نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران
2 دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، سنندج، ایران
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق بررسی بیان ژنهای کلیدی 1-دی‌اکسی دی‌زایلولز-5-فسفات ردوکتوایزومراز (DXR) و گاماترپینن‌سنتاز (GTS) در مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول در گیاه مرزه تابستانه (Satureja hortensis) یکی از گیاهان دارویی مهم متعلق به خانواده نعناعیان و از منابع مهم ترکیبات فوق بود.
مواد و روش‌ها: تیمار گیاهان با اسیدسالیسیلیک، متیل جاسمونات و اشعه UV-B انجام گرفت. RNA از گیاهان شاهد و تحت تیمار استخراج شد و سپس cDNA سنتز شد. آغازگرها جهت جداسازی و بیان ژنهای DXR و GTS طراحی شدند. بیان ژنهای مورد مطالعه بهروش RT-PCR نیمه کمی بررسی شد.
نتایج: قطعاتی از ژنهای GTS و DXR توالی یابی شدند. نتایج بررسی بیان ژن در سطح رونوشت نشان داد که هر دو ژن DXR و GTS در بافت‌های مختلف (ریشه، ساقه، برگ و گل آذین) دارای بیانهای متفاوتی هستند و در بافت‌های هوایی بهویژه گل آذین و برگ دارای بیان بیشتری می‌باشند. همچنین بیان این ژن‌ها تحت تاثیر الیسیتورهای غیر زیستی شامل اسید سالیسیلیک، متیل جاسمونات و اشعه UV-B تغییرات چشمگیری نشان می‌دهد.
نتیجهگیری: تحت شرایط کنترل شده با بهکارگیری الیسیتورهای غیر زیستی شامل اسید سالیسیلیک، متیل جاسمونات و اشعه UV-B می‌توان بیان ژنهای DXR و GTS را بالا برده و احتمالا تولید متابولیت ثانویه تیمول و کارواکرول را افزایش داد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Differential expression of the key genes involved in the biosynthesis of monoterpenes in different tissues and in response to abiotic elicitors in Summer savory (Satureja hortensis)
نویسندگان [English]
- S Ghobadi 1
- i A Marouf 2
- M Majd 2
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران
2 دانشگاه کردستان، دانشکده کشاورزی، سنندج، ایران
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the expression of key genes, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase )DXR( and gamma-terpinene synthase (GTS), involve in thymol and carvacrol biosynthesis pathway in Summer savory (Satureja hortensis). This species is one of the important medicinal plants of the Lamiaceae family, and consider as an important source of the mentioned compounds.
Material and Methods: Plants were treated with salicylic acid, methyl jasmonate and UV-B rays. RNAs were extracted from control and treated plants and cDNAs were synthesized. Primers were designed for gene isolation and expression studies. Transcript expression analyses for the DXR and GTS were performed using semi-quantitative RT-PCR method.
Results: A partial segment for DXR and GTS genes was sequenced. The relative gene expression analyses showed differential expression of both genes at transcript level in different tissues (roots, stems, leaves and inflorescence), with higher levels of expression in leaf and inflorescence. The expression of both genes under the effect of abiotic elicitors including salicylic acid, methyl jasmonate and UV-B rays exhibited significant alteration.
Conclusion: Under controlled conditions, using abiotic elicitors such as: salicylic acid, methyl jasmonate and UV-B radiation could elevate the level of gene expression and possibly increase the production of secondary metabolite such as: thymol and carvacrol.
کلیدواژه‌ها [English]
- Gene expression
- Metabolic engineering
- Monoterpen
- Summer savory
- thymol and carvacrol
مقدمه
گیاه مرزه تابستانه با نام علمی Satureja hortensis یک گیاه معطر و یک ساله، متعلق به خانواده نعناعیان Lamiaceae)) است. قسمتهای هوایی مرزه و برخی دیگر از گونههای جنس Satureja از قدیم به‌عنوان طعم دهنده غذاها و همچنین در طب سنتی مورد استفاده قرار گرفته اند (1). بررسیهای فیتوشیمیایی بر روی مرزه آشکار کرده است که مقادیر زیادی ترکیبات مونوترپن فنولیک در اسانس آن وجود دارد (2). از مهم‌ترین ترکیبات مونوترپنی که در مرزه یافت شده‌است می‌توان به تیمول (Thymol )، کارواکرول (Carvacrol)، گاماترپینن ( γ-terpinen )، پی سایمن (p-Cymene )، آلفاپینن (α-pinene ) و بتاپینن β-pinene ) اشاره کرد (2و3). مونوترپن‌ها ترکیباتی بیرنگ، چربی دوست و فرار هستند که در دفاع در برابر انواع گیاهخواران و عوامل بیماری‌زا نقش دارند (4). تیمول وکارواکرول به‌عنوان اجزای اصلی اسانس مرزه در بیشتر مطالعات معرفی شده اند (5-7). تیمول وکارواکرول دارای خواص اکسیداتیو، ضد میکروبی، ضد سرفه، خلط آور، ضد اسپاسم و ضد باکتری و قارچ هستند (8-11). اثرات ضدمیکروبی آن‌ها بهدلیل نفوذپذیر نمودن غشای سلول است که می‌توانند با کاتیون‌های سطح غشا کلاته شده و فعالیت‌های حیاتی را مختل کنند (12). همچنین مشخص شده است که این ترکیبات باعث تغییرات در مورفولوژی و تجمع هیف در قارچها شده و در نتیجه قطر هیف کاهش یافته و باعث تجزیه دیواره می‌شوند (13). بنابراین تیمول و کارواکرول که اجزای اصلی اسانس‌های مرزه می‌باشند به‌عنوان مهارکننده‌ی رشد در برابر باکتری‌ها و قارچ‌های مختلف شناخته شده اند.
بهطور کلی ترپنوییدها و ازجمله مونوترپن‌ها در گیاهان علاوه بر مسیر موالونات (mevalonate ) که منجر به تولید ایزوپنتیل پیرو فسفات Isopentenyl pyrophosphate (IPP) می‌شود از طریق یک مسیر دیگر که مسیر غیر موالونات یا مسیر متیل اریتریتول فسفات (2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate) نامیده می‌شود، سنتز می‌شوند (14). مسیر MEP در پلاستیدها اتفاق می افتد و شامل هفت واکنش آنزیمی دخیل برای تشکیل ایزوپنتنیل دی‌فسفات (Isopentenyl diphosphate ) (IPP) و دی‌متیل آلیل دی‌فسفات (Dimethylallyl diphosphate) (DMAPP) از پیرووات (Pyruvate) و دی‌گلیسرآلدهید 3-فسفات D-glyceraldehyde 3-phosphate)(GAP) می‌باشد (شکل 1). واکنشی که توسط آنزیم 1-دی‌اکسی دی‌زایلولز-5-فسفات ردوکتوایزومراز (1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase) (DXR) کاتالیز می شود یک واکنش مهم است و دارای نقش کلیدی در کنترل بیوسنتز ایزوپرنوئیدها در پلاستیدها است (15-16). بیوسنتز ترپنوییدها با اتصال سر به دم ایزوپنتیل دی‌فسفات (IPP) به ایزومر دی‌متیل آلیل دی‌فسفات (DMAPP) ادامه می یابد که با این اتصال ژرانیل دی‌فسفات (Geranyl diphosphate ) (GPP) حاصل می‌شود. علاوه بر این، از اتصال GPP با واحدهای IPP، پرنیل دی‌فسفات‌های (Prenyl diphosphates ) بزرگ‌‌‍تر مانند فارنسیل دی‌فسفات (Farnesyl diphosphate ) (FPP) و ژرانیل ژرانیل دی‌فسفات (Geranylgeranyl diphosphate ) (GGPP) را تشکیل می‌شوند (14). محصول GPP و FPP طی فرآیندهای حلقوی شدن به‌ترتیب اسکلت‌های مونوترپن و سز‌کویی‌ترپنی را تشکیل میدهند. تشکیل تیمول و کارواکرول با مونوترپن گاماترپینن (γ-terpinen ) (GT) شروع شده و در ادامه از طریق پی‌سایمن آروماتیک واکنشها بهسمت سنتز آن‌ها پیش میرود (17). گاماترپینن که بهوسیله آنزیم گاماترپینن‌سنتاز (γ-terpinen synthase ) (GTS)کاتالیز می‌شود، پیش ماده مونوترپنهای آروماتیک در ادامه مسیر بوده و بنابراین نقشی اساسی را در این مسیر ایفا مینماید (18).
شکل 1: مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول از طریق متیل اریتریتول فسفات (MEP). :pyr پیرووات، G3P: گلیسرالدهید ۳-فسفات، DXS: 1-دئوکسی گزیلولوز 5-فسفات سنتاز، DXP: 1-دئوکسی گزیلولوز 5-فسفات ، DXR: 1-دی‌اکسی دی‌زایلولز-5-فسفات ردوکتاز ، MEP: متیل اریتریتول فسفات،CMS: 2-سی متیل دی اریترول 4 فسفات سیتیدیل ترانسفراز، CDP-ME: 4-دی فسفوسیتیدیل 2-سی متیل اریترول، CMK: 4-دی فسفوسیتیدیل 2-سی متیل د-اریترول کیناز، CDP-MEP: 4-دی فسفوسیتیدیل 2-سی متیل د-اریترول 2-فسفات، MCS: 2- سی-متیل دی اریترول 2و4-سیکلودی فسفات سنتاز،:MEcPP 2- سی-متیل-دی-اریترول 2و4-سیکلودی فسفات، HDS: (ای)-4- هیدروکسی-3-متیل-بوت-2-انیل پیروفسفات سنتاز، HMB-PP: (ای)-4- هیدروکسی-3-متیل-بوت-2-انیل پیروفسفات ، HDR: (ای)-4- هیدروکسی-3-متیل-بوت-2-انیل پیروفسفات ردوکتاز، DMAPP: دی‌متیل آلیل دی‌فسفات، IPP: ایزوپنتنیل دی‌فسفات، GPP: ژرانیل دی‌فسفات.
با توجه به اهمیت تیمول و کارواکرول که دارای خواص بسیار مهمی از جمله آنتی اکسیدانت، ضد میکروب و باکتری، ضد سرفه و اسپاسم می‌باشند (8-11)، تاکنون مطالعات زیادی بر روی این ترکیبات صورت گرفته است. تیمول از مهم‌ترین روغن‌های ضروری در مرزه تابستانی است که خاصیت ضد قارچی و ضد عفونی آن از لحاظ علمی ثابت شده است. کارواکرول نیز به‌عنوان افزودنی غذایی بهدلیل خواص ضد باکتریایی آن استفاده می‌شود. با توجه به افزایش روز افزون مقاومت باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیز عوارض جانبی این داروها و همچنین استفاده رو به رشد نگهدارندههای شیمیایی غذایی که بسیاری از آن‌ها ممکن است سرطان‌زا باشند، توجه به عصاره و ترکیبات گیاهان دارویی و مواد ضد میکروبی طبیعی که حاوی تیمول و کارواکرول باشند، افزایش یافته است. در حال حاضر تولید تجاری بیشتر متابولیت‌های ثانویه از طریق گیاهان وحشی یا ارقام موجود انجام میگیرد اما روشهای بیوتکنولوژی نیز امروزه در زمینه بررسی و تولید آن‌ها مورد توجه قرار دارند که می‌توان به روشهای کشت بافت و سلول گیاهی، دستکاریهای ژنتیکی، کشت ریشههای موئین و مهندسی متابولیت اشاره کرد (19). در روش کشت بافت و سلول گیاهی علاوه بر شناخت چگونگی بیوسنتز متابولیتها و همچنین مکانیسم تنظیمی آن‌ها راهکارهای مختلفی را بهمنظور افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه می‌توان بهکار برد، که از جمله می توان استفاده از الیسیتورها، افزودن پیش سازها و بهینه سازی محیط کشت را نام برد (20). الیسیتورها مواد شیمیایی یا ترکیبات و عوامل زیستی و غیر زیستی متنوعی هستند که می‌توانند تغییرات فیزیولوژیکی و تجمع برخی ترکیبات ثانویه و فیتوآلکسینها را در گیاهان القا کنند (21). بهدلیل آنکه متابولیت‌های ثانویه نقش دفاعی را در گیاهان بر عهده دارند، مقدار آن‌ها در اثر اعمال تنش‌های زیستی و غیر زیستی افزایش می‌یابد. نقش اسیدسالیسیلیک در واکنش‌های دفاعی گیاه بهخوبی نشان داده شده است (22-23). همچنین جاسمونیک‌اسید از تنطیم‌کننده‌های رشد گیاهی نقش مهمی را در سازوکار دفاعی گیاهان نسبت به تنش‌های محیطی و به‌خصوص القای ژنهای دفاعی در مواجهه با عوامل بیماری‌زا ایفا می کند (23-24). در نتیجه الیسیتورهایی مانند اسیدسالیسیلیک و متیل جاسمونات بهطورکارآمدی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی از طریق کشتهای تحت کنترل، هیدروپونیک و کشتهای سلولی بهکار رفتهاند.
یکی دیگر از اثرات متقابل گیاهان و محیط در ارتباط با جذب اشعه های UV است. متابولیت‌های ثانویه در برابر تابش اشعههای UV و بهویژه UV-B نقش مهمی دارند و مطالعات اخیر نشان داده اند که تابش اشعه UV-B یک تنظیم کننده مهم متابولیت‌های ثانویه درگیاهان است (25). بنابراین نقش و تاثیر آن بر روی بیان ژن‌ها و تغییرات متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی اطلاعات مناسبی را در راستای افزایش متابولیت‌های ثانویه در اختیار قرار می‌دهد. بهطور کلی با توجه به اهمیت مرزه به‌عنوان یک گیاه دارویی که دارای ترکیبات مونوترپنوییدی با ارزشی مانند تیمول و کارواکرول است و همچنین نقش ژنهای DXR و GTS به‌عنوان ژنهای کلیدی در بیوسنتز مواد مذکور، تعیین توالی و بررسی میزان بیان آن‌ها تحت الیسیتورهای مختلفی مانند اسیدسالیسیلیک، جاسمونیک اسید و اشعه UV-B مهم بهنظر می‌رسد. نتایج به‌دست آمده می‌تواند در جهت افزایش و بهره‌برداری تجاری ترکیبات ترپنوییدی تیمول و کارواکرول در مرزه بهکار گرفته شود.
مواد و روش‌ها
کاشت مرزه و تیمار گیاهان با اسیدسالیسیلیک و جاسمونیک اسید: بذرهای گیاه مرزه از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. گیاهان در شرایط گلخانه در دمای حدود 20 تا 25 درجه سانتی‌گراد پرورش یافتند. اسیدسالیسیلیک و متیل‌جاسمونات به‌ترتیب با غلظت‌های 1 و 1/0 میلی‌مولار بر روی برگ‌های گیاه مرزه (در مرحله گلدهی) و در شرایط رشدی گلخانه محلول پاشی شدند. قبل از اعمال تیمار (صفر) و در 4، 12، 24 و 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها از برگ گیاهان نمونه‌گیری انجام شد. همچنین بر روی برگ گیاهان شاهد آب مقطر استریل پاشیده شد و در زمان‌های ذکر شده نمونه‌گیری انجام شد. نمونه‌های گیاهی جهت انجام مراحل بعدی در دمای 80– درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.
تیمار گیاهان با اشعه UV-B: تاثیر UV-B به‌عنوان بخشی از اشعه ماورای بنفش (Ultraviolet) که به زمین می‌رسد، بر بیان ژن در گیاه مرزه مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا در زمان قبل از شروع تابش اشعه UV-B از گیاهان نمونه برگی تهیه شد (ساعت صفر)، سپس بلافاصله تعدادی از گیاهان بهمدت 24 ساعت تحت تابش اشعه UV-Bزیر هود لامینار و تعدادی تحت تابش نور معمولی قرار داده شدند و بعد از 24 ساعت از آن گیاهان نمونه برگی تهیه شد.
استخراج RNA و ساخت cDNA: RNA از بافت‌های ریشه، ساقه، برگ و گل آذین گیاهان مورد مطالعه در مرحله گلدهی با روش تک مرحله‌ای مبتنی بر محلول ترایزول (Trizol) استخراج شد. به این صورت که به ازای 1/0 گرم از بافت تازه، 1 میلی‌لیتر ترایزول اضافه شد و پس از طی مراحل کامل استخراج، در نهایت 50 میکرولیتر آب تیمار شده با دپس (DEPC) به رسوب به‌دست آمده اضافه شد. بهمنظور به‌دست آوردن RNA خالص و عاری از DNA، نمونه‌های RNAهای جدا شده با استفاده از آنزیم DNase1 شرکت فرمنتاز (Fermentase) طبق دستورالعمل شرکت سازنده تیمار شدند. کیفیت RNA بر روی ژل آگارز 2/1 درصد تعیین و غلظت با دستگاه نانو دراپ (NanoDrop1000spectrophotometer) در طول موجهای 260 و 280 نانومتر مشخص شد. برای ساخت DNA مکمل (cDNA) از کیت سنتز cDNA شرکت سیناژن طبق دستورالعمل استفاده شد.
طراحی آغازگر ها و جداسازی ژنهای مورد مطالعه: از آن‌جا که ژنهای GTS و DXR تاکنون در جنسSatureja وخصوصا گونه مرزه تابستانه توالی‌یابی نشده‌اند، برای تعیین توالی بخشی از آن‌ها ابتدا توالی این ژن‌ها در گیاهان هم‌خانواده مرزه از سایت NCBI دریافت شد و هم‌ردیفی توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار ClustalW (26) انجام گرفت. براساس نواحی حفاظت شده این توالی‌ها و با استفاده از نرم‌افزار Primer3 (27) آغازگرها طراحی شدند. نهایتا پس از جداسازی و تعیین توالی قسمتهایی از ژنهای GTS و DXR، آغازگرهای اختصاصی جهت بررسی بیان این ژن‌ها در مرزه تابستانه طراحی شد (جدول 1). با استفاده از نرم افزار Oligo calculator دایمر و مشخصات ترمودینامیکی پرایمرها بررسی شد.
RT-PCRنیمه کمی: جهت اندازه گیری بیان ژنهای GTS و DXR به روش RT-PCR نیمه کمی از ژن عامل افزایش 1 آلفا (Elongation factor 1 alpha ) (EF1α) (28) به‌عنوان کنترل داخلی (ژن رفرنس) استفاده شد. آغازگرهای اختصاصی بهکار رفته در جدول 1 ارائه شده است. همسان‌سازی غلظت‌های cDNA جهت هماهنگ سازی کلیه واکنشها انجام گرفت. نسبتهای مواد بهکار رفته و چرخههای حرارتی در جدول 2 و جدول 3 آورده شده است.
جدول 1: مشخصات مربوط به آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی بیان ژن
|
اندازه قطعه |
دمای اتصال |
توالی آغازگر (3→ 5) |
نام آغازگر |
|
700 جفت باز |
2/61 درجه سانتی‌گراد |
GCCTTTTGTCCTTCCTCTTG |
F-DXR |
|
|
6/61 درجه سانتی‌گراد |
TCCGCTCGATGCTTGTCGC |
R-DXR |
|
300 جفت باز |
9/51 درجه سانتی‌گراد |
CTCTTGGATTCAGACTCCTCAG |
F-GTS |
|
|
9/50 درجه سانتی‌گراد |
GAGGGAGAGCCAAAGAATG |
R-GTS |
|
500 جفت باز |
7/56 درجه سانتی‌گراد |
AACCTCGACTGGTACAAGGGC |
F-EF1α |
|
|
2/56 درجه سانتی‌گراد |
GGCTCCTTCTCCAGCTCCTT |
R-EF1α |
F آغازگر مستقیم، R آغازگر معکوس
جدول 2: نوع و غلظت مواد مورد استفاده در هر واکنش PCR
|
مواد |
غلظت در محلول‌پایه |
حجم استفاده‌شده |
|
cDNA |
- |
1میکرولیتر |
|
آغازگر مستقیم یا معکوس |
pmol/µl 5 |
هرکدام میکرولیتر |
|
آنزیم تک DNA پلی‌مراز |
u/µl 10 |
1/0 میکرولیتر |
|
کلرید‌منیزیم |
mM 50 |
3/0 میکرولیتر |
|
بافر PCR |
X 10 |
میکرولیتر |
|
dNTP |
mM 10 |
2/0 میکرولیتر |
|
آب |
- |
4/5 میکرولیتر |
|
کل |
- |
10 میکرولیتر |
جدول 3: چرخه حرارتی واکنش RT-PCR نیمه کمی
|
تعداد چرخه |
مرحله |
زمان |
دما (°C) |
|
1 |
واسرشت اولیه |
4 (دقیقه) |
94 |
|
|
واسرشت |
30 (ثانیه) |
94 |
|
28 |
اتصال |
30 (ثانیه) |
* |
|
|
بسط |
** (ثانیه) |
72 |
|
1 |
بسط نهایی |
7 (دقیقه) |
72 |
*بسته به نوع ژن (جدول 1 )، ** بسته به طول ژن (60 ثانیه هر کیلو باز)
کمی کردن RT-PCRو آنالیز دادهها: عکسهای مربوط به ژل (حاصل از RT-PCR نیمه‌کمی) با استفاده از نرم‌افزار GelQuantNET به داده‌های کمی و عددی تبدیل شدند. آنالیز واریانس دادهها براساس طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. مقایسه میانگین دادهها بهروش دانکن در سطح احتمال 5 درصد )05/0 (p< و با استفاده از نرم‌افزار SPSS انجام شد. نمودارهای مناسب جهت تجزیه و تحلیل بیان ژن‌ها توسط نرم‌افزار Microsoft Excel 2010 رسم شد.
نتایج
تعیین توالی ژنهای GTSو DXRو ارزیابی آن‌ها
با توجه به اینکه قطعات تکثیر شده که دارای سایزهای پیش‌بینی شده هستند، اولین مرحله از صحیح بودن همسانه‌سازی ژن‌ها می‌باشند، جهت اطمینان از صحت ژنهای مورد مطالعه، محصولات تکثیر شده تعیین توالی شدند. نتایج تعیین توالی در شکل‌های2 و 3 ارائه شده است.
شکل2: توالی به‌دست آمده برای ژن گاماترپینن‌سنتاز در گیاه مرزه (Satureja hortensis).
شکل3: توالی به‌دست آمده برای ژن DXR در گیاه مرزه (Satureja hortensis).
جهت تایید نهایی توالی‌های به‌دست آمده برای ژنهای مورد نظر این توالی‌ها در پایگاه داده‌ای NCBI بلاست (Blast x) شدند. با توجه به e-value و درصد یکسانی توالی با سایر توالی‌های موجود در پایگاه داده، مشخص شد که توالی‌های به‌دست آمده مربوط به ژنهای GTS و DXR هستند. نتایج حاصل از بلاست و سایر اطلاعات مربوط به آن در جدول 4 و جدول 5 ارائه شده است. هم‌ردیفی ناحیه تعیین توالی شده ژنهای GTS و DXR درگیاه مرزه با همین نواحی در سایر گیاهان هم‌خانواده آن‌ها نشان داد که این ژن‌ها بسیار مشابه و حفاظت شده هستند. این نتایج نشان می‌دهد که توالی‌های معرفی شده به احتمال زیاد (با توجه به e-value ) متعلق به ژنهای GTS و DXR باشند.
جدول4: بخشی از نتایج بلاست ناحیه توالی‌یابی شده ژن GTS در مرزه
|
accession number |
Identity |
e-value |
gene (species) |
|
87% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
Gamma-terpinene synthase, chloroplastic (Origanum vulgare) |
|
|
86% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
||
|
86% |
0.0 |
||
|
85% |
0.0 |
||
|
85% |
0.0 |
||
|
78% |
0.0 |
||
|
67% |
0.0 |
sabinene synthase (Salvia pomifera) |
|
|
66% |
0.0 |
||
|
64% |
0.0 |
||
|
64% |
0.0 |
جدول 5: بخشی از نتایج بلاست ناحیه توالی‌یابی شده ژن DXRدر مرزه
بیان ژنهایGTS و DXR در بافت‌های مختلف مرزه
جهت بررسی بیان ژن در شرایط نرمال در گلخانه ابتدا از بافت‌های ریشه، ساقه، برگ و گل آذین نمونه‌گیری و سپس استخراج RNA با موفقیت انجام شد. RT-PCR نیمه‌کمی برای ژن GTS و ژن رفرنس EF1α در بافت‌های مختلف انجام شد. نتایج به‌دست آمده نشان می‌دهد که بیشترین میزان بیان به‌ترتیب در بافت‌های برگ (6/1) و گل‌آذین (4/1) و کمترین میزان بیان مربوط به بافت ریشه (8/0) و سپس ساقه (4/0) می‌باشد (شکل 4). همچنین RT-PCR نیمه‌کمی برای ژن DXR و ژن رفرنس EF1αدر بافت‌های مختلف انجام شد. نتایج به‌دست آمده برای این ژن نیز نشان می‌دهد که بیشترین میزان بیان DXR به‌ترتیب در بافت‌های گل‌آذین (8/2) و برگ (2/1) و کمترین میزان بیان مربوط به بافت ساقه (7/0) و سپس ریشه (5/0) می‌باشد (شکل 5 ).
شکل 4: نمودار نسبی بیان ژنGTSدر چهار بافت مختلف گیاه مرزه (بالا)، RT-PCR نیمه کمی برای ژن هدف GTS و ژن کنترل EF1α داخلی (پایین، باند حدود 500 جفت باز مربوط به ژن کنترل داخلی EF1α و باند حدود 300 جفت باز مربوط به ژن GTS می‌باشد).
شکل 5: نمودار نسبی بیان ژن DXRدر چهار بافت مختلف گیاه مرزه (بالا)، RT-PCR نیمه کمی برای ژن هدف DXRو ژن کنترل EF1α داخلی (پایین، باند حدود 500 جفت باز مربوط به ژن کنترل داخلی EF1α و باند حدود 700 جفت باز مربوط به ژن DXRمی‌باشد).
بیان ژنهایGTSو DXR در برگ تحت تاثیر اسید سالیسیلیک
اثر اسیدسالیسیلیک با غلظت 1 میلی‌مولار بر روی میزان بیان ژن گاماترپینن‌سنتاز در برگ‌ها و در زمان‌های متفاوت پس از اعمال تیمار بررسی شد. نتایج نشان‌داد که در گیاهان تحت تیمار و گیاهان شاهد (تیمار نشده) بیان ژن GTS دارای تغییرات معنی‌داری در سطح 5 درصد است. بهطوریکه تا 12 ساعت پس از اعمال تیمار در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد افزایش بیان مشاهده می‌شود و بعد از 24 ساعت میزان بیان کاهش می‌یابد تا در نهایت پس از 48 ساعت میزان بیان به سطح گیاهان شاهد نزدیک می‌شود و تقریبا در همان سطح 24 ساعت قرار میگیرد (شکل 6). اما در گیاهان شاهد (عدم اعمال تیمار) تفاوت معنی‌داری از لحاظ میزان بیان ژن GTS مشاهده نمیشود (شکل 6).
شکل 6: نمودار الگوی بیان نسبی ژن GTS در زمان‌های متفاوت پس از اعمال تیمار با اسیدسالیسیلیک در برگ گیاه مرزه.
حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
همچنین بررسی میزان بیان ژن DXR در برگ‌ها در اثر تیمار با اسیدسالیسیلیک با غلظت 1 میلی‌مولار نشان داد که در گیاهان تیمار شده پس از چهار ساعت افزایش بیان مشاهده می‌شود (شکل 7) و بعد از آن بیان DXR کاهش می‌یابد بهطوریکه پس از 48 ساعت از اعمال تیمار سطح بیان این ژن به سطح گیاهان تیمار نشده می‌رسد (شکل 7). بهطور کلی پس از چهار ساعت از اعمال تیمار بین گیاهان تیمار شده با تیمار نشده اختلاف قابل توجهی وجود ندارد.
شکل 7: نمودار الگوی بیان نسبی ژن DXR در زمان‌های متفاوت پس از اعمال تیمار با اسید سالیسیلیک در برگ گیاه مرزه.
حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
بیان ژنهایGTSو DXR در برگ تحت تاثیر متیل‌جاسمونات
بیان ژن GTSدر گیاهان تحت تیمار با متیل‌جاسمونات با غلظت 1/0 میلی مولار نیز بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد که بیان این ژن تحت تاثیر متیل‌جاسمونات قرار میگیرد، بهطوریکه تا 24 ساعت پس از اعمال تیمار ژن GTSافزایش بیان معنی‌داری نشان می‌دهد و سپس بعد از 48 ساعت از میزان بیان ژن کاسته شده بهطوریکه میزان آن تا سطح گیاهان تیمار نشده پایین می آید (شکل 8). اما در گیاهان تیمار نشده تفاوت معنی‌داری در سطح بیان ژن گاماترپینن‌سنتاز مشاهده نمیشود (شکل 8).
شکل 8: نمودار الگوی بیان نسبی ژن GTSدر زمان‌های متفاوت پس از اعمال تیمار با متیل‌جاسمونات در برگ گیاهان مرزه تحت تیمار و کنترل. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
همچنین اثرتیمار با متیل جاسمونات روی میزان بیان ژن DXR در شکل 9 نشان داده شده است. نتایج این بررسی نشان داد که بیان DXR در اثر اعمال تیمار متیل جاسمونات 1/0 میلی‌مولار دارای تغییرات است، بهطوریکه در 12 ساعت پس از اعمال تیمار میزان بیان ژن DXR به بالاترین سطح خود می‌رسد و سپس میزان بیان بهتدریج کاهش یافته و در 48 ساعت پس از اعمال تیمار به سطح میزان آن در گیاهان تیمار نشده نزدیک می‌شود (شکل9)، اما در گیاهان تیمار نشده اختلاف معنی‌داری در سطح بیان ژن DXR در زمان‌های متفاوت مشاهده نمیشود.
شکل 9: نمودار الگوی بیان نسبی ژن DXR در زمان‌های متفاوت پس از اعمال تیمار با متیل جاسمونات در برگ گیاهان تیمار شده و گیاهان کنترل. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
بیان ژنهایGTSو DXRتحت اشعه UV-B
آنالیز داده‌های حاصل از RT-PCR نیمه کمینشان داد که ژن GTS در گیاه مرزه تحت تابش اشعهی UV-B پس از 24 ساعت نسبت به گیاهان کنترل در ساعت صفر و نیز گیاهان کنترل در معرض 24 ساعت نور معمولی افزایش بیان نشان می‌دهد (شکل 10). بنابراین می‌توان گفت که بیان ژن مذکور 24 ساعت بعد از اعمال تابش اشعه تحت تاثیر قرار میگیرد. در گیاهان کنترل (هم قبل از اعمال تابش اشعه UV-B وهم 24 ساعت در معرض نور معمولی) یک روند یکنواخت در میزان بیان ژن GTSوجود داشت و تفاوت معنی‌داری در سطح بیان ژن در این گیاهان مشاهده نشد (شکل 10).
شکل 10: نمودار الگوی بیان نسبی ژن GTSدر برگ گیاه مرزه در زمان‌های 0 (شاهد) و پس از اعمال تیمار با اشعه UV-B.
حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
همچنین در بررسی بیان DXR در برگ گیاه مرزه تحت تیمار اشعه ی UV-B، نتایج به‌دست آمده نشان داد که بیان این ژن در گیاهان تحت UV-B پس از 24 ساعت نسبت به گیاهان کنترل (ساعت صفر) و همچنین گیاهان تحت تابش نور معمولی پس از 24 ساعت، تحت تاثیر قرار گرفته و افزایش معنی‌داری یافته است (شکل 11).
شکل 11: نمودار الگوی بیان نسبی ژن DXR در برگ گیاه مرزه در زمان‌های 0 (شاهد) و پس از اعمال تیمار با اشعه UV-B.
حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد با آزمون دانکن می‌باشد.
بحث
مرزه یک گیاه دارویی با ارزش است که دارای ترکیبات مهمی به نام مونوترپن‌ها، گروهی از متابولیت‌های ثانویه، هست که در صنایع غذایی و دارویی کاربرد ویژه ای دارند. بنابراین تقاضا برای این ترکیبات رو به افزایش است، اما بهدلیل محدودیتهایی از جمله شرایط آب و هوایی، خاک و تغییرات سطح کشت، که می‌توانند در محتوی، میزان پایین ترکیبات ثانویه و یا کاهش برداشت گیاهان مرزه موثر باشند، نیازمند بهکارگیری راهکارهای متفاوتی جهت افزایش تولید آن‌ها هستیم. روشهای متعددی از جمله کشت سلول و بافت، کشت ریشههای مویین، مهندسی ژنتیک و افزایش بیان ژن در مسیر تولید متابولیت‌های ثانویه، جهت افزایش تولید آن‌ها معرفی شده است (29-32). دست ورزی ژنتیکی در راستای افزایش متابولیت‌های ثانویه گیاهی یکی از روشهای مهم و کاربردی در عصر جدید است که در این زمینه شناسایی و دستکاری ژنتیکی ژنهای موثر در سنتز متابولیت‌های ثانویه مانند مونوترپن‌ها دارای ارزش زیادی است. بنابراین اولین گام جهت بهکارگیری روش مهندسی ژنتیک و افزایش بیان ژن‌ها در مسیر بیوسنتزی، توالی یابی و مطالعه بیان ژن‌ها بهویژه ژنهای کلیدی می‌باشد. در این راستا در گیاه مرزه توالی‌های بخشی از ژنهای DXR و GTSشناسایی و بیان آن‌ها در بافت‌ها و تحت تاثیر دو الیسیتور مهم شیمیایی اسید سالیسیلیک و متیل جاسمونات و همچنین اشعه UV-B به‌عنوان یکی از اجزای پرانرژی‌اشعه ماورای بنفش نور خورشیدی بررسی شد.
در این پژوهش برای دست یافتن به اهدف فوق، ابتدا با استفاده از توالی‌های مربوط به ژنهای گاماترپینن‌سنتاز و DXR در گیاهان خویشاوند و نزدیک به مرزه، جفت آغازگرهایی در جهت مستقیم و معکوس جهت جداسازی این ژن‌ها طراحی شد و سایر مراحل تا تعیین توالی محصولات به‌دست آمده با موفقیت انجام گرفت. مقایسه توالی اسیدآمینه به‌دست آمده برای ژن GTSبا سایر گیاهان، نشان‌دهنده بیشترین درجه یکسانی (87 درصد) با گیاهان متعلق به جنس آویشن و پونه از خانواده نعنائیان (Lamiaceae) می‌باشد. مقایسه توالی اسیدآمینه‌ای به‌دست آمده از ژن DXR نیز با توالی پروتئینی آن در سایر گیاهان نشان‌دهنده وجود درجه یکسانی بالاتر از 90 درصد با گونههای نعناع و مریم‌گلی از خانواده نعنائیان (Lamiaceae) است. بنابراین نتایج نشان می‌دهد که مشابهت بالایی بین توالی‌های پپتیدی ژنهای هدف (DXR و GTS) در مرزه با توالی‌های ثبت شده در NCBI بهویژه برای گیاهان متعلق به خانواده نعنائیان (Lamiaceae) وجود دارد که به احتمال زیاد صحت توالی‌های به‌دست آمده را تایید میکند.
در بررسی بیان نسبی ژن در مرزه، میزان بیان ژن GTSدر بافت برگ بیشتر از سایر بافت‌ها بود که این امر می‌تواند تایید کننده نقش مهم این ژن در بیوسنتز مونوترپن‌ها در برگ و احتمالا کرک‌های غده‌ای باشد. زیرا مطالعات انجام شده نشان دادهاند که اکثر گیاهان خانواده نعناعیان دارای اسانس ترشحی در کرک‌های غده‌ای موجود بر روی اندام‌های رویشی و زایشی هوایی هستند (33). در مطالعات انجام شده روی مرزه گونه Satureja horvatii نیز نشان داده شد که برگ‌ها دارای کرک‌های غده‌ای هستند که محل سنتز مونوترپن‌ها می‌باشند (34). همچنین در بررسی بیان ژن DXR میزان بیان بالایی در بافت‌های گل‌آذین و برگ‌ها نسبت به بافت‌های ریشه و ساقه مشاهده شد که بیانگر تایید محل بیوسنتز مونوترپن‌ها در این اندام‌های هوایی است. در هماهنگی با این پژوهش، مطالعه‌ای روی بیان ژن DXR در گیاه آرابیدوپسیس انجام شده که نشان‌دهنده وجود بالاترین میزان بیان در بافت گل‌آذین و پایین‌ترین میزان بیان در بافت ساقه می‌باشد (35). همچنین در گیاه جینسنگ هندی (Withania somnifera) نشان داده شد که میزان بیان ژن DXR در بافت برگ نسبت به بافت ریشه خیلی بیشتر است (36)، این امر می‌تواند بهدلیل تولید متابولیت‌های ثانویه در پلاستیدهای مستقر در برگ‌ها باشد که بهمیزان بالای بیان DXR نیاز هست و از آن‌جا که بافت ریشه عاری از این ترکیبات است، بنابراین بیان ژن DXR در بافت ریشه از سایر بافت‌ها بسیار پایینتر می‌باشد (36).
اطلاعات در مورد بیان ژنهای کلیدی موثر در مسیر متابولیت‌های ثانویه و چگونگی تنظیم بیان آن ها می‌تواند در راستای افزایش سطح آنزیمهای کد شونده بهوسیله این ژن‌ها و نهایتا افزایش متابولیت ثانویه بهکار گرفته شود. بدینمنظور بیان دو ژن GTS و DXR تحت تاثیر دو الیسیتور شیمیایی اسیدسالیسیلیک و متیل جاسمونات و همچنین اشعه UV-B به‌عنوان اشعه غالب در زمین که همیشه گیاهان در معرض آن قرار دارند، بررسی شد. اسیدسالیسیلیک و متیل جاسمونات نقش مهمی را در واکنش‌های دفاعی گیاه ایفا می‌کنند که افزایش مقدار آن‌ها منجر به تولید پیامهایی در گیاهان می‌شوند که در نهایت بیان گروههای خاصی از ژن‌ها بهویژه ژنهای دفاعی افزایش می‌یابد (21 و37). در این پژوهش هر دو ژن GTSوDXR در ابتدای اعمال تیمار اسیدسالیسیلیک (4 ساعت پس از تیمار گیاهان) افزایش بیان و سپس روند کاهشی نشان دادند. با توجه به ارتباط مستقیم بین متابولیت‌های ثانویه (مانند مونوترپن) و بیان ژنهای کلیدی (مانند GTS و DXR )، بهنظر می‌رسد که زمان مناسب اعمال تیمار در جهت افزایش مونوترپن در گیاه مرزه ابتدای اعمال تیمار با اسیدسالیسیلیک باشد. بنابراین تاثیر تیمارهای کوتاه مدت در راستای افزایش مونوترپن‌ها مفیدتر خواهد بود. در مطالعه ای که تاثیر تیمار اسیدسالیسیلیک بر گیاه جینسنگ هندی بررسی شد، بیان ژن DXR در 6 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش یافت و متعاقبا کاهش نشان داد (36)، که این نتایج تقریبا مشابه با یافته‌های این تحقیق می‌باشد. پنولاس و همکاران (38) نیز نشان دادند که متیل سالیسیلات، از مشتقات اسیدسالیسیلیک، نرخ انتشار مونوترپن در گیاه چوبی بلوط همیشه سبز (Quercus ilex) را افزایش می‌دهد. بهطور کلی نتایج نشان می‌دهندکه اسیدسالیسیلیک می‌تواند به‌عنوان یک تقویت کننده بالقوه برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان از جمله مونوترپن‌ها در مرزه استفاده شود.
در بررسی اثر متیل‌جاسمونات بر بیان ژنهای GTS و DXR در مرزه، در زمان‌های 4 تا 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش بیان معنی‌داری مشاهده شد و پس از زمان 24 ساعت یک روند کاهشی را نشان داند. در استفاده از متیل‌جاسمونات در گیاه جینسنگ هندی نیز میزان بیان ژن DXR در بافت برگ تا زمان 72 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش یافت (38). در تحقیق دیگری روی گیاه ریحان شیرین (Ocimum basilicum) از متیل‌جاسمونات به صورت محلول‌پاشی روی گیاهان استفاده شد و کل محتوای فنلی از جمله ترپنوییدها به‌صورت قابل توجهی بعد از اعمال تیمار در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش یافت (39). با توجه به این نتایج بهنظر می‌رسد که بهکار بردن تیمار متیل جاسمونات نیز می‌تواند منجر به افزایش بیان ژنهای موثر در مسیر متابولیت‌های ثانویه شده و نهایتا محتوی کل متابولیتها افزایش می‌یابد. بنابراین در مرزه می‌توان دوره 4 تا 24 ساعت را برای اعمال تیمار و افزایش بیان ژنهایی مانند GTS و DXR و نهایتا افزایش مونوترپن‌ها در نظر داشت.
گیاهان همیشه در معرض انواع تنش‌های زنده و غیر زنده هستند و متابولیت‌های ثانویه نقش مهمی در مقابله با این تنشها به‌صورت اثر متقابل با آن‌ها دارند. یکی از این اثرات متقابل گیاهان و محیط در ارتباط با جذب اشعه های UV است. متابولیت‌های ثانویه در برابر تابش اشعههای فرابنفش (UV) و بهویژه UV-B نقش مهمی دارند (25). مطالعات اخیر نشان دادهاند که تابش اشعه UV-B یک تنظیم کننده مهم متابولیت‌های ثانویه در گیاهان است (25). دوزهای پایین و در محدوده اکولوژیکی اشعه UV-B ( nm315-280 ) می‌تواند محتوی بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه از جمله ترکیبات فنلی، کاروتنوئیدها وگلوکوزینولاتها را کاملا تغییر دهد (25و40 ). بنابراین اعمال تیمار در دوز مناسب و کنترل شده اشعه UV-B ممکن است بتواند متابولیت‌های ثانویه در گیاهان را افزایش دهد. تحقیقات نشان داده اند که ژنهای کلیدی بیوسنتز فلاونوئیدها توسط اشعه UV-B افزایش بیان نشان میدهند و محتوای فلاونوئیدهای سلولی افزایش می‌یابد (25). در پژوهش حاضر که تاثیر اشعه UV-B بر بیان ژنهای GTS و DXR به‌عنوان دو ژن کلیدی در مسیر بیوسنتز مونوترپن‌ها در مرزه، مورد ارزیابی قرار گرفت، هر دو ژن تحت تاثیر قرار گرفتند و افزایش بیان چشمگیری نشان دادند. در شرایط کم UV-B در آرابیدوپسیس بیان فاکتور رونویسی HY5 افرایش نشان داده است (41). همچنین مقادیر فلاونئوئیدها، آنتوسیانیدینها و هیدروکسی بنزوئیک اسیدها درگیاهان انگور فرنگی سیاه (Ribes nigrum) که در معرض اشعه UV-B قرار گرفته بودند، افزایش محتوی نشان دادند (42). هائو و همکاران (43) در کشت کالوس گیاه Ginkgo biloba تحت تابش UV-B نشان دادند که نیتریک اکسید سنتاز و فنیل آلانین آمونیا لیاز افرایش فعالیت بیشتری دارند. در چندین گونه گیاهی دیگر نیز تولید متابولیت‌های ثانویه در پاسخ به UV-B بهخوبی مستند شده است (40، 44-45). بهطور کلی نتایج نشان میدهند که متابولیت‌های ثانویه و ژنهای مرتبط با مسیر بیوسنتزی می‌توانند تحت تاثیر اشعه UV-B قرار گرفته و افزایش نشان میدهند. روی هم رفته، نتایج اولیه اثرات تیمار گیاهان مرزه با UV-B نشان می‌دهد که پتانسیل مناسبی جهت افزایش ترکیبات با ارزش متابولیت‌های ثانویه از این طریق وجود دارد.
نتیجه گیری
درک مسیر متابولیت‌های ثانویه و چگونگی تنظیم بیان ژنهای مرتبط با آن‌ها می‌تواند در راستای تولید بیشتر متابولیت ثانویه در گیاهان دارویی بسیار موثر باشد. نتایج بررسی بیان دو ژن کلیدی (GTSو DXR) در مسیر متیل اریتریتول فسفات در پلاستیدها در گیاه مرزه تابستانه نشان داد سطوح بیان در بافت‌ها متفاوت است و همچنین اعمال الیسیتورهای غیرزیستی مختلف مانند اسید سالیسیلیک، متیل جاسمونات و اشعه UV-B می‌توانند سطح بیان این ژن‌ها را تغییر دهند. با توجه به اینکه محتوی ترکیبات ثانویه تحت تاثیر بیان ژن‌ها ی درگیر در بیوسنتز آنهاست، بنابراین می‌توان با انتخاب الیسیتورهای مناسب و اعمال آن‌ها در زمان‌های مناسب بیان ژنهای موثر در مسیر بیوسنتزی را افزایش داده و قاعدتا ترکیبات ثانویه از جمله ترکیبات مونوترپنی را در مرزه افزایش داد.
)