نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی گروه زیست شناسی تکوینی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، تهران، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
3 دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، مرکز تحقیقات علوم اعصاب و گروه علوم تشریح، تهران، ایران
4 دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، مرکز تحقیقات علوم اعصاب، تهران، ایران
چکیده
هدف: این تحقیق به بررسی هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی ترمیم نقص جزئی استخوان ران توسط سلولهای BMSCs و غشای ژلاتین- کیتوسان در موش صحرایی بالغ نژاد آلبینو - ویستار پرداخته است. مواد و روشها: در این بررسی تجربی60 سر موش صحرایی نر بالغ نژاد آلبینو- ویستار بهطور تصادفی در پنج گروه مساوی قرار گرفتند: گروه شاهد که بعد از ایجاد نقص هیچ درمانی دریافت نکردند، گروه شم که بعد از ایجاد نقص محیط کشت بهصورت موضعی در محل تزریق شد، گروه ژلاتین – کیتوسان که از غشا در محل نقص استفاده شد، گروه سلول که پیوند غیر اتولوگ سلولهای BMSC بهصورت موضعی در محل نقص انجام شد، گروه سلول - غشاء که سلول بههمراه غشاء ژلاتین – کیتوسان در محل نقص پیوند شد. نتایج: میانگین مساحت ترابکولای استخوانی در گروههای غشا و سلول نسبت به گروه شاهد افزایش معنیداری را نشان داد. میانگین تعداد استئوسیتها در ناحیه نقص در گروه سلول نسبت به گروه شاهد افزایش معنیداری نشان داد. میانگین تعداد استئوسیتها در گروههای شم و غشا نسبت به گروه شاهد اختلاف معنیداری نداشت ولی این میانگین درگروه سلول- غشا نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری داشت (001/0p <). نتیجه گیری: پیوند سلولها در ترمیم نقص موثر بوده و غشا هم میتواند به ترمیم نقص کمک نماید ولی استفاده از سلول بههمراه غشا کمک چندانی به ترمیم نقص جزئی استخوان ران نمیکند.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of the Repair of Bone Defect using Chitosan - Gelatin Membrane and Bone Marrow Stromal Cells in Male Albino Wistar Adult Rat
نویسندگان [English]
- A A 1
- M S 2
- SH S 3
- Gh k 4
چکیده [English]
Aim: This study aimed to evaluate the histomorphometric and immunohistochemical parameters of the repair of femoral bone defect using bone marrow stromal cells on gelatin – chitosan membrane in adult Albino Wistar rats. Materials and Methods: In this experimental study, sixty male Albino wistar adult rats were equally divided into five groups as follows: Control group that received no treatment after bone defect. Sham group that after bone defect, the culture medium was injected locally at the site of defect. Gelatin-chitosan group that membrane was used into bone defect. Cell group that nonautolog BMSCs were injected locally into defect .Cell-GC group that cell transplantation with chitosan - gelatin membrane were used into the bone defect. Results: The mean area of trabeculae in groups of membranes and cells significantly increased when compared to the control group.The mean number of osteocytes and cells in the bone defect in cell group significantly increased when compared to the control group.No significant difference were found in chitosan - gelatin and sham groups compared to control group but the mean number of osteocytes significantly decreased in BMSCs with gelatin-chitosan scaffold group compared to control group (p < 0.001) Conclusion: BMSC transplantation and gelatin-chitosan scaffold are effective in repair of bone defect. However, the use of BMSCs with gelatin-chitosan scaffold is not effective in repair of femoral bone defect.
کلیدواژه‌ها [English]
- BMSCs
- Cell transplantation
- Gelatin-Chitosan scaffold
- Bone Repair
- Rat
مقدمه
یکی از معضلات و مشکلات پیش روی علم پزشکی، وجود شکستگیهای دیر جوش خورنده استخوان و نواقص استخوانی است. اقدامات درمانی مختلفی در جهت ترمیم و بهبود نقص استخوان و شکستگیها همچون استفاده از سیمان استخوانی، پیوند سلولهای بنیادی، استفاده از پروتئینهای شکل دهندهی استخوان و کاربرد مواد زیست تخریب پذیر صورت میپذیرد (1، 2، 3 و 4). سلولهای بنیادی مزانشیمی ) (Mesenchymal Stem Cells) (MSCs) سلولهای چند استعدادی و پرتوانی هستند که به راحتی تلخیص و تکثیر شده و میتوانند تبدیل به سلولهای استخوانی، غضروفی، فیبروبلاست، عضلانی و غیره شوند و میتوان از آنها برای پیوند استفاده کرد (5 و 6). سلولهای بنیادی را میتوان از منابع مختلف از جمله مغز استخوان، (5) درم، (7) پالپ دندان، (8) سینوویوم، (9) و دندان شیری بهدست آورد (10). سلولهای ایده‌آل برای پیوند باید چندین خصوصیت از جمله دستیابی آسان، قدرت تکثیر سریع در محیط کشت، قدرت حیات طولانی و عدم رد پیوند در میزبان را داشته باشند. سلولهای استرومایی مغز استخوان (Bone Marrow Stromal Cells) (BMSCs) تمامی این صفات را دارا می‌باشند.) 4 و 11(
امروزه درمهندسی بافت، داربستهای زیست تخریب پذیر بهعنوان بستری برای سلولهای بنیادین ساخته میشوند (12 و 13). در مهندسی بافت، داربست سلولی به تعیین شکل سه بعدی، افزایش بقای سلول و ایجاد چسبندگی مکانیکی اولیه کمک نموده و نیز به تجمع سلولی و ایجاد بافت و شکلگیری ساختار بافتی کمک کرده و میتواند بافت طبیعی و کاملی را حاصل کند (14).
مهندسی بافت استخوان نیز بهطور معمول به کمک داربستهایی که القاگر تشکیل استخوان بوده و قدرت هدایت و رشد سلولهای استخوانی را دارند، انجام میشود. انواع متفاوتی از داربستها در آزمایشگاه و در موجود زنده مورد بررسی قرار گرفته اند. ژلاتین، کیتوسان و کلاژن موادی زیست تخریب پذیر بوده و میتوانند بهعنوان مادهی اولیه داربست سلولی در مهندسی بافت بهکار گرفته شوند (14)
در مطالعه یوجی یین و همکاران (14) گزارش شده است که غشا ژلاتین - کیتوسان و بتا تری کلسیم فسفات با استفاده از تکنیکFreez – Drying تولید و اثرات پوستی آن بر روی خرگوش مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج حاصل از این تحقیق نشان میدهد که این غشا میتواند بهعنوان غشای مناسب در مهندسی بافت استخوانی نیز مورد استفاده قرار گیرد. در تحقیق Caplen و همکاران (15)، نشان داده شده است که پیوند MSC کشت شده بر روی ژل کلاژن به خرگوشهای مبتلا به ضایعات استخوانی و غضروفی سبب تشکیل مجدد استخوان و غضروف در ناحیه آسیب دیده شده است اما بافت تشکیل شده در این محل از نظر خصوصیات مکانیکی با بافت نرمال بهطور قابل توجهی متفاوت بوده و طی 24 هفته بافت از بین رفته است (15).
نتایج هیستومورفومتری حاصل از تحقیقات استوکمن (16) بر روی نقص جمجمه خوک که در آن پیوند سلولهای استرومایی صورت گرفته بود، نشان داد که سی روز بعد از ایجاد نقص، گروه شاهد و تجربی از نظر حجم استخوان ترمیم شده به حجم کل نقص تفاوتی نشان ندادند.
با توجه به اهمیت سلولهای بنیادی در ترمیم نواقص بافتی و از طرفی وجود گزارشاتی مبنی بر اثر مثبت داربستهای زیست تخریب پذیر در تسریع ترمیم بافتها، هدف از تحقیق حاضر بررسی ترمیم نقص جزئی استخوان ران توسط سلولهای استرومایی مغز استخوان همراه با غشا ژلاتین – کیتوسان در موش صحرایی با استفاده از روشهای هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی میباشد.
مواد و روشها
در این پژوهش تجربی از 60 سر موش صحرایی نر و بالغ نژاد آلبینو- ویستار با وزن حدود 200 تا 250 گرم استفاده شد. خوراک دام موشها بهصورت حبه بههمراه آب و بهصورت آزاد در دسترس موشها قرار گرفت. حیوانات در دمای حیوانخانه که حدود 2 ± 22 درجه سانتیگراد و روشنایی آن بهطور متناوب دوره روشنایی و تاریکی 12 ساعته بود در شرایط مطلوب و استاندارد حیوانخانه دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله نگهداری شدند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا... بود، هنگام کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد. حیوانات به طور تصادفی به پنج گروه تقسیم شدند. 1- گروه شاهد (Control) شامل حیواناتی که بر روی استخوان ران پای راستشان در ناحیه فوقانی اپیفیز دیستال سوراخی بهصورت دو طرفه ایجاد نموده و هیچ درمانی دریافت نکردند. 2- گروه شم (Sham) گروهی که 72 ساعت بعد از ایجاد آسیب، 50 میکرولیتر از محیط کشت بهصورت موضعی، درمحل نقص استخوان تزریق شد. 3- گروه (ژلاتین – کیتوسان) که پس از ایجاد نقص استخوان ران و گذشت 3 روز پیوند غشای ژلاتین-کیتوسان در محل آسیب انجام شد 4- گروه سلول ((BMSCs که 72 ساعت بعد از ایجاد نقص استخوانی تعداد 000/150سلول BMSCs بهصورت غیراتولوگ و موضعی در محل آسیب تزریق شد.5 - گروه سلول - غشا (BMGC) که نقص استخوانی در ران ایجاد شده و 3 روز بعد 000/150 سلول بنیادی مغز استخوان به همراه غشای ژلاتین-کیتوسان در محل آسیب پیوند شد.
روش تهیه غشا: ابتدا کیتوسان (Ch) (Germany ,Merck (Darmstadt) با نسبت 1 درصد وزنی به محلول آب مقطر 2 بار تقطیر که با درجه حرارت 40 درجه سانتیگراد اضافه شد محلول حاصل بهوسیلهی دستگاه همزن(Germany, IKA-RH) مخلوط شد. سپس میزان 5/0 میلی لیتر اسید استیک خالص به آن اضافه و ژلاتین ( Sigma-Aldrich هنــد، (Bangalore) با نسبت 1 درصد وزنی به آن اضافه و به دمای جوش رسانده شد. محلول حاصل بهوسیلهی اتوکلاو استریل گردید.
استخراجسلول: ابتدا موشهای صحرایی بالغ نر نژاد Albino wistar با وزن حدود 200 تا 250 گرم بهصورت تصادفی انتخاب شده و بهوسیله مخلوط کتامین (50 میلیگرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلیگرم بر کیلوگرم) (هر دو Holland, Alfasan) بیهوش شدند. سپس استخوان ران پای چپ و راست اکسپوز شده و توسط قیچی استخوان بر، شکستگی کامل در استخوان ایجاد شده و با کمک سرنگ 5 میلیلیتری حاوی 1 میلیلیتر محیط αMEM (UK- GIBCO) و سرم جنین گاوی FBS Fetal bovine serum) ) (UK- GIBCO) 10 درصد و یک سر سوزن G18 مغز استخوان را از هر دو انتهای پروگزیمال و دیستال استخوان آسپیره کرده و تمام محتویات سرنگ را بهدرون یک فلاسک 25 میلیلیتر تخلیه و در انکوباتور با 2/7 pH=، دمای 37 درجه سانتیگراد و میزان CO2، 5 درصد و در محیط مرطوب انکوباتور(MMM کشور انگلیس) برای مدت 24 ساعت نگهداری نموده و سپس محیط کشت تعویض شد. هنگام تعویض محیط، سلولها توسط (Phosphate Buffer Saline) PBS استریل شسته شدند. پس از آن تعویض محیط هر 2 تا 3 روز تا تخلیه کامل سلولهای خونی و خونساز و پر شدن بیش از 80 درصد کف فلاسک ادامه یافت. بعد از پاساژ دوم، سلولها آماده پیوند شدند.
کشت سلولهای BMSC بر روی غشاء ژلاتین – کیتوسان: پس از تهیه غشا و قرار دادن قطعات1×1 سانتیمتر آن بهمدت یک هفته در محیط کشت αMEM UK-) GIBCO) حاوی سرم، آن را بهوسیله محلول PBS و الکل 96 درصد شستشو داده و غشاها در پلیتهای شش خانه ای استریل در زیر هود JAL TAJHIZ)کشور ایران) قرار گرفته و به کف پلیتهای آغشته به محلول ژلاتین استریل یک درصد، منتقل شدند. سپس قطعات غشا را بهآرامی بر روی پلیت پهن نموده و کمی در داخل هود قرار داده تا خشک شوند. در این هنگام سلولهای استرومایی را از کف پلیت بهوسیله آنزیم تریپسین (Germany, Merck) جدا کرده و بر روی غشا ریخته و کمی محیط کشت حاوی محلول سرم گاوی به آن اضافه شد. سپس پلیتها در دستگاه انکوباتور( MMMکشور انگلیس) قرار داده شدند. پس از دو روز غشاها را در زیر میکروسکوپ Leica) کشورآلمان( مشاهده کرده تا از وجود سلول استرومایی اطمینان حاصل شود.
ایجادنقصاستخوانی: حیوانات بهوسیله مخلوط کتامین هیدروکلرید mg/kg) 60( و زایلازین هیدروکلرید (10 میلیگرم بر کیلوگرم) (هر دو (Holland, Alfasan بیهوش شده و پوست خلفی خارجی ران، توسط بتادین و الکل استریل شد. بهمنظور ایجاد نقص استخوان با استفاده از جراحی، پس از بیهوش کردن حیوانات، سطح خارجی ناحیه ران راست آنها تراشیده شد و با بتادین استریل شد. سپس برشی به طول دو سانتیمتر در ناحیه خارجی پای راست حیوانات ایجاد و پس از کنار زدن عضلات ، استخوان ران در معرض دید قرار گرفت، سپس سوراخی به قطر ١ میلی متر بهصورت دو طرفه (Transcortical) در ناحیه بالای اپیفیز دیستال استخوان ران ایجاد شد و در پایان عضلات و پوست بهوسیله نخ ۴ صفر قابل جذب دوخته شد و مراقبتهای پس از عمل جراحی از حیوانات به عمل آمد. پس از گذشت ٧٢ ساعت از جراحی ناحیه عمل مجددا باز شد و در گروههای پیوند سلول مقدار ٥٠ میکرو لیتر محیط کشت حاوی 000/150 سلول نشان دار شده با (UK- GIBCO) Brdu (که ٧٢ ساعت قبل از پیوند در معرض Brdu با غلظت 5/1میلیمولار قرار گرفته بودند) و در گروه شم فقط ٥٠ میکرولیتر محیط کشت تزریق شد. در گروه غشا که غشا ژلاتین – کبتوسان در محل نقص استخوانی پیوند زده شد و گروه سلول - غشا که غشایی که سلول روی آن کشت داده شده بود در محل نقص پیوند زده شد و سپس عضلات و پوست مجددا با نخ ۴ صفر قابل جذب دوخته شد.
نمونهبرداریازحیوانات: موشها 28 روز بعد از جراحی دوم با استفاده از دوز بالای کلروفورم کشته شده و پس از برداشتن استخوانها، ارزیابیهای هیستومورفومتریک و ایمونوهیستوشیمی بر روی آنها صورت گرفت.
شمارشسلولیوبررسی میزان زندهبودنسلولها ((Viability test: برای مشخص کردن زنده بودن سلولها، به نسبت مساوی حجمی از سوسپانسیون سلولی و تریپان بلو (4/0 درصد) بر روی لام نئوبار ریخته و سلولهای زنده و مرده توسط میکروسکوپ اینورت Leica) کشور آلمان) با بزرگنمایی ٤٠٠ بررسی و شمارش شدند و از آنجایی که سلولهای مرده توسط تریپان بلو به رنگ آبی درمی آیند و سلولهای زنده شفاف می‌باشند، تعداد سلولهای زنده و مرده شمارش شده و درصد آنها محاسبه و ثبت شدند.
مطالعه هیستومورفومتری: جهت بررسی میزان ترابکولا موجود در محل کال استخوانی از مجموعه سخت افزاری (کامپیوترو میکروسکوپ متصل به دوربین(Tsview INFINITY1) کشور کانادا ( وسیستم نرم افزاریMotic استفاده شد. بدین ترتیب که از هر نمونه استخوان پس از کلسیم زدایی با اسید فرمیک ۱۰ درصد و فیکساسیون و پردازش بافتی، مقاطع طولی سریالی 5 میکرونی از نمونهها تهیه و با نسبت ۱ به۴ تعداد ۷ مقطع از ناحیه کال تهیه و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین انجام شد. جهت مطالعه هیستومورفومتری، از مقاطع بافتی، تصاویر با بزرگنمایی100 برابر تهیه و میزان ترابکولاها و بافت همبندی عروقی در مساحتی برابر با 50000 میکرومترمربع اندازهگیری و ثبت شدند.
شمارشسلولی
تعداد استئوسیتهای موجود درتیغه های استخوانی در سطحی معادل50000 میکرومتر مربع با بزرگنمایی٤٠٠ برابر محاسبه و ثبت شدند.
ردیابی سلولهای تزریق شده بهروش ایمونوهیستوشیمی: در پایان هفته چهارم، از ناحیه نقص استخوانی از گروههای مختلف مقاطع پارافینی به ضخامت 5 میکرومتر تهیه و وجود سلولهای نشاندار شده موجود در محل ترمیم استخوان با استفاده از روش ایمنو هیستوشیمی و بهرهگیری از آنتی Brdu ردیابی و تایید شدند.
آنالیز آماری
ارزیابی آماری دادهها با استفاده از آزمون آماری ANOVA و آزمون تکمیلی Tukey Post Hock انجام شد. در انجام آزمونهای آماری از نرم افزار SPSS استفاده شد. کلیه اطلاعات ارائه شده برحسب Mean ± SEM میباشد. میزان 05/0 p< بهعنوان درجه معنیداری در نظر گرفته شد.
نتایج
تعیین میزان حیات سلولها
بر اساسviability test درصد سلولهای BMSCs در انتهای مراحل کشت نشان دهنده این واقعیت بود که پس از پاساژ چهارم و پرشدن بیش از هشتاد درصد کف پلیت، میزان BMSCs زنده ، به بیش از 91 درصد رسید.
هیستومورفومتریبافتاستخوان
میانگین درصد وسعت تیغههای استخوانی(Trabeculae) شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروه های مختلف بر حسب میکرومتر مربع بهترتیب در گروه شاهد (130/2 ± 23/69)، در گروه شم (07/2 ± 91/69)، در گروه غشا (46/1 ± 18/86)، در گروه سلول ( 71/1 ± 52/81 ) و در گروه سلول- غشا (16/1 ± 79/70) بوده است. مقایسه میانگین درصد تیغههای استخوانی گروهها با یکدیگر نشان داد که تفاوت معنیداری در گروه شم نسبت به گروه شاهد وجود نداشته است ولیکن این غیرمعنیداری افزایش را نشان میدهد. در گروههای غشا و سلول (هر دو 001/0p<) نسبت به گروه شاهد افزایش چشمگیر معنیداری را نشان داده است، حال آنکه این میانگین در گروه سلول– غشا نسبت به گروه شاهد افزایش غیرمعنیداری داشته است. این میانگین در دو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم افزایش چشمگیر و معنیداری را نشان داده است (001/0p<) . ولی گروه سلول- غشا نسبت به گروه شم دارای افزایش غیرمعنیداری بوده است و در گروه سلول در مقایسه با گروه غشا دارای کاهش غیرمعنیداربود. حال آنکه میانگین درصد تیغههای استخوانی در گروه سلول – غشا نسبت به گروه غشا دارای کاهش معنیداری بود (001/0p<).در نهایت این میانگین در گروه سلول – غشا در مقایسه با گروه سلول دارای کاهش معنیداری بود (001/0p<)
میانگین درصد بافت همبندی- عروقی (Connective Vascular Tissue) شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروههای مختلف بر حسب میکرومتر مربع به ترتیب در گروه شاهد (082/2 ± 06/30)، گروه شم (07/2 ± 96/29)، گروه غشا (46/1 ± 82/13)، گروه سلول (69/1 ± 05/18) و گروه سلول- غشا (25/1 ± 10/29) بوده است. از مقایسه اعداد این نتیجه حاصل شد که میانگین درصد بافت همبندی- عروقی درگروههای غشا و سلول نسبت به گروه شاهد دارای کاهش معنیدار بوده (001/0p<)، حال آنکه این میانگین دردو گروه شم و سلول- غشا نسبت به گروه شاهد رابطه معنیداری را نشان نداد. دو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم معنیدار بوده و کاهش چشمگیری را نشان دادند (001/0p<) ولیکن در گروه سلول – غشا نسبت به گروه شم کاهش معنیداری را نشان داد. در ادامه بررسیها این نتیجه حاصل آمد که میانگین درصد بافت همبندی - عروقی درگروه غشا نسبت به گروه سلول کاهش معنیدارداشته است و گروه سلول- غشا نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنیدارو چشمگیری بود (001/0p<). در انتها گروه سلول نسبت به گروه سلول – غشا دارای کاهش معناداری بود (001/0p<) (نمودار 1) (شکل 1).
|
* |
|
* |
|
* |
|
* |
نمودار 1:میانگین درصدوسعت ناحیه ترمیم شده استخوان و درصد بافت همبندی – عروقی در محل آسیب ران چهار هفته بعد از جراحی.
|
* |
اختلاف معنیدار با گروه شاهد (05/0p<)
|
A |
|
B |
|
E |
|
D |
|
C |
|
TR |
|
CO |
|
TR |
|
CO |
|
A |
|
TR |
|
CO |
|
CO |
|
TR |
|
TR |
|
CO |
شکل 1: تصاویر مقاطع بافت استخوانی ناحیه ترمیم شده مربوط به حیوانات گروه شاهد (A)، گروه شم (B)، گروه غشاء (C)، گروه سلول (D) و گروه سلول - غشا (E) در پایان هفته چهارم. . ترابکولاراستخوان (T)، فضاهایپیوندیعروقی..(C وسعت ترابکولایی درC و D نسبت به A و B افزایش یافته و برعکس وسعت عروقی کاهش یافته است. (رنگآمیزیهماتوکسیلین-ائوزین،بزرگنمایی 100×(
در اندازهگیریهای حاصل از مساحت ترابکولای استخوان چنین بهدست آمد که نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازهگیری شده در گروههای شاهد (023/0 ± 70/0)، شم (020/0 ± 699/0)، غشا (014/0 ± 86/0)، سلول (017/0 ± 81/0) و سلول-غشا (011/0 ± 70/0) بود. این نسبت در گروه شم نسبت به شاهد کاهش غیرمعنیدار و در گروه سلول - غشا نسبت به شاهد دارای اختلاف معنیداری نبود. در صورتیکه این نسبت درگروههای غشا و سلول نسبت به گروه شاهد افزایش چشمگیر و معنیداری را نشان داد) 001/0p<). نسبت مورد بررسی دردو گروه غشا و سلول نسبت به گروه شم دارای افزایش معنیدارو چشمگیری بود (001/0p<) حال آنکه گروه
سلول- غشا نسبت به گروه شم دارای افزایش غیرمعنیدار بوده است. در ادامه بررسیها مشخص شد که نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازهگیری شده درگروه سلول نسبت به گروه غشا کاهش غیر معنیداری را نشان داده است حال آنکه نسبت ترابکولای استخوانی به کل ناحیه اندازهگیری شده در گروه سلول- غشا نسبت به گروه غشا دارای کاهش چشمگیر و معنیداری بوده است (001/0p<). در نهایت این نسبت درگروه سلول در مقایسه با گروه سلول– غشا دارای افزایش چشمگیر و معنیدار بوده است (001/0 (p< (نمودار2 ).
|
* |
نمودار 2: میانگین نسبت مساحت ترابکولای استخوان به کل ناحیه ترمیم شده درمحل نقص بر حسب میکرومتر مربع در چهار هفته بعد از جراحی. مساحت ترابکولا در گروه شاهد و شم اختلافی نداشتند. *تفاوت معنیدار با گروه شاهد (05/0p<)
در بررسی دیگر بر روی ناحیه ایجاد نقص، مشخص شد میانگین نسبت بافت همبندی - عروقی به کل ناحیه اندازه گیری شده در گروههای شاهد (021/0 ± 29/0)، شم (020/0 ± 29/0)، غشا (014/0 ± 13/0)، سلول (016/0 ± 18/0) و سلول- غشا (012/0 ± 29/0) بود. این میانگین نسبت در گروه های شم و سلول - غشا نسبت به شاهد دارای تفاوت غیرمعنیدار بود. در صورتیکه این میانگین در گروههای غشا و سلول نسبت به گروه شاهد دارای کاهش چشمگیر و معنیداری بود (001/0p<). میانگین نسبت بافت همبندی- عروقی به کل ناحیه اندازه گیری شده درگروههای غشا و سلول نسبت به گروه شم دارای کاهش معنیدار و چشمگیری بود (001/0p<) حال آنکه در گروه سلول - غشا نسبت به گروه شم رابطه معنیداری وجود نداشت. در ادامه بررسیها مشخص شد که گروه سلول نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنیداری بوده است. از سویی دیگر، این نسبت در گروه سلول- غشاء نسبت به گروه غشا دارای افزایش معنیدارو چشمگیری بوده است (001/0p<). در نهایت میانگین نسبت بافت همبندی - عروقی به کل ناحیه اندازه گیری شده در گروه سلول- غشا نسبت به گروه سلول دارای افزایش چشمگیر ومعنیدار (001/0p<) بوده است (نمودار3 ).
|
* |
نمودار 3: میانگین نسبت مساحت بافت همبندی- عروقی استخوان به کل ناحیه ترمیم شده درمحل نقص بر حسب میکرومتر مربع در چهار هفته بعد از جراحی. این نسبت در گروه شاهد و شم اختلاف چندانی نداشتند. * تفاوت معنیدار با گروه شاهد (05/0p<)
تعداداستئوسیتها
بررسی و شمارش تعداد استئوسیتها درسطحی برابر 50000 میکرومتر مربع از ترابکولاهای ناحیه نقص استخوانی با بزرگنمایی 400 برابر در گروهای مختلف نشان داد که میانگین تعداد استئوسیتها در گروههای شاهد (82/16 ± 47/72)، شم (87/2 ± 24/55)، غشا (24/10 ± 62/51)، سلول (74/3± 53/88) و سلول- غشا (98/0 ±36/24) بود. میانگین تعداد استئوسیتها در گروههای شم، غشا و سلول نسبت به گروه شاهد اختلاف معنیداری نداشت به این ترتیب که در گروههای شم و غشا کاهش غیر معنیدار و در گروه سلول افزایش غیر معنیدار مشاهده گردید در حالیکه میانگین تعداد استئوسیتها درگروه سلول- غشا نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری داشته است (001/0p<). از سوی دیگر میانگین تعداد استئوسیتها در گروه غشا نسبت به گروه شم دارای کاهش غیرمعنیدار بوده است حال آنکه میانگین تعداد استئوسیتها در گروه سلول نسبت به گروه شم افزایش معنیدار (01/0p<) و در گروه سلول- غشا نسبت به گروه شم کاهش معنیدار (001/0p<) داشته است. علاوه بر این میانگین تعداد استئوسیتها در گروه غشا در مقایسه با گروه سلول دارای کاهش غیر معنیدار و گروه غشا نسبت به گروه سلول- غشا افزایش غیر معنیدار داشته است. میانگین تعداد استئوسیتها در گروه سلول در مقایسه با گروه سلول- غشا به شدت افزایش نشان داده است (001/0p<) (نمودار 4).
|
* |
نمودار 4: تعداد استئوسیتها در 50000 میکرومتر مربع ازترابکولای استخواندر محل آسیب چهار هفته بعد از پیوند. *اختلاف معنیدار با گروه شاهد (05/0p<)
نتایج ایمونوهیستوشیمی
در پایان آزمایش وجود سلولهای نشاندار شده در محل ترمیم استخوان در هر دو گروه سلول – غشا و سلول با استفاده از روش ایمنوهیستوشیمی تایید شد (شکل2).
|
|
|
A |
شکل 2: سلولهای ردیابی شده BMSC چهار هفته بعد از پیوند سلول و سلول-غشا. کنترل منفی (A) ، سلول – غشا (B) و سلول (C). پیکان به هسته سلولهای نشاندار اشاره دارد که در B و C به رنگ قهوه ای دیده میشوند ولی در A رنگ نگرفته و به رنگ بنفش دیده می شوند (بزرگنمایی100×)
بحث
در مواردی مثل شکستگیهایی که در آن جوش خوردگی و ترمیم ضایعه با دشواری همراه است و یا در بیماریهایی مانند سرطان، عفونت، استئوپروز، استئوآرتریت و غیره فرآیندها و مکانیزمهایی که برای بازسازی محل آسیب باید طی شده و وارد عمل شوند اغلب با دشواری رو به رو میشوند (17). امروزه ﺳﻠﻮلﻫﺎی ﺑﻨﻴﺎدی ﻣﺰاﻧﺸﻴﻤﻲ مغز استخوان و نیز دارﺑﺴﺖهای زیست تخریب پذیر جهت ترمیم نقائص استخوانی استفاده ای گسترده دارد (18). یافتههای هیستومورفومتری این تحقیق چهار هفته بعد از پیوند بیانگر افزایش مساحت ترابکولاهای استخوانی و کاهش بافت همبندی- عروقی در گروههای پیوند سلول و پیوند غشا نسبت به گروه شاهد بوده است. تعداد استئوسیتها درناحیه ترمیم در گروه پیوند سلول- غشا نسبت به گروه شاهد کاهش معنیداری نشان داد.
مشابه نتایج گروه سلول و گروه غشا تحقیق ما، یافتههای Kon و همکاران (19) بر روی استخوان حیوانات مدل بزرگ است. ایشان استخوانهای آسیب دیده که بر روی آنها پیوند سلول و یا سلول بههمراه داربست انجام شده بود را با استخوانهای شاهد که سالم بودند، مورد ارزیابی و مقایسه قرار دادند. در بز سی و دو هفته بعد از پیوند سلول، استخوانهای تجربی همانند استخوانهای شاهد بودند و تقریبا بهطور کامل ترمیم شده بودند. در گوسفند نیز هشت هفته بعد از پیوند چنین نتیجهای بهدست آمد (20).
در بررسی نتایج ما ، میانگین درصد وسعت تیغههای استخوانی شکل گرفته در محل نقص استخوانی در گروههای سلول و غشا، دارای افزایش معنیداری نسبت به گروه شاهد بوده است. در تحقیق Cao (21)، بررسی هیستولوژی و مورفومتری حاصل از پیوند سلول اتولوگ در ناحیه آسیب استخوانی در بز 16 هفته بعد از پیوند، نشان داد که نسبت حجم استخوان ترابکولای موجود در محل آسیب به حجم کل بافت استخوان در گروه پیوند سلول نسبت به گروههای داربست و شاهد افزایش معنیداری پیدا کرده بود. بررسی هیستولوژی آنان هم نشان داد که در گروه سلول بازسازی بهخوبی صورت گرفته اما در گروه شاهد ترمیم نقص استخوان با کندی انجام شده و ناحیه ترمیم از بافت فیبروزه پر شده بود و در گروه داربست در مرکز نقص استخوان بافت فیبروزی بههمراه مقداری استخوان پراکنده مشاهده شد که نشان دهنده تشکیل استخوان بهمیزان حداقل بود. همچنین مطالعه هیستومورفومتری این گروه نشان داد که میانگین درصد تیغههای استخوانی، ضخامت تیغهها و نیز تعداد ترابکولاها در ناحیه آسیب استخوان نسبت به گروه کنترل، افزایش معنیداری داشته است و لذا نتایج تحقیقات Cao همسو با نتایج تحقیقات ما میباشد. اگرچه در تحقیقات ما نتیجه عملکرد داربست در بازسازی استخوان، مغایر با نتیجه گزارش شده از سوی ایشان میباشد.
یافتههای هیستولوژیک تحقیق ما نشان داد که در گروههای سلول و غشا بهدلیل افزایش میزان وسعت ترابکولاهای استخوانی و کاهش مساحت بافت همبندی عروقی، بافت ترمیمی محل آسیب تقریبا با بافت اطراف که آسیب ندیده بودند یکنواخت و یکپارچه شده و فضای خالی چندانی بین آنها نبود که حاکی از روند استئوژنز سریعتر و افزایش روند بازسازی (Remodeling) استخوان در محل ترمیم می باشد چنین تصور میشود که تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای استئوبلاست بهوسیله یک سری فرآیندهای سیگنال دهی مانند اینتگرین و پروتئینهای شکل دهنده استخوان (BMP) در یک واکنش متقابل انجام میشود. بعضی مطالعات نشان میدهند که سلولهایBMSC میتوانند طیف وسیعی از سیتوکینها را ترشح کنند (11). فاکتورهای رونویسی Runx-2 ,osterix تمایز استئوبلاستیک و شکلگیری استخوان را کنترل می نمایند. در همین راستا و همسو با نتایج تحقیقات ما، تحقیقات Niedhviedzki و همکاران (22) است که مطالعات هیستولوژیک آنها ، ده، بیست و چهل روز بعد از پیوند غیر اتولوگ سلولهای استرومایی به محل نقص استخوان رادیال خرگوش بود و نشان داد که ده روز بعد از پیوند سلولهای استرومایی، استئوبلاستها همراه با الیاف کلاژن افزایش یافته، پریوست و آندوست فعال و ضخیم بوده و ناحیه ترمیم از یک شبکه رگی غنی برخوردار بوده است. در اندام کنترل و در ناحیه نقص استخوانی مقدار زیادی بافت همبند سست و میزان کمی الیاف کلاژن و شبکه مویرگی مشاهده شد. میزان ترابکولاهای شکل گرفته در ناحیه کال در اندام تجربی بیشتر از گروه کنترل بود. بیست روز بعد از پیوند در اندام تجربی، ترابکولاهای استخوانی جدید در محل نقص بهوسیله بافت همبند فیبروزه احاطه شده و در اطراف ترابکولاها بافت همبند متراکم نیز مشاهده شد. در اندام کنترل میزان ترابکولاهای استخوانی در محل نقص کمتر بوده و میزان استخوان متراکم، تعداد استئوبلاستها و شبکه مویرگی وسعت کمتری داشتند. پس از 40 روز در اطراف کال، جهت گیری ترابکولا بهصورت موازی در آمده و بافت آن ناحیه به استخوان کورتیکال تغییر شکل داده است (22).
تحقیق ما نشان داد که تعداد استئوسیتها در ترابکولای استخوان در گروههای پیوند سلول بهطور برجسته افزایش یافته در حالیکه در گروه شاهد تعداد استئوسیتها بهمیزان کمتری دیده میشد. همچنین در گروه سلول- غشا کاهش تعداد استئوسیتها نسبت به گروههای سلول و غشا مشاهده شد. نتایج همچنین نشان داد که در گروههای پیوند سلول و پیوند غشا، ترابکولاهای استخوانی متراکم بوده و بهوسیله بافت همبند فیبروزه احاطه شده اند. علت این امر می تواند وجود فاکتورهای دیگری که در تمایز سلولهای استرومایی مغز استخوان به سلولهای استئوبلاست و استئوسیت نقش داشته و بهعنوان پروتئینهای موجود در مسیر سیگنال دهی Wnt است، باشد. پروتئین ROR2 یک گیرنده (Reseptor ) تیروزین کینازی Orphan است که بهعنوان رسپتور همراه (Co-receptor) عمل میکند و در هر دو مسیر سیگنال دهی اصلی و فرعی وجود دارد و بیان آن در سلولهای MSC در حال تمایز، افزایش و در سلولهای تمایز یافته به استئوسیت کاهش مییابد. ROR2 در تمایز سلولهای MSC به استئوبلاستها و در طول روند استئوژنز دخالت میکند (23). علاوه بر آن Liu و همکاران (24) نیز نشان دادند که ROR2 دودمان استئوبلاستیک را از سلولهای بنیادی مزانشیمی انسان (human Mesenchymal Stem Cell) (hMSC) بهراه می اندازند. در همین راستا، در تحقیق دیگری که توسط Nather و همکاران (25) او صورت گرفت از پیوند اتولوگ سلولهای بنیادی مزانشیمی برای ترمیم آلوگرافت نقص استخوان ران در خرگوش استفاده شد و نتایج آن بهبود وضعیت ترمیم استخوان و افزایش سلولهای استخوانی در ناحیه دیافیز ران متعاقب پیوند آلوگرافت بوده است. که نتایج این محققین در راستای یافته های تحقیق ما میباشد.
در تعدادی از تحقیقات، نتایج متفاوت با یافتههای ما نیز دیده میشوند. بهطور مثال Meinel و همکاران (26) بعد از پیوند سلولها (5 هفته) بههمراه داربست شبه ترابکولایی در نقص جمجمه موش کوچک آزمایشگاهی نشان دادند که پس از پیوند سلول همراه با داربست، میزان ترابکولاهای استخوانی در این گروه در مقایسه با گروههای داربست و شاهد بیشتر بوده است. در مثالی دیگر ، نتایج Stockman و همکاران (16) را میتوان ذکر نمود زیرا ایشان پس از پیوند اتولوگ سلولهای استرومایی مغز استخوان همراه با داربست کلاژن در محل نقص استخوان جمجمه خوک، و بررسیهای هیستولوژیک نشان دادند که میزان کال استخوانی سی روز بعد از پیوند در گروه تجربی که پیوند سلول همراه با کلاژن دریافت کرده اند در مقایسه با گروه شاهد که در آنها تنها از کلاژن استفاده شده بود، افزایش معنیداری نداشت که این یافتهها تا حدی متفاوت با نتایج هیستومورفومتری ما است.
تزریق سلولهای استرومایی به محل آسیب استخوانی، ظرفیت استئوژنیک آنها را بالا میبرد که حاصل آن افزایش سرعت
تشکیل کال استخوانی میباشد. تصور بر آن است که پیوند سلولهای استئوبلاست، تولید غضروف و کال استخوانی را از طریق استخوان سازی داخل غضروفی تحریک میکند (27).
نتیجه گیری
نتایج هیستومورفومتری و ایمونوهیستوشیمی تحقیق حاضر نشان داد که روند ترمیم استخوان در محل نقص جزئی استخوان ران در موش صحرایی، با استفاده از پیوند غشا ژلاتین - کیتوسان و سلولهای بنیادی مغز استخوان سبب افزایش سرعت ترمیم و بازسازی استخوان ران میشود.
تشکروقدردانی
این مطالعه با پشتیبانی مرکز تحقیقات ترومای دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله )عج ( انجام شد، که بدین وسیله تشکر و قدردانی میشود.
)