نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشکده علوم، دانشگاه بوعلی سینا، گروه زیست شناسی، همدان، ایران
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش اثرات نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر روی جوانهزنی، رشد ریشه، مقدار رنگیزههای فتوسنتزی، محتوای پروتئین کل، فعالیت برخی آنزیمهای آنتیاکسیدانتی و محتوای کربوهیدرات گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris) میباشد. مواد و روش‌ها: آزمایش در شرایط کشت گلخانه، بهصورت کاملا تصادفی با 4 تکرار طراحی شد. گیاهان در معرض غلظتهای مختلف (01/0، 5/0 و 1 ) گرم بر لیتر نانو اکسید آلومنیوم قرارگرفتند و ویژگیهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاهان تحت تیمار با گیاهان شاهد مقایسه شد . نتایج: بر اساس نتایج بهدست آمده تیمار با نانو اکسید آلومینیوم اثر مثبتی بر درصد جوانهزنی، طول ریشه، محتوای کلروفیل b و کل، محتوای قندهای محلول و نامحلول داشت. کاهش در محتوای کلروفیل a، محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز در نمونههای تحت تیمارها در مقایسه با شاهد مشاهده شد. اثر نانو اکسید آلومینیوم بر سرعت جوانهزنی بذر و فعالیت آنزیم پراکسیداز معنیدار نبود. نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج بررسی حاضر تیمار با نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر بیشتر ویژگیهای تکوینی و فیزیولوژیک در لوبیا اثر مثبت را نشان داد که بیانگر فقدان اثر مسمومیت نانو ذره مورد مطالعه در غلظتهای بهکار رفته است. در مورد برخی از ویژگیها (محتوای کلروفیل a، محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز) اثر کاهشی مشاهده شد که میتواند مربوط به مکانیسمهای مقاومت در گیاه مورد مطالعه باشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Developmental and biochemical responses of Phaseolus vulgaris L. to Aluminum oxide nano-particles treatment
نویسندگان [English]
- A Ch
- F M
- S M
- Z Sh
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the effect of different concentrations of Aluminum oxide nano-particles on seed germination, root length, and the amounts of photosynthetic pigments, total protein content, and changes in activity of some antioxidant enzymes and carbohydrates content in Phaseolus vulgaris. Material and methods: Experiment was performed under greenhouse conditions and completely randomized designed with four replications. Plants were exposed to different concentrations (0.01, 0.5 and 1 g/L) of nano-Aluminum oxide and the physiological and biochemical characteristics of treated plants were compared with control ones. Results: The results showed that treatment by Aluminium oxide nano-particles had a positive impact on the seed germination, root length, total chlorophyll and chlorophyll b content and also sugar content. Decrease in the content of chlorophyll a, protein and catalase activity was observed in the treated plants in comparison to control. Aluminium oxide nano-particle didn’t have a significant effect on seed germination speed and peroxidase activity. Conclusion: Based on the results of this study, nano-particles are able to have a positive effect on some developmental and physiological characteristics of Phaseolus vulgaris L. This indicated that applied nano-particles are not toxic in the used concentrations. Decreasing in characteristics (chlorophyll a, total protein and catalase activity) was observed that could be related to plant resistance.
کلیدواژه‌ها [English]
- Aluminium oxide
- Biochemical responses
- Phaseolus vulgaris
- physiological responses
- Nano-particle
مقدمه
نانو ذرات مجموعهای از اتمها یا مولکولهایی با ابعاد 1 تا 100 نانومتر هستند که میتوانند خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به درشت مولکولها داشته باشند (1 و 2). خصوصیات متمایز این ذرات با اندازه کوچک، افزایش سطح ویژه و سطح انرژی آنها مرتبط است. ویژگیهای خاص نانو ذرات باعث بهرهبرداری از آنها در دامنه گستردهای از کاربرد در لوازم آرایشی، داروسازی، منسوجات، الکتریسیته، حسگرهای زیستی تا کاتالیزورها شده است (3).
استفاده از فناوری نانو در کشاورزی همگام با سایر عرصهها در حال گسترش است. عرضه کودهای شیمیایی بهصورت نانو ذرات بهتازگی مورد توجه قرار گرفته است. نتایج تحقیقات نشاندهندهی واکنشهای مختلف گیاهان بوده است (4). با بهرهگیری از نانوکودها عناصر غذایی با سرعتی مناسب و بهطور تدریجی در تمام فصول رشد گیاه آزاد میشوند. این روند آزادسازی تدریجی، آبشویی عناصر را بهشدت کاهش میدهد و بنابراین گیاهان قادر به جذب مواد غذایی بیشتری خواهند بود. تاکنون از فناوری نانو در کشاورزی، صنایعغذایی و علوم دامی استفادههای بسیاری شده است. از جمله ایجاد سیستمهای هوشمند برای پیشگیری و درمان بیماریهای گیاهی و بازیافت ضایعات حاصل از محصولات کشاورزی (5).
امروزه استفاده صنعتی از نانو ذرات نیز بهسرعت رو به افزایش است. نانو ذرات آزاد در طبیعت، در تماس مستقیم با بدن انسان هستند و بهنوعی دارای خطر بالقوه برای سلامتی انسان میباشند. گیاهان در معرض محیطهای خاکی، آبی و هوایی هستند. بنابراین نانو ذرات توسط سطوح گیاهی جذب شده، بهدنبال آن بهدرون گیاه راه یافته و در آنجا باقی میمانند و بدینطریق وارد چرخه غذایی میشوند (6).
شیوهی در معرض قرارگیری با نانو ذرات مسیر ورود به گیاه را تعیین خواهد کرد. جذب اتمسفری نانو ذرات فلزی توسط برگها به اثبات رسیده و توسط فاکتورهای مورفولوژیکی همانند ساختار کرکها، وجود هیپودرم و روزنهها تحت تاثیر قرار میگیرد (7). همچنین تارهایکشنده نقش خود را در جذب ذرات از محیطهای خاکی و آبی ایفا میکنند (8). نتایج محدودی دربارهی پیامدهای زیستی در ارتباط با جذب نانو ذرات توسط گیاهان وجود دارد و سوالات بسیاری دربارهی سرنوشت و رفتار نانو ذرات در گیاهان باقی مانده است (9).
سنجش سمیت نانو ذرات آلومینیوم و سایر اکسیدهای فلزی بر روی نوعی پلانکتون به نامهای Daphnia (10) و Ceriodaphniadubia (11) وابستگی شدید به غلظت را نشان داد. مطالعهای که بر رویCaenorhabditis elegans برای بررسی سمیت نانو ذره آلومینیوم انجام شد، نشانداد که در معرض قرار گرفتن با نانو ذره آلومینیوم بهطور قابل توجهی پاسخهای استرسی شدید، تولید رادیکالهای آزاد اکسیژن و آسیبهایاکسیداتیو را القا میکند (12). همچنین مطالعه بر روی لاینهای سلولی پستانداران، اثر سمیت بر فعالیتهای دهیدروژنازهای میتوکندریایی و لیزوزومی و تشکیل وزیکولهای پیش هستهای (perinuclear) در سلولهای CHO-K1 بعد از تیمار با نانو ذرات اکسید آلومینیوم و اکسید تیتانیوم بهمدت 24 ساعت را نشان داد (13). شیوههای متنوعی از عملکردهای درگیر در سمیت القا شده توسط نانو ذرات در جلبکها پیشنهاد شده است از جمله: برهمکنش شیمیایی بین ذرات (14 و 15) و استرسهای اکسیداتیو که باعث مرگ سلولی میشود (16 و 17) و سمیت یونها (18).
هوندریک و سیمون (19) در مطالعهای نشان دادند که اکسید تیتانیوم اثرات سمی و ممانعتکنندهی رشد بر جلبک سبز Desmodesmns sp. دارد. در تحقیقات دیگر مشخص شد که نانو ذرات روی و اکسید روی مانع جوانهزنی دانههایLolium perenne و Zea mays میشوند. در معرض قرارگرفتن دانه رستهای Rhaphanus sativus ، Brassica napus، Lactuca sativa و Cucumis sativus با نانو ذرات اکسید روی منجر به از بین رفتن تقریبا کامل ریشه این گیاهان شد (20).
همچنین در تحقیقاتی که بر روی ذرت، خیار و کلم انجام گرفت نانو ذره اکسید آلومینیوم مانع رشد ریشه این گیاهان شد. در مقابل نانو ذرات آلومینیوم سبب افزایش رشد ریشه ترپچه شد (21 و 22).
نانو ذرات آلومینیوم رشد، بیوماس و کارایی فتوسنتزی در گیاه Lemna minor را افزایش داد (23). همچنین رمضانی و همکاران (24) هیچ تفاوت معنیداری بین گروه شاهد و گروه تیمار شده با نانو ذرات روی-مس از نظر فعالیت آنزیمهای سوپر اکسیددسموتاز و آسکورباتدسموتاز در گیاه یونجه مشاهده نکردند.
گیاه مورد استفاده در این پژوهش، لوبیا (رقم شکوفا) با نام علمی Phaseolus vulgaris از تیره Fabaceae بود. تیره حبوبات بعد از تیره کاسنی، تقریبا دومین تیره مهم گیاهان گلدار است که نزدیک به430 جنس و13000گونه دارد (25). این گیاه بومی آمریکاست. گیاهی یکساله، قدکوتاه، راست یا پیچنده که گلهای کوچک، سفیدرنگ، برگهای سه برگچهای و نیام باریک دارند. لگومها ارزشغذایی بسیار بالایی دارند. آنها مواد پروتئینی بسیار بیشتری را نسبت به سایر محصولات گیاهی دارا هستند. کربوهیدراتها و چربیها نیز در لگومها وجود دارند. پروتئینها بهصورت دانههای آلرون در سلولهای مشابه سلولهای واجد دانههای نشاسته دیده میشوند. محتوای بالای پروتئین در ارتباط با حضور گرهکهای واجد باکتریهای تثبیتکننده نیتروژن در ریشههای لگومها میباشد. بقولات همچنین بهعنوان منبع تغذیهای برای حیوانات اهمیت دارند که دراین مورد دانهها، پوسته میوهها و بخشهای سبز آنها مورد استفاده قرار میگیرد. لگومها در سراسر دنیا کاشته میشوند و بهعنوان غذا و دارو مورد استفاده قرار میگیرند (26).
با توجه به اینکه در سالهای اخیر استفاده از نانو ذرات اکسید آلومینیوم استفاده و کاربرد فراوانی در صنایع مختلف پیدا کرده است و آلودگیهای زیست محیطی احتمالی قابل پیش بینی است، پژوهش حاضر، با هدف بررسی تاثیر محلولپاشی نانو ذره اکسید آلومینیوم بر برخی ویژگیهای فیزیولوژیکی و شاخصهای رشد گیاه لوبیا که دارای ارزش غذایی ویژهای است، طراحی و اجرا شد.
مواد و روش‌ها
کشت گیاه لوبیا: بذر گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris) رقم شکوفا، از مرکز تحقیقات کشاورزی همدان، در شهریور ماه سال1393 تهیه و در گلخانه پژوهشی دانشگاه بوعلیسینا همدان، بهصورت کشت گلدانی در چهار گروه دوازدهتایی کاشته شد. طراحی آزمایش بهصورت طرح بلوکهای کاملا تصادفی طرح ریزی شد. گیاهان گروه تیماری با سه غلظت از نانو اکسید آلومینیوم شامل 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر مورد تیمار قرارگرفت. یک گروه هم بهعنوان شاهد انتخاب شد. بعد از گذشت یک ماه، محلولپاشی شروع و تا بعد از گلدهی ادامه پیدا کرد. نانو ذرات مورد استفاده در این پژوهش از شرکت پیشگامان مشهد تهیه شد. نانو اکسید آلومینیوم کاربردی در این پژوهش از نوع گاما، با 9/99 درصد خلوص و ابعاد10 تا20 نانومتر بود (شکل 1).
شکل 1: تصویر ذرات نانو اکسید آلومینیوم (سمت راست) توسط میکروسکوپ SEM و طیف اشعه X نانو ذرات اکسید آلومینیوم
سرعت و درصد جوانهزنی: ابتدا بذرهای سالم و یکنواخت انتخاب و بهمدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 20 درصد قرار داده و ضد عفونی سطحی شدند. سپس بذرها چندین بار با آب مقطر شستشو داده و بهمنظور کشت در پتری دیشهای استریل دارای پنبه و کاغذ صافی قرارگرفتند. بهمنظور انجام مطالعات آماری برای هر گروه تیماری و گروه شاهد50 بذر در نظر گرفته شد. درصد و سرعت جوانهزنی در هریک از گیاهان مورد تیمار و گروه شاهد طی 7 روز محاسبه و مقایسه شد. خروج ریشه اصلی از بذر بهعنوان زمان شروع جوانهزنی در نظر گرفته (23) و سپس در صد جوانه زنی بذرها Germination Percentage(GP) از رابطه زیر بهدست آمد:
PG=100(N' /N) (در صد)
N: تعداد کل بذرها ، N': تعداد بذرهای جوانه زده میباشد.
فرمول سرعت جوانهزنی (27):
GS= ∑jI ni/Di
ni تعداد بذرهای جوانهزده در روزهای شمارش و Di تعداد روز پس از شروع آزمایش.
بذرهایی که طبق روش ذکرشده کشت داده شدند، بعد از 72 ساعت مورد اندازهگیری طول ریشه قرارگرفتند. طول ریشه در هر 4 گروه، نسبت به یکدیگر مقایسه شد.
سنجش رنگیزههای فتوسنتزی: سنجش رنگیزههای فتوسنتزی با روش آرنون (28) انجام شد. 1/0گرم برگ تازه گیاه لوبیا را وزن کرده و با 5 میلیلیتر استون 80 درصد سائیده شد. بعد از یکنواخت شدن، محلول حاصل را بهمدت 20 دقیقه با سرعت4800 دور در دقیقه با دستگاه سانتریفیوژ مدل 5417R، سانتریفیوژ گردید. درگام بعدی، مجداد 5 میلیلیتر استون 80 درصد به محلول شفاف رویی اضافه کرده، جذب محلولها در دو طول موج663 و 645 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر )مدلBiowave II ساخت کشور انگلستان) خوانده شد. میزان کلروفیل a، b و کل در هریک از نمونهها با استفاده از فرمولهای زیر بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد:
645A×00269/0- 663A×0127/0= غلظت کلروفیلa
663A×0046/0- 645A×0229/0= غلظت کلروفیل b
663A×00802/0 +645A×0202/0= غلظت کلروفیل(a+b)
645A = میزان جذب در طول موج 645
663A= میزان جذب در طول موج 663
سنجش کمی پروتئینها و فعالیت آنزیمی
تهیه محلول عصارهگیری: بدینمنظور، 2/1گرم تریس، 1/0گرم اسیدآسکوربیک، 2/17گرم ساکارز، 1/0گرم سیستئین کلراید و 8/26 میلیلیتر اسیدکلریدریک2/0 نرمال را مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 100 میلیلیتر با 5/7:pH رسانده شد.
تهیه عصاره: یک گرم از بافت تر گیاه را وزن کرده، 5 میلیلیتر از محلول عصارهگیری را بر روی آن تزریق و محلول حاصل تا مرحله همگنسازی سائیده شد. سپس بهمدت 10 دقیقه بهحالت سکون باقی ماند و با دستگاه سانتریفیوژ با سرعت 10000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد. تمامی مراحل استخراج در دمای 4- درجه سانتیگراد انجام شد و محلول حاصل در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
سنجش مقدار پروتئین کل: سنجشِ کمی پروتئینها با استفاده از روش برادفورد (29) انجام گرفت. 1/0میلیلیتر از عصاره تهیه شده را در لوله آزمایش ریخته و به آن 5 میلیلیتر معرف برادفورد اضافه کرده و به سرعت ورتکس شد. جذب نمونهها پساز 25 دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر خواندهشد. محتوای پروتئین کل بر اساس میلیگرم بر گرم وزن تر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) گزارش شد.
سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز: 1/0میلیلیتر از عصاره تهیه شده را در لولهآزمایش ریخته و به آن 2 میلیلیتر تامپون استات 02/ مولار0با 8/4:pH ، 2/0 میلیلیتر آب اکسیژنه 3 درصد و 1/0 میلیلیتر بنزیدین (02/0 مولار در متانول 50 درصد) اضافه کرده و جذب نوری محلول با دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج 530 نانومتر خوانده شد. در نهایت فعالیت آنزیم برحسب واحد جذب در دقیقه به ازای هر میلیگرم پروتئین در گرم وزن تر محاسبه شد (30).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و میزان کاهش H2O2 با مطالعه تغییرات جذب در 530 نانومتر انجام شد. 2/0 میلیلیتر عصارهی آنزیمی به 5/2 میلیلیتر تامپون فسفات با 7pH= و 3/0 میلیلیتر آب اکسیژنه 3 درصد افزوده شد. و پس از مخلوط شدن کامل آنها تغییرات جذب در طول موج 530 نانومتر خوانده شد و فعالیت آنزیم بر حسب واحد جذب در دقیقه بهازای هر میلیگرم پروتئین در گرم وزن تر محاسبه شد (31).
سنجش کربوهیدراتها (32)
قندهای محلول: سنجش قندهای محلول و نامحلول با استفاده از روش فنل- اسیدسولفوریک انجام گرفت. 1/0 گرم از ماده خشک اندام گیاهی در 10 میلیلیتر اتانول 70 درصد ریخته شد و پس از یک هفته، 5/0 میلیلیتر از بخش رویی محلول برداشته و با آب مقطر به حجم 2 میلیلیتر رسانده شد. سپس به آن 1 میلیلیتر فنل 5 درصد اضافه و بعد از آنکه خوب بههم زده شد به آن 5 میلیلیتر سولفوریک اسید غلیظ اضافه شد، حدود نیم ساعت پس از خنک شدن کامل محلول، جذب آن توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر خوانده شد. برای اندازهگیری مقدار قند از منحنی استاندارد تهیه شده از گلوکز استفاده شد.
قندهای نامحلول: محلول اتانولی حاصل از قندهای محلول را صاف کرده و رسوب حاصل خشک و وزن شد. 10میلیلیتر آب بر روی رسوب ریخته و بهمدت 15دقیقه در بنماری درحال جوش قرار گرفت. سپس محلول رویی را صاف کرده و با آب به حجم 25میلیلیتر رسانده شد. 2 میلیلیتر از محلول را برداشته و به آن 1 میلیلیتر محلول فنل 5 درصد بهعلاوه 5 میلیلیتر اسید سولفوریک غلیظ اضافه و بهمنظور همگنسازی همزده شد. با گذشت نیم ساعت در دمای آزمایشگاه، میزان جذب محلولها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج 485 نانومتر خوانده شد.
آنالیز آماری
در این پژوهش، تمام محاسبات آماری با حداقل 3 تا 5 تکرار با استفاده از نرمافزار SAS (version9.1) توسط آزمون دانکن بر پایه طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم افزارExcell 2007 رسم شد.
نتایج
سرعت و درصد جوانهزنی
جدول 1 اثر تیمار نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر درصد جوانهزنی، سرعت جوانهزنی و طول ریشه را نشان میدهد. با افزایش غلظت نانو ذرات اکسید آلومینیوم در محیط درصد جوانهزنی، سرعت جوانهزنی و طول ریشه افزایش یافت. از نظر آماری افزایش در درصد جوانهزنی در سطح (05/0p≤) و افزایش در طول ریشه در سطح (01/0p≤) معنیدار بود. تیمار با نانو ذرات بر سرعت جوانهزنی فاقد تاثیر آماری معنیدار بود. درصد جوانهزنی از 33/72 درصد در نمونه شاهد به 33/90 درصد در تیمار 1 گرم بر لیتر رسید. اختلاف معنیدار در درصد جوانهزنی بین تیمار شاهد و غلظتهای 01/0 و 5/0 مشاهده نشد (جدول 1).
جدول 1: اثر غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر برخی پارامترهای رشد در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف آماری معنیدار است.
|
طول ریشه (mm)** |
سرعت جوانهزنی (n/d) NS |
جوانهزنی (%)* |
تیمار |
|
46/11±27/3 b |
43/49±35/8 |
33/72±05/12 b |
شاهد |
|
38/12±45/7 b |
33/38±42/7 |
33/75±31/13 ab |
نانو اکسید آلومینیوم 0.01 (g/l) |
|
69/18±18/9 a |
23/53±09/9 |
90±21/7 ab |
نانو اکسید آلومینیوم 0.5 (g/l) |
|
2/12±63/5 b |
93/53±77/5 |
33/90±50/6 a |
نانو اکسید آلومینیوم 1 (g/l) |
* اختلاف معنیدار با گروه شاهد در سطح 05/0p≤
**اختلاف معنیدار با گروه شاهد در سطح 01/0p≤
NS نتایج فاقد اختلاف آماری معنادار هستند.
نتایج نشان داد که طول ریشه بهمیزان 23/7 میلیمتر در تیمار 5/0 نسبت به شاهد افزایش یافته است. نتایج حاکی از این است که سرعت جوانهزنی با افزایش غلظت نانو ذرات افزایش نسبی نشان داد اما از نظر آزمون مقایسهای دانکن این افزایش معنیدار نیست.
سنجش رنگیزههای فتوسنتزی
آنالیز دادهها مشخص کرد که اثرات تمار با نانو ذرات اکسید آلومینیوم در غلظتهای مختلف بر روی میزان کلروفیل a، b و a±b از نظر آماری معنیدار بوده است (01/0p≤). با افزایش غلظت نانو ذره اکسید آلومینیوم در محیط، میزان کلروفیل a، از 0097/0 میلیگرم در هر گرم بافت تر گیاهی در گیاهان شاهد، به 0076/0 میلیگرم در هر گرم بافت تر گیاهی در محیط حاوی 1 گرم بر لیتر نانو ذره اکسید آلومینیوم کاهش یافت. در این گیاه همزمان با افزایش غلظت نانو ذره اکسید آلومینیوم، میانگین کلروفیل b افزایش یافت. براساس آزمون دانکن میزان کلروفیل b در هریک از تیمارها با میزان کلروفیل b در نمونههای شاهد تفاوت معنیدار داشت (01/0p≤)، بهطوریکه نمونههای با تیمار 1 گرم بر لیتر، دارای 0072/0 میلیگرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه بیشترین میزان کلروفیل b و گیاهان شاهد با 003/0 میلیگرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه کمترین میزان کلروفیل b را دارا بودند. در گروههای تیمار شده با نانو ذره اکسید آلومینیوم تغییر محتوای کلروفیل کل افزایش معنیداری را نشان داد، بدینصورت که میزان کلروفیل کل در نمونههای شاهد و گروههای تحت تیمار با غلظتهای 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر نانو ذره اکسید آلومینیوم بهترتیب 0126/0، 0137/0، 0088/0 و 0148/0 میلیگرم بر لیتر در هر گرم بافت تازه گیاه بود (شکل 2).
شکل 2: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای انواع کلروفیل در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند
.
سنجش کمی پروتئینها و فعالیت آنزیمی
تیمار با نانو ذره اکسید آلومینیوم موجب کاهش در محتوای پروتئین کل شد (شکل 3). اما کاهش در مقدار پروتئین کل تنها در غلظت 01/0 گرم بر لیتر دارای اختلاف معنیدار (05/0p≤) با گروه شاهد بود.
شکل 3: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای پروتئین کل در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند.
نتایج آزمون مقایسهای دانکن نشان داد که نانو ذره اکسید آلومینیوم بر فعالیت آنزیم پراکسیداز اثر معنیداری نداشته است
(شکل 4).
شکل 4: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر فعالیت آنزیم پراکسیداز در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند.
نتایج حاصل از اندازهگیری اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید
آلومینیوم بر فعالیت آنزیم کاتالاز در شکل 5 نشان داده شده است. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان تحت تیمار نانو ذره اکسید آلومینیوم کاهش نشان داد که این کاهش در همه غلظتها معنیدار بود. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاهان شاهد بهمیزان 0016/0 واحد جذب در دقیقه بهازای میلیگرم پروتئین گزارش شد. این مقدار در گیاهان تیمار شده با غلظتهای 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر نانو ذره اکسید آلومینیوم به مقدار 0002/0، 0003/0 و 0004/0 واحد جذب در دقیقه بهازای میلیگرم پروتئین رسید.
شکل 5: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر فعالیت آنزیم کاتالاز در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند.
سنجش کربوهیدراتها
بررسی آنالیز دادهها نشان داد که اثرات نانو ذره اکسید آلومینیوم بر قندهای محلول معنیدار بوده (01/0p≤) و با افزایش غلظت نانو ذره محیط، بهتدریج مقدار قند محلول افزایش یافته است.
کمترین میزان قندهای محلول 151/0 میلیگرم در هر گرم بافت خشک گیاهی به مربوط به گیاهان شاهد بود. در حالیکه گیاهان تیمار شده با غلظتهای 01/0، 5/0 و 1 گرم در لیتر نانو ذره بهترتیب دارای 154/0، 154/0 و 172/0 میلیگرم قند محلول در هر گرم بافت خشک گیاهی بودند (شکل 6).
شکل 6: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای قندهای محلول در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند.
آنالیز دادههای مربوط به میزان قندهای نامحلول تفاوت معنیداری بین گروههای تحت تیمار با غلظتهای مختلف نانو
ذرات را نشان داد. تاثیر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم بر میزان قندهای نامحلول در سطح یک درصد (01/0p≤) معنیدار بود. میزان قند تامحلول در گیاهان شاهد 1122/0 میلیگرم در هر گرم بافت خشک گیاهی بود که این میزان در غلظت 1 گرم بر لیتر نانو ذره اکسید آلومینیوم به 1173/0 میلیگرم افزایش یافت (شکل 7).
شکل 7: اثر غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (0، 01/0، 5/0 و 1 گرم بر لیتر) بر محتوای قندهای نامحلول در گیاه لوبیا. هر ستون معرف میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. ستونهای با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنیدار هستند
.
بحث
استفاده صنعتی از نانو ذرات به سرعت در حال افزایش است و
این باعث نگرانی در مورد سرنوشت زیست محیطی و اثرات
بیولوژیکی بالقوه این ذرات شده است. گیاهان عالی به شدت با محیط جوی و زمینی خود در تعامل هستند و انتظار میرود با نانو ذرات تحت تاثیر قرار گیرند (33 و 34).
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که نانو ذره اکسید آلومینیوم درصد جوانهزنی و طول ریشه گیاه لوبیا را افزایش داده است. افزایش سرعت جوانهزنی تحت تاثیر این ذرات از نظر آماری معنیدار نبود. علومی و همکاران (35) در مطالعات خود نشان دادند که درصد جوانهزنی گیاه شیرینبیان در تیمار با نانو اکسید مس کاهش یافته است. در مطالعهی دیگر افزایش جوانهزنی ذرت در تیمار با نانو ذره روی گزارش شده است (20) که با نتایج پژوهش
حاضر مطابقت دارد. دلیل افزایش جوانهزنی را میتوان به نفوذپذیری بالای نانو ذرات بهدرون پوسته بذر و در نتیجه افزایش جذب آب و افزایش جذب نور و فعالیت آنزیم روبیسکو نسبت داد (34 و 36).
در گروههای تیماری با نانو اکسید آلومینیوم، طول ریشه نیز افزایش معنیداری را نشان داد. بهنظر میرسد دلیل این افزایش، افزایش قدرت جذب آب درحضور نانو ذرات باشد. قبلا اثر نانو آلومینیوم بهعنوان تشدیدکننده طول ریشه دانه رستهای Arabidopsis thaliana نشان داده شده است (37). جاهل و همکاران (22) نشان دادند که نانو ذرات آلومینیوم رشد ریشه Lemna minor را در مقایسه با گروه شاهد افزایش داد. افزایش در جوانهزنی و رشد گیاهان گوجهفرنگی تحت تیمار نانو لولههای کربنی از طریق افزایش قدرت جذب آب (38) و همچنین افزایش تحریک رشد اسفناج تحت تیمار نانو اکسید تیتانیوم گزارش شده است (34). نتایج گزارشهای فوق با نتایج پژوهش حاضر همسو است. در غلظت 1 گرم بر لیتر روند افزایش متوقف و رشد ریشه کاهش یافت بهنظر میرسد همانگونه که در مطالعات قبلی گزارش شده نانو ذرات آلومینیوم در غلظتهای بالا اثر مهارکنندگی بر رشد تعدادی از گونههای گیاهان دارد (21, 20).
سرعت جوانهزنی بذر گیاه لوبیا، تحت تیمار با نانو ذرات آلومینیوم افزایش یافت. اما این افزایش از نظر آماری معنیدار نبود. تیمار با نانو ذرات در سرعت جوانهزنی موثر بوده و رشد گیاه را افزایش میدهند. کلید افزایش سرعت جوانهزنی بذر در گروههای تحت تیمار یا نانو ذرات، در نفوذ این ذرات به داخل بذرهاست (39). صابر و همکاران (40) اثر دو نوع نانو ماده شامل: نانو رس و نانو نقره بر جوانهزنی و رشد بذور کلمگل مورد بررسی قرار دادند نتایج نشان داد نانو رس تاثیر مثبت بر درصد و سرعت جوانهزنی داشت در حالیکه نانو نقره بهطور کامل از جوانهزنی بذور کلم گل ممانعت کرد.
نتایج بهدست آمده از این تحقیق نشان داد که تیمار با ذرات نانو آلومینیوم محتوای کلروفیل a را کاهش، کلروفیل b و a±b را افزایش داده است. افزایش میزان کلروفیل در مطالعات قبلی نیز مشاهده شده است. ترابیان و همکاران (41) گزارش کردند که محتوای کلروفیلa و کلروفیل کل آفتابگردان تحت تیمار کود نانو سولفات آهن بهترتیب به میزان 30 و 13 درصد نسبت به نمونههای شاهد افزایش یافته است. در تحقیقی که روی Pelargonium zonale انجام گرفت مقدار کلروفیل a، b و کل در گروه تیمار شده با غلظت 60 میلیگرم در لیتر نانو نقره افزایش و سپس در غلظت 80 میلیگرم در لیتر کاهش یافت (42).
هیچگونه تغییر معنیداری برای کلروفیل a در Chlamydomonas reinhardtii در سطوح مختلف نانو اکسید تیتانیوم مشاهده نشد در حالیکه محتوای کلروفیل b و کارتنوئیدها در گروههای تحت تیمار بعد از 3 و 4 روز در معرض نانو ذرات قرار گرفتن افزایش یافت (43). طبق نظر آندرسون و همکاران (44) افزایش میزان کلروفیل دلیلی بر فعال بودن سلولها و افزایش تولید مواد قندی آنها است و افزایش مواد قندی از طریق تنظیم تنفس و فشار اسمزی موجب کاهش پیری گلها میشود. بهنظر میرسد افزایش میزان کلروفیل با مصرف نانو آلومینیوم از طریق افزایش فعالیت سلولی بوده است.
نتایج نشان دهندهی عدم اختلاف معنیدار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در گروههای تیماری با گروه شاهد و کاهش معنیدار فعالیت آنزیم کاتالاز در گروههای تحت تیمار بود. ساز و کار دفاعی گیاهان برای مقابله با خسارتهای ناشی از تنش اکسیداتیو و حذف گونههای فعال اکسیژن شامل آنزیمهای آنتیاکسیدانت و ترکیبات آنتیاکسیدانتها است. ساز و کارهای آنزیمی، شامل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، دهیدرو آسکوربات ردوکتاز و غیره، غلظت سوپراکسید و پراکسیدهیدروژن را کاهش میدهند. آنتیاکسیدانتهای تولید شده توسط ساز و کارهای غیرآنزیمی در گیاهان نیز شامل ویتامین E، آسکوربات، گلوتاتیون، ترکیبات فلاوونوئیدی، کارتنوئیدها و غیره هستند (45).
عدم اختلاف معنیدار میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و کاهش میزان فعالیت کاتالاز ممکن است نشاندهنده یک مکانیسم محافظتی بهتر در این گیاه باشد. اختمال میرود تنش حاصل از تیمار با نانو ذرات آلومینیوم سبب از بین رفتن سیستم دفاعی شده باشد و فعالیت آنتیاکسیدانتی را کاهش داده است. بهتر است دیگر آنزیمهای دخیل در سیستم دفاعی نیز بررسی شود.
حاتمی و همکاران (46) در تحقیقات خود نشان دادند که در گروههای تیمار شده با غلظتهای مختلف نانو ذرات نقره، تغییر فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز در دو رقم شمعدانی (آنتونی و بلوواندر) بعد از پنج روز در شرایط تاریکی از نظر آماری تفاوت معنیدار داشت. در تیمار 60 میلیگرم در لیتر نانو ذرات، فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در دو رقم افزایش یافت و سپس با افزایش غلظت نانو ذرات در سطح 80 میلیگرم در لیتر کاهش نشان داد. همچنین افزایش فعالیت دو آنزیم کاتالاز و پراکسیداز با افزایش غلظت نانو نقره و سپس کاهش فعالیت این دو آنزیم در شمعدانیهای تحت تیمار مشاهده شده است (42).
در گیاه پریوش میزان فعالیت آنزیمهای سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گایاکول پراکسیداز در غلظت صفر میکرومول نانو اکسید روی کاهش و سپس در غلظتهای 2، 4 و 10 میکرومول افزایش یافت. (5).
در گیاهان آفتابگردان که با محلولی از آهن، مس و کادمیوم تیمار شده بودند فعالیت لیپوکسیژناز و پراکسیداسیون بیشتری نسبت به گروه شاهد داشتند. برخلاف یونهای آهن و کادمیوم که سبب کاهش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز شدند یون مس آن را افزایش داد. البته هر سه یون به کاهش دیگر آنزیمهای آنتیاکسیدانت (کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیونردوکتاز و دهیدروآسکوربات) منجر شدند (47). که همسو با نتایج پژوهش حاضر است. مطالعات گذشته نشان میدهد که واکنش آنزیمهای آنتیاکسیدانتی به فلزات مبهم است و میتواند بین گونههای گیاهی و حتی بین بافتهای مختلف یک گیاه متفاوت باشد (48).
نتایج سنجش محتوای پروتئین نشان داد که همزمان با افزایش غلظت آلومینیوم، محتوای پروتئین کل کاهش یافت (کاهش پروتئین تنها در غلظت 01/0 گرم بر لیتر معنیدار بود). برخی شواهد وجود دارد که کاهش سنتز پروتئین و افزایش پروتئولیز دلایلی برای کاهش پروتئین در طول تنش هستند (49 و 50). بهنظر میرسد در اینجا نیز کاهش سنتز پروتئین و افزایش پروتئولیز عوامل کاهش دهنده پروتئین در شرایط تیماری هستند. در بررسی اثر نانو ذرات نقره بر محتوای پروتئین کل دو رقم Foxi و Flowerfairy گیاه Pelargonium zonale مشخص شد که محنوای پروتئین کل در هر دو رقم ابتدا افزایش و سپس بهسرعت کاهش یافته است (42). بهبودی و همکاران (51) نشان دادند که با افزایش میزان نانو ذرات اکسید مس و اکسید روی مقدار پروتئین دانه لوبیا چیتی کاهش یافت که با نتایج مطالعه حاضر همسو است. محتوای پروتئین برگ Abelmoschus esculantus در همهی تیمارهای نانو روی به جز ppm 200 افزایش یافت (52). بهطور مشابه پروتئین کل در غلظتهای 20، 40 و ppm 60 تیمار لوبیا و ذرت با نانو ذرات نقراه افزایش یافت اما در تیمار80 و ppm 100 کاهش نشان داد (53). نتایج آزمون مقایسهای دانکن نشان داد که با افزایش غلظت نانو اکسید آلومینیوم محیط، مقدار قندهای محلول و نامحلول افزایش یافته است. برخی از تحقیقات نشان داده است که با افزایش غلظت فلزات سنگین، میزان تعادل آب درون سلولی دچار اختلال شده و سبب تغییرات فراساختاری در اندامکهای سلولی و آنزیمهای مسیر متابولیسم قندها میشود و با افزایش غلظت فلزات سنگین میزان فعالیت آنزیم اینورتاز کاهش مییابد. بهدنبال کاهش میزان انتقال آب به برگها و تجمع این عناصر سنگین در سلول، میزان کربوهیدراتها در برگها افزایش مییابد. در واقع افزایش قندها یک نوع مکانیسم تطابقی و سازگار یافته برای حفظ و نگهداری پتانسیل اسمزی تحت تنش آلومینیوم است. تجمع کربوهیدراتها در حفظ غشای سلولی و تنظیم اسمزی موثر است (54 و 55).
در تیمار Abelmoschus esculantus (L.) Moench با نانو ذره نقره محتوای کربوهیدراتها در تمام غلظتها کاهش یافت (52). محتوای کربو هیدراتها در گیاهان لوبیا و ذرت تیمار شده با غلظتهای 20، 40 و ppm 60 نانو ذرات نقراه افزایش یافت اما در تیماز 80 و 100 ppmکاهش نشان داد (53). در تیمار Ocimum basilicum با نانو ذرات آهن (Fe3O4) با افزایش غلظت ذرات سطح کربوهیدرات کل بهطور معنیداری افزایش یافت (56) که با نتایج پژوهش حاضر همسو است.
نتیجه گیری
مطالعهی حاضر بهمنظور ارزیابی پاسخهای تکوینی و بیوشیمیایی لوبیا به تیمار نانو اکسید آلومینیوم انجام گرفت. نتایج مطالعه حاضر موثر بودن تیمار با نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر ویژگیهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیک لوبیا را اثبات کرد. نانو ذرات اکسید آلومینیوم سبب افزایش درصد جوانهزنی، طول ریشه، محتوای کلروفیل b و کل، محتوای قندهای محلول و نامحلول و کاهش محتوای پروتئین کل و فعالیت آنزیم کاتالاز در گروههای تحت تیمار با ناو ذرات آلومینیوم در مقایسه با گروه شاهد شد. اثر نانو ذرات اکسید آلومینیوم بر سرعت جوانهزنی بذر و فعالیت آنزیم پراکسیداز معنیدار نبود.
)