فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه پدافند هوایی خاتم‌الانبیاء(ص)، دانشکده علوم پایه، گروه فیزیک

2 دانشگاه کاشان، دانشکده فیزیک

چکیده

هدف: در این پژوهش از بستر زیست‌سازگار فوم گرافینی سه‌بعدی جهت کشت سلول‌های بنیادی عصبی انسان استفاده شده است.
مواد و روش­ها: فوم‌ گرافینی برای اولین بار توسط ته‌ نشینی صفحه‌های اکسید گرافینی بر روی زیر لایه‌ای از جنس پلی‌اتیلن ترفتالات (PET)تحت اشعه‌ی فرابنفش و دمای 80 درجه سانتی‌گراد ساخته‌ شده‌ است و روش ساخت صفحه­های اکسید گرافنی روش بهبود یافته هامرز است.
نتایج: با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی ضخامت فوم‌های ساخته ‌شده در حدود 10 تا 50 میکرومتر اندازه‌گیری شد که در هر میکرومتر از آن‌ها حدود 10 لایه‌ی اکسید گرافینی وجود دارد. همچنین میکروسکوپ نیروی اتمی وجود گرافین تک لایه‌ با ضخامت 4/1 نانومتر را در محلول اکسید گرافین نشان می‌دهد. طیف‌ سنجی فوتو الکترون پرتوی ایکس احیای جزئی فوم اکسید گرافینی را طی مراحل ساخت تایید می‌کند. طیف ‌سنجی رامان نیز وجود صفحه‌های اکسید گرافینی چند لایه را در ساختار فوم نشان می‌دهد. با استفاده از آزمون کششی، مدول یانگ این فوم‌ها در بهترین حالت حدود  GPa7/1 به‏دست آمد. علاوه بر این، مقاومت سطحی الکتریکی فوم‌ها با استفاده از روش پروب چهار نقطه‌ای در حدود  17-24 Ω/sq اندازه‌گیری شد.
نتیجه­گیری: با توجه به‏روش پروب چهار نقطه­ای مشخص شد این مقاومت الکتریکی برای فراهم کردن جریان الکتریکی در حدود  mA20 تحت ولتاژهایی پایین‌تر از  V5/0 به‌منظور تحریک الکتریکی سلول‌های بنیادی عصبی و تمایز آن‌ها به‏سمت نورون‌ها (به نسبت سلول­های گلیال) مناسب است. تست زاویه‌ی تماس نیز نشان داد که سطح مقطع فوم اکسید گرافینی پیچانده شده خاصیت فرا آبدوستی دارد که به القای تکثیر و تمایز موثر سلول‌های بنیادی عصبی در سرتاسر تخلخل و سطوح داربست کمک می‌کند. تصاویر فلورسانس نیز نشان دادند تحریک الکتریکی سلول‌های بنیادی عصبی منجر به رشد کواکسیال-شکل تارهای عصبی در جهتی مشخص و القای تمایز آن‌ها به‏سمت نورون‌ها شده است. این نتایج فوم گرافینی را به‌عنوان داربستی رسانا و منعطف برای بازتولید سیستم­های عصبی و مهندسی بافت پیشنهاد می­دهد.    

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Fabrication and characterization of graphene foams and using it for electrical stimulation of human neural stem cells

نویسندگان [English]

  • F Jahantigh 1
  • H Nanakar 2
  • SMB Ghorashi 2

1 دانشگاه پدافند هوایی خاتم‌الانبیاء(ص)، دانشکده علوم پایه، گروه فیزیک

2 دانشگاه کاشان، دانشکده فیزیک

چکیده [English]

Aim: In this study biocompatible 3D graphene oxide foams have been used for Human neural stem cells (hNSCs) culturing.
Material and Methods: For the first time, graphene oxide foam were fabricated by precipitation of chemically exfoliated graphene oxide sheets in an aqueous suspension onto the PET substrate at ~80 oC under UV irradiation.
Results: By using scanning electron microscopy, the thickness of these foams (with linear density of ~10 GO sheets/µm) was measured around 10-50 µm. X-Ray photoelectron spectroscopy confirmed that the UV irradiation resulted in partial reduction of the layers during fabrication process. Also Raman spectroscopy demonstrated the presence of multilayer graphene oxide sheets (≥3 layers) in the foam structure. The Young’s modulus of the foams was obtained about 1.7 GPa. Furthermore, Four probe method found that the electrical sheet resistance of the GOFs was low enough (17-24 Ω/sq). Conclusion: To produce the electrical simulation currents (~20 mA) used in differentiation of the neural stem cells into the neurons (rather than glial cells). Contact angle test also showed that rolling the GOFs resulted in formation of cross-section with superhydrophilic characteristic, inducing effective proliferation and differentiation of the hNSCs throughout the pores and interfaces of the scaffold. Moreover, Fluorescence imaging revealed that stimulating the hNSCs resulted in coaxial-like growth of the neural fibers and inducing differentiation of the neural stem cells in to the neurons.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Graphene foams
  • electrical stimulation
  • 3D Scaffolds
  • Neural stem cells

مقدمه

گرافین به‌عنوان نانو ماده‌ای دوبعدی با ساختار گرافیتی دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی ازجمله خواص الکتریکی و مکانیکی مثال‌زدنی (1 و 2)، سطح مؤثر بسیار بالا (3)، سادگی در عامل دار شدن (4) و همچنین تولید کم‌هزینه آن (5) است. بنابراین، در بخش‌های فراوانی همچون استخراج DNA/RNA(6 و 7)، انتقال دارو (8 و 9). هدف‌گیری سلول‌های سرطانی(10) و رشد سلول‌های بنیادی (11) مورداستفاده قرارگرفته است. در سال­های اخیر، لایه‌های گرافینی به‌طور موفقیت‌آمیزیبه‌عنوان داربست‌های دوبعدی در مهندسی بافت مبتنی بر سلول‌های بنیادی مورداستفاده قرارگرفته‌اند. به خاطر خواص الکتریکی ویژه‌ی گرافین که می‌تواند به‌طورمؤثری در تحریک الکتریکی نورون‌ها شرکت کند، توجه محققان به آن در حوزه ترمیم سیستم‌های عصبی جذب‌شده است. چراکه ترمیم بافت­های عصبی و نورون­ها به‌خودی‌خود صورت نمی­گیرد و ساخت بافت مصنوعی عصبی برای ترمیم نقاط و بافت­های عصبی آسیب‌دیده برای بازیابی عملکرد سیستم عصبی انسان لازم است. ازاین‌رو، تلاش­های بسیاری برای ساخت چنین بافت­هایی با استفاده از مواد مختلف صورت گرفته است. از بین موادی که تاکنون استفاده‌شده است، گرافین می‌تواند سطح زیست سازگاری برای رشد و تمایز سلول‌های عصبی تأمین کند. جذب و چسبندگی مؤثر سلول‌ها بر بستر گرافینی منجر به انتقال بارهای الکتریکی موردنیاز تحریک و تمایز عصبی می‌شود (12). برای مثال پارک و همکارانش(13) از گرافین دوبعدی به‌عنوان بستری رسانا در تمایز سلول‌های بنیادی عصبی انسان به سمت نورون‌ها (به‌جای سلول‌های گلیال) با کمک تحریک الکتریکی استفاده کردند. همچنین تزریق الکترون‌ها از ورقه‌های اکسید گرافینیتحریک‌شده توسط پرتوی لیزر پالسی نیز منجر به تمایز سلول‌های بنیادی عصبی انسان به سمت نورون‌ها شده است (14). هدف تمامی تحقیقات صورت گرفته در این حوزه، دستیابی به بافتی عصبی است که در آن تعداد نورون­ها در مقایسه به تعداد سلول­های گلیال بیشتر باشد تا خصلت پیام­رسانی بافت حفظ شود. این افزایش نسبی تعداد نورون­ها نیز به‌طورمعمول توسط تحریک الکتریکی سلول­های بنیادین در طی فرآیند تمایز سلولی صورت می­پذیرد. در این پژوهش از فوم گرافینی برای ساخت چنین بافت­های عصبی استفاده‌شده است.در سال‌های اخیر، فوم‌های گرافینی به‌طور گسترده‌ای توسعه‌یافته‌اند و به‌عنوان داربست‌های سه‌بعدی در تمایز سلول‌ها به سمت رده‌های سلولی دلخواه مورداستفاده قرارگرفته‌اند (15-17). اگرچه روش شیمیایی و معروف هامرز (Hummers) یکی از ساده‌ترین و کم‌هزینه‌ترین روش‌های ساخت اکسید گرافین و اکسید گرافین احیاشده است، اما تمام فوم‌های گرافینی‌ای که تاکنون در رشد و تمایزات سلولی مورداستفاده قرارگرفته‌اند از روش رسوب نشانی بخار شیمیایی (Chemical vapor deposition) ساخته‌شده‌اند. البته قابل‌ذکر است که دیکینو همکاران (18) فوم‌های گرافینی‌ای بنام صفحات گرافینی با استفاده از روش هامرز ساخته‌اند، اما تاکنون گزارشی مبنی بر استفاده از چنین فوم‌ها و صفحاتی به‌عنوان داربستی سه‌بعدی در رشد و تمایزات سلولی منتشرنشده است.

مواد و روش‏ها

در این پژوهش در ابتدا فوم‌ اکسید گرافینی برای اولین بار توسط ته‌نشینی لایه‌های اکسید گرافینی بر روی زیر لایه‌ای از جنس پلی‌اتیلن ترفتالات (Polyethylene terephthalate) تحت اشعه‌ی فرابنفش و دمای 80 درجه سانتی‌گراد ساخته‌شده‌ است.سپس از سمت یکی از لبه‌های آن پیچانده شده تا به‌عنوان بستری سه‌بعدی و استوانه‌ای شکل که قابلیت تکثیر و تمایز نورون‌ها در جهت محور اصلی استوانه را دارد، عمل کند. ساخت چنین فومی برای اولین بار توسط ته­نشینی لایه­های اکسید گرافینی، بدون فیلتر کردن محلول آن صورت گرفته
است. طیف‌سنجی فوتوالکترون پرتوی ایکس X-ray
photoelectron spectroscopy) به‌منظور مطالعه حالت شیمیایی کربن‌های موجود در فوم که تحت تأثیر اشعه‌ی UV(Ultraviolet)قرار داشتند، مورداستفاده قرارگرفته ‌است. میکروسکوپ الکترونی روبشیScanning electron microscope) و طیف‌سنجی رامان نیز برای تائید حضور لایه‌های گرافینی تک‌لایه و چند‌لایه در ساختار فوم به کارگرفته‌شده‌اند. مقاومت سطحی الکتریکی فوم گرافینی برای سنجش توانایی فوم در تحریک الکتریکی سلول‌های عصبی تحت ولتاژهای پایین محاسبه‌شده است. همچنین آب‌دوستی سطوح و سطح مقطع فوم 3 بعدی نیز موردبررسی قرارگرفته است. درنهایت فوم گرافینی به‌عنوان بستری سه‌بعدی در رشد جهت‌دار تارهای عصبی توسط تمایز سلول‌های بنیادی عصبی به سمت نورون‌ها به کمک تحریک الکتریکی مورداستفاده قرارگرفته است.

فعالیت‌های تجربی

ساخت فوم گرافینی سه‌بعدی: در ابتدا برای ساخت فوم سه‌بعدی محلول اکسید گرافین با استفاده از روش بهبودیافته‌ی هامرز به دست آمد. جزئیات این روش پیش‏تر در گزارش‌هایی آمده است (19). سپس محلول اکسید گرافین با غلظت حدود 5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی زیرلایه با جنس پلی‌اتیلن ترفتالات تحت دمای 80 درجه سانتی­گراد و اشعه لامپ UV(Philips, 10W)طی مدت 24 ساعت قرار گرفت. درنهایت فوم گرافینی از روی‌هم انباشته شدن لایه­های اکسید گرافینی بر روی‌هم تشکیل شد. ضخامت این فوم به‌دست‌آمده از حدود 15 تا 50 میکرومتر بود. هرچه ضخامت فوم گرافینی بیشتر بود، رنگ آن از قهوه­ای تیره به سمت سیاهی میل می­کرد. طبق گزارش پارک و همکاران (13) فوم ساخته‌شدهبه مدت 2 ساعت در محلول لامینین با غلظت 10 میکرومتر بر میلی‏لیتر در محیط کشت انکوباتور شد تا چسبندگی سلول­ها  بر روی آن بیشتر شود. سپس 3 مرتبه با محلولPBS(Phosphate-buffered saline)شسته شد. در مرحله­ی بعد فوم سه‌بعدی از پیچانده شدن فوم گرافینی حول یکی از لبه­های آن به دست آمد. این روش منجر به شکل­گیری داربست استوانه­ای شکلی با قطر خارجی در حدود 30 لایه گرافینی شد.

مشخصه یابی: برای مطالعه­ی مورفولوژی سطح مقطع فوم سه‌بعدی از SEM(TESCAN) در انرژی keV 25استفاده‌شده است. از XPS با منبع اشعه ایکس Al-Kαدر انرژی eV6/1486و در خلا حدودPa7-10 برای بررسی وضعیت اتم­های کربن موجود در ساختار فوم گرافینی کمک گرفته‌شده است. برای کالیبره کردن طیف گرفته‌شده، انرژی پیوندی قله‌ی اصلی در eV0/285 ثابت فرض شده و همه‌ی مقادیر انرژی پیوندی با خط ثابت انرژی C(1s) در eV0/285سنجیده شده است. قله‌های طیف XPS با استفاده از نرم‌افزار SDP و با در نظر گرفتن مؤلفه‌هایگاوسی پس از حذف پیش‌زمینه به حالات شیمیایی آن‌ها تفکیک‌شده‌اند. ساختار کربنی فوم نیز با استفاده از طیف­سنجی رامان(HR-800 Jobin–Yvon) با منبع Nd-YAG با طول‌موج تحریکی 532 نانومتر موردبررسی قرارگرفته است. خاصیت آب‌دوستی سطوح و سطح مقطع فوم نیز با کمک تست زاویه تماس در دمای اتاق موردمطالعه قرارگرفته است. درنهایت رسانندگی الکتریکی فوم نیز با محاسبه مقاومت سطحی لایه­های گرافینی با استفاده از فن پروب چهار نقطه­ای اندازه­گیری شده است.

کشت سلول: سلول­های بنیادی عصبی انسان (تهیه‌شده از گیبکو) در محیط مناسبی که متشکل از 2درصد سرم آلبومینِ گاوی(BSA)، 1 درصد پنی‌سیلین/ استرپتومایسین، 2 میلی‏متر گلوتامین، 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر عامل رشد اپیدرمال و 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر عامل رشدفیبروبلاست عمومی(bFGF) است، تحت اتمسفر CO2و دمای 37 درجه سانتی­گراد کشت داده شدند. در طی فرآیند کشت، محیط کشت هر سه روز یک‌بار از نو تازه شده است. سلول­های بنیادی عصبی با چگالی تقریبی104×6  سلول در هر سانتی­متر مربع طبق دفترچه راهنمای گیبکو با شماره کاتالوگ N7800-100,200 در بین لایه­های فوم پیچیده نشده کاشته شدند و سپس فوم دوباره پیچیده شد. فرآیند تکثیر سلول­ها به مدت 72 ساعت ادامه پیدا کرد.

تمایز و تحریک الکتریکی سلول­های بنیادی: بلافاصله پس از فرآیند تکثیر، تمایز عصبی سلول­های بنیادی با برداشتن عامل­های رشد از محیط کشت شروع شد (20). مدت‌زمان تمایز در حدود 2 هفته در نظر گرفته شد. برای تحریک الکتریکی در ابتدا محیط کشت با محیطی خارجی شامل 140 میلی‏مولNaCl،  5 میلی‏مول KCL، 2 میلی‏مول CaCl2، 5/1 میلی‏مولMgCl2، 15 میلی‏مول اسید اسکوربیک، 10 میلی‏مول گلوکز و 10 میلی‏مول HRPESو باpH حدود 5/6 جایگزین شد. سپس یک سری پالس­­های ولتاژ کاتدی 100 میلی‌ثانیه‌ای در بازه‌های زمانی 10 ثانیه‌ای به دو انتهای فوم پیچیده شده که  به‌طور الکتریکی باسیم‌های طلا و چسب نقره به ژنراتور متصل شده بود، اعمال شد. مشخص شد که آستانه‌ی تحریک الکتریکی این سلول‌های عصبی در حدود 20 میلی‌آمپر است.

تصویربرداری فلورسانس از سلول­ها:به‌منظور تصویربرداری از سلول‌ها با استفاده از نشان‌گرهای پروتئینی، سلول‌های رشد یافته بر روی لایه‌های فوم اکسید گرافینی پیچانده شده به مدت 20 دقیقه توسط محلول PBS حاوی 4 درصد حجمی پارافورمالدهید تثبیت شدند. در مرحله‌ی بعدی نمونه‌ها سه مرتبه با PBS شستشو گردیدند و به مدت 60 دقیقه در محلول PBS حاوی 2 درصدBSA، 0/1 درصد تریتون ایکس-100  و آنتی-نستین (با رقیق‌شدگی ~1: 500) انکوبیت شدند. بعدازاین مرحله نیز، سلول‌ها به مدت 60 دقیقه با گوت آنتی-ربیتTRITC (Tetramethylrhodamine) (با رقیق‌شدگی ~1: 500) انکوبیت شدند. سپس دوباره 3 مرتبه با محلول PBS شستشو شدند. پس از طی شدن این مراحل، بتا تیوبولین کلاس III مخصوص نورون (TUJ1، به‌عنوان نشان‌گر سلول‌ نورون که در شکل­ها با فلش شماره 1 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 500)، پروتئین اسیدی فیبریلاری گلیال (GFAP) (Glial fibrillar acidic protein)، به‌عنوان نشان‌گر سلول گلایلکه در شکل­ها با فلش شماره 2 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 500) وDAPI(4'­,­6-­diamidino-2-phenylindole)(به‌عنوان نشان‌گر هسته‌های سلول که در شکل­ها با فلش شماره 3 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 100) به محلول PBS اضافه شدند و به مدت 30 دقیقه با سلول‌های تمایزیافته انکوبیت شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی شده در سطح مقطع فوم (توسط بریدن فوم پیچانده شده) و در سطوح داخلی آن (توسط به‌آرامی باز کردن فوم پیچانده شده) توسط PBS شستشو شدند و با استفاده از میکروسکوپ فلورسانسی هم کانون (Zeiss LSM510) تحت نظر قرار گرفتند. تعداد متوسط سلول‌ها در واحد سطح نیز توسط شمارش سلول‌های رنگ‌آمیزی شده در مساحتی در حدود 4 میلی‏متر مکعب به دست آمد. تمامی آرایه­های زیستی حداقل 3 مرتبه انجام گرفتند. اختلاف معنی‏دار برای p مقدار کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

نتایج

شکل 1-آ تصویر SEMو شکل 2 تصویر  FESEMاز سطح مقطع فوم گرافینی بریده­شده است و لایه‌لایه بودن آن را نشان می­دهد. این لایه­ها بین دولایه باضخامت حدود 1 میکرومتر پَکیده شده­اند. شکل 1-ب نیز تصویر SEM با بزرگنمایی بیشتر را نشان می­دهد. از روی شکل فضاهای خالی کمتر از میکرون نیز بین لایه­های تشکیل‌دهنده فوم با چگالی حدوداً 10 لایه در هر میکرومتر و ضخامت کمتر از 80 نانومتر، کاملاً واضح است. برای تعیین حالات شیمیایی اتم­های کربن موجود در فوم گرافینی و فوم گرافینی عامل دار شده با لامینین از XPSاستفاده‌شده است. شکل 3-آ-1 طیف XPS با تفکیک­پذیری بالای C(1s) را نشان می­دهد. برای کالیبره کردن طیف گرفته‌شده، انرژی پیوندی  قله‌ی اصلی (که به پیوند‌هایC─C، C─H و C=C نسبت داده‌شده‌اند) در eV0/285 ثابت فرض شده و همه‌ی مقادیر انرژی پیوندی با خط ثابت انرژیC(1s) در eV 0/285 سنجیده شده است. با توجه به شکل3-آ-1قله‌های موجود در 286/6 eV،287/3 eV، 288/3 eV و 289/4 eVبه ترتیب به گروه‌های عاملی حاوی اکسیژنC─O، C─O─C، C=O و O=C─O نسبت داده‌شده است.نتایج طیفXPS فوم گرافینی عامل‌دار شده با لامینین نیز در شکل 3-آ- 2 آمده است.

 

 

(آ)

(ب)

5µm

1µm

شکل 1: تصاویر  SEM از سطح مقطع فوم گرافینی ساخته‌شده  با بزرگنمایی­های مختلف

 

 

شکل 2: تصاویر FESEM از سطح مقطع فوم گرافینی ساخته‌شده  با بزرگنمایی­های مختلف

 

 

همان‌طور که مشاهده می‌شود قله‌ی موجود در  eV0/286 به شکل‌گیری پیوند کربن با نیتروژن((C─Nبر روی سطح فوم گرافینی اشاره دارد. علاوه بر این، شکل 3-ب نیز حضور پیک مربوط به N(1s)در طیفXPS با تفکیک‌پذیری بالای فوم گرافینی عامل‌دار شده با لامینینرا نشان می‌دهد که بر موفقیت در عامل‌دار شدن فوم توسط لامینین اشاره دارد. با توجه به طیف گرفته‌شده نسبت اکسیژن به کربن(O/C) در لایه‌های فوم گرافینی و لایه‌های فوم گرافینی عامل‌دار شده با لامینین در حدود 25/0 به دست آمد. برای مقایسه‌ بهتر، طیفXPS صفحه‌های اکسیدگرافینیِ از قبل آماده‌شده (بدون اعمال حرارتی و بدون اینکه تحت اشعه‌ی فرابنفش قرارگرفته باشد) نیز در درون شکل 3-آ آمده است. نسبت O/C در این صفحه‌های گرافینی در حدود 49/0است. ازآنجایی‌که نسبت متداول O/C در اکسید گرافین احیاشده با هیدرازین در حدود 2/0 است، این نتایج نشان‌دهنده‌ی احیای جزئی فوم اکسید گرافینی در طول مدت فرآیند ساخت و سپس عامل‌دار شدن لایه‌های فوم اکسید گرافینی است. برای بررسی بیشتر ساختار کربنی فوم گرافینی طبق شکل 4 از طیف­سنجی رامان استفاده‌شده است. پیک­های شناخته‌شده طیف­سنجی رامان برای مواد کربنی، یعنی پیک G و پیک Dبه ترتیب در cm-11580و  cm-11350 دیده می‏شوند. نسبت شدت پیک G/D که به‌عنوان پارامتری برای ارزیابی متوسط اندازه حوزه­های sp2ای در ساختار گرافیتی­ که حاوی پیوندهای sp2 و sp3است، برای فوم اکسید گرافینی در حدود 3/1 و برای فوم عامل­دار شده با لامینین در حدود 1/1 به دست آمد. این کاهش در نسبت شدت پیک G/Dنشان‌دهنده تشکیل پیوندهای کربن با نیتروژن موجود در لامینین نسبت داد. در طیف­سنجی رامان پیک D2مواد حاوی گرافین نیز به‌شدت به تعداد لایه­ها و صفحه­های گرافینی موجود در ساختار حساس است (21). برای مثال نسبت شدت پیکD/G2برای گرافین تک­لایه، دولایه، سه­لایه و چندلایهبه ترتیب در حدود 6/1، 8/0، 3/0 و 07/0 است. با توجه به شکل 4 این نسبت برای فوم ساخته‌شده در حدود 4/0 به دست آمد مه نشان­گر وجود گرافین سه­لایه­ای و بالاتر در ساختار فوم است. برای تعیین میزان آب‌دوستی فوم ساخته‌شده از تست زاویه تماس کمک گرفته‌شده است. شکل 5 نتایج به‌دست‌آمده برای سطح مقطع و سطح‌رویی فوم اکسید گرافینی پیچانده شده است.

 

 

(آ)

(ب)

(2)

(1)

 

 

شکل 3: آ) طیفXPS با تفکیک‌پذیری بالا مربوط به C(1S)  از فوم اکسید گرافینی1) بدون عامل‌دار و 2)با عامل‌دار شدن توسط لامینین؛ب)طیفXPS  با تفکیک‌پذیری بالا مربوط به N(1S) از فوم اکسید گرافینی قبل و بعد از عامل­دار شدن توسط لامینین

 

 

افزایش ناهمواری‌های یک سطح می­تواند خاصیت آب‌دوستی را تغییر دهد (22) آب‌ دوستی می‌تواند در افزایش میزان جذب آب، عامل‌های رشد و سلول‌ها بسیار مؤثر باشد که در ادامه به آن پرداخته‌شده است. شکل 5 همچنین مقاومت سطحی الکتریکی لایه­های فوم گرافینی را نشان می­دهد. آنچه اندازه­گیری شد در حدود Ω/sq17بود که نشان‌دهنده این است که فوم به‌خوبی می­تواند جریان­های تحریک الکتریکی در حدود mA20 را برای تمایز سلول­های عصبی تحت ولتاژهای کمتر از 5 ولت فراهم کند. علاوه بر این مشخص شد که  مقاومت سطحی الکتریکی فومی که با لامینین عامل دار شده بود فقط 38 درصدافزایش ‌یافت هبود. برای تائید صحت مقاومت به‌دست‌آمده می­توان آن را بر اساس میزان مقاومت به‌دست‌آمده برای صفحه­های اکسید گرافینی از پیش گزارش‌ شده تخمین زد.

 

 

(آ)

 

(ب)

 

شکل 4: طیف رامان آ)فوم اکسید گرافینی و ب)فوم اکسید گرافینی عامل‌دار شده با لامینین با استفاده از طول‌موج تحریکی532 نانومتر

 

 

اکسید گرافین-لامینین            اکسید گرافین

 

سطح فیلم

سطح مقطع فیلم رول شده

 

 

 

شکل 5: تست زاویه تماس و مقاومت سطح برای سطح‌رویی و سطح مقطع فوم سه‌بعدی گرافینی

 

 

برای مثال دریکی از گزارش­ها (23) میزان Rs  برای اکسید گرافینی که به‌طور جزئی احیاشده بود در حدودMΩ/sq10(که برابر مقاومت در حدود Ω-cm1است) است. در این پژوهش ماده­ای که جریان الکتریکی در آن جریان دارد فوم پیچیده شده بود که انباشتی از صفحه­های ته‌نشین شده اکسید گرافین است. برای فوم استوانه­ای شکل با  شعاع خارجی در حدود 450 میکرومتر (مطابق با 15 لایه روی‌هم انباشته‌شده) و طول5/1 سانتی‏مترمی­توان میزان مقاومت را در حدود Ω200 تخمین زد که به‌خوبی مطابق با محاسبات ما بوده است.برای تجزیه‌وتحلیل خواص پایه زیستی در ابتدا چسبندگی به سطح و تکثیر سلول­های بنیادی در سرتاسر تخلخل و حفره­های موجود در فوم گرافینی که خاصیت فرا-آبدوستی در سطح مقطع خود دارد، موردبررسی قرارگرفته است. در رابطه با همین منظور شکل 6-آ نشان‌دهنده تصویر فلورسانس از سلول­های بنیادی عصبی رشد یافته بر روی سطح مقطع فوم استوانه­ای شکل است. فواصل بین لایه­های تشکیل‌دهنده فوم به‌خوبی مشخص است که در حدود 20 میکرومتر است. به‌طور واضح می‏توان دید که سلول­ها به‌طور یکپارچه بر روی سطح مقطع تکثیر یافته‏اند. این موضوع نشان‌دهنده رشد سلول‏ها در سرتاسر تخلخل و سطوح لایه­های تشکیل‌دهنده فوم است. علاوه بر این شکل 6-ب نیز تصویر فلورسانس از رشد سلول­ها در لایه­های داخلی فوم گرافینیبازشده را نشان می­دهد. این طویل شدن و کشیده شدگی سلول­ها به همراه جواب مثبت آن­ها به نشان­گر نِستین نشان­دهنده تکثیر سه‌بعدی سلول­ها  با مشخصات عصبی در سرتاسر تخلخل فوم سه‌بعدی است. به‌منظور تجزیه‌وتحلیل کمی فرآیند تکثیر، شکل 7 تعداد هسته­ سلول و سلول‏های عصبی در  واحد مساحت تصویر فلورسانس سلول­های تکثیر یافته بر روی سطح مقطع و لایه­های داخلی فوم گرافینی و زیرلایه PDMS (به‌عنوان نمونه مرجع) را نشان می­دهد. استفاده از PDMS این کمک را کرده تا بتوان تشخیص داد رشد سلولی بین سطوح فوم گرافینی به‌طور مشخصی بیشتر از رشد بر روی PDMS است و همچنین رشد سلولی بر روی سطح مقطع فوم استوانه­ای شکل قابل‌مقایسه با رشد بر روی PDMS است. این رشد قابل‌توجه سلول­ها در سطوح داخلی و سطح مقطع فوم گرافینی را می­توان به زیست سازگاری سطح و فرا-آبدوستی سطح مقطع فوم نسبت داد. البته این را هم باید توجه کرد که به علت ماهیت ناهموار سطح مقطع فوم، تمرکز میکروسکوپ بر روی سلول­ها ساده نبود و به همین دلیل همان‌طور که در شکل 6 نیز با خط خطا مشخص‌شده، مقدار و شمارش سلول­ها به‌طور قابل ‌توجهی کاهش‌یافته است.

 

 

فلش شماره 1 (سلول بنیادی عصبی)

فلش شماره 3 (هسته سلول)

(ب)

(آ)

400µm

100µm

شکل 6: آ) شکل فلورسانس از سلول­های بنیادی عصبی رشد یافته بر روی سطح مقطع فوم استوانه­ای شکل و ب)لایه­های داخلی فوم گرافینی بازشده، از نشان‌گر نِستین (فلش شماره 1) برای رنگ‌آمیزی سلول‌های بنیادی عصبی و از نشان­گرِ DAPI (فلش شماره 3) برای رنگ‌آمیزی هسته‌ی سلول استفاده‌شده است.

 

 

 

سلول عصبی

هسته

 

سطح فوم بازشده

سطح مقطع فوم رول شده

نمونه کنترل

شکل 7 : تعداد هسته‌ها و سلول‌های عصبی رنگ‌آمیزی شده (ستون­های سمت چپ و ستون هاشور خورده سمت راست)‌ و تکثیریافته بر روی سطح مقطع فوم استوانه‌ای شکل و سطوح داخلی فوم بازشده در مساحت سطح در مقایسه با نمونه مرجع (PDMS).نتایج معنی‌دار با (*) برایp-مقدار کمتر از 0/05 مشخص‌شده‌اند (n=3).

 

 

تمایز سلول­های بنیادی عصبی انسان به سمت نورون­ها نیز بلافاصله پس از حذف عامل­های رشدEGF (Epidermalgrowth factor)و bFGF
(Basic fibroblast growth factor) از محیط کِشت شروع شد. پس از گذشت 3 روز، هیچ تغییر خاصی در مورفولوژی سلول­ها دیده نشد. اما بعد از 2 هفته، تغییرات قابل‌توجهی در مورفولوژی سلول­های تمایزیافته مشاهده شد. به‌طوری‌که طویل شدند و علائم عصبی نشان دادند.در ضمن سلول­های بنیادی عصبی به سمت سلول­های گلیال (پشتیبان بافت­های عصبی و فعالیت نورون­ها) نیز تمایز یافتند.در این پژوهش از نشان­گر GFAP با فلش شماره 2 برای مشخص کردن سلول­های گلیال و نشان­گر TUJ1 با فلش شماره 1 برای مشخص کردن سلول­های عصبی (نورون­ها) استفاده‌شده است. شکل 8-آ و 8-ب نشان‌دهنده‌ی تصاویر فلورسانس از سلول­های گلیال و نورون­های تمایزیافته بر سطح داخلی فوم بازشده و سطح مقطع فوم استوانه­ای شکل پس از گذشت 2 هفته از تحریک الکتریکی است. این تصاویر اشاره بر این دارند که فوم سه‌بعدی استوانه­ای شکل به‌خوبی توانسته نقش یک داربست سه‌بعدی برای تمایز نورون­ها و رشد تارهای عصبی حول سمتی فرض شده (محور اصلی استوانه) را ایفا کند. اگرچه اندازه بخش قابل‌توجهی از تخلخل سطح مقطع فوم زیر میکرون است، اما نقایص تخلخلی با اندازه­های بین 1 تا 10 میکرومتر نیز موجود است که می­تواند به‌عنوان مکان مناسبی برای رشد هسته سلول عمل کند. قابل‌ذکر است که تخلخل­ها و فصل مشترک­های زیر میکرون هم می­تواند مکان مناسبی برای رشد تارهای طویل نورون­ها باشد. تصاویر فلورسانسی که اینجا از سطح مقطع فوم گرفته‌شده است تقریباً بهترین تصاویری است که در شرایط آزمایش گرفته‌شده است. تصاویر مناسب دیگری نیز  برای تجزیه‌وتحلیل کمی فرآیند تمایز مورداستفاده قرار گرفت. به همین منظور، تعداد سلول­ها­ در واحد مساحت سطح به‌وسیله شمارش هسته سلول رنگ‌شده با DAPIبه‌دست‌آمده است  (شکل 9-آ). سپس خصوصیات عصبی سلول­های تمایزیافته بر اساس نسبت تعداد سلول­های عصبی (مشخص‌شده با فلش شماره 1)  و سلول­های گلیال (مشخص‌شده با فلش شماره 2) به تعداد هسته سلول موردبررسی قرار گرفت (شکل 9-ب و 9-ج). علاوه بر این نسبت تعداد سلول­های عصبی به سلول­های گلیال نیز محاسبه شد که نتیجه آن در شکل 9-د آمده است. این امر به دلیل تمایز گلیالی در غیاب محرک­های فیزیکی و شیمیایی است (24-26) درحالی‌که در احیای عصبی و مرمت مغز تقاضای بیشتر مربوط به تمایزات نورونی است (27 و 28). همچنین، مشخص شد که تحت تحریک الکتریکی تعداد هسته سلول به‌طور قابل‌توجهی بر روی سطح مقطع و فصل مشترک­های فوم پیچیده شده افزایش‌یافته است (شکل 9-آ). علاوه بر این، نسبت تعداد نورون­ها و سلول­های گلیال تمایزیافته بر روی سطح مقطع و فصل مشترک­های فوم پیچیده شده نیز افزایش تحت تحریک الکتریکی افزایش‌یافته است ( شکل 9-ب و 9-ج). هرچند طبق شکل 9-د این افزایش برای تعداد نورون­ها به نسبت تعداد سلول­های گلیال بیشتر است. این نتایج نشان می­دهند که فوم گرافینی پیچیده شده که به‌صورت استوانه­ای شکل است می­تواند تحت تحریک الکتریکی به‌عنوان یک داربست سه‌بعدی نویدبخشی در بازسازی قابل‌کنترل نورون­ها عمل کند.

 

 

 

 

 

فلش شماره 3 (هسته سلول)

فلش شماره 2 (سلول گلیال)

فلش شماره 1 (سلول عصبی)

(ب)

(آ)

حفره مرکزی فوم پیچیده شده

300µm

100µm

 

شکل 8: تصاویر فلورسانس از نورون‌ها و سلول‌های گلیال تمایزیافته بر روی سطح مقطع فوم استوانه‌ای شکل و ب)سطح داخلی فوم بازشده پس از گذشت 2 هفته تحریک الکتریکی، هسته‌ سلول، نورون‌ها و سلول‌های گلیالبه ترتیب با نشان‌گرهایDAPI، TUJ1 و GFAP  و به ترتیب با فلش‏های شماره 3، 1 و 2 مشخص‌شده‌اند


 

عدم اعمال تحریک الکتریکی

تحت اعمال تحریک الکتریکی

 

عدم اعمال تحریک الکتریکی

تحت اعمال تحریک الکتریکی

 

 

عدم اعمال تحریک الکتریکی

تحت اعمال تحریک الکتریکی

 

 

 

عدم اعمال تحریک الکتریکی

تحت اعمال تحریک الکتریکی

 

 

(ج)

(د)

سطح فوم بازشده

سطح مقطع فوم رول شده

سطح فوم بازشده

سطح مقطع فوم رول شده

سطح فوم بازشده

سطح مقطع فوم رول شده

سطح مقطع فوم رول شده

سطح فوم بازشده

(ب)

(آ)

شکل 9: مقایسه‌ی آ) تعداد هسته‌ سلول تمایزیافته،ب) نسبت تعداد نورون‌ها به تعداد هسته‌ سلول، ج) نسبت تعداد سلول‌های گلیال به تعداد هسته‌ سلول تمایزیافته و د)نسبت تعداد نورون‌ها به تعداد سلول‌های گلیالتمایزیافته در مساحت سطح موجود در سطح مقطع و فصل مشترک فوم گرافینی در زمان استفاده از تحریک الکتریکی و عدم استفاده از آن

 

بحث

در سال 2013 گزارش شد که کشت سلول‌های بنیادی عصبی موشی روی یک‌لایه‌ی نازک از گرافن سبب افزایش سیگنال‌های الکتریکی در شبکه‌های عصبی می‌شود که این امر ناشی از خاصیت رسانندگی الکتریکی گرافن، با کشت سلول‌های بنیادی عصبی روی گرافن است (29) وقتی سلول‌های بنیادی موش به‏مدت 9 روز در روی بستری از گرافن اکساید کشت داده می‌شوند بیان مارکرهای بنیادی بودن در آن‌ها به‌شدت کاهش می‌یابد که نشان‌دهنده‌ی القای تمایز عصبی در این سلول‌ها است (30). در سال 2010 نشان داده شد که با کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی بر روی یک تک لایه از گرافن لوله شده (نانو لوله کربنی) بدون هیچ فاکتور عصبی در محیط کشت، سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از هفت روز کشت روی این بستر کربنی مارکرهای عصبی نستین و MAP2 را بیان کردند که نشان ‌دهنده‌ی تمایز عصبی در آن‌ها بود (31) از طرفی اهمیت گروه‌های کربوکسیل در افزایش توان نانولوله‌های کربنی در تمایز عصبی بیان‌ شده است. وقتی سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسانی بر روی نانو لوله‌های کربنی کربوکسیل­دار کشت یافتند، نه‌تنها میزان بیان پروتئین‌های عصبی نسبت به گروه کنترل (گروه فاقد کربوکسیل) افزایش یافت بلکه مدت ‌زمان بیان این مارکرها از 1 روز به 14 روز افزایش، نشان داد نانو لوله‌های کربنی کربوکسیله شده از یک‌طرف سبب افزایش بیان فاکتورهای رشد عصبی می‌شود و از طرف دیگر با برقراری پیوند با آن‌ها از طریق گروه‌های کربوکسیل خود، سبب به دام انداختن آن‌ها به‌منظور ایجاد یک محیط مناسب برای تمایز طولانی ‌مدت عصبی می‌شود (31). توانایی نانو ذرات گرافن اکساید در تمایز عصبی سلول‌های بنیادی جنینی و موش گزارش‌ شده است. با توجه به اطلاعات موجود از اثرات خانواده‌ی مواد گرافن و مشتقات آن در تمایز عصبی و از یک‌طرف به‏دلیل اهمیت گروه‌های عاملی کربوکسیل در افزایش میزان تمایل نورون (32) و از طرف دیگر توانایی بالاتر نانو ذرات گرافن اکساید در مقایسه با نانو لوله‌های کربنی در تمایز عصبی (33)، نانو ذرات گرافن اکساید (گرافن دارای گروه‌های عاملی کربوکسیل و هیدروکسیل) به‌عنوان ماده‌ی القاکننده‌ی تمایز عصبی انتخاب شد. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به‏دلیل تهیه و کشت آسان، بالا بودن قدرت تمایز و عمر طولانی، با صرفه بودن از نظر اقتصادی و همچنین دارا بودن قدرت رشد و تکثیر بالا، یک کاندید خوبی برای استفاده در این تحقیق تبدیل شدند و نظر به اینکه بر اساس مطالعات صورت گرفته، اثرات احتمالی نانو گرافن اکساید بر روی روند تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی موش به سلول‌های عصبی بدون اضافه کردن فاکتورهای تمایزی عصبی هنوز مورد بررسی قرار نگرفته بود ما در این تحقیق نتیجه گرفتیم سلول­های بنیادی عصبی انسان به‏خوبی بر روی داربست سه بعدی گرافینی ساخته شده تکثیر یافتند و سپس به کمک تحریک الکتریکی، به‏سمت رده نورونی و گلیالی تمایز یافتند. مساله قابل اهمیت، تمایز بیشتر به‏سمت رده نورونی (به جای رده گلیالی) می­باشد که این مطلب در شکل 9 به‏خوبی نشان داده شده است. با توجه به این موضوع که ویژگی رسانندگی الکتریکی داربست­های گرافینی در تکثیر و تمایز سلول­های بنیادی عصبی و تحریک الکتریکی آن­ها و تشکیل بافت­های عصبی نقش اساسی دارند، می­توان در تحقیقات آینده به‏سوی ساخت داربست­های اکسید گرافینی احیا شده با درصد مولکول­های اکسیژن کمتر، به‏منظور افزایش میزان رسانندگی الکتریکی رفت. برای مثال می­توان از احیا کننده­های سبز و دوستدار محیط زیست برای احیای محلول اکسید گرافین سنتز شده استفاده کرد و سپس اقدام به ساخت داربست گرافینی کرد. این نوع بافت­های عصبی ساختگی، معمولا قبل از استفاده عملی در انسان احتیاج به آزمایشات فراوان به‏منظور بررسی عدم ایجاد مشکل در بدن انسان دارند و حتی آن نتایجی که بر روی دیگر موجودات از جمله موش‌های آزمایشگاهی و ... به‏دست می­آیند، دلیل کافی برای نتیجه­گیری یکسان بر روی انسان نخواهند بود و به بررسی و تحقیق بیشتری احتیاج است.

نتیجه­گیری

در این پژوهش فوم گرافینی پیچیده شده به‌عنوان داربست سه‌بعدی رسانای الکتریکی در مقیاس موردنظر ساخته شد و در رشد تارهای عصبی تحت تحریک الکتریکی مورداستفاده قرار گرفت. آنالیز XPS نشان داد که فوم گرافینی به‌طور جزئی تحت اشعه فرابنفش و دمای80درجه­ی سانتی­گراد احیاشده بود. ضخامت متوسط هر فوم گرافینی در حدود15 الی50 میکرومتر به دست آمد و چگالی لایه­های تشکیل‌دهنده آن نیز به‌طور متوسط حدود 10 لایه در هر میکرومتر است. طیف­سنجی رامان وجود صفحه­های گرافینی چندلایه­ای در ساختار فوم را تائید کرد. مشخص شد مقاومت سطحی الکتریکی فوم گرافینی نیز حدودΩ/sq 17به‌طور کامل مناسب برای تولید جریان­های تحریک الکتریکی (حدود  mA20) در تمایز سلول­های عصبی با استفاده از ولتاژهای کمتر از 5 ولت بود. تست زاویه تماس نیز نشان داد که اگرچه سطح فوم گرافینی عامل دار شده با لامینین آب‌دوست هستند، اما سطح مقطع فوم پیچیده شده خاصیت فرا-آبدوستی دارد که به تکثیر و تمایز مؤثرتر سلول­ها در سراسر تخلخل و فصل مشترک­های فوم منجر می­شود. درنهایت تحریک الکتریکی سلول­های بنیادی عصبی انسان بر روی فوم نیز به تکثیر بیشتر سلول­ها و تسریع تمایز آن­ها به سمت نورون­ها در مقایسه با سلول­های گلیال منتهی شد. همه این نتایج می­تواند کاربردهای فوم گرافینی پیچیده شده را به‌عنوان داربست سه‌بعدی در بازسازی مؤثر شبکه­های عصبی در نانو داروهای آتی مهیا کند

.  GeimAK, Novoselov KS. The rise of graphene, Nat. Mater. 2007; 6(3): 183–191.
2. Lee C, Wei X, KysarJW, HoneJ. Measurement of the elastic properties andintrinsic strength of monolayer graphene, Science. 2008; 321: 385–388.
3. LiD, MüllerMB, GiljeS, KanerRB, WallaceGG. Processable aqueousdispersions of graphene nanosheets, Nat. Nanotechnol. 2008; 3(2): 101–105.
4. Akhavan O, GhaderiE, EmamyH. Nontoxic concentrations of PEGylatedgraphene nanoribbons for selective cancer cell imaging and photothermaltherapy, J. Mater. Chem. 2012; 22 (43): 20626–20633.
5. AkhavanO, BijanzadK, MirsepahA. Synthesis of graphene from natural andindustrial carbonaceous wastes, RSC Adv. 2014;4 (39): 20441–20448.
6. AkhavanO, GhaderiE,HashemiE,RahighiR. Ultra-sensitive detection ofleukemia by graphene, Nanoscale. 2014; 6 (24): 14810–14819.
7. HashemiE, AkhavanO, ShamsaraM, ValimehrS, et al. DNA and RNAextractions from eukaryote and prokaryote cells by graphene nanoplatelets,RSC Adv. 2014; 4: 60720–60728.
8.  MohantyN, BerryV. Graphene-based single-bacterium resolution biodevice and DNA transistor: interfacing graphene derivatives with nanoscale andmicroscale biocomponents, Nano Lett. 2008;8 (12): 4469–4476.
9. AkhavanO,GhaderiE, RahighiR, AbdolahadM. Spongy graphene electrodein electrochemical detection of leukemia at single-cell levels, Carbon. 2014; 79: 654-66.
10. YangK, ZhangS, ZhangG,SunX, et al. Graphene in mice: ultrahighin vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy, Nano Lett. 2010; 10(9): 3318-3323.
11. AkhavanO, GhaderiE, AkhavanA. Size-dependent genotoxicity of grapheme nanoplatelets in human stem cells, Biomaterials. 2012; 33 (32): 8017–8025.
12. KotovNA, WinterJO, ClementsIP, JanE, et al. Campidelli, et al.,Nanomaterials for neural interfaces, Adv. Mater. 2009; 21 (40): 3970–4004.
13. ParkSY, ParkJ, SimSH, SungMG, et al., Enhanceddifferentiation of human neural stem cells into neurons on graphene, Adv.Health Mater. 2011; 23 (36) 263–267.
14. AkhavanO, GhaderiE. The use of graphene in the self-organizeddifferentiation of human neural stem cells into neurons under pulsed laserstimulation, J. Mater. Chem. B. 2014; 2: 5602–5611.
15. ChenZ,RenW, GaoL, LiuB, et al. Cheng, Three-dimensional flexibleand conductive interconnected graphene networks grown by chemical vapourdeposition, Nat. Mater. 2011; 10(6): 424–428.
16. LiN, ZhangQ, GaoS, SongQ, et al., Three-dimensionalgraphene foam as a biocompatible and conductive scaffold for neural stemcells, Sci. Rep. 2013; 3: 1604.
17. CrowderSW,PrasaiD,RathR,BalikovDA, et al. Threedimensionalgraphene foams promote osteogenic differentiation of humanmesenchymal stem cells, Nanoscale. 2013; 5 (10): 4171-4176.
18. DikinDA, StankovichS, ZimneyEJ, PinerR.D, et al. Preparation and characterization of graphene oxide paper,Nature. 2007; 448 (7152): 457–460.
19. EsfandiarA,AkhavanO, IrajizadA. Melatonin as a powerful bio-antioxidantfor reduction of graphene oxide, J. Mater. Chem. 2011; 21(29) 10907–10914.
20.DonatoR, MiljanEA, HinesSJ, AouabdiS, et al.Differential development of neuronal physiological responsiveness in twohuman neural stem cell lines, BMC Neurosci. 2007; 8: 36.
21. MalardLM, PimentaMA, DresselhausG. Ramanspectroscopy in graphene, Phys. Rep. 2009; 473(5-6): 51–87.
22. WenzelRN. Surface roughness and contact angle, J. Phys. Colloid Chem. 1949; 53(9): 1466–1467.
23. AkhavanO, KalaeeM, AlaviZS, et al. Esfandiar, Increasing theantioxidant activity of green tea polyphenols in the presence of iron for thereduction of graphene oxide, Carbon. 2012; 50 (): 3015-3025.
24. Ellis-BehnkeRG,LiangYX,YouSW, TayDK, et al. Nanoneuro knitting: peptide nanofiber scaffold for brain repair and axonregeneration with functional return of vision, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(13). 5054–5059.
25. OriveG, AnituaE, PedrazJL, EmerichDF. Biomaterials for promoting brainprotection, repair and regeneration, Nat. Rev. Neurosci. 2009; 10 (9): 682–692.
26.  SilvaGA, CzeislerC, NieceKL, BeniashE, et al. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope densitynanofibers, Science. 2004; 303: 1352–1355.
27. ContiL E. Cattaneo, Neural stem cell systems: physiological players or in vitroentities, Nat. Rev. Neurosci. 2010; 11 (3): 176–187.
28.  GageFH. Mammalian neural stem cells, Science. 2000; 287 (5457): 1433–1438.
29. Mingliang Tang, Qin Song, Ning Li, Ziyun Jiang, Rong Huang, Guosheng Cheng. “Enhancement of electrical signaling in neural networks on graphene films”.Biomaterials 2211, Pages 6122–6111. 1.
30. Chen GY, Pang DW, Hwang SM, Tuan HY, Hu YC. “A graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and differentiation”. Biomaterials. 2212 Jan; 11(2): 111-22.
31. Chor Yong Tay, Haigang Gu,Wen Shing Leong, Haiyang Yu, Hua Qiong Li, Boon Chen Heng,Hosea Tantang, Say Chye Joachim Loo, Lain Jong Li, Lay Poh Tan. “Cellular behavior of human mesenchymal stem cells cultured on single-walled carbon nanotube film”. C A R B ON 1 1 (2212) 1295 –1121.
32. Yu-Shuan Chen a, Ging-Ho Hsiue. “Directing neural differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated multiwalled carbon nanotubes”. Biomaterials 11 (2211)
33. Yang D,Li T,Xu M,Gao F,Yang J,Yang Z, Le W. “Graphene oxide promotes the differentiation of mouse embryonic stem cells to dopamine neurons”. Nanomedicine (Lond). 2211.