مقدمه

آسیب­های سیستم عصبی از علل عمده مرگ و میر در جهان محسوب می­شوند. تاکنون روش­های مختلفی برای درمان بیماری­های عصبی کشف شده است. برخی از این روش­ها عبارتست از کاهش سطح پروتئین­های تجمع یافته با استفاده از محدودسازی نفوذپذیری سد خونی-مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به‏منظور حمایت از نورون­های آسیب دیده و همچنین دارو درمانی (1-3). از جمله روش­های درمانی دیگر استفاده از سلول­های بنیادی است که امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت‏های عصبی مرکزی آسیب دیده فراهم آورده است. تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی نیاز به تحقیق و پژوهش فراوان دارد. در سال­های اخیر روش­های بسیاری برای تولید سلول­های عصبی از سلول­های چند توان در محیط آزمایشگاه به‏کار گرفته شده است (4-6). مهندسی بافت عصب یکی از امیدوار کننده­ترین روش­ها برای درمان ضایعات سیستم عصبی مرکزی است. در سیستم کشت ­سه­بعدی، کشت و رشد سلول روی بستری که ماتریکس خارج سلولی (ECM) Extracellular) matrix) را شبیه­سازی می­کند و داربست نامیده می­شود، انجام می­گیرد. توزیع سه­ بعدی و رشد سلول­ها درون داربست متخلخل از اهمیت بالینی بسیاری برای مهندسی بافت عصب برخوردار است. در این زمینه داربست­های قابل کاشت در درمان بسیاری از بیماری­های سیستم عصبی مرکزی از جمله پارکینسون، آلزایمر و آسیب­های وارده به مغز به‏کار برده شده­اند (7). ساختار و خواص داربست به اهمیت و حساسیت بافت و بارهایی که در بدن موجود زنده روی آن وارد می­شود وابسته است. از آنجایی‏که داربست به‏عنوان زمینه متخلخل مصنوعی و موقت برای هدایت رشد ­سه­بعدی بافت به‏کار می­رود، موادی که شباهت زیادی با بافت آسیب دیده دارند به‏عنوان مهم­ترین کاندید برای تعویض بافت مطرح می­شوند (8). چالشی که در برابر مهندسین بافت قرار دارد مربوط به ترکیب پیچیده خواص مورد نیاز برای داربست‏های ایده­آل است. این مسئله به‏خصوص در مهندسی بافت استخوان یعنی جایی‏که توان داربست و قابلیت تحمل بار مکانیکی مورد نیاز است اهمیت دارد (9). استفاده از مواد طبیعی به‏عنوان داربست مشکلاتی مثل خطرات عفونت­زایی، پایداری زیستی و مکانیکی، زیست ­سازگاری و تحمیل هزینه­ را در پی دارد. مواد و سرامیک­های متخلخل استفاده­های زیادی در کاربردهای زیستی- پزشکی از جمله بازسازی بافت استخوان پیدا کرده­اند. اما با وجود پیشرفت­های فراوانی که در زمینه تولید داربست­های زیست­سازگار برای تکثیر انواع سلول‏های موجود در بافت­های مختلف حاصل شده است، تولید داربستی که قادر باشد کلیه­ی شرایط ماتریکس ­خارج ­سلولی طبیعی را درسیستم عصبی مرکزی به‏طور مصنوعی ایجاد کند هنوز با مشکلات بیشماری روبه­روست. در این میان، ظهور و گسترش علوم و فناوری نانو موجب شده است تا راهکارهای موثری برای ساخت داربست­های سه­بعدی با پایه نانوکامپوزیت پلیمرهای زیست­تخریب‏‏پذیر زیست­سازگار به‏وجود آید. نانومواد ساختارهایی با اندازه یک تا صد نانومتر هستند که در صورت طراحی درست قادرند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مناسب ارائه دهند. خواص ایده­آل داربست برای بازسازی عصب
زیست­سازگاری، التهاب کمتر، زیست ­تخریب­پذیری قابل کنترل، تولید محصولات غیرسمی، تخلخل برای عروق و مهاجرت سلول و ماتریکس سه­بعدی با خواص مکانیکی مناسب مشابه ماتریکس خارج سلولی است (10و11). در این پژوهش از میان طیف وسیع پلیمرهای قابل استفاده در مهندسی بافت عصبی، ترکیب کیتوسان / پلی­وینیل الکل / نانولوله کربنی (CS/PVA/CNT) (Chitosan/polyvinyl alcohol/carbon nanotube  به‏عنوان داربست انتخاب شد. استفاده از ترکیب پلیمری دو ماده مذکور به علت تشکیل ساختار هیدروژلی (Hydrogel structure) مشابه ECM و نرخ مناسب زیست­ تخریب­پذیری از اهمیت بی‏شماری برخوردار است. با استفاده از نانوکامپوزیت CS/PVA به‏دلیل زیست­سازگاری مناسب و عدم سمیت، امکان رشد سلول­های U373 و اتصال مناسب آن‏ها به نانوکامپوزیت برای ترمیم آسیب وارده به اعصاب محیطی فراهم شده ­است (12). کیتوسان پلیمری خطی با ساختاری ساکاریدی است که از هیدرولیز پلیمر طبیعی کیتین  به‏دست می­آید. به‏دلیل وجود گروه­های آمینی در کیتوسان این پلیمر دارای خصوصیات منحصر به‏فردی است که از آن جمله می­توان به قابلیت زیستی، غیرسمی بودن و سازگاری با سلول­ها و بافت­ها اشاره نمود (13و 14). با وجود این، به‏دلیل نامناسب بودن پاره­ای از خصوصیات فیزیکی این پلیمر از جمله قابلیت کششی و ارتجاعی، استفاده از کیتوسان در برخی از زمینه­های مهندسی بافت با محدودیت‏‏هایی مواجه است. از این رو می­بایست برای ارتقای خصوصیات  فیزیکی و شیمیایی آن از ترکیب کیتوزان و نوعی پلیمر سنتتیک همچون PVA استفاده شود. از PVA به‏دلیل نرخ زیست­سازگاری/زیست­تخریب­پذیری مناسب می­توان در زمینه­های مختلف پزشکی بهره گرفت. PVA دارای خصوصیات آب­دوستی مناسب بوده و قابلیت بالایی در تشکیل فیبر دارد. سلول کشت شده روی داربست کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در این پژوهش، سلول­های سرطانی جنینی P19 بود. سلول­های کارسینومای جنینی (EC)(Embryonal carcinoma cells) مانند دیگر سلول­های بنیادی نامیرا بوده و قدرت تکثیر بالایی در محیط کشت دارند (15). از ویژگی­های بارز این سلول­ها پرتوان (Pluripotent) بودن و همچنین تکثیر و تمایز آن‏ها در محیط کشت است. بنابراین سلول‏های P19 کاندید خوبی برای تمایز عصبی هستند. هدف از این مطالعه استفاده از داربست کیتوسان/پلی‏وینیل­الکل/نانولوله­کربنی به‏منظور تمایز عصبی سلول­های بنیادی برای کاربردهای بالقوه مهندسی بافت عصبی بود. سلول­های تمایز یافته سپس از نظر بروز فنوتیپ عصبی و بیان نشانگر ویژه عصبی بتاتوبولین بررسی شدند.

مواد و روش­ها

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19: رده سلولی P19 در محیط کشت α-MEM ( α-modified Eagle's medium:Gibco, 11900- 073) و غلظت ده درصد سرم جنینی گاو (fetal bovine serum: Sigma, 10270-106) و مخلوط آنتی­بیوتیکی پنی­سیلین /استرپتومایسین (Penicillin G: Sigma, P3032/ Streptomycin: Sigma, S1277) کشت و در دمای 37 درجه سانتی­گراد و فشار پنج درصد CO₂  انکوبه شد. سلول­ها­ پس از رسیدن به تراکم مناسب واکشت شدند.

تولید اجسام شبه­جنینی: برای تولید اجسام شبه­جنینی (Embryoid bodies) از روش کشت معلق استفاده شد. بدین‏منظور سلول­های P19 در پتری ­دیش­های باکتریولوژی محتوی محیط کشت α-MEM همراه با ده درصد سرم کشت داده شدند (10⁴×5/2 سلول در یک میلی­لیتر)(6). از آنجایی‏که در این پتری­دیش­ها سلول به بستر کشت نمی­چسبد، سلول­ها تمایل دارند به یکدیگر چسبیده و تجمعات سلولی یا اجسام شبه­جنینی تشکیل دهند.

تمایز عصبی سلول­های P19 با استفاده از سیستم کشت  ­سه­بعدی: رده سلول بنیادی P19 در محیط کشت α-MEM همراه با سه درصد سرم جنینی گاو روی داربست کشت داده شد. تشکیل اجسام شبه­جنینی گامی ضروری در پروتکل‌های تمایزی سلول‌های بنیادی است. به‏همین دلیل در ابتدا سلول‌ها به‏صورت معلق و بدون حضور داربست کشت شدند تا این اجسام تولید شوند. سپس تعداد سه تا پنج جسم شبه­جنینی روی هر داربست منتقل و تحت شرایط میزان 5 درصد، CO₂و دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوباتور نگه‏داری شد. بعد از اطمینان از چسبندگی اجسام شبه­جنینی، محیط کشت با محیط حاوی سه درصد سرم تعویض شد. نگه‏داری از سلول‌ها تا رسیدن تراکم سلولی به هفتاد تا هشتاد درصد ادامه داشت.

رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله: به‏‌منظور بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی حاصل از تمایز سلول­های بنیادی در کشت سه­بعدی از رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل ­ویوله (cresyl violet: Merck, 3653684) که اجسام نیسل (Nissl bodies) را در سلول­های عصبی رنگ‌آمیزی می‏کند، استفاده شد. پس از شستشو با PBS سلول­ها با استفاده از اتانول 70 درصد به‏مدت ده دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند. سپس به‏مدت سه تا ده دقیقه در محلول کرزیل­ ویوله (کرزیل ­ویوله 25/0 درصد، اسید استیک­ گلاسیال 8/0 درصد، استات­سدیم 6/0 میلی­مولار، آب مقطر 100 سانتی­مترمکعب) انکوبه شدند. برای مشاهده مستقیم و تصویربرداری سلول­های رنگ شده از میکروسکوپ واژگون (Inverted microscope) استفاده شد. پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به صورت میانگین± انحراف معیار گزارش شد.

ایمنوفلورسنس: ایمنوفلورسنس روشی دیگر جهت شناسایی نشانگرهای اختصاصی سلول­های عصبی در محیط کشت است. آنتی­بادی­ اولیه مورد استفاده در این روش آنتی­بادی مونوکلونال ضد بتاتوبولین­III موش (mouse anti β-III tubulin monoclonal antibody: Abcam, ab7751) بود. ایمنوگلوبولینIgG) G) کونژوگه شده با فلورسئین­ایزوتیوسیانات (FITC-conjugated anti-mouse IgG: Sigma, F9137FITC: ) به‏عنوان آنتی­بادی­ ثانویه استفاده شد. برای انجام ایمنوفلورسنس در ابتدا سلول­ها در پلیت­های 12 خانه­ای حاوی داربست کشت شدند. سپس با استفاده از محلول چهار درصد پارافرمالدئید به‏مدت نیم ساعت در درجه حرارت اطاق تثبیت و بعد از آن سه بار با محلول PBS ایمنوهیستوشیمی شستشو شدند. از محلول بلاک­کننده برای پوشاندن جایگاه­های آنتی­ژن­ غیراختصاصی استفاده شد. جهت ایجاد نفوذپذیری، سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول 3/0 درصد تریتون X-100 در PBS و در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، انکوباسیون سلول­ها به‏مدت نیم ساعت با محلول ده درصد سرم نرمال بز در PBS انجام شد. نمونه­ها بعد از چسباندن با گلیسرول 70 درصد در محلول PBS با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شدند. جهت اطمینان از درستی نتایج حاصله، در نمونه­های کنترل آنتی­بادی­ اولیه حذف شد.

نتایج

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19

سلول­های P19 پس از انتقال به ظروف مخصوص کشت به کف آن چسبیده و به سرعت شروع به تکثیر نمودند. این سلول­ها که دارای شکل چندوجهی هستند (شکل 1 الف و ب) حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت تشکیل کلونی‏های سلولی را آغاز کردند (شکل 1 ج و د). پس از رسیدن کلونی­ها به نقطه تلاقی با هم، سلول‏ها واکشت شدند.

 شکل 1: تصویر میکروسکوپ نوری واژگون از کشت و تکثیر تدریجی سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی P19 (پیکان) در محیط کشت 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. سلول­ها بلافاصله بعد از کشت به‏صورت انفرادی به بستر کشت می‏چسبند. الف: بعد از مدتی سلول­ها شروع به تکثیر می­کنند، ب: کلونی­هایی که پس از تکثیر سلول­های P19 در محیط کشت ظاهر می­شوند، ج و د: کلونی سلولی حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت حاوی 𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. بزرگنمایی: الف و ب، ×400، ج، ×100، ، د، ×250،

تولید اجسام شبه­جنینی

کشت معلق سلول­های سرطانی جنینی P19 در پتری دیش­های باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه­جنینی شد. سلول‏های P19 در محیط کشت α-MEM ده درصد سرم به بستر کشت نمی­چسبند، بلکه به یکدیگر ­چسبیده و تجمعات سلولی تحت عنوان اجسام شبه­جنینی ایجاد می­کنند (شکل2).

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از تجمعات سلولی یا جسم شبه­جنینی (پیکان) تشکیل شده از سلول­های P19 در محیط کشت  𝛂-MEM و ده درصد سرم جنینی گاو. الف: یک جسم شبه­جنینی پیش از چسبیدن به بستر کشت، ب: یک جسم شبه­جنینی پس از چسبیدن به بستر کشت. سر پیکان سلول­هایی را که از اطراف جسم جنینی در حال تکثیر هستند نشان می‏دهد. بزرگنمایی: الف، ×40، ب، ×100.

داربست  

داربست­های مورد استفاده در مهندسی بافت به‏عنوان مشابهی از ماتریکس خارج سلولی نقش مهمی ایفا می‏کنند. مهندسی بافت به معنی استفاده از داربستی است که می­تواند در محل نقص کاشته شده و بافت آسیب دیده را در مکان ترمیم کند. این داربست­ باید به‏عنوان الگوی سه­بعدی موقتی برای چسبیدن سلول­ها، تکثیر و مهاجرت آن­ها و سرانجام شکل­گیری بافت جدید عمل نماید. برای ساخت داربست از روش الکتروریسی استفاده شد. تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 3: تصویر میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ از نمونه داربست نانوکامپوزیتی الکتروریسی شده کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/ نانولوله­کربنی در دو بزرگنمایی­ مختلف. نانولوله­کربنی در داربست­های مهندسی بافت عصب به‏عنوان جزء رسانا و هدایت­کننده پیام عصبی نقش ایفا می­کند.

کشت سه­بعدی سلول­های بنیادی P19

سلول­های بنیادی P19 در پتری­دیش­ محتوی داربست در محیط کشتα-MEM  و سه درصد سرم جنینی گاو کشت داده شدند. شکل 4 الف اتصال و چسبندگی اجسام شبه­جنینی روی داربست نانوکامپوزیتی و سلول­هایی که از اطراف این اجسام در حال تکثیر هستند را نشان می­دهد. تصویر سلول­های بنیادی کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی در شکل 4 ب نشان داده شده است. گستردگی و شیوه قرارگیری سلول­ها بر روی داربست دلیل بر مناسب بودن بستر نانوالیاف کامپوزیتی برای سلول­ها است. این نتایج نشان می­دهد داربست­های تهیه شده محیط و بستر بسیار مطلوبی را برای اتصال و رشد سلول­ها فراهم کرده­اند.

شکل 4: تصویر میکروسکوپ نوری از اتصال و چسبندگی الف: جسم شبه­جنینی (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره). سلول­هایی­که از اطراف جسم شبه­جنینی در حال تکثیر هستند به‏خوبی درون داربست جای گرفتند (سر پیکان)، ب: سلول­های بنیادی P19 (پیکان) روی داربست نانوکامپوزیتی (ستاره) که به‏خوبی درون داربست جای گرفتند. بزرگنمایی: الف، ×100، ب، ×250.

بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی توسط رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله

جهت شناسایی سلول­های عصبی حاصل از تمایز از روش‏های مختلف استفاده می­شود. از جمله این روش­ها رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله است که اجسام نیسل سلول­های عصبی را به رنگ بنفش در می­آورد (شکل 5). پس از رنگ­آمیزی با کرزیل­ ویوله، سلول­های عصبی همراه با زواید سلولی خود به‏رنگ بنفش درآمدند. سلول­های کشت روی داربست که به این رنگ پاسخ مثبت داده­اند با دو بزرگنمایی پایین (شکل 5 الف) و بالا (شکل 5 ب) نشان داده شده­اند.

شکل 5: تصویر میکروسکوپ نوری از رنگ­آمیزی کرزیل ­ویوله جهت شناسایی سلول­های عصبی (پیکان) و غیرعصبی (سرپیکان) در داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی. بزرگنمایی: الف، ×100، ، ب، ×400.

پس از رنگ­آمیزی،سلول­هایی که به کرزیل ­ویوله پاسخ مثبت دادند با استفاده از میکروسکوپ نوری شمارش و درصد آن­ها نسبت به تعداد کل سلول­ها محاسبه شد. رنگ­آمیزی و شمارش سلولی حداقل پنج بار تکرار شد. اعداد حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه و دانکن تجزیه و تحلیل و نتایج به‏صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد (نمودار 1).نتایج نشان داد که میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت شده روی داربست­ نانوکامپوزیت (CNT) بیشتر از  میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (WS) بوده و این اختلاف از نظر آماری معنادار است (3=n و 5/0>ρ).

نمودار 1: مقایسه­ی درصد سلول­های عصبی در داربست­ نانوکامپوزیتی کیتوسان/پلی­وینیل­الکل/نانولوله­کربنی (CNT) و بدون داربست (WS) توسط رنگ‏آمیزی کرزیل­ویوله. میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کشت سه­بعدی بیشتر از میانگین درصد سلول­های عصبی در گروه کنترل (بدون داربست) بود و از نظر آماری اختلاف معناداری نشان داد (3=n و 5/0>ρ). حروف کوچک انگلیسی نشان دهنده اختلاف معنی‏دار بین گروه­های مختلف است.

بررسی بیان پروتئین­های اختصاصی عصبی در سلول­های تمایزیافته به روش ایمنوفلورسنس

ایمنوفلورسنس روش مناسبی جهت شناسایی سلول­های عصبی در محیط کشت است. سلول­های حاصل از تمایز در معرض آنتی­بادی­ اولیه (ضد بتاتوبولین3) و ثانویه (کونژوگه شده با ماده فلورسنت) قرار گرفتند تا بیان نشانگر بتاتوبولین3 در آن­ها ارزیابی شود. بتاتوبولین3 ویژه مغز در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر اختصاصی برای نورون­هاست. مقاطع رنگ­آمیزی شده به‏­وسیله­ میکروسکوپ فلورسنس بررسی و تصویربرداری شدند (شکل 6). همچنین برای اطمینان از درستی نتایج به‏دست آمده گروهی به‏عنوان گروه کنترل منفی که در آن آنتی­بادی اولیه حذف شده بود در نظر گرفته شد (شکل 7). در این گروه سلول­ها هیچگونه واکنش فلورسنتی از خود نشان ندادند. 

شکل 6: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره). این تصاویر بیان نشانگر عصبی بتاتوبولین3 را نشان می­دهد. بتاتوبولین3 ویژه مغز است و در بیشتر زواید عصبی بافت­های بالغ وجود داشته و نشانگر مناسبی برای شناسایی نورون­هاست. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: بیان بتاتوبولین3 با استفاده از آنتی­بادی ضد بتاتوبولین3 ، ج: رنگ­آمیزی هسته با استفاده از هوخست، د: تصویر مرکب از (ب) و (ج).  بزرگنمایی ×1000.

شکل7: تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های تمایزیافته (پیکان) حاصل کشت سلول­های بنیادی کارسینومای جنینی رده P19 روی داربست­ نانوکامپوزیتی (ستاره) به‏عنوان گروه کنترل منفی که بدون آنتی­بادی اولیه انجام گرفت. الف: سلول P19 تمایز یافته با استفاده از نور مرئی، ب: همان میدان دید با فیلتر فلورسنس و بدون استفاده از آنتی­بادی اولیه‏، ج: رنگ‏آمیزی هسته با استفاده از رنگ اختصاصی هوخست انجام شد. بزرگنمایی ×100.