نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه پدافند هوایی خاتم‌الانبیاء(ص)، دانشکده علوم پایه، گروه فیزیک
2 دانشگاه کاشان، دانشکده فیزیک
چکیده
هدف: در این پژوهش از بستر زیست‌سازگار فوم گرافینی سه‌بعدی جهت کشت سلولهای بنیادی عصبی انسان استفاده شده است.
مواد و روشها: فوم گرافینی برای اولین بار توسط ته نشینی صفحههای اکسید گرافینی بر روی زیر لایه‌ای از جنس پلی‌اتیلن ترفتالات (PET)تحت اشعه‌ی فرابنفش و دمای 80 درجه سانتیگراد ساخته شده است و روش ساخت صفحههای اکسید گرافنی روش بهبود یافته هامرز است.
نتایج: با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی ضخامت فوم‌های ساخته شده در حدود 10 تا 50 میکرومتر اندازهگیری شد که در هر میکرومتر از آنها حدود 10 لایه‌ی اکسید گرافینی وجود دارد. همچنین میکروسکوپ نیروی اتمی وجود گرافین تک لایه با ضخامت 4/1 نانومتر را در محلول اکسید گرافین نشان میدهد. طیف سنجی فوتو الکترون پرتوی ایکس احیای جزئی فوم اکسید گرافینی را طی مراحل ساخت تایید می‌کند. طیف سنجی رامان نیز وجود صفحههای اکسید گرافینی چند لایه را در ساختار فوم نشان میدهد. با استفاده از آزمون کششی، مدول یانگ این فوم‌ها در بهترین حالت حدود GPa7/1 بهدست آمد. علاوه بر این، مقاومت سطحی الکتریکی فوم‌ها با استفاده از روش پروب چهار نقطهای در حدود 17-24 Ω/sq اندازهگیری شد.
نتیجهگیری: با توجه بهروش پروب چهار نقطهای مشخص شد این مقاومت الکتریکی برای فراهم کردن جریان الکتریکی در حدود mA20 تحت ولتاژهایی پایین‌تر از V5/0 به‌منظور تحریک الکتریکی سلولهای بنیادی عصبی و تمایز آنها بهسمت نورونها (به نسبت سلولهای گلیال) مناسب است. تست زاویه‌ی تماس نیز نشان داد که سطح مقطع فوم اکسید گرافینی پیچانده شده خاصیت فرا آبدوستی دارد که به القای تکثیر و تمایز موثر سلولهای بنیادی عصبی در سرتاسر تخلخل و سطوح داربست کمک می‌کند. تصاویر فلورسانس نیز نشان دادند تحریک الکتریکی سلولهای بنیادی عصبی منجر به رشد کواکسیال-شکل تارهای عصبی در جهتی مشخص و القای تمایز آنها بهسمت نورونها شده است. این نتایج فوم گرافینی را به‌عنوان داربستی رسانا و منعطف برای بازتولید سیستمهای عصبی و مهندسی بافت پیشنهاد میدهد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Fabrication and characterization of graphene foams and using it for electrical stimulation of human neural stem cells
نویسندگان [English]
- F Jahantigh 1
- H Nanakar 2
- SMB Ghorashi 2
1 دانشگاه پدافند هوایی خاتم‌الانبیاء(ص)، دانشکده علوم پایه، گروه فیزیک
2 دانشگاه کاشان، دانشکده فیزیک
چکیده [English]
Aim: In this study biocompatible 3D graphene oxide foams have been used for Human neural stem cells (hNSCs) culturing.
Material and Methods: For the first time, graphene oxide foam were fabricated by precipitation of chemically exfoliated graphene oxide sheets in an aqueous suspension onto the PET substrate at ~80 oC under UV irradiation.
Results: By using scanning electron microscopy, the thickness of these foams (with linear density of ~10 GO sheets/µm) was measured around 10-50 µm. X-Ray photoelectron spectroscopy confirmed that the UV irradiation resulted in partial reduction of the layers during fabrication process. Also Raman spectroscopy demonstrated the presence of multilayer graphene oxide sheets (≥3 layers) in the foam structure. The Young’s modulus of the foams was obtained about 1.7 GPa. Furthermore, Four probe method found that the electrical sheet resistance of the GOFs was low enough (17-24 Ω/sq). Conclusion: To produce the electrical simulation currents (~20 mA) used in differentiation of the neural stem cells into the neurons (rather than glial cells). Contact angle test also showed that rolling the GOFs resulted in formation of cross-section with superhydrophilic characteristic, inducing effective proliferation and differentiation of the hNSCs throughout the pores and interfaces of the scaffold. Moreover, Fluorescence imaging revealed that stimulating the hNSCs resulted in coaxial-like growth of the neural fibers and inducing differentiation of the neural stem cells in to the neurons.
کلیدواژه‌ها [English]
- Graphene foams
- electrical stimulation
- 3D Scaffolds
- Neural stem cells
مقدمه
گرافین به‌عنوان نانو مادهای دوبعدی با ساختار گرافیتی دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی ازجمله خواص الکتریکی و مکانیکی مثال‌زدنی (1 و 2)، سطح مؤثر بسیار بالا (3)، سادگی در عامل دار شدن (4) و همچنین تولید کم‌هزینه آن (5) است. بنابراین، در بخش‌های فراوانی همچون استخراج DNA/RNA(6 و 7)، انتقال دارو (8 و 9). هدف‌گیری سلولهای سرطانی(10) و رشد سلولهای بنیادی (11) مورداستفاده قرارگرفته است. در سالهای اخیر، لایههای گرافینی به‌طور موفقیت‌آمیزیبه‌عنوان داربستهای دوبعدی در مهندسی بافت مبتنی بر سلولهای بنیادی مورداستفاده قرارگرفته‌اند. به خاطر خواص الکتریکی ویژه‌ی گرافین که میتواند به‌طورمؤثری در تحریک الکتریکی نورونها شرکت کند، توجه محققان به آن در حوزه ترمیم سیستمهای عصبی جذب‌شده است. چراکه ترمیم بافتهای عصبی و نورونها به‌خودی‌خود صورت نمیگیرد و ساخت بافت مصنوعی عصبی برای ترمیم نقاط و بافتهای عصبی آسیب‌دیده برای بازیابی عملکرد سیستم عصبی انسان لازم است. ازاین‌رو، تلاشهای بسیاری برای ساخت چنین بافتهایی با استفاده از مواد مختلف صورت گرفته است. از بین موادی که تاکنون استفاده‌شده است، گرافین میتواند سطح زیست سازگاری برای رشد و تمایز سلولهای عصبی تأمین کند. جذب و چسبندگی مؤثر سلولها بر بستر گرافینی منجر به انتقال بارهای الکتریکی موردنیاز تحریک و تمایز عصبی میشود (12). برای مثال پارک و همکارانش(13) از گرافین دوبعدی به‌عنوان بستری رسانا در تمایز سلولهای بنیادی عصبی انسان به سمت نورونها (به‌جای سلولهای گلیال) با کمک تحریک الکتریکی استفاده کردند. همچنین تزریق الکترون‌ها از ورقه‌های اکسید گرافینیتحریک‌شده توسط پرتوی لیزر پالسی نیز منجر به تمایز سلولهای بنیادی عصبی انسان به سمت نورونها شده است (14). هدف تمامی تحقیقات صورت گرفته در این حوزه، دستیابی به بافتی عصبی است که در آن تعداد نورونها در مقایسه به تعداد سلولهای گلیال بیشتر باشد تا خصلت پیامرسانی بافت حفظ شود. این افزایش نسبی تعداد نورونها نیز به‌طورمعمول توسط تحریک الکتریکی سلولهای بنیادین در طی فرآیند تمایز سلولی صورت میپذیرد. در این پژوهش از فوم گرافینی برای ساخت چنین بافتهای عصبی استفاده‌شده است.در سالهای اخیر، فوم‌های گرافینی به‌طور گسترده‌ای توسعه‌یافته‌اند و به‌عنوان داربستهای سه‌بعدی در تمایز سلولها به سمت رده‌های سلولی دلخواه مورداستفاده قرارگرفته‌اند (15-17). اگرچه روش شیمیایی و معروف هامرز (Hummers) یکی از ساده‌ترین و کم‌هزینه‌ترین روش‌های ساخت اکسید گرافین و اکسید گرافین احیاشده است، اما تمام فوم‌های گرافینی‌ای که تاکنون در رشد و تمایزات سلولی مورداستفاده قرارگرفته‌اند از روش رسوب نشانی بخار شیمیایی (Chemical vapor deposition) ساخته‌شده‌اند. البته قابل‌ذکر است که دیکینو همکاران (18) فوم‌های گرافینی‌ای بنام صفحات گرافینی با استفاده از روش هامرز ساخته‌اند، اما تاکنون گزارشی مبنی بر استفاده از چنین فوم‌ها و صفحاتی به‌عنوان داربستی سه‌بعدی در رشد و تمایزات سلولی منتشرنشده است.
مواد و روشها
در این پژوهش در ابتدا فوم اکسید گرافینی برای اولین بار توسط تهنشینی لایههای اکسید گرافینی بر روی زیر لایه‌ای از جنس پلی‌اتیلن ترفتالات (Polyethylene terephthalate) تحت اشعه‌ی فرابنفش و دمای 80 درجه سانتیگراد ساخته‌شده است.سپس از سمت یکی از لبههای آن پیچانده شده تا به‌عنوان بستری سه‌بعدی و استوانهای شکل که قابلیت تکثیر و تمایز نورونها در جهت محور اصلی استوانه را دارد، عمل کند. ساخت چنین فومی برای اولین بار توسط تهنشینی لایههای اکسید گرافینی، بدون فیلتر کردن محلول آن صورت گرفته
است. طیفسنجی فوتوالکترون پرتوی ایکس X-ray
photoelectron spectroscopy) به‌منظور مطالعه حالت شیمیایی کربن‌های موجود در فوم که تحت تأثیر اشعه‌ی UV(Ultraviolet)قرار داشتند، مورداستفاده قرارگرفته است. میکروسکوپ الکترونی روبشیScanning electron microscope) و طیفسنجی رامان نیز برای تائید حضور لایههای گرافینی تکلایه و چندلایه در ساختار فوم به کارگرفته‌شده‌اند. مقاومت سطحی الکتریکی فوم گرافینی برای سنجش توانایی فوم در تحریک الکتریکی سلولهای عصبی تحت ولتاژهای پایین محاسبه‌شده است. همچنین آبدوستی سطوح و سطح مقطع فوم 3 بعدی نیز موردبررسی قرارگرفته است. درنهایت فوم گرافینی به‌عنوان بستری سه‌بعدی در رشد جهت‌دار تارهای عصبی توسط تمایز سلولهای بنیادی عصبی به سمت نورونها به کمک تحریک الکتریکی مورداستفاده قرارگرفته است.
فعالیت‌های تجربی
ساخت فوم گرافینی سه‌بعدی: در ابتدا برای ساخت فوم سه‌بعدی محلول اکسید گرافین با استفاده از روش بهبودیافته‌ی هامرز به دست آمد. جزئیات این روش پیشتر در گزارش‌هایی آمده است (19). سپس محلول اکسید گرافین با غلظت حدود 5 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی زیرلایه با جنس پلی‌اتیلن ترفتالات تحت دمای 80 درجه سانتیگراد و اشعه لامپ UV(Philips, 10W)طی مدت 24 ساعت قرار گرفت. درنهایت فوم گرافینی از روی‌هم انباشته شدن لایههای اکسید گرافینی بر روی‌هم تشکیل شد. ضخامت این فوم به‌دست‌آمده از حدود 15 تا 50 میکرومتر بود. هرچه ضخامت فوم گرافینی بیشتر بود، رنگ آن از قهوهای تیره به سمت سیاهی میل میکرد. طبق گزارش پارک و همکاران (13) فوم ساخته‌شدهبه مدت 2 ساعت در محلول لامینین با غلظت 10 میکرومتر بر میلیلیتر در محیط کشت انکوباتور شد تا چسبندگی سلولها بر روی آن بیشتر شود. سپس 3 مرتبه با محلولPBS(Phosphate-buffered saline)شسته شد. در مرحلهی بعد فوم سه‌بعدی از پیچانده شدن فوم گرافینی حول یکی از لبههای آن به دست آمد. این روش منجر به شکلگیری داربست استوانهای شکلی با قطر خارجی در حدود 30 لایه گرافینی شد.
مشخصه یابی: برای مطالعهی مورفولوژی سطح مقطع فوم سه‌بعدی از SEM(TESCAN) در انرژی keV 25استفاده‌شده است. از XPS با منبع اشعه ایکس Al-Kαدر انرژی eV6/1486و در خلا حدودPa7-10 برای بررسی وضعیت اتمهای کربن موجود در ساختار فوم گرافینی کمک گرفته‌شده است. برای کالیبره کردن طیف گرفته‌شده، انرژی پیوندی قله‌ی اصلی در eV0/285 ثابت فرض شده و همه‌ی مقادیر انرژی پیوندی با خط ثابت انرژی C(1s) در eV0/285سنجیده شده است. قله‌های طیف XPS با استفاده از نرم‌افزار SDP و با در نظر گرفتن مؤلفه‌هایگاوسی پس از حذف پیش‌زمینه به حالات شیمیایی آنها تفکیک‌شده‌اند. ساختار کربنی فوم نیز با استفاده از طیفسنجی رامان(HR-800 Jobin–Yvon) با منبع Nd-YAG با طول‌موج تحریکی 532 نانومتر موردبررسی قرارگرفته است. خاصیت آبدوستی سطوح و سطح مقطع فوم نیز با کمک تست زاویه تماس در دمای اتاق موردمطالعه قرارگرفته است. درنهایت رسانندگی الکتریکی فوم نیز با محاسبه مقاومت سطحی لایههای گرافینی با استفاده از فن پروب چهار نقطهای اندازهگیری شده است.
کشت سلول: سلولهای بنیادی عصبی انسان (تهیه‌شده از گیبکو) در محیط مناسبی که متشکل از 2درصد سرم آلبومینِ گاوی(BSA)، 1 درصد پنی‌سیلین/ استرپتومایسین، 2 میلیمتر گلوتامین، 10 نانوگرم بر میلیلیتر عامل رشد اپیدرمال و 10 نانوگرم بر میلیلیتر عامل رشدفیبروبلاست عمومی(bFGF) است، تحت اتمسفر CO2و دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. در طی فرآیند کشت، محیط کشت هر سه روز یک‌بار از نو تازه شده است. سلولهای بنیادی عصبی با چگالی تقریبی104×6 سلول در هر سانتیمتر مربع طبق دفترچه راهنمای گیبکو با شماره کاتالوگ N7800-100,200 در بین لایههای فوم پیچیده نشده کاشته شدند و سپس فوم دوباره پیچیده شد. فرآیند تکثیر سلولها به مدت 72 ساعت ادامه پیدا کرد.
تمایز و تحریک الکتریکی سلولهای بنیادی: بلافاصله پس از فرآیند تکثیر، تمایز عصبی سلولهای بنیادی با برداشتن عاملهای رشد از محیط کشت شروع شد (20). مدت‌زمان تمایز در حدود 2 هفته در نظر گرفته شد. برای تحریک الکتریکی در ابتدا محیط کشت با محیطی خارجی شامل 140 میلیمولNaCl، 5 میلیمول KCL، 2 میلیمول CaCl2، 5/1 میلیمولMgCl2، 15 میلیمول اسید اسکوربیک، 10 میلیمول گلوکز و 10 میلیمول HRPESو باpH حدود 5/6 جایگزین شد. سپس یک سری پالسهای ولتاژ کاتدی 100 میلی‌ثانیه‌ای در بازه‌های زمانی 10 ثانیه‌ای به دو انتهای فوم پیچیده شده که به‌طور الکتریکی باسیم‌های طلا و چسب نقره به ژنراتور متصل شده بود، اعمال شد. مشخص شد که آستانه‌ی تحریک الکتریکی این سلولهای عصبی در حدود 20 میلی‌آمپر است.
تصویربرداری فلورسانس از سلولها:به‌منظور تصویربرداری از سلولها با استفاده از نشان‌گرهای پروتئینی، سلولهای رشد یافته بر روی لایههای فوم اکسید گرافینی پیچانده شده به مدت 20 دقیقه توسط محلول PBS حاوی 4 درصد حجمی پارافورمالدهید تثبیت شدند. در مرحلهی بعدی نمونه‌ها سه مرتبه با PBS شستشو گردیدند و به مدت 60 دقیقه در محلول PBS حاوی 2 درصدBSA، 0/1 درصد تریتون ایکس-100 و آنتی-نستین (با رقیق‌شدگی ~1: 500) انکوبیت شدند. بعدازاین مرحله نیز، سلولها به مدت 60 دقیقه با گوت آنتی-ربیتTRITC (Tetramethylrhodamine) (با رقیق‌شدگی ~1: 500) انکوبیت شدند. سپس دوباره 3 مرتبه با محلول PBS شستشو شدند. پس از طی شدن این مراحل، بتا تیوبولین کلاس III مخصوص نورون (TUJ1، به‌عنوان نشانگر سلول نورون که در شکلها با فلش شماره 1 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 500)، پروتئین اسیدی فیبریلاری گلیال (GFAP) (Glial fibrillar acidic protein)، به‌عنوان نشانگر سلول گلایلکه در شکلها با فلش شماره 2 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 500) وDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(به‌عنوان نشانگر هسته‌های سلول که در شکلها با فلش شماره 3 مشخص شده و با رقیق‌شدگی ~1: 100) به محلول PBS اضافه شدند و به مدت 30 دقیقه با سلولهای تمایزیافته انکوبیت شدند. سلولهای رنگ‌آمیزی شده در سطح مقطع فوم (توسط بریدن فوم پیچانده شده) و در سطوح داخلی آن (توسط به‌آرامی باز کردن فوم پیچانده شده) توسط PBS شستشو شدند و با استفاده از میکروسکوپ فلورسانسی هم کانون (Zeiss LSM510) تحت نظر قرار گرفتند. تعداد متوسط سلولها در واحد سطح نیز توسط شمارش سلولهای رنگ‌آمیزی شده در مساحتی در حدود 4 میلیمتر مکعب به دست آمد. تمامی آرایههای زیستی حداقل 3 مرتبه انجام گرفتند. اختلاف معنی‌دار برای p مقدار کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
شکل 1-آ تصویر SEMو شکل 2 تصویر FESEMاز سطح مقطع فوم گرافینی بریدهشده است و لایه‌لایه بودن آن را نشان میدهد. این لایهها بین دولایه باضخامت حدود 1 میکرومتر پَکیده شدهاند. شکل 1-ب نیز تصویر SEM با بزرگنمایی بیشتر را نشان میدهد. از روی شکل فضاهای خالی کمتر از میکرون نیز بین لایههای تشکیل‌دهنده فوم با چگالی حدوداً 10 لایه در هر میکرومتر و ضخامت کمتر از 80 نانومتر، کاملاً واضح است. برای تعیین حالات شیمیایی اتمهای کربن موجود در فوم گرافینی و فوم گرافینی عامل دار شده با لامینین از XPSاستفاده‌شده است. شکل 3-آ-1 طیف XPS با تفکیکپذیری بالای C(1s) را نشان میدهد. برای کالیبره کردن طیف گرفته‌شده، انرژی پیوندی قله‌ی اصلی (که به پیوندهایC─C، C─H و C=C نسبت داده‌شده‌اند) در eV0/285 ثابت فرض شده و همه‌ی مقادیر انرژی پیوندی با خط ثابت انرژیC(1s) در eV 0/285 سنجیده شده است. با توجه به شکل3-آ-1قله‌های موجود در 286/6 eV،287/3 eV، 288/3 eV و 289/4 eVبه ترتیب به گروه‌های عاملی حاوی اکسیژنC─O، C─O─C، C=O و O=C─O نسبت داده‌شده است.نتایج طیفXPS فوم گرافینی عاملدار شده با لامینین نیز در شکل 3-آ- 2 آمده است.
|
(آ) |
|
(ب) |
|
5µm |
|
1µm |
شکل 1: تصاویر SEM از سطح مقطع فوم گرافینی ساخته‌شده با بزرگنماییهای مختلف
شکل 2: تصاویر FESEM از سطح مقطع فوم گرافینی ساخته‌شده با بزرگنماییهای مختلف
همان‌طور که مشاهده میشود قله‌ی موجود در eV0/286 به شکلگیری پیوند کربن با نیتروژن((C─Nبر روی سطح فوم گرافینی اشاره دارد. علاوه بر این، شکل 3-ب نیز حضور پیک مربوط به N(1s)در طیفXPS با تفکیکپذیری بالای فوم گرافینی عاملدار شده با لامینینرا نشان میدهد که بر موفقیت در عاملدار شدن فوم توسط لامینین اشاره دارد. با توجه به طیف گرفته‌شده نسبت اکسیژن به کربن(O/C) در لایههای فوم گرافینی و لایههای فوم گرافینی عاملدار شده با لامینین در حدود 25/0 به دست آمد. برای مقایسه بهتر، طیفXPS صفحههای اکسیدگرافینیِ از قبل آماده‌شده (بدون اعمال حرارتی و بدون اینکه تحت اشعه‌ی فرابنفش قرارگرفته باشد) نیز در درون شکل 3-آ آمده است. نسبت O/C در این صفحههای گرافینی در حدود 49/0است. ازآنجایی‌که نسبت متداول O/C در اکسید گرافین احیاشده با هیدرازین در حدود 2/0 است، این نتایج نشان‌دهنده‌ی احیای جزئی فوم اکسید گرافینی در طول مدت فرآیند ساخت و سپس عاملدار شدن لایههای فوم اکسید گرافینی است. برای بررسی بیشتر ساختار کربنی فوم گرافینی طبق شکل 4 از طیفسنجی رامان استفاده‌شده است. پیکهای شناخته‌شده طیفسنجی رامان برای مواد کربنی، یعنی پیک G و پیک Dبه ترتیب در cm-11580و cm-11350 دیده می‌شوند. نسبت شدت پیک G/D که به‌عنوان پارامتری برای ارزیابی متوسط اندازه حوزههای sp2ای در ساختار گرافیتی که حاوی پیوندهای sp2 و sp3است، برای فوم اکسید گرافینی در حدود 3/1 و برای فوم عاملدار شده با لامینین در حدود 1/1 به دست آمد. این کاهش در نسبت شدت پیک G/Dنشاندهنده تشکیل پیوندهای کربن با نیتروژن موجود در لامینین نسبت داد. در طیفسنجی رامان پیک D2مواد حاوی گرافین نیز به‌شدت به تعداد لایهها و صفحههای گرافینی موجود در ساختار حساس است (21). برای مثال نسبت شدت پیکD/G2برای گرافین تکلایه، دولایه، سهلایه و چندلایهبه ترتیب در حدود 6/1، 8/0، 3/0 و 07/0 است. با توجه به شکل 4 این نسبت برای فوم ساخته‌شده در حدود 4/0 به دست آمد مه نشانگر وجود گرافین سهلایهای و بالاتر در ساختار فوم است. برای تعیین میزان آبدوستی فوم ساخته‌شده از تست زاویه تماس کمک گرفته‌شده است. شکل 5 نتایج به‌دست‌آمده برای سطح مقطع و سطح‌رویی فوم اکسید گرافینی پیچانده شده است.
|
(آ) |
|
(ب) |
|
(2) |
|
(1) |
|
|
|
|
شکل 3: آ) طیفXPS با تفکیکپذیری بالا مربوط به C(1S) از فوم اکسید گرافینی1) بدون عاملدار و 2)با عاملدار شدن توسط لامینین؛ب)طیفXPS با تفکیکپذیری بالا مربوط به N(1S) از فوم اکسید گرافینی قبل و بعد از عاملدار شدن توسط لامینین
افزایش ناهمواری‌های یک سطح میتواند خاصیت آبدوستی را تغییر دهد (22) آب دوستی میتواند در افزایش میزان جذب آب، عاملهای رشد و سلولها بسیار مؤثر باشد که در ادامه به آن پرداخته‌شده است. شکل 5 همچنین مقاومت سطحی الکتریکی لایههای فوم گرافینی را نشان میدهد. آنچه اندازهگیری شد در حدود Ω/sq17بود که نشاندهنده این است که فوم به‌خوبی میتواند جریانهای تحریک الکتریکی در حدود mA20 را برای تمایز سلولهای عصبی تحت ولتاژهای کمتر از 5 ولت فراهم کند. علاوه بر این مشخص شد که مقاومت سطحی الکتریکی فومی که با لامینین عامل دار شده بود فقط 38 درصدافزایش یافت هبود. برای تائید صحت مقاومت به‌دست‌آمده میتوان آن را بر اساس میزان مقاومت به‌دست‌آمده برای صفحههای اکسید گرافینی از پیش گزارش شده تخمین زد.
|
(آ) |
|
|
|
(ب) |
|
|
شکل 4: طیف رامان آ)فوم اکسید گرافینی و ب)فوم اکسید گرافینی عاملدار شده با لامینین با استفاده از طول‌موج تحریکی532 نانومتر
|
اکسید گرافین-لامینین اکسید گرافین |
|
|
|
سطح فیلم سطح مقطع فیلم رول شده |
|
|
|
|
|
|
شکل 5: تست زاویه تماس و مقاومت سطح برای سطح‌رویی و سطح مقطع فوم سه‌بعدی گرافینی
برای مثال دریکی از گزارشها (23) میزان Rs برای اکسید گرافینی که به‌طور جزئی احیاشده بود در حدودMΩ/sq10(که برابر مقاومت در حدود Ω-cm1است) است. در این پژوهش مادهای که جریان الکتریکی در آن جریان دارد فوم پیچیده شده بود که انباشتی از صفحههای ته‌نشین شده اکسید گرافین است. برای فوم استوانهای شکل با شعاع خارجی در حدود 450 میکرومتر (مطابق با 15 لایه روی‌هم انباشته‌شده) و طول5/1 سانتیمترمیتوان میزان مقاومت را در حدود Ω200 تخمین زد که به‌خوبی مطابق با محاسبات ما بوده است.برای تجزیه‌وتحلیل خواص پایه زیستی در ابتدا چسبندگی به سطح و تکثیر سلولهای بنیادی در سرتاسر تخلخل و حفرههای موجود در فوم گرافینی که خاصیت فرا-آبدوستی در سطح مقطع خود دارد، موردبررسی قرارگرفته است. در رابطه با همین منظور شکل 6-آ نشاندهنده تصویر فلورسانس از سلولهای بنیادی عصبی رشد یافته بر روی سطح مقطع فوم استوانهای شکل است. فواصل بین لایههای تشکیل‌دهنده فوم به‌خوبی مشخص است که در حدود 20 میکرومتر است. به‌طور واضح میتوان دید که سلولها به‌طور یکپارچه بر روی سطح مقطع تکثیر یافتهاند. این موضوع نشاندهنده رشد سلولها در سرتاسر تخلخل و سطوح لایههای تشکیل‌دهنده فوم است. علاوه بر این شکل 6-ب نیز تصویر فلورسانس از رشد سلولها در لایههای داخلی فوم گرافینیبازشده را نشان میدهد. این طویل شدن و کشیده شدگی سلولها به همراه جواب مثبت آنها به نشانگر نِستین نشاندهنده تکثیر سه‌بعدی سلولها با مشخصات عصبی در سرتاسر تخلخل فوم سه‌بعدی است. به‌منظور تجزیه‌وتحلیل کمی فرآیند تکثیر، شکل 7 تعداد هسته سلول و سلولهای عصبی در واحد مساحت تصویر فلورسانس سلولهای تکثیر یافته بر روی سطح مقطع و لایههای داخلی فوم گرافینی و زیرلایه PDMS (به‌عنوان نمونه مرجع) را نشان میدهد. استفاده از PDMS این کمک را کرده تا بتوان تشخیص داد رشد سلولی بین سطوح فوم گرافینی به‌طور مشخصی بیشتر از رشد بر روی PDMS است و همچنین رشد سلولی بر روی سطح مقطع فوم استوانهای شکل قابل‌مقایسه با رشد بر روی PDMS است. این رشد قابل‌توجه سلولها در سطوح داخلی و سطح مقطع فوم گرافینی را میتوان به زیست سازگاری سطح و فرا-آبدوستی سطح مقطع فوم نسبت داد. البته این را هم باید توجه کرد که به علت ماهیت ناهموار سطح مقطع فوم، تمرکز میکروسکوپ بر روی سلولها ساده نبود و به همین دلیل همان‌طور که در شکل 6 نیز با خط خطا مشخص‌شده، مقدار و شمارش سلولها به‌طور قابل توجهی کاهش‌یافته است.
|
فلش شماره 1 (سلول بنیادی عصبی) |
|
فلش شماره 3 (هسته سلول) |
|
(ب) |
|
(آ) |
|
400µm |
|
100µm |
شکل 6: آ) شکل فلورسانس از سلولهای بنیادی عصبی رشد یافته بر روی سطح مقطع فوم استوانهای شکل و ب)لایههای داخلی فوم گرافینی بازشده، از نشانگر نِستین (فلش شماره 1) برای رنگ‌آمیزی سلولهای بنیادی عصبی و از نشانگرِ DAPI (فلش شماره 3) برای رنگ‌آمیزی هسته‌ی سلول استفاده‌شده است.
|
|
|
سلول عصبی |
|
هسته |
|
|
|
سطح فوم بازشده |
|
سطح مقطع فوم رول شده |
|
نمونه کنترل |
شکل 7 : تعداد هسته‌ها و سلولهای عصبی رنگ‌آمیزی شده (ستونهای سمت چپ و ستون هاشور خورده سمت راست) و تکثیریافته بر روی سطح مقطع فوم استوانهای شکل و سطوح داخلی فوم بازشده در مساحت سطح در مقایسه با نمونه مرجع (PDMS).نتایج معنی‌دار با (*) برایp-مقدار کمتر از 0/05 مشخص‌شده‌اند (n=3).
تمایز سلولهای بنیادی عصبی انسان به سمت نورونها نیز بلافاصله پس از حذف عاملهای رشدEGF (Epidermalgrowth factor)و bFGF
(Basic fibroblast growth factor) از محیط کِشت شروع شد. پس از گذشت 3 روز، هیچ تغییر خاصی در مورفولوژی سلولها دیده نشد. اما بعد از 2 هفته، تغییرات قابل‌توجهی در مورفولوژی سلولهای تمایزیافته مشاهده شد. به‌طوری‌که طویل شدند و علائم عصبی نشان دادند.در ضمن سلولهای بنیادی عصبی به سمت سلولهای گلیال (پشتیبان بافتهای عصبی و فعالیت نورونها) نیز تمایز یافتند.در این پژوهش از نشانگر GFAP با فلش شماره 2 برای مشخص کردن سلولهای گلیال و نشانگر TUJ1 با فلش شماره 1 برای مشخص کردن سلولهای عصبی (نورونها) استفاده‌شده است. شکل 8-آ و 8-ب نشان‌دهنده‌ی تصاویر فلورسانس از سلولهای گلیال و نورونهای تمایزیافته بر سطح داخلی فوم بازشده و سطح مقطع فوم استوانهای شکل پس از گذشت 2 هفته از تحریک الکتریکی است. این تصاویر اشاره بر این دارند که فوم سه‌بعدی استوانهای شکل به‌خوبی توانسته نقش یک داربست سه‌بعدی برای تمایز نورونها و رشد تارهای عصبی حول سمتی فرض شده (محور اصلی استوانه) را ایفا کند. اگرچه اندازه بخش قابل‌توجهی از تخلخل سطح مقطع فوم زیر میکرون است، اما نقایص تخلخلی با اندازههای بین 1 تا 10 میکرومتر نیز موجود است که میتواند به‌عنوان مکان مناسبی برای رشد هسته سلول عمل کند. قابل‌ذکر است که تخلخلها و فصل مشترکهای زیر میکرون هم میتواند مکان مناسبی برای رشد تارهای طویل نورونها باشد. تصاویر فلورسانسی که اینجا از سطح مقطع فوم گرفته‌شده است تقریباً بهترین تصاویری است که در شرایط آزمایش گرفته‌شده است. تصاویر مناسب دیگری نیز برای تجزیه‌وتحلیل کمی فرآیند تمایز مورداستفاده قرار گرفت. به همین منظور، تعداد سلولها در واحد مساحت سطح به‌وسیله شمارش هسته سلول رنگ‌شده با DAPIبه‌دست‌آمده است (شکل 9-آ). سپس خصوصیات عصبی سلولهای تمایزیافته بر اساس نسبت تعداد سلولهای عصبی (مشخص‌شده با فلش شماره 1) و سلولهای گلیال (مشخص‌شده با فلش شماره 2) به تعداد هسته سلول موردبررسی قرار گرفت (شکل 9-ب و 9-ج). علاوه بر این نسبت تعداد سلولهای عصبی به سلولهای گلیال نیز محاسبه شد که نتیجه آن در شکل 9-د آمده است. این امر به دلیل تمایز گلیالی در غیاب محرکهای فیزیکی و شیمیایی است (24-26) درحالی‌که در احیای عصبی و مرمت مغز تقاضای بیشتر مربوط به تمایزات نورونی است (27 و 28). همچنین، مشخص شد که تحت تحریک الکتریکی تعداد هسته سلول به‌طور قابل‌توجهی بر روی سطح مقطع و فصل مشترکهای فوم پیچیده شده افزایش‌یافته است (شکل 9-آ). علاوه بر این، نسبت تعداد نورونها و سلولهای گلیال تمایزیافته بر روی سطح مقطع و فصل مشترکهای فوم پیچیده شده نیز افزایش تحت تحریک الکتریکی افزایش‌یافته است ( شکل 9-ب و 9-ج). هرچند طبق شکل 9-د این افزایش برای تعداد نورونها به نسبت تعداد سلولهای گلیال بیشتر است. این نتایج نشان میدهند که فوم گرافینی پیچیده شده که به‌صورت استوانهای شکل است میتواند تحت تحریک الکتریکی به‌عنوان یک داربست سه‌بعدی نویدبخشی در بازسازی قابل‌کنترل نورونها عمل کند.
|
فلش شماره 3 (هسته سلول) |
|
فلش شماره 2 (سلول گلیال) |
|
فلش شماره 1 (سلول عصبی) |
|
(ب) |
|
(آ) |
|
حفره مرکزی فوم پیچیده شده |
|
300µm |
|
100µm |
شکل 8: تصاویر فلورسانس از نورونها و سلولهای گلیال تمایزیافته بر روی سطح مقطع فوم استوانهای شکل و ب)سطح داخلی فوم بازشده پس از گذشت 2 هفته تحریک الکتریکی، هسته سلول، نورونها و سلولهای گلیالبه ترتیب با نشان‌گرهایDAPI، TUJ1 و GFAP و به ترتیب با فلشهای شماره 3، 1 و 2 مشخص‌شده‌اند
|
عدم اعمال تحریک الکتریکی تحت اعمال تحریک الکتریکی
|
|
عدم اعمال تحریک الکتریکی تحت اعمال تحریک الکتریکی
|
|
|
|
عدم اعمال تحریک الکتریکی تحت اعمال تحریک الکتریکی
|
|
|
|
|
|
عدم اعمال تحریک الکتریکی تحت اعمال تحریک الکتریکی
|
|
|
|
(ج) |
|
(د) |
|
سطح فوم بازشده |
|
سطح مقطع فوم رول شده |
|
سطح فوم بازشده |
|
سطح مقطع فوم رول شده |
|
سطح فوم بازشده |
|
سطح مقطع فوم رول شده |
|
سطح مقطع فوم رول شده |
|
سطح فوم بازشده |
|
(ب) |
|
(آ) |
شکل 9: مقایسه‌ی آ) تعداد هسته سلول تمایزیافته،ب) نسبت تعداد نورونها به تعداد هسته سلول، ج) نسبت تعداد سلولهای گلیال به تعداد هسته سلول تمایزیافته و د)نسبت تعداد نورونها به تعداد سلولهای گلیالتمایزیافته در مساحت سطح موجود در سطح مقطع و فصل مشترک فوم گرافینی در زمان استفاده از تحریک الکتریکی و عدم استفاده از آن
بحث
در سال 2013 گزارش شد که کشت سلولهای بنیادی عصبی موشی روی یک‌لایه‌ی نازک از گرافن سبب افزایش سیگنال‌های الکتریکی در شبکههای عصبی میشود که این امر ناشی از خاصیت رسانندگی الکتریکی گرافن، با کشت سلولهای بنیادی عصبی روی گرافن است (29) وقتی سلولهای بنیادی موش بهمدت 9 روز در روی بستری از گرافن اکساید کشت داده می‌شوند بیان مارکرهای بنیادی بودن در آنها به‌شدت کاهش می‌یابد که نشان‌دهنده‌ی القای تمایز عصبی در این سلولها است (30). در سال 2010 نشان داده شد که با کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی بر روی یک تک لایه از گرافن لوله شده (نانو لوله کربنی) بدون هیچ فاکتور عصبی در محیط کشت، سلولهای بنیادی مزانشیمی پس از هفت روز کشت روی این بستر کربنی مارکرهای عصبی نستین و MAP2 را بیان کردند که نشان دهنده‌ی تمایز عصبی در آنها بود (31) از طرفی اهمیت گروه‌های کربوکسیل در افزایش توان نانولوله‌های کربنی در تمایز عصبی بیان شده است. وقتی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی بر روی نانو لوله‌های کربنی کربوکسیلدار کشت یافتند، نه‌تنها میزان بیان پروتئین‌های عصبی نسبت به گروه کنترل (گروه فاقد کربوکسیل) افزایش یافت بلکه مدت زمان بیان این مارکرها از 1 روز به 14 روز افزایش، نشان داد نانو لوله‌های کربنی کربوکسیله شده از یک‌طرف سبب افزایش بیان فاکتورهای رشد عصبی میشود و از طرف دیگر با برقراری پیوند با آنها از طریق گروه‌های کربوکسیل خود، سبب به دام انداختن آنها به‌منظور ایجاد یک محیط مناسب برای تمایز طولانی مدت عصبی میشود (31). توانایی نانو ذرات گرافن اکساید در تمایز عصبی سلولهای بنیادی جنینی و موش گزارش شده است. با توجه به اطلاعات موجود از اثرات خانواده‌ی مواد گرافن و مشتقات آن در تمایز عصبی و از یک‌طرف بهدلیل اهمیت گروه‌های عاملی کربوکسیل در افزایش میزان تمایل نورون (32) و از طرف دیگر توانایی بالاتر نانو ذرات گرافن اکساید در مقایسه با نانو لوله‌های کربنی در تمایز عصبی (33)، نانو ذرات گرافن اکساید (گرافن دارای گروه‌های عاملی کربوکسیل و هیدروکسیل) به‌عنوان ماده‌ی القاکننده‌ی تمایز عصبی انتخاب شد. سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بهدلیل تهیه و کشت آسان، بالا بودن قدرت تمایز و عمر طولانی، با صرفه بودن از نظر اقتصادی و همچنین دارا بودن قدرت رشد و تکثیر بالا، یک کاندید خوبی برای استفاده در این تحقیق تبدیل شدند و نظر به اینکه بر اساس مطالعات صورت گرفته، اثرات احتمالی نانو گرافن اکساید بر روی روند تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی موش به سلولهای عصبی بدون اضافه کردن فاکتورهای تمایزی عصبی هنوز مورد بررسی قرار نگرفته بود ما در این تحقیق نتیجه گرفتیم سلولهای بنیادی عصبی انسان به‌خوبی بر روی داربست سه بعدی گرافینی ساخته شده تکثیر یافتند و سپس به کمک تحریک الکتریکی، بهسمت رده نورونی و گلیالی تمایز یافتند. مساله قابل اهمیت، تمایز بیشتر بهسمت رده نورونی (به جای رده گلیالی) میباشد که این مطلب در شکل 9 به‌خوبی نشان داده شده است. با توجه به این موضوع که ویژگی رسانندگی الکتریکی داربستهای گرافینی در تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی عصبی و تحریک الکتریکی آنها و تشکیل بافتهای عصبی نقش اساسی دارند، میتوان در تحقیقات آینده بهسوی ساخت داربستهای اکسید گرافینی احیا شده با درصد مولکولهای اکسیژن کمتر، به‌منظور افزایش میزان رسانندگی الکتریکی رفت. برای مثال میتوان از احیا کنندههای سبز و دوستدار محیط زیست برای احیای محلول اکسید گرافین سنتز شده استفاده کرد و سپس اقدام به ساخت داربست گرافینی کرد. این نوع بافتهای عصبی ساختگی، معمولا قبل از استفاده عملی در انسان احتیاج به آزمایشات فراوان به‌منظور بررسی عدم ایجاد مشکل در بدن انسان دارند و حتی آن نتایجی که بر روی دیگر موجودات از جمله موش‌های آزمایشگاهی و ... بهدست میآیند، دلیل کافی برای نتیجهگیری یکسان بر روی انسان نخواهند بود و به بررسی و تحقیق بیشتری احتیاج است.
نتیجهگیری
در این پژوهش فوم گرافینی پیچیده شده به‌عنوان داربست سه‌بعدی رسانای الکتریکی در مقیاس موردنظر ساخته شد و در رشد تارهای عصبی تحت تحریک الکتریکی مورداستفاده قرار گرفت. آنالیز XPS نشان داد که فوم گرافینی به‌طور جزئی تحت اشعه فرابنفش و دمای80درجهی سانتیگراد احیاشده بود. ضخامت متوسط هر فوم گرافینی در حدود15 الی50 میکرومتر به دست آمد و چگالی لایههای تشکیل‌دهنده آن نیز به‌طور متوسط حدود 10 لایه در هر میکرومتر است. طیفسنجی رامان وجود صفحههای گرافینی چندلایهای در ساختار فوم را تائید کرد. مشخص شد مقاومت سطحی الکتریکی فوم گرافینی نیز حدودΩ/sq 17به‌طور کامل مناسب برای تولید جریانهای تحریک الکتریکی (حدود mA20) در تمایز سلولهای عصبی با استفاده از ولتاژهای کمتر از 5 ولت بود. تست زاویه تماس نیز نشان داد که اگرچه سطح فوم گرافینی عامل دار شده با لامینین آب‌دوست هستند، اما سطح مقطع فوم پیچیده شده خاصیت فرا-آبدوستی دارد که به تکثیر و تمایز مؤثرتر سلولها در سراسر تخلخل و فصل مشترکهای فوم منجر میشود. درنهایت تحریک الکتریکی سلولهای بنیادی عصبی انسان بر روی فوم نیز به تکثیر بیشتر سلولها و تسریع تمایز آنها به سمت نورونها در مقایسه با سلولهای گلیال منتهی شد. همه این نتایج میتواند کاربردهای فوم گرافینی پیچیده شده را به‌عنوان داربست سه‌بعدی در بازسازی مؤثر شبکههای عصبی در نانو داروهای آتی مهیا کند
)