصی عصبی در سلول­های تمایزیافته به روش ایمنوفلورسنس

ایمنوفلورسنس روش مناسبی جهت شناسایی سلول­های عصبی در محیط کشت است. سلول­های حاصل از تمایز در معرض آنتی­بادی­ اولیه (ضد بتاتوبولین3) و ثانویه (کونژوگه شده با ماده فلورسنت) قرار گرفتند تا بیان نشانگر بتاتوبولین3 در آن­ها ارزیابی شود. بتاتوبولین3 ویژه مغز در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر اختصاصی برای نورون­هاست. مقاطع رنگ­آمیزی شده به‏­وسیله­ میکروسکوپ فلورسنس بررسی و تصویربرداری شدند (شکل 6). همچنین برای اطمینان از درستی نتایج به‏دست آمده گروهی به‏عنوان گروه کنترل منفی که در آن آنتی­بادی اولیه حذف شده بود در نظر گرفته شد (شکل 7). در این گروه سلول­ها هیچگونه واکنش فلورسنتی از خود نشان ندادند. 

 

 

شکل 6: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره). این تصاویر بیان نشانگر عصبی بتاتوبولین3 را نشان می­دهد. بتاتوبولین3 ویژه مغز است و در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر مناسبی برای شناسایی نورون­هاست. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: بیان بتاتوبولین3 با استفاده از آنتی­بادی ضد بتاتوبولین3 ، ج: رنگ­آمیزی هسته با استفاده از هوخست، د: تصویر مرکب از (ب) و (ج).  بزرگنمایی ×1000.

 

 

شکل7: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) به‏عنوان گروه کنترل منفی که بدون آنتی­بادی اولیه انجام گرفت. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: همان میدان دید با فیلتر فلورسنس و بدون استفاده از آنتی­بادی اولیه‏، ج: رنگ‏آمیزی هسته با استفاده از رنگ اختصاصی هوخست انجام شد. بزرگنمایی ×100.

 

 

 بحث

کشت و تمایز سلول­های بنیادی در محیط آزمایشگاه و سپس پیوند سلول­های تمایز یافته امیدهای تازه­ای را برای درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله اختلالات سیستم عصبی فراهم نموده است. از طرف دیگر استفاده از ساختارهای سه­بعدی برای کشت سلول­های پیوندی، شرایط رشد، تکثیر و تمایز سلولی را به وضعیت طبیعی درون بدن نزدیک­تر می­نماید (16). به‏منظور تولید داربست مناسب برای پیوند و نیل به درمان موثر با استفاده از آن هنوز انجام تحقیقات پایه­ای گسترده­ای مورد نیاز است. پروژه حاضر در این راستا طراحی و ارائه شده است. در این پروژه پس از کشت ­سه­بعدی سلول­های P19 و بررسی میزان زنده‏مانی و تمایز آن­ها روی داربست، این سلول­ها از نظر بروز فنوتیپ عصبی مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج حاصل از این پروژه نشان داد که داربست کیتوسان /پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی برای تمایز عصبی سلول­های P19 مفید است؛ زیرا این داربست می­تواند باعث برقراری اتصالات ­سلولی و همچنین تکثیر، سازمان­یابی و تمایز عصبی سلول­ها شود. سلول­های P19، همانند سایر سلول­های بنیادی نامیرا و فناناپذیر هستند. این سلول­ها به سرعت در محیط کشت تکثیر شده و می­توانند تحت شرایط مناسب به تمام انواع سلول­ها تمایز یابند. سلول­های P19  در مطالعات گسترده­ای به‏منظور تمایز به انواع سلول­ها به‏ویژه سلول عصبی مورد استفاده قرار گرفته­اند (6، 17، 18). اجتماعات سلولی P19 پس از انتقال به ظروف کشت به بستر چسبیده و بعد از 12 تا 24 ساعت کلونی­های سلولی را تشکیل می­دهند. در مهندسی بافت عصبی به داربست­هایی نیاز است که با وجود داشتن ساختار فیزیکی و شیمیایی مناسب، از پایداری مطلوب نیز برخوردار باشند (19). در این پژوهش از نانو لوله­های­ کربنی تک جداره به‏دلیل خواص منحصر به فرد آن‏ها برای تقویت و پایداری نانوکامپوزیت کیتوسان/­پلی­وینیل­ا­لکل استفاده شد. استفاده از نانو لوله­های‏ کربنی در داربست­های مهندسی بافت عصب علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی داربست، رفتار سلول­های عصبی را نیز بسیار تحت تاثیر قرار می­دهد. در پروژه حاضر سازگاری زیستی داربست­ نانوکامپوزیتی با سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی (رده P19) مورد بررسی قرار گرفت. گستردگی و شیوه قرارگیری سلول­ها روی داربست، نشان از مناسب بودن بستر نانو الیاف کامپوزیتی برای سلول­ها است. وجود نانو لوله­های ­کربنی، علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی، رسانایی لازم را نیز برای بدنه داربست ایجاد می­کند و به این ترتیب امکان برقراری ارتباط میان سلول­های عصبی را تسهیل می­نماید. ساخت کانال هدایت عصبی زیست­تخریب­پذیر بر اساس کیتین/کیتوسان مهندسی بافت عصبی را بهبود بخشیده است (20). در مدل حیوانی نقص عصب سیاتیک توسط پیوند عصب مصنوعی، پلی از مخلوط کیتوسان/پلی­گلیکولیک­اسید به اندازه سی میلی‏متر زده شد (21). جایو و همکاران (22) با استفاده از داربست زیست­تخریب­پذیر کیتوسان/پلی­گلیکولیک­اسید اقدام به ایجاد پل دراز مدت در عصب سیاتیک آسیب دیده موش صحرایی نمودند و با بهره­گیری از بررسی­های بافت­شناسی و سنجش الکتروفیزیولوژی بازیابی عملکردی آن را بررسی کردند. نتایج نشان داد که نقص عصب سیاتیک بعد از مدتی برطرف شد. اولین بار در ایران متقی طلب و همکاران (12)، داربست کامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی را برای کاربرد در مهندسی بافت عصب معرفی کردند. در پژوهش آن­ها رشد سلول­های عصبی طبیعی مشتق از مغز انسان روی داربست مذکور بررسی و تایید شد. سپس داربست کامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی به‏روش الکتروریسی ساخته و مشخص شد که سلول­های L929 نسبت به این داربست پاسخ مناسبی از خود نشان می­دهند. همچنین تکثیر سلولی روی داربست­های دارای نانولوله­های­کربنی بیشتر از داربست­های بدون نانولوله بود (23). بر اساس برخی گزارش­ها نانولوله­های­کربنی سمی هستند (24). ولی برخی عقیده دارند که این نانولوله­ها نه تنها اثر سمی ندارند، بلکه برای رشد سلولی بسیار مفیدند (25). نتایج حاصل از این مطالعه نیز مفید بودن نانو لوله­های مذکور در کشت سلول­های بنیادی و القای تمایز در آن­ها را به اثبات رساند. در پژوهش حاضر بعد از القای عصبی در سلول­های بنیادی توسط داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی و تایید اولیه فنوتیپ عصبی این سلول­ها، تعداد سلول­های تمایز یافته روی داربست با استفاده از رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله شمارش شد. کرزیل­  ویوله اجسام نیسل که ویژه سلول عصبی است را رنگ­آمیزی می­کند. مطالعه­ای که توسط اسماعیلی و همکاران (5) صورت گرفت، نشان داد که سلول­های بنیادی P19 پس از تمایز به سلول­های عصبی به رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند. با استفاده از این رنگ­آمیزی اختصاصی تمایز سلول­های کارسینومای جنینی P19 به سلول­های عصبی روی داربست­ نانوکامپوزیتی تایید و مشاهده شد که این داربست نقش به‏سزایی در تمایز عصبی دارد. در این پژوهش میزان تمایز سلول­های P19 به سلول­های عصبی روی داربست و گروه کنترل (بدون داربست) تفاوت چشم‏گیری داشت و مشاهده شد که داربست باعث القای تمایز عصبی شده است.

علاوه بر بررسی مورفولوژیکی، سلول­های عصبی حاصله در این پژوهش از نظر بیان نشانگر اختصاصی بتاتوبولین3، مورد ارزیابی قرار گرفتند. با استفاده از روش ایمنوفلورسنس بیان این پروتئین در این سلول­ها ارزیابی شد. سلول­های P19 تمایز نیافته دارای شکل چندوجهی هستند و آنتی­ژن­های جنینی را در سطح خود بیان می‏کنند. بسیاری از این آنتی­ژن­ها در سلول­های زایای نورواپیتلیال بیان می­شوند. بتاتوبولین3 ویژه مغز است. ایزوفرم پروتئین بتاتوبولین3 در بیشتر زواید عصبی بافت‏های بالغ وجود داشته و نشانگر دیگری برای نورون‏هاست. در مطالعه­ای که توسط بخشعلی­زاده و همکاران (6) صورت گرفت، ردیابی پروتئین ویژه سلول‏های عصبی بتاتوبولین3 به‏روش ایمنوفلورسنس بیان این پروتئین­ اختصاصی عصبی را در سلول­های تمایز یافته نشان داد.

نتیجه گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که نانو لوله­های کربنی ترکیب شده با داربست نانوالیاف کیتوسان/پلی­وینیل­الکل با قطر نانومتری و تخلخل بالا می­تواند ضمن تامین خواص مکانیکی مناسب، بستری مفید برای رشد سلولی فراهم کند و به‏طور بالقوه گزینه­ای بسیار مطلوب جهت استفاده در مهندسی بافت عصب باشد. وجود نانو لوله ­کربنی، علاوه بر ارتقای خواص مکانیکی، رسانایی لازم را نیز برای بدنه داربست ایجاد می­کند و به این ترتیب امکان برقراری ارتباط میان سلول­های عصبی را تسهیل می­نماید.

تشکر و  قدردانی

این پژوهش در دانشکده علوم دانشگاه اصفهان انجام شده است. بدین­وسیله از تمام کسانی که ما را در انجام این طرح یاری نمودند به‏ویژه سرکار خانم قربانی کارشناس محترم آزمایشگاه قدردانی می­شود.

  1. Brandt R. Cytoskeletal mechanisms of neuronal degeneration. Cell Tissue Res. 2001; 305(2): 255-65.
  2. Skovronsky DM, Lee VMY, Trojanowski JQ. Neurodegenerative diseases: new concepts of pathogenesis and their therapeutic implications. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2006; 1: 151-70.
  3. Vickers JC, King AE, Woodhouse A, Kirkcaldie MT, et al. Axonopathy and cytoskeletal disruption in degenerative diseases of the central nervous system. Brain Res Bull. 2009; 80(4): 217-23.
  4. Mansergh FC, Wride MA, Rancourt DE. Neurons from stem cells: implications for understanding nervous system development and repair. Biochem Cell Biol. 2000; 78(5): 613-28.
  5. Esmaeili F, Tiraihi T, Movahedin M, Mowla SJ. Selegiline induces neuronal phenotype and neurotrophins expression in embryonic stem cells. Rejuv Res. 2006; 9(4): 475-84.
  6. Bakhshalizadeh S, Esmaeili F, Houshmand F, Shirzad H, et al. Effects of selegiline, a monoamine oxidase B inhibitor, on differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells, into neuron-like cells. In Vitro Cell Dev-An. 2011; 47(8): 550-7.
  7. Orive G, Anitua E, Pedraz JL, Emerich DF. Biomaterials for promoting brain protection, repair and regeneration. Nat Rev Neurosci. 2009; 10(9): 682-92.
  8. Zhang L, Webster TJ. Nanotechnology and nanomaterials: promises for improved tissue regeneration. Nano today. 2009; 4(1): 66-80.
  9. Dhariwala B, Hunt E, Boland T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue Eng. 2004; 10(9-10): 1316-22.
  10. Amado S, Simoes MJ, da Silva PASA, Luis AL, et al. Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model. Biomaterials. 2008; 29(33): 4409-19.
  11. Wen X, Tresco PA. Fabrication and characterization of permeable degradable poly (DL-lactide-co-glycolide)(PLGA) hollow fiber phase inversion membranes for use as nerve tract guidance channels. Biomaterials. 2006; 27(20): 3800-9.
  12. Mottaghitalab F, Mottaghitalab V, Farokhi M, Amiralian N, et al. Fabrication of chitosan/poly (vinyl alcohol)-carbon nanotube nanocomposites for neural tissue regeneration. Modares J Med Sci: Pathobiol. 2010; 12(4): 59-69.
  13. Lee JS, Choi KH, Ghim HD, Kim SS, et al. Role of molecular weight of atactic poly (vinyl alcohol)(PVA) in the structure and properties of PVA nanofabric prepared by electrospinning. J Appl Polym Sci. 2004; 93(4): 1638-46.
  14. Naebe M, Lin T, Tian W, Dai L, et al. Effects of MWNT nanofillers on structures and properties of PVA electrospun nanofibres. Nanotechnology. 2007; 18(22): 225605.
  15. Rudnicki MA, McBurney MW. Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines. In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson EJ (ed.). IRL Press: Oxford; 1987; 19–49.
  16. Kumari A, Yadav SK, Yadav SC. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids Surf B Biointerfaces. 2010; 75(1): 1-18.
  17. Ebrahimie M, Esmaeili F, Cheraghi S, Houshmand F, et al. Efficient and Simple Production of Insulin-Producing Cells from Embryonal Carcinoma Stem Cells Using Mouse Neonate Pancreas Extract, As a Natural Inducer. PloS one. 2014; 9(3): e90885, Doi:10.1371/journal.pone.0090885.
  18. Mansouri A, Esmaeili F, Nejatpour A, Houshmand F, et al. Differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells into insulin-producing cells promoted by pancreas-conditioned medium. J Tissue Eng Regen Med.  2016; 8, DOI: 10.1002/term.1927:600-12.
  19. Leipzig ND, Wylie RG, Kim H, Shoichet MS. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 2011; 32(1): 57-64.
  20. Freier T, Montenegro R, Koh HS, Shoichet MS. Chitin-based tubes for tissue engineering in the nervous system. Biomaterials. 2005; 26(22): 4624-32.
  21. Wang X, Hu W, Cao Y, Yao J, et al. Dog sciatic nerve regeneration across a 30-mm defect bridged by a chitosan/PGA artificial nerve graft. Brain. 2005; 128(8): 1897-910.
  22. Jiao H, Yao J, Yang Y, Chen X, et al. Chitosan/polyglycolic acid nerve grafts for axon regeneration from prolonged axotomized neurons to chronically denervated segments. Biomaterials. 2009; 30(28): 5004-18.
  23. Liao H, Qi R, Shen M, Cao X, et al. Improved cellular response on multiwalled carbon nanotube-incorporated electrospun polyvinyl alcohol/chitosan nanofibrous scaffolds. Colloids Surf B Biointerfaces. 2011; 84(2): 528-35.
  24. Jia G, Wang H, Yan L, Wang X, et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ sci technol. 2005; 39(5): 1378-83.
  25. Shi Kam NW, Jessop TC, Wender PA, Dai H. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J Am Chem Soc. 2004; 126(22): 6850-1.

  • تاریخ دریافت 03 بهمن 1395

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما