مقدمه

یکی از عمده‏ترین علل مرگ و میر انسان در سراسر جهان، بیماری سرطان می­باشد و در این میان، سرطان سینه، شایع­ترین سرطان و نیز علت اصلی مرگ در میان زنان سراسر دنیا می‏باشد (1). بر اساس گزارشات آماری در سال­های اخیر، در حدود 41/24 درصد سرطان­ها در بانوان ایرانی، از نوع سرطان سینه بوده است (2). علی‏رغم پیشرفت­های فراوان در علم پزشکی مدرن در قرن گذشته، اغلب سرطان­ها هنوز قابل درمان نمی‏باشند. این امر تا حدودی ناشی از پیچیدگی پاتوژنز سرطان و مشکلات درمان­های موثر درحال پیشرفت می­باشد. از سوی دیگر شیمی درمانی، پرتودرمانی و جراحی، که از روش­های مرسوم در درمان اغلب سرطان­ها از جمله سرطان سینه می‏باشند، عوارض جانبی نامطلوبی دارند (3). همچنین اگرچه بسیاری از سرطان­ها در ابتدا به شیمی درمانی پاسخ می­دهند، اما اغلب پس از مدتی به آن مقاوم می­شوند (4). لذا تلاش برای کشف درمان­های جدید، همواره ادامه دارد. امروزه داروهای گیاهی به‏علت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرار گرفته اند و اثرات درمانی محصولات طبیعی فراوانی علیه انواع سرطان­­ها، به اثبات رسیده است (5). متابولیت‏های ثانویه گیاهی، همواره منبع مطلوبی از ترکیبات جدید برای درمان سرطان بوده (6) و  ترپن­ها، متنوع ترین و فراوان‏ترین خانواده از متابولیت های ثانویه هستند که طیف وسیعی نیز دارای فعالیت‏های دارویی علیه بیماری‏های انسانی می­باشند (7). سزکوئی ترپن‏ها (با سه واحد ترپنی) از ترکیباتی هستند که مقدار قابل توجهی از آن‏ها در گونه‏های گیاهی خانواده آرتمیزیا وجود دارد (8 و 9). از جمله این ترکیبات، آرتمیزینین، یک پراکسید سزکوئی­ ترپن لاکتون موجود درگیاه دارویی چینی به‏نام آرتمیزیا آنوا است (10) که در سال 1972 به‏صورت خالص از اندام هوایی این گیاه، استخراج و ساختار آن در سال 1975 تعیین شد (11). در حال حاضر، انواع مشتقات نیمه سنتزی آرتمیزینین برای افزایش جذب، پایداری و کاهش سمیت، توسعه یافته اند که در این میان، آرتسونات، به‏دلیل حلالیت و فعالیت بالا، از توانمندترین این مشتقات می­باشد (12). آرتمیزینین و مشتقات آن، داروی ضد مالاریای طبیعی و بالقوه هستند که نسبتا ارزان بوده (13) و نیز مشخص شده     علاوه بر فعالیت ضد مالاریایی، فعالیت­های آنتی اکسیدانتی، ضد میکروبی (ضد باکتریایی، ضد ویروسی، ضد قارچی) و ضد توموری (ضد التهابی، ضد رگ‏زایی و ضد تکثیری و القای آپوپتوزی) نیز نشان می­دهند (12، 14 و 15) در تازه ترین گزارش، Kim و همکارانش (16) نشان دادند که آرتمیزینین دارای خواص ضد التهابی (با مهار تولید نیتریک اکساید)، خواص آنتی اکسیدانتی (با مهار رادیکال­های آزاد DPPH) و نیز خواص ضد میکروبی می­باشد.

استفاده از داروی ضدمالاریای آرتمیزینین در تحقیقات سرطان از آن‏جا آغاز شد که برخی محققین پی بردند شاید آرتمیزینین و مشتقات آن بتوانند همان مسیر تخریبی رادیکال‏های آزاد در انگل مالاریا را در سلول­های سرطانی نیز ایجاد نمایند. در سال‏های اخیر، موارد بسیاری از فعالیت ضد سرطانی آرتمیزینین، برعلیه بسیاری از انواع سرطان­ها، هم در شرایطin vitro  و هم in vivo گزارش شده است (17). مشخص شده آرتمیزینین و مشتقات آن، پیشرفت سرطان را در مدل­های آزمایشگاهی بسیاری از جمله رده های سلولی سرطانی، مدل­های حیوانی و حتی کار­ آزمایی­های بالینی مهار می­کنند (18). اولین بار دو محقق  به‏نام­های Lai و Singh (19)، نشان دادند که آرتمیزینین می­تواند موجب القای آپوپتوزیس در سلول­های سرطانی شود. انستیتو ملی سرطان امریکا (NCI) نیز فعالیت ضد سرطانی مشتق آرتمیزینین، آرتسونات را با سنجش اثر مهارکنندگی آن­ها بر روی رشد 55 نوع رده سلولی، آزمایش نموده و نتایج، حاکی از بیشترین تاثیر آرتسونات بر روی لوسمی و سرطان روده و سپس بر روی سرطان­های پستان، تخمدان، پروستات و سرطان­های سیستم عصبی مرکزی مانند گلیوبلاستوما بوده است (20). همچنین نتایج مشابهی با استفاده از مدل­های حیوانی به‏دست آمد. به‏عنوان مثال، تجویز آرتمیزینین به موش­های مبتلا به سرطان فیبروسارکوما و نیز سرطان سینه موجب کاهش رشد و اندازه سلول­های توموری شد (21 و 22). در حال حاضر نیز ترکیبات آرتمیزینین در فاز I – II کار آزمایی­های بالینی بر روی سرطان‏های پستان، روده و شش می‏باشند. شایان ذکر است که تحقیق در مورد آرتمیزینین و سرطان، هنوز در مراحل بسیار اولیه است (23)، به‏طوری‏که هنوز مکانیسم پیام رسانی ضد سرطانی آرتمیزینین، به‏خوبی مشخص نشده است و نیز مکانیسم فعال شدن آرتمیزینین در سلول­های سرطانی تاکنون مبهم باقی مانده است (12 و 24). اگرچه به‏نظر می‏رسد مکانیسم عمل ضد سرطانی این ترکیبات، به‏واسطه پل اندو پراکسیدی موجود در ساختارشان صورت گیرد که در اثر واکنش با آهن فعال شده و تولید رادیکال­های آزاد می‏نمایند. رادیکال­های آزاد نیز موجب تخریب لیزوزوم و تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS: Reactive Oxygen Species) می­شوند و بالاخره ROS، باعث آزادسازی سیتوکروم C، فعال شدن کاسپازهای 3 و 9 و نهایتا آپوپتوزیس می­شود (12 و 25). همچنین از آن‏جاکه اکثر سلول‏های سرطانی، غلظت‏های بالایی از رسپتورهای ترانسفرینی را در سطح خود بیان کرده و جریان یون آهن در آن­ها نسبت به سلول­های طبیعی بیشتر است (26)، لذا آرتمیزینین به‏طور اختصاصی بر روی این سلول­ها اثر نموده و بدین‏ترتیب، اثرات سمی آرتمیزینین و مشتقات آن خاص سلول‏های سرطانی می­باشد (17 و 27). داروهای ضد سرطانی کنونی، اکثرا با سمیت و مقاومت دارویی همراه هستند، لذا از چالش‏های عمده در درمان سرطان، توسعه داروهای موثرتری است که برای انواع سرطان­ها اختصاصی بوده، ولی حداقل اثرات جانبی را بر روی سلول­های طبیعی پستانداران داشته باشند. آرتمیزینین از داروهای بسیار نادری است که بدون هیچ‏گونه عوارض جانبی یا مقاومت بالینی در درمان مالاریا استفاده می‏شود و از همه مهم­تر اینکه اثر سمیت سلولی آن بر روی سلول سرطانی، اختصاصی است (12, 27). طبق تحقیقات پیشین به‏نظر می­رسد مکانیسمی که آرتسونات به‏واسطه آن اثر سمیت سلولی بر روی سلول­ها اعمال می­کند، از طریق تولید استرس اکسیداتیو باشد (28 و 29). در میان فاکتورهای بی‏شمار، استرس اکسیداتیو که در اثر برهم خوردن تعادل بین سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی بدن و تشکیل رادیکا­ل­های آزاد روی می­دهد، نقش مهمی در شروع، ایجاد و پیشرفت سرطان دارد (30). از آن‏جایی‏که آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، نقش کلیدی در حفاظت سلول­ها در برابر استرس اکسیداتیو ایفا می‏کنند، اختلال در تنظیم فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، همچون سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز باعث سرطان می‏شود (31). سوپراکسید دیسموتاز، دسته‏ای از آنزیم­هاست که دیسموتاسیون رادیکال سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و مولکول اکسیژن کاتالیز می­کند. سپس برخی دیگر از آنزیم­های آنتی اکسیدانتی ازجمله پراکسیداز، پراکسید هیدروژن را به آب تبدیل می­کنند (32). این واکنش­های پشت سر هم، کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از ROS را تضمین می‏کنند (33). همچنین مشخص شده کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی یا تنظیم کاهشی بیان آن­ها، در انواع سرطان­ها از جمله سرطان پروستات، سرطان سینه، مثانه، کبد و غیره نقش دارد (34-36). البته عدم تغییر و یا حتی بیان بیشتر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی در برخی سرطان­ها نیز گزارش شده است (37). بنابراین احتمالا حفظ سطوح کافی از فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، برای ممانعت از پیشرفت سرطان ضروری می­باشد. لذا هدف قرار دادن فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، می­تواند راهکار مهمی برای توسعه عوامل درمانی در درمان سرطان باشد. به­علاوه، مطالعه اثرات داروهای ضدسرطانی بر روی فعالیت و بیان آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، درک مکانیسم عملکرد دارو را افزایش می­دهد (33). از سوی دیگر، تحقیقات نشان داده که بین فعالیت آنتی اکسیدانتی گیاهان و اثرات ضدتکثیری آن­ها ارتباط مستقیمی وجود دارد. این امر حاکی از عملکرد بالقوه آنتی اکسیدانت‏ها در مهار رشد سلول­های سرطانی می­باشد (38). از آنجایی‏که مشخص شده آرتمیزینین و مشتقات آن دارای فعالیت آنتی اکسیدانتی می­باشند، بنابراین می­توانند به­طور بالقوه اثرات ضد تکثیری نشان دهند (12و 16). برخی مطالعات نیز حاکی از اثر سمیت سلولی این ترکیبات از طریق تولید گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) و افزایش استرس اکسیداتیو می‏باشند. نیتریک اکساید (NO) یکی از انواع رادیکال آزاد می‏باشد (28) که تولید بیش از حد آن در اثر فعالیت آنزیم نیتریک اکساید سنتاز (iNOS : inducible Nitric Oxide Synthase)، در برخی شرایط پاتوفیزیولوژیکی از جمله سرطان، التهاب، دیابت و غیره نقش دارد (39 و 40). به‏علاوه، نقش نیتریک اکساید در تومورزایی بر اساس مطالعاتی که نشان می­دهند حضور نیتریک اکساید و نیتریک اکساید سنتاز، در سلول­های سرطانی نسبت به سلول­های طبیعی، بیشتر است ثابت شده و بدین‏ترتیب به­‏نظر می­رسد که ارزش تشخیصی در تحقیقات سرطان داشته باشند (41 و42). یافته‏های حاصل از بررسی­های بالینی بر روی برخی انواع توموری نشان می­دهند که نیتریک اکساید و نیتریک اکساید سنتاز، نه تنها در پیش‏گیری بلکه در گزینه های درمانی جدید نیز ارزشمند می ­باشند (43-45). گزارش‏های مختلفی نشان می­دهند که آرتمیزینین و مشتقات آن، نیتریک اکساید را کاهش می­دهند و مطالعات بسیاری نقش سمیت سلولی آرتسونات را از طریق مهار تولید نیتریک اکساید با جزئیات به اثبات رسانیده اند (46-49). این واقعیت که آرتسونات، تولید نیتریک اکساید ناشی از نیتریک اکساید سنتاز را مهار می­نماید، نشان می­دهد که نیتریک اکساید ممکن است در عملکرد سمیت سلولی آن نقش داشته باشد. ارتباط بین نیتریک اکساید و سمیت سلولی، ویژه آرتسونات نیست و   پیش­تر برای داروهای ضدسرطانی معتبر، گزارش شده است (46).

اگرچه مطالعات فراوانی حاکی از اثر سمیت سلولی آرتمیزینین و مشتقات آن از طریق تولید استرس اکسیداتیو می‏باشند، اما مطالعاتی که پروفایل آنتی اکسیدانتی آن را در رده سلولی سرطان سینه نشان دهند، بسیار محدودند. لذا در این مطالعه اثر سمیت سلولی و ضد تکثیری آرتسونات، موثرترین مشتق آرتمیزینین، بر روی رده سلولی سرطان سینه MCF-7 بررسی شد و نیز برای بررسی مکانیسم فعالیت ضدتکثیری آن، فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز و نیز میزان مهار تولید نیتریک اکساید پس از تیمار با این ترکیب سنجیده شد.

مواد و روش‏ها

مواد شیمیایی و دستگاه‏ها: محیط کشتF12  DMEM/Ham’s و سرم جنین گاوی (FBS: Fetal Bovine Serum) از شرکت  Gibco(انگلستان) و محلول پنی­سیلین/ استرپتومایسین از شرکت Biobasic (کانادا)، خریداری شد. پودرهایMTT ((3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2 5-diphenyl tetrazolium bromide، تریپسین/EDTA، آرتسونات و معرفGriess  نیز از شرکت سیگما (آمریکا) تهیه شدند. سایر مواد شیمیایی و محلول­ها همگی از شرکتMerck  (آلمان) خریداری شدند. همچنین از دستگاه­ ثبت الایزا ساخت شرکت BioTek (آمریکا) و دستگاه اسپکتروفوتومتر ساخت شرکتUltrospec 3000  (کانادا) مدل Pharmacia biotechاستفاده شد.

روش­ها

کشت سلول: رده سلولی MCF-7 پس از خریداری از مرکز ذخایر ژنتیکی ایران(IBRC) ، در این مطالعه استفاده شد. سلول­ها در محیط کشت DMEM/Ham’s F12 حاوی10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی بیوتیک (پنی­سیلین/ استرپتومایسین) کشت داده شده و در فلاسک 25 سانتی‏متر مکعب در انکباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد CO₂، نگه‏داری شدند. سلول­ها پس از رسیدن به تراکم 80 تا 90 درصد، به‏کمک محلول تریپسین/EDTA (25/0 درصد تریپسین و 05/0 درصد EDTA) از کف سلول­ها برداشت شده و پس از حداقل 5 مرتبه پاساژ و رسیدن سلول­ها به فاز رشدی، برای انجام تست­ها استفاده شدند.

سنجش سمیت سلولی: تست MTT: اثر مهار رشدی آرتسونات بر روی سلول­های MCF-7، با استفاده از تست MTT سنجش شد (50). این تست، یک روش رنگ سنجی کمی است که اساس آن بر پایه احیای آنزیمی محلول زرد رنگ MTT به‏وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی و تشکیل کریستال ارغوانی رنگ و نامحلول در آب فورمازان می­باشد که تنها در سلول‏های زنده روی می­دهد. میزان جذب نوری بلورهای فورمازان پس از حل شدن در حلال‏های آلی همچون دی متیل سولفوکساید (DMSO: Dimethyl sulfoxide)، به‏کمک دستگاه ثبت الایزا قابل سنجش است و بیانگر میزان سلول‏های زنده می­باشد. بدین منظور سلول‏هایMCF-7، درتراکم10³×10 سلول در هر چاهک، در پلیت 96 خانه و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصدCO₂  کشت داده شدند. پس از 24 ساعت انکوبه شدن و رسیدن به تراکم مطلوب، سوپرناتانت با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 1، 5، 10، 25، 50، 75، 100 و 200  میکروگرم بر میلی­لیتر) که در حلال استون حل شدند، تعویض و همراه با محیط کشت کامل به چاهک­ها اضافه گردید. غلظت نهایی حلال استون در چاهک­ها کمتر از 1/0 درصد محاسبه شد. پس از 24 ساعت تیمار، 10 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به هر چاهک اضافه شد و پلیت به‏مدت چهار ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محتویات کشت با احتیاط دور ریخته شد و 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO)، به منظور حل کردن کریستال­های نامحلول فورمازان به هر چاهک افزوده گردید. در نهایت پس از 10 دقیقه، جذب نوری محلول، در طول موج 570 نانومتر با دستگاه ثبت الایزا خوانده شده و درصد زیستایی سلولی با استفاده از فرمول زیر به‏دست آمد. لازم به ذکر است هر غلظت از ترکیب در سه چاهک تکرار شده و از سوی دیگر آزمایش، درسه تکرار مجزا صورت گرفت.

درصد زیستایی سلولی = (جذب نوری نمونه تقسیم بر جذب نوری کنترل) × 100: درصد زیستایی برای تعیین مقادیر) IC₅₀ غلظت 50 درصد کشنده سلولی-  (Inhibitory Concentrationبه‏کار می­رود که عبارتست از غلظت یک ترکیب که باعث مهار 50 درصدی رشد سلول­های تیمارشده در مقایسه با کنترل می­شود.

 سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی: برای بررسی اثر ترکیب آرتسونات بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداز در سلول­های MCF-7 ابتدا عصاره سلولی تهیه شد. بدین منظور سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (100 و 50، 25، 10، 0 میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏مدت 24 ساعت تیمار و سپس با استفاده از اسکراپر جدا شدند. پس از سانتریفیوژ به‏مدت 7 دقیقه و دورRPM 1300، رسوب سلولی، دو بار باPBS  (Phosphate Buffered Saline) سرد شستشو داده شد. سپس100 میکرولیتر بافر لیزکننده به رسوب سلول­ها اضافه شد و پس از 15 دقیقه سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و دورRPM 10000، سوپرناتانت حاصل، جهت اندازه­گیری میزان پروتئین و نیز سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی، مورد استفاده قرار گرفت. اندازه­گیری پروتئین کل نمونه­ها با استفاده از روش برادفورد (51) انجام شد. بدین منظور، 5 میکرولیتر از نمونه با آب مقطر به حجم 50 میکرولیتر رسانده و 5/2 میلی لیتر از محلول برادفورد به آن اضافه و به‏مدت 10 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی انکوبه شد. سپس جذب نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین نمونه­ها از روی منحنی استاندارد پروتئین، با در نظر گرفتن ضریب رقت نمونه و با استفاده از محلول یک میلی‏گرم در میلی لیتر آلبومین سرم گاوی  (BSA: Bovine Serum Albumin) محاسبه شد.

a)                   تعیینفعالیت آنزیمسوپراکسیددیسموتاز(SOD: :superoxide dismutase)  سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) طبق روش Beauchamp و Fridovich (52) و با کمی تغییرات به‏کمک دستگاه ثبت الایزا انجام شد. به‏منظور سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) ، یک میلی لیتر محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار با 7=pH ، EDTA 1/0 میلی مولار، متیونین 13 میلی مولار، نیترو بلوتترازولیوم (NBT: Nitro Blue Tetrazolium) 75 میکرومولار، ریبوفلاوین 21/0 میلی‏مولار و نیز سوپرناتانت آنزیمی، تهیه و به هر چاهک از یک پلیت 24 خانه منتقل شد. همچنین به‏منظور مقایسه فعالیت آنزیمSOD  در نمونه‏ها با کنترل، علاوه بر چاهک‏های نمونه و بلانک از چاهک کنترل نیز استفاده شد که محتوای واکنشی چاهک بلانک و کنترل مشابه چاهک نمونه بوده، با این تفاوت که دو چاهک مذکور فاقد آنزیم می‏باشند. لازم به‏ذکر است که محتوای واکنشی چاهک کنترل به‏همراه نمونه‏ها در معرض نور قرار گرفت، درحالی‏که محتوای واکنشی بلانک در تاریکی قرار داده شد. سپس پلیت مذکور به‏مدت 5 دقیقه، بر روی یک شیکر و در معرض دو عدد لامپ فلوئورسنت (20 وات) قرار داده شد و پس از افزوده شدن محتوی ویال حاوی بلانک به یکی از چاهک‏های پلیت، جذب نمونه‏ها با دستگاه ثبت الایزا در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. این روش براساس تبدیل نیترو بلو تترازولیوم به فورمازان درحضور نور و ظهور رنگ می­باشد. در صورتی‏که در محیط واکنش، آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز موجود باشد، از انجام این واکنش ممانعت نموده و میزان تشکیل ماده رنگی و در نتیجه ظهور رنگ را کاهش می­دهد. در واقع اختلاف جذب نمونه‏های دارای عصاره آنزیمی و کنترل (فاقد آنزیم)، نشان­دهنده ممانعت واکنش تشکیل ماده رنگین فورمازان توسط SOD می­باشد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه‏ها محاسبه و فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیم در هر میلی‏گرم پروتئین عصاره (محاسبه شده از روش برادفورد) بیان شد. طبق تعریف، یک واحد فعالیتSOD ، مقدار فعالیت آنزیمی است که باعث 50 درصد ممانعت از احیای فتوشیمیایی نیترو بلو تترازولیوم به فورمازان تحت شرایط سنجش می‏شود.

b)                  سنجشفعالیت آنزیمپراکسیداز:(POD: peroxidase): برای اندازه گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز از سوبسترای 4-آمینوآنتی پیرین در حضور پراکسید هیدروژن با روش اسپکتوفتومتری استفاده شد (53 و 54). اکسیداسیون 4-آمینوآنتی پیرین در دمای اتاق به‏مدت 2 دقیقه در یک میلی‏لیتر محلول واکنش متشکل از 470 میکرو لیتر 4- آمینوآنتی پیرین2 میلی مولار و 470 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 1 میلی‏مولار و 60 میکرولیتر سوپرناتانت آنزیمی مورد سنجش قرار گرفت و بر علیه سل بلانک که حاوی تمام مواد به‏جز نمونه آنزیمی بود، خوانده شد. فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) با دنبال کردن تغییرات جذب در دقیقه (∆A/min) که در نتیجه اکسیداسیون 4- آمینو آنتی پیرین می­باشد، در طول موج 510 نانومتر ثبت شد. همچنین برای محاسبه فعالیت آنزیمی از ضریب خاموشی mM-1cm-1)6/26( استفاده شد. هر واحد از فعالیت آنزیم پراکسیداز عبارت است از مقداری از آنزیم که باعث افزایش جذب 001/0 در دقیقه در طول موج 510 نانومتر تحت شرایط سنجش می­شود.

 اندازهگیریمیزاننیتریک اکساید (NO): غلظت نیتریت به‏عنوان شاخصی از تولید نیتریک اکساید با روش گریس (Griess)  اندازه‏گیری می­شود. در این روش، معرف گریس
(1 درصد سولفانیل آمید، 1/0 درصد نفتیل اتیلن آمید دهیدروکلراید در 5/2 درصد فسفریک اسید) برای سنجش غلظت نیتریت به نمونه اضافه می‏شود (55)؛ بدین منظور      سلول­های  MCF-7پس از 24 ساعت تیمار با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100میکروگرم بر میلی‏لیتر)، از انکوباتور خارج شده و سوپرناتانت محیط کشت از پلیت‏های کشت به ویال‏های 5/1میلی‏لیتری منتقل شد و پس از سانتریفیوژ به‏مدت 7 دقیقه و دور RPM 1300، حدود 100 میکرولیتر از هر نمونه به یک چاهک از پلیت 96 تایی انتقال یافت. سپس حدود 100 میکرولیتر معرفGriess   به ‏هر چاهک اضافه شد و برای 10 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی قرار داده شد. رنگ ارغوانی تولید شده نسبت مستقیم با میزان تولیدNO  دارد. میزان جذب این رنگ توسط دستگاه ثبت الایزا و در طول موج 550 نانومتر قرائت شد. هرچه غلظت نیتریت در نمونه بیشتر باشد، میزان جذب در این طول موج بیشتر خواهد بود. به این ترتیب می‏توان با روش گریس کاهش یا افزایش نیتریک اکساید را در نمونه‏ها با کنترل مقایسه نمود. همچنین برای سنجش میزانNO  آزاد شده توسط نمونه‏های تیمار شده، از منحنی استانداردNO  استفاده شد. بدین‏منظور از نیتریت سدیم (NaNO2)  جهت تهیه غلظت­های نیتریت  استفاده شد.

آنالیز آماری

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزارهای  SPSSو Excel انجام شد. پس از انجام تست نرمالیته(Kolmogorov  Smirnov= K.S) از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) و Post Hoc )تست( Dunnette برای مقایسه گروه­ها با کنترل استفاده شد. همچنین (05/0p<) معنی‏دار در نظر گرفته شد. تمامی آزمایش‏ها با حداقل سه تکرار انجام و نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند.

نتایج

آرتسونات به‏صورت وابسته به دوز باعث مهار رشد سلول­های سرطان سینه شد.

بررسی سمیت سلولی آرتسونات بر روی رده سلولی MCF-7، با استفاده از تست MTT انجام شد. همان‏طور که در نمودار 1 نشان داده شده، تیمار سلول­هایMCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 1، 5، 10، 25، 50، 75، 100، 200میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏مدت 24 ساعت، باعث مهار معنی‏دار رشد سلول­ها به‏صورت وابسته به دوز در مقایسه با گروه کنترل شد (05/0p<)  بدین ترتیب با افزایش غلظت آرتسونات، درصد زیستایی به‏طور معناداری کاهش یافت. همچنین مقادیر IC₅₀ آرتسونات پس از 24 ساعت 73/1 ± 78/43 میکروگرم بر میلی­لیتر محاسبه شد. بدین ترتیب نتایج ما نشان داد که آرتسونات رشد و تکثیر سلول‏هایMCF-7 را به‏صورت وابسته به دوز مهار نمود.

نمودار 1: فعالیت ضد تکثیری آرتسونات بر روی سلول­های MCF-7. پس از 24 تیمار سلول­ها با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 5، 10، 25، 50، 75، 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر) درصد زیستایی سلول­ها با استفاده از تست MTT انجام شد. داده‏ها به‏صورت میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش مستقل باحداقل سهتکراربیان شده اند.* 05/0p <، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.

میزان پروتئین کل در سلول­های سرطان سینه پس از تیمار با آرتسونات به‏صورت وابسته به دوز کاهش یافت. نتایج حاصل از تست سنجش پروتئین برادفورد نشان داد که غلظت پروتئین در عصاره سلولی استخراج شده، پس از تیمار با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100) میکروگرم بر میلی­لیتر) به‏صورت وابسته به دوز کاهش یافت (نمودار 2). همچنین برای

تعیین غلظت پروتئین از منحنی استاندارد استفاده شد (نمودار 3).

فعالیت­ آنزیم­های آنتی اکسیدانتی سوپراکسید دیسموتاز

و پراکسیداز در سلول­های سرطان سینه پس از تیمار با آرتسونات افزایش یافت.

a) فعالیت­ آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: سنجش فعالیت آنزیمی عصاره‏های سلولی استخراج شده از سلول­های MCF-7 تیمارشده با غلظت‏های مختلف آرتسونات نشان داد که فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در غلظت­های 10، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر در مقایسه با گروه کنترل، به‏طور معنی‏داری افزایش یافته است. نتایج نشان داد که آرتسونات در غلظت موثر 25 میکروگرم بر میلی­لیتر بیشترین افزایش را در فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز نسبت به گروه کنترل داشته است. به­طوری‏که میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز از U/mg 05/0 ± 39/0 در کنترل به U/mg 19/0± 39/3 افزایش یافته است. این درحالی‏است که دوز کشنده (بالاتر ازIC₅₀  ) 100 میکروگرم بر میلی­لیتر کمترین فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز را نشان داد ) (05/0p<) (U/mg04/0±  18/0) (نمودار a4).

نمودار2: غلظت پروتئین کل در عصاره سلولی استخراج شده. پس از 24 تیمار سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر، تست سنجش غلظت پروتئین به‏روش برادفورد انجام شد. * 05/0p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می‏باشد.

نمودار3: منحنیاستانداردپروتئین که بااستفادهاز رقت‏های مختلفمحلولیکمیلیگرمدرمیلیلیتر آلبومین سرمگاوی (BSA) رسم شد.

نمودار4: اثر آرتسونات بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانتی. پس از 24 تیمار سلول­های MCF-7 با غلظت­های مختلف انتخابی آرتسونات (0، 10، 25، 50 و 100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر)، فعالیت آنزیم­های  a) سوپر اکسید دیسموتاز و b) پراکسیداز سنجش شد. هرتستباحداقل سهتکرارانجام و نتایج به‏صورت میانگین واحد آنزیمی در هر میلی گرم پروتئین ± انحراف معیار بیان شده اند.* 05/0 p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.

b) فعالیت­ آنزیم پراکسیداز: نتایج نشان داد که آرتسونات فعالیت­ آنزیم پراکسیداز را در غلظت­های 10، 25 و 50 میکروگرم بر میلی­لیتر در مقایسه با گروه کنترل،                        به‏طور معنی‏داری افزایش داد. میزان فعالیت­ آنزیم پراکسیداز در غلظت موثر 25 میکروگرم بر میلی­لیتر، U/mg 53/2 ±61/31 محاسبه شد که در مقایسه با گروه کنترل (U/mg 21/1± 59/3) افزایش قابل توجهی نشان می­دهد. همچنین غلظت­های 50 و 10 میکروگرم بر میلی­لیتر به‏ترتیب با مقادیر U/mg43/2 ± 26/16 و  U/mg98/1 ± 31/8 بیشترین فعالیت آنزیم پراکسیداز را بعد از دوز 25 میکروگرم بر میلی­لیتر نشان دادند      (نمودار b4).

آرتسونات تولید نیتریک اکساید را در سلول­های سرطانی

مهار نمود. غلظت نیتریک اکساید (NO) با استفاده از متد گریس و با کمک منحنی استانداردNO ، محاسبه شد (نمودار 5). اثر غلظت­های مختلف آرتسونات (10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر) بر روی سلول­های MCF-7 به‏مدت 24 ساعت، کاهش وابسته به دوز در تولید نیتریک اکساید (NO) را نشان داد (نمودار 6). به‏طوری‏که میزان نیتریک اکساید (NO) از 91/2± 65/39 نانو مولار در گروه کنترل به 76/1± 95/8 نانو مولار در غلظت 25 میکروگرم بر میلی­لیتر کاهش یافت (05/0p<). به‏عبارت دیگر با توجه به این نتایج می‏توان دریافت که آرتسونات موجب مهار معنی‏دار تولید نیتریک اکساید در سلول­های  MCF-7 شد.

نمودار5: منحنیاستانداردنیتریک اکساید (NO) که بااستفادهاز غلظت‌های مختلف نیتریت سدیم (0، 10، 20، 30، 50، 100 و 200 نانو مولار) رسم شد.

نمودار6: اثر آرتسونات بر مهار تولید نیتریک اکساید در سلول‏هایMCF-7. میزان مهار تولید نیتریک اکساید (NO) در سوپرناتانت حاصل از  سلول­های MCF-7 تیمارشده با غلظت‏های مختلف آرتسونات (0، 10، 20، 50 و 100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر) به‏‏مدت 24 ساعت که با استفاده از متد گریس و به‏کمک منحنیاستانداردنیتریک اکساید (NO) محاسبه شد. هرتستباحداقل سهتکرارانجام و داده‏ها به‏صورت میانگینتولید نیتریت سدیم بر حسب نانومولار ± انحراف معیاربیان شده اند. *05/0p<، نشان دهنده تفاوت معنی­دار با گروه کنترل می­باشد.