وجود مقادیر سمی فلزات سنگین در محیط زیست گیاهان باعث ایجاد تغییرات فیزیولوژیک شده و می­­­تواند موجب کاهش توان رشد گیاه و در حالت شدیدتر باعث از بین رفتن گیاه شود. گیاهان حساس در چنین شرایطی آسیب دیده و از بین می­روند در حالی‏که گیاهان مقاوم در این شرایط همچنان به رشد و تولید مثل خود ادامه می­دهند. علائم سمیت سرب در گیاه شامل جلوگیری از رشد، کلروز و سیاه شدن سیستم ریشه می­باشد. وقتی سرب حتی در مقادیر کم وارد سلول می­شود گستره وسیعی از اثرات مضر را روی فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه ایجاد می­کند از جمله باعث ممانعت از فعالیت آنزیم‏ها، اختلال در تغذیه معدنی و تعادل آب گیاه می­شود. همچنین باعث تغییر وضعیت هورمون­ها شده و ساختار و نفوذپذیری غشا را تحت تاثیر قرار می­دهد. این اختلالات، فعالیت­های معمول فیزیولوژیکی گیاهان را بر هم زده و در غلظت­های بالا ممکن است منجر به مرگ سلول نیز شود (1). سمیت سرب باعث کاهش درصد جوانه­زنی، شاخص جوانه­زنی، شاخص تحمل، طول گیاه و توده خشک گیاه می­شود (2).

گیاهانی که در معرض سرب قرار می­گیرند کاهش میزان فتوسنتز را نشان می­دهند که ناشی از تخریب فرا ساختار کلروپلاست، جلوگیری از سنتز کلروفیل، پلاستوکوئینون و کارتنوئیدها، ممانعت از انتقال الکترون و جلوگیری از فعالیت آنزیم­های چرخه کالوین است. سرب با ایجاد اختلال در جذب فلزات ضروری مثل منیزیم و آهن مانع از سنتز کلروفیل می­شود (2 و 3). افزایش تخریب کلروفیل در گیاهان تیمار شده با سرب ناشی از افزایش فعالیت کلروفیلاز می­باشد. گزارش شده که در تیمار سرب کلروفیل b بیشتر از کلروفیلa  تحت تاثیر قرار می‏گیرد (4 و 5).

یکی از اثرات سمی سرب القا تنش اکسیداتیو در گیاهان به‏دلیل افزایش تولید گونه­های اکسیژن فعال(ROS)  می­باشد که نتیجه عدم تعادل حالت ردوکس سلولی است (6 و 7). در بسیاری از گیاهان نقش کربوهیدرات­ها به‏عنوان یک عامل تنظیم کننده اسمزی در تنش­های محیطی پذیرفته شده است. چندین گزارش بر روی تجمع کربوهیدرات در تنش­های زیستی و غیر­زیستی وجود دارد (8 و 9). آنتوسیانین­ها دسته ای از فلاونوئیدها هستند که به‏طور گسترده­ای در گیاهان وجود دارند (10). اتصال آنتوسیانین به برخی فلزات و کاهش اثرات سمی آن‏ها گزارش شده است (11). همچنین مطالعات دیگری افزایش تجمع آنتوسیانین را با افزایش یافتن غلظت فلز سنگین گزارش کردند  (12،13 و 14). اسپند با نام علمی Peganum harmala L. گیاهی چند ساله از خانواده Zygophylaceae است که مصارف دارویی فراوانی دارد. با توجه به دامنه رشد گسترده اسپند در خاک‏های نواحی مختلف فلز­دوست و غیرفلزدوست، بررسی مقاومت این گیاه به فلزات سنگین حائز اهمیت است. این تحقیق با هدف بررسی تغییرات رشد و برخی واکنش‏های فیزیولوژیک در شرایط تنش ناشی از افزایش سرب و مقایسه بین دو جمعیت فلزدوست و غیر فلز دوست اسپند انجام شده است.

مواد و روش‏ها

به‏منظور ارزیابی مقاومت به سرب، بذر دو جمعیت گیاه اسپند انتخاب شد. یک جمعیت فلزدوست از خاک­های آلوده به سرب و روی منطقه معدنی کوشک بافق یزد و دیگری جمعیت غیرفلزدوست از خاک­های منطقه ماهان کرمان که غیرآلوده می‏باشد انتخاب شد. بذرها حداقل از 25 گیاه جمع آوری شده بودند. جهت کشت بذر، گلدان­های پلاستیکی به قطر 9 سانتیمتر حاوی مخلوطی از پرلیت ریز و درشت تهیه شد. در هرگلدان تعداد 6 عدد بذر گیاه اسپند کاشته شد و 3 تکرار در هر غلظت از تیمار در نظر گرفته شد. پس از گذشت 5 روز آبیاری با آب مقطر گیاهچه­های حاصل به‏مدت 40 روز با محلول غذایی هوگلند اصلاح شده تغذیه شدند (15). سپس گیاهان به محلول آزمایش منتقل شدند که ترکیب آن مشابه محلول هوگلند فوق بود اما بدون NH4H2PO4 و Fe(Na)-EDTA به‏دلیل جلوگیری از رسوب فسفات سرب و تشکیل کمپلکس Pb-EDTA ناشی از جایگزینی آهن تهیه شد. گیاهچه­ها به‏مدت 14روز تحت تاثیر غلظت­های مختلف سرب قرار گرفتند. غلظت­های مختلف سرب با استفاده از نمک نیترات سرب ₂) (Pb(NO₃) تهیه شد. تیمارها به‏صورت 0، 5، 10، 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در نظر گرفته شد. pH محلول غذایی و محلول غذایی حاوی سرب در محدوده 5/5 تنظیم شد. محلول­های غذایی هر هفته با محلول‏های تازه جایگزین گردید و گیاهان در اتاقک کشت با دمای متناوب 20/25 درجه سانتی­گراد (شب/روز)، تناوب نوری (16 ساعت نور)، شدت نور 200 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه رشد کردند.

اندازهگیریطولاندامهواییوریشه: در پایان تیماردهی، طول ساقه و ریشه با استفاده از خط­کش اندازه­گیری شد. طول ساقه از یقه تا قسمت انتهای ساقه و طول ریشه از یقه تا انتهای ریشه در نظر گرفته شد. برای هر تیمار بیش از 3 تکرار در نظر گرفته شد و مقادیر بر اساس سانتیمتر گزارش شد .

استخراج قند از بافت­های گیاهی: برای استخراج قند، بافت گیاهی مورد نظر را به‏مدت 24 ساعت در دمای 70 تا 80 درجه سانتی­گراد خشک کرده و سپس 01/0 گرم از بافت خشک به تعداد 3 تکرار در هر تیمار توزین شد و با 10 میلی‏لیتر آب مقطر گرم در هاون سائیده شد و با کاغذ صافی صاف گردید.

برای اندازه­گیری هیدرات­های کربن محلول از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد. در این روش اکثر قندها شامل مونوساکاریدها، دی ساکاریدها، اولیگوساکاریدها قابل شناسایی می­باشند. اسید سولفوریک، دی ساکاریدها، اولیگوساکاریدها و پلی ساکاریدها را به واحدهای کوچکتر یعنی مونوساکارید می‏شکند. سپس پنتوزها یا قندهای پنج کربنه به فورفورال دهیدراته شده و هگزوزها یا قندهای شش کربنه به هیدروکسی متیل فورفورال دهیدراته می­شوند. این ترکیبات سپس با فنل واکنش داده و در اثر این واکنش، رنگ زرد طلائی حاصل می‏شود که این رنگ تا چند ساعت پایدار باقی می­ماند. با خواندن جذب ترکیب رنگی هر نمونه در طول موج 490 نانومتر می­توان به مقدار قند محلول نمونه پی برد. به این منظور 2 میلی­لیتر از عصاره گیاهی استخراج شده را با 50 میکرولیتر فنل 80 درصد وزنی (حل شده در آب مقطر) مخلوط کرده و سپس 5 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ به صورت عمود بر سطح مایع به آن اضافه شد. این مخلوط به‏مدت 10 دقیقه در محیط نگه‏داری شده و پس از آن به‏مدت 15 دقیقه در حمام آب­ گرم 25 تا 30 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و سپس جذب محلول در 490 نانومتر خوانده  شد (16). سپس منحنی استاندارد با استفاده از گلوکز خالص رسم شده و مقدار قندهای محلول با کمک این نمودار در یک گرم بافت گیاهی به‏دست آمد.

برای سنجش قندهای احیا، DNS (دی نیترو سالیسیلیک اسید) 1 درصد ، سود 6/1 درصد و تارتارات سدیم-پتاسیم 25 درصد  با کمک مگنت و روی هیتر به‏آرامی حل شد. سپس 2 میلی­لیتر از عصاره گیاهی استخراج شده با 1 میلی­لیتر از رنگ ساخته شده مخلوط و به‏مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش 100 درجه سانتی­گراد قرار داده شد، سپس کل محلول به‏دست آمده با 10 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط شد و جذب نمونه‏ها در 546 نانومتر خوانده شد و با کمک از گلوکز خالص منحنی استاندارد مربوط به میزان قندهای احیا محاسبه شد (17).

سنجش آنتوسیانین­ها: جهت اندازه‏گیری مقدار آنتوسیانین­ها، 1/0 گرم از اندام هوایی تازه گیاه در هاون چینی با 10 میلی­لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و اسید کلریدریک خالص به نسبت حجمی 1:99) کاملا سائیده و به‏مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. سپس 10 دقیقه در g 4000 سانتریفوژ و جذب محلول بالایی در طول موج 550 نانومتر اندازه‏گیری شد. با استفاده از ضریب خاموشی 33000 مول بر سانتی‏متر مکعب غلظت آنتوسیانین­ها محاسبه و نتایج بر حسب میکرومولار بر گرم وزن تر ارائه شد (18).

رنگدانه­های فتوسنتزی: اندازه‏گیری مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها با استفاده از روش Lichtenthaler (1987) انجام پذیرفت. 2/0 گرم از برگ­های تازه گیاه با 15 میلی‏لیتر استن 80 درصد سائیده شده و پس از صاف کردن جذب آن‏ها با دستگاه اسپکتروفتومتر (Carry 50  استرالیا) در طول موج­های 8/646، 20/663 و 470 نانومتر خوانده شد و غلظت رنگیزه­ها با استفاده از رابطه‏های زیر و بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد:

Chla= (12.25 A663.2-2.79 A646.8)

Chlb= (21.21 A646.8-5.1 A663.2) 

ChlT= chla+chlb                             

Car= [1000 A470-1.8 chla-85.02 chlb] /198

در این فرمول chla، chlb، chlT و car به‏ترتیب غلظت کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها (شامل کاروتن­ها و گزانتوفیل­ها) می­باشد (19).

                :(FAA)اندازه­گیری مقدار آمینواسیدهای آزاد

مقدار آمینواسیدهای آزاد در نمونه‏ها از طریق رنگ سنجی با نین­هیدرین به‏دست آمد. 2/0 گرم بافت تازه برگی در 5 میلی‏لیتر بافر پتاسیم فسفات سرد 50 میلی مولار )8/6= (pH سائیده، به‏مدت 20 دقیقه در g18000 سانتریفیوژ شد. از محلول رویی برای سنجش آمینواسیدهای آزاد استفاده شد. یک میلی­لیتر معرف نین­هیدرین به 5 میلی لیتر نمونه افزوده شد. سپس، لوله­ها 4 تا 7 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. پس از سرد شدن، جذب نمونه ها در 570 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه مقدار آمینواسیدهای آزاد از منحنی استاندارد گلیسین استفاده شد (20).

آنالیز آماری

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد. برای آنالیز نتایج، از روش آنالیز واریانس دو­ طرفه استفاده شد که در آن معنی‏دار بودن یا نبودن اثر تیمار سرب و جمعیت مورد آنالیز قرار گرفت. به‏منظور پی بردن به معنی­دار بودن یا نبودن تفاوت میانگین­ها در هر جمعیت بین تیمارهای مختلف از آزمون Tukey HSD استفاده شد. همچنین تفاوت بین دو جمعیت در هر غلظت از تیمار سرب با استفاده از آزمون t-test بررسی شد. کلیه نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel رسم شدند.

نتایج

­شکل 1 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر رشد طولی اندام هوایی گیاه اسپند نشان می دهد. طبق شکل، تیمار سرب باعث کاهش معنی­دار طول اندام هوایی گیاه نسبت به شاهد در هر دو جمعیت شده است. کمترین طول اندام هوایی در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر در هر دو جمعیت مشاهده شد (شکل 1).

شکل 1: اثر غلظت­های مختلف سرب بر طول اندام هوایی در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین طول اندام هوایی 12 گیاه از هر جمعیت ± خطای استاندارد. حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است.

اولین نشانه قابل مشاهده سمیت سرب ممانعت از رشد ریشه می­باشد. جهت ارزیابی میزان مقاومت به سرب، پس از 14 روز تیمار میزان رشد ریشه گیاهان جمعیت­های مختلف اسپند اندازه­گیری شد (شکل 2). همان‏طور که در شکل 2 مشاهده می‏شود 14 روز پس از تیمار سرب، کاهش طول ریشه در هر دو جمعیت فلز دوست و غیر­ فلزدوست گیاه اسپند که در معرض تیمار سرب قرار گرفته بودند مشاهده می­گردد. نتایج آنالیز نشان داد که بین دو جمعیت تفاوت معنی‏داری وجود دارد، به‏طوری‏که کمترین طول ریشه در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر جمعیت غیر­فلزدوست مشاهده می‏شود. طول ریشه در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر جمعیت غیر­فلزدوست نسبت به شاهد 25 درصد کاهش نشان داد.

شکل 2: اثر غلظت­های مختلف سرب بر طول ریشه در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین طول ریشه 12 گیاه از هر جمعیت ± خطای استاندارد) حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی‏دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

تغییرات محتوای کلروفیل a، b و کل برگ در اثر تیمار سرب در شکل 3 نشان داده شده است. بر اساس شکل 3، میزان کلروفیل a، b و کل در غلظت­های مختلف تیمار سرب کاهش معنی­داری را نسبت به شاهد در هر دو جمعیت نشان می­دهند. نتایج حاصل از آنالیز واریانس تفاوت معنی­داری را در محتوای کلروفیل b و کل، بین دو جمعیت نشان می­دهد، به‏طوری‏که کمترین مقدار کلروفیل b و کل در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلزدوست مشاهده می­شود. بنابراین مقدار کلروفیل a، b و کل در تیمار سرب 50 میلی­گرم در لیتر نسبت به شاهد در جمعیت غیرفلزدوست به‏ترتیب 26، 40 و 29 درصد کاهش نشان داد.

شکل 4 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر محتوای کاروتنوئید گیاه اسپند نشان می­دهد. تمام غلظت­های سرب باعث کاهش معنی­دار محتوای کاروتنوئید در هر دو جمعیت گیاه اسپند نسبت به شاهد شدند. غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت غیرفلزدوست و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت فلزدوست، کمترین مقادیر کاروتنوئید را نسبت به بقیه غلظت­ها نشان دادند. بنابراین غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت غیرفلزدوست نسبت به شاهد به ترتیب 31 و 26 درصد کاهش نشان دادند و  50 میلی­گرم در لیتر سرب جمعیت فلزدوست نسبت به شاهد 27 درصد کاهش نشان داد.

نتایج حاصل از تاثیر غلظت­های مختلف سرب در شکل 5 نشان می­دهد که افزایش معنی­دار مقدار آنتوسیانین­ها در غلظت­های 25 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب نسبت به شاهد در هر دو جمعیت مشاهده می‏شود، اما در غلظت­های 5 و 10 میلی­گرم در لیتر سرب در هر دو جمعیت تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نمی­شود.

شکل 6 نتایج آنالیز واریانس داده­های حاصل از اثر تیمار سرب را بر محتوای قندهای محلول گیاه اسپند نشان می دهد. غلظت‏های مختلف سرب باعث افزایش معنی­دار این قندها در جمعیت فلز دوست گیاه اسپند شدند اما در جمعیت غیر فلز دوست تنها در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب باعث افزایش معنی­دار قندهای محلول نسبت به شاهد شدند، همچنین در بقیه غلظت­ها در جمعیت غیرفلزدوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نشد.

بنابراین بین دو جمعیت در غلظت‏های 5 و 25 میلی­گرم در لیتر تفاوت معنی­داری مشاهده شد، به‏طوری‏که بیشترین مقدار قندهای محلول در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست مشاهده شد، به‏طوری‏که نسبت به کنترل 129 درصد افزایش نشان داد. نتایج نشان داد که غلظت‏های 5، 10 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلزدوست مقادیر کمتری را نشان دادند اما تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد نشان ندادند. 

شکل 3: اثر غلظت­های مختلف سرب بر تغییرات غلظت کلروفیل a، b و کل در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

شکل 4: اثر غلظت­های مختلف سرب بر تغییرات غلظت کاروتنوئید در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

شکل 5: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار آنتوسیانین در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلزدوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است.

شکل 6: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار قندهای محلول در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلزدوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلزدوست یا غیر فلزدوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

نتایج حاصل از تاثیر غلظت­های مختلف سرب در شکل 7 نشان می­دهد که غلظت­های مختلف سرب باعث افزایش معنی­دار قندهای احیا در جمعیت فلزدوست گیاه اسپند می­شوند اما در جمعیت غیر فلز دوست تنها در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب افزایش معنی­دار نسبت به شاهد مشاهده می­شود، در بقیه غلظت­های جمعیت غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نمی­شود. نتایج آنالیز نشان داد که بین دو جمعیت فلز دوست و غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری مشاهده می­شود، به‏طوری‏که بیشترین مقدار قندهای احیاء در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست مشاهده می­شود، به‏طوری‏که نسبت به کنترل 281 درصد افزایش نشان داد. نتایج نشان داد که غلظت­های 5، 10 و 50 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست مقادیر کمتری را نشان دادند اما تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد نشان ندادند. بنابراین در غلظت­های مختلف سرب، جمعیت فلز دوست افزایش معنی­داری در محتوای قندهای احیا نسبت به جمعیت غیر فلز دوست نشان می­دهد.

شکل 7: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار قندهای احیا شده در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.

با توجه به شکل 8 مشخص است که تیمار سرب در تمام غلظت‏‏ها باعث افزایش معنی­دار محتوای آمینواسیدهای آزاد نسبت به گیاهان شاهد در هر دو جمعیت شده است اما در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نشد. همچنین بر طبق آنالیزهای انجام شده بین دو جمعیت تفاوت معنی­داری وجود دارد، به‏طوری‏که بیشترین مقدار آمینواسیدهای آزاد در غلظت 25 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت فلزدوست در مقایسه با سایر غلظت­ها مشاهده شد، به‏طوری‏که نسبت به شاهد 338 درصد افزایش نشان داد. کمترین مقدار آمینو اسیدهای آزاد در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر سرب در جمعیت غیر فلز دوست مشاهده شد اما تفاوت معنی داری نسبت به شاهد مشاهده نشد. بنابراین در غلظت­های مختلف سرب، جمعیت فلزدوست افزایش معنی­داری در محتوای آمینو اسیدهای آزاد نسبت به جمعیت غیر فلز دوست نشان داد.

شکل 8: اثر غلظت­های مختلف سرب بر مقدار آمینو اسیدهای آزاد در دو جمعیت گیاه Peganum harmala (جمعیت فلز دوست کوشک و جمعیت غیر فلز دوست کرمان) بعد از دو هفته تیمار (میانگین 3 تکرار ± خطای استاندارد). حروف غیر مشترک، به‏طور جداگانه در هر سری از جمعیت فلز دوست یا غیر فلز دوست، بیانگر وجود اختلاف معنی­دار بین تیمارها بر اساس آزمون Tukey HSD (05/0p<) است. علامت * نشان دهنده تفاوت معنی­دار بین دو جمعیت است.