نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی واحدعلوم و تحقیقات، فارس، گروه زیست شناسی، فارس، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز، گروه زیست شناسی، شیراز، ایران
3 دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده دامپزشکی، گروه بیوشیمی و سلولی مولکولی، اهواز، ایران
4 دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون، گروه زیست شناسی، کازرون، ایران
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق بررسی آثار جانبی دوز درمانگاهی بوسولفان بر بافت بیضه و اسپرم اپیدیدیمی موش نر بالغ است. مواد و روشها: موشهای نر بالغ نژاد NMRI (25 تا 35 گرم) به دو گروه شانزده تایی تقسیم شدند. کنترل و گروه تیمار با بوسولفان که بهترتیب 100 میکرولیتر DMSO(Dimethyl Sulfoxide) و 2/3 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان بهمدت چهار روز دریافت کردند. حیوانات 35 روز بعد از آغاز درمان کشته شدند. تغییرات بافتی در لوله سمی نیفر، پارامترهای کیفی اسپرم (تعداد و مورفولوژی)، قابلیت حیات و شکست کروموزومی اسپرم بهترتیب بهوسیله میکروسکوپ نوری، CASA (Computer–aided Sperm Analyzer) ، سنجش MTT (3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazolium Bromide) و سنجش تانل بررسی شدند. نتایج: بوسولفان بهطور معنیداری منجر به کاهش پارامترهای اسپرم (تعداد و مورفولوژی طبیعی) و افزایش تخریب دیواره لوله سمی نیفر شد. ناهنجاریهای سر، قطعه میانی و دم در اسپرم گروه درمان در مقایسه باکنترل بهطور معنیداری کاهش یافته بود. از سوی دیگر، سطوح پایینتر MTT در گروه درمان در مقایسه با کنترل معنیدار بود. افزایش تعداد اسپرمهای تانل مثبت در گروه درمان نشان دهنده افزایش شکست کروموزومی بهدنبال درمان با بوسولفان بود. نتیجه گیری: نتایج نشان داد که دوزهای درمانگاهی بوسولفان آثار ژنوتوکسیک، پرآپوپتوتیک و سیتوتوکسیک بر روند اسپرماتوژنز میگذارد. علاوه بر آن، بوسولفان سیتوتوکسیستی را در بافت بیضه افزایش میدهد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of side effects of busulfan on testis tissue and epididymal sperm of adult mice following treatment with clinical dose
نویسندگان [English]
- P N 1
- A V 2
- MR T 3
- S KH 4
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to assess side effects of clinical dose of busulfan on testis and epididymal sperm of adult male mouse. Material and Methods: Male adult NMRI mice (25-35 g) were divided into two groups of sixteen each. Control and busulfan treated group were administered 100 μL DMSO (Dimethyl Sulfoxide) and 3.2 mg/kg busulfan for 4 days, respectively. The animals were sacrificed 35 days after starting treatment. The histological change on germinal epithelium, sperm quality parameters (count and normal morphology), viability and DNA fragmentation on sperm were analyzed by light microscopy, CASA (Computer–aided Sperm Analyzer), MTT (3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazolium Bromide) and TUNEL assays, respectively. Results: Busulfan administration significantly decreased parameters of sperm (count and normal morphology) and increased germinal epithelium destruction. The head, mid piece and tail abnormalities of treated group were increased significantly versus control. The lower levels of MTT in treated group were significant compared with control group. Higher levels of TUNEL positive cells that were found in treated groups demonstrated the increasing of DNA fragmentation in sperms following busulfan treatment. Conclusion: The results showed that clinical dose of busufan induces genotoxic, pre-apoptotic and cytotoxic effects on spermatogenesis. Also, busulfan can increase cytotoxicity on testis tissue of adult male mouse.
کلیدواژه‌ها [English]
- Apoptosis
- Busulfan
- Epididymal sperm
- sperm viability
- Testis
بوسولفان یکی از رایجترین داروهای شیمی درمانی است که قبل از پیوند مغز استخوان در کودکان و بالغین مورد استفاده قرار میگیرد (1 و 2). علاوه بر آن، این دارو در درمان لوسمی میلوژنیک مزمن و سرطان تخمدان نیز بهطور وسیع کاربرد دارد (3 و 4). این در حالی است که بوسولفان به سلولهای سالم فرد تحت شیمی درمانی آسیب میزند. آسیب داروهای شیمی درمانی مانند بوسولفان به DNA سلولها منجر به القای پیری (5) و در شرایطی آپوپتوزیس (6) میگردد. این دارو توانایی القای آپوپتوزیس را در سلولهای زایای بیضه دارد (3 و 4).
پیر شدن سلولی در نتیجه مصرف بوسولفان در سلولهای فیبروبلاست WI39 طی سیگنال خارج سلولی تنظیم کنندهی کیناز (Erk) و آبشارp38 MAPK (p38 Mitogen-activated protein kinase) رخ میدهد. علاوه بر آن، دو مسیر Erk و p38 MAPK از جمله مسیرهای القای آپوپتوزیس میباشند. القای پیری وابسته به بوسولفان در سلولهای WI139 با حذف سریع گلوتاتیون داخل سلولی و افزایش پیوسته در تولید ROS (Reactive Oxygen Species) همراه است، که ناشی از فعالیت مسیر Erk و p38MAPK میباشند (7).
از سوی دیگر، این دارو واجد اثرات جانبی متعددی بر گنادهای هر دو جنس نر و ماده (1 و 8)، اسپرماتوژنز و تولید اسپرم طبیعی (9 و 10) است.در واقع بوسولفان بهدلیل خاصیت آلکیله کنندگی، دارای تاثیر سوء بر DNA سلولهایی است که دارای قدرت تقسیم بیشتری هستند. به همین دلیل یکی از بیشترین اثرات خود را بروی اسپرماتوگونی های بیضه میگذارد. با وجود آن، تمام اسپرماتوگونیها بهدنبال مصرف بوسولفان از بین نمیروند (11).
مطالعات اخیر نیز مؤید القای آزواسپرمی در موش بهدنبال تیمار با بوسولفان است (12). تیمار با تک دوزهای 10، 20 و 40 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان، آپوپتوزیس را در سلولهای زایای نر بهخصوص در اسپرماتوگونیها و اسپرماتوسیتهای اولیه القا میکند (11). از سوی دیگر تزریق منفرد 20 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان منجر به حذف وسیع سلولهای اسپرماتوژنیک در بافت بیضه موش نر و افزایش درصد اسپرمهای واجد مورفولوژی غیر طبیعی میگردد (13). نتایج کاربردی فراوانی از مطالعات آثار جانبی شیمی درمانی بر سیستم تولید مثلی، بهویژه در جنس نر بدست آمده است. اما عمدتا در مطالعات اخیر از دوزهای بالا و سمی بوسولفان استفاده شده است (6، 11 و 13). این در شرایطی است که دوزهای پایین و با سمیت کمتر بوسولفان و سایر داروهای شیمی درمانی طی درمان سرطان مد نظر قرار میگیرند. اما کمبود مطالعه ایی دقیق در تعیین آثار جانبی دوزهای پایین و درمانگاهی بوسولفان در بافت سالم فرد تحت شیمی درمانی و بهویژه در سیستم تولید مثل آشکار است. بنابراین، هدف از این تحقیق، مطالعه آثار سمی دوز درمانگاهی (2/3 میلی گرم بر کیلوگرم) بوسولفان بر بافت بیضه و اسپرم اپیدیدیمی موش بالغ نژاد NMRI بوده است.
مواد و روشها
نگهداری حیوانات: برای انجام این تحقیق، موشهای نر بالغ نژاد NMRI با میانگین وزنی 5±30 گرم (8 هفته ای) از خانه حیوانات دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز خریداری شدند. حیوانات در شرایط استاندارد (دمای 2±21 درجه سانتیگراد، 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) با دسترسی به آب و غذای کافی و براساس راهنمای مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی (National Institutes of Health publication No. 86-23) نگهداری شدند.
تیمار حیوانات: 32 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به دو گروه 16 تایی تقسیم شدند. جهت تیمار موشها، بوسولفان (Sigma, St. Louis, MO) در DMSO(Dimethyl Sulfoxide) 2 درصد و آب مقطر استریل با نسبت 1:1 در دمای اتاق حل گردید. گروه کنترل بهمدت 4 روز بهصورت زیر جلدی 100 میکرولیتر DMSO (Sigma, St. Louis, MO) در روز و گروه تیمار با بوسولفان بهمدت 4 روز 2/3 میلی گرم بر کیلوگرم بوسولفان بهصورت درون صفاقی دریافت کردند.
تشریح حیوانات و استخراج نمونه: حیوانات با استفاده از تزریق داخل صفاقی مادهی بیهوش کنندهی کتامین هیدروکلراید (80 میلیگرم بر کیلوگرم) و گزیلازین (10 میلیگرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند. سپس در شرایط استریل تشریح و پس از باز نمودن ناحیه شکم، بیضه و اپیدیدیم چپ خارج گردید. اپیدیدیم به لولهی اپندورف حاوی 1 میلیلیتر سالین فسفاته PBS (Phosphate Buffer Saline, pH=7.4) منتقل و به قطعات کوچکتر تقسیم شد. لولههای حاوی نمونه برای مدت 30 دقیقه در انکوباتور CO2 دار با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت و سپس قطعات کوچک بافتی خارج شدند. نمونههای اسپرم 2 بار در محلول سالین فسفاته PBS (pH=7.4) شستشو داده و رسوب اسپرمی بهمنظور مطالعه آپوپتوزیس، قابلیت حیات و سنجش پارامترهای اسپرم بهترتیب توسط سنجش تانل(Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)–mediated dUTP-biotin nick end labeling assay: TUNEL assay)، سنجشMTT (3-4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazolium Bromide) و CASA (Computer–Aided Sperm Analysis) بررسی شدند. بیضههای استخراج شده نیز در محلول بوئن جهت مطالعات مورفولوژیکی تثبیت شدند.
مطالعه مورفولوژی دیواره لولههای سمی نیفر بیضه: بیضهها بعد از 48 ساعت تثبیت در بوئن، در پارافین قالب گیری شدند. برشهای 5 میکرومتر تهیه و با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی گردید. سپس نمونهها توسط میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند(Olympus/3H light microscope, Japan).
لولههای سمی نیفر با بررسی 15 میدان در 5 برش بافتی از هر بیضه بهمنظور مطالعه اثر تخریبی بوسولفان مطالعه شد. شدت تخریب لولههای سمینیفر توسط دو فاکتور: حذف دیواره لولههای سمینیفر و حضور اسپرم در لولههای سمینیفر تعیین شد. براین اساس، 4 نوع لوله سمی نیفر در بافت بیضه مشخص شد که شامل: نوع اول) دیواره لولههای سمینیفر طبیعی واجد اسپرم، نوع دوم) حذف دیواره لولههای سمینیفر و وجود اسپرم، نوع سوم) حذف دیواره لولههای سمی نیفر و عدم حضور اسپرم، نوع چهارم) لولههای سمینیفر خالی.
علاوه بر آن، قطر لولههای سمینیفر توسط نرم افزارimage analyzer Leica (DMLB) and Leica Qwin بررسی شد. سپس، قطر و شدت تخریب لولههای سمینیفر بین 2 گروه مورد مقایسه قرار گرفت.
سنجش پارامترهای اسپرم: پارامترهای مختلف شامل تعداد اسپرم، اسپرم با مورفولوژی طبیعی و اسپرم غیر طبیعی با استفاده از برنامه CASA که بروی میکروسکوپ فاز کنتراست (Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) نصب شده بود مطالعه شدند. سپس پارامترهای مختلف بین گروههای کنترل و تیمار با بوسولفان شده مقایسه شد.
بررسی قابلیت حیات اسپرم، سنجش MTT: پودر زرد رنگ MTT (Sigma, USA) با نسبت 5/0 میلیگرم در میلی لیتر در محیط HAM’S F10 و 25mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) حل و pH آن به 4/7 رسید. سپس BSA با غلظت 10 درصد به محلول MTT اضافه و در دمای 4 درجه سانتی گراد و در تاریکی حداکثر برای مدت زمان یک هفته نگهداری شد.
رسوب اسپرم بهمنظور ایجاد غلظت نهایی 5/1 تا 2 میلیون اسپرم در 50 میکرولیتر در PBS (pH 7.4) حل شد. 50 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرمی به 450 میکرولیتر MTT (که قبلا بهمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفته بود) مخلوط شد. سپس نمونهها بهمدت 2 ساعت در انکوباتور CO2 دار با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از گذشت 2 ساعت نمونهها از انکوباتور خارج و 200 میکرولیتر DMSO جایگزین محلول MTT شد. سپس میزان جذب در طول موج تست 570 نانومتر و طول موج رفرنس 670 نانومتر قرائت گردید. جذب نوری نهایی براساس اختلاف جذب بین طول موجهای رفرنس و تست محاسبه شد. نتایج بهصورت درصد در مقایسه با کنترل بیان شد.
ارزیابی شکست کروموزومی، سنجش تانل: قطعه قطعه شدن DNA اسپرم توسط تکنیک تانل بررسی شد. این تکنیک توانایی شناسایی سلولهای آپوپتوتیک را براساس نحوهی قطعه قطعه شدن DNA آنها در سوسپانسیون سلولی و بافتی دارد (14 و 15).
تکنیک تانل با استفاده از کیت سنجش تانل In Situ Cell Death Detection Kit Fluorescein (Roche Diagnostics, Germany) و براساس دستورالعمل آن انجام شد. رسوب اسپرم در PBS (pH 7.4) بهمنظور ایجاد غلظت نهایی 2 تا 3 میلیون سلول در 200 میکرولیتر حل شد. سپس 200 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم در 300 گرم بهمدت 5 دقیقه سانترفیوژ شد. رسوب حاصل در 100 میکرولیتر پارافرم آلدئید 4 درصد )در (PBS برای 1 ساعت در دمای اتاق معلق گردید و مدام نمونه تکان داده شد تا از چسبیدن اسپرمها به هم جلوگیری شود. بعد از پایان تثبیت، نمونه ابتدا 2 بار در 100 میکرولیتر PBS شستشو شدند و سپس جهت افزایش نفوذپذیری در غشای سلولی بهمدت 2 دقیقه بروی یخ در محلول 1/0 درصد تریتون 100x- در 1/0 درصد سدیم قرار گرفتند. محلول 1/0 درصد تریتون 100x- در 1/0 درصد سدیم مورد استفاده برای افزایش نفوذپذیری بهوسیله 1 مرحله سانترفیوژ و 3 بار شستشو در PBS حذف شد. سپس نمونه در 50 مخلوط واکنش ( 45میکرولیتر محلول نشاندار نمودن و 5 میکرولیتر TdT) معلق شد و بهمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در انتها نمونه 2 بار در PBS شستشو داده شد.
50 میکرولیتر از نمونه بروی لام منتقل و 200 اسپرم در 8 تا 10 میدان دید تصادفی در زیر میکروسکوپ فلورسنس (Olympus, BX51, Japan) شمارش شد. سپس تعداد اسپرمهای تانل مثبت در گروههای کنترل و تیمار با بوسولفان مقایسه شدند.
آنالیز آماری
آنالیز آماری دادهها با استفاده از نرم افزار 16.0 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) انجام شد آزمون- تی (T-test) نمونههای مستقل برای مقایسه مقادیر مختلف بین گروه تیمار و کنترل استفاده شد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنیداری 05/0p< بیان شد.
نتایج
مطالعه مورفولوژیک لولههای سمی نیفر
رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین جهت بررسی اثر مخرب بوسولفان بر دیواره لولههای سمی نیفر در گروههای کنترل و تیمار شده مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1). سطح بالایی از تخریب دیواره لولههای سمی نیفر 35 روز بعد از آغاز تیمار با 2/3 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان (بهطور روزانه بهمدت 4 روز) در گروه درمان مشاهده شد. از سوی دیگر، لولههای سمینیفر در حیوانات کنترل طبیعی بودند.
شکل 1: تصاویر میکروسکوپ نوری لولههای سمی نیفر در موشهای تیمار شده و کنترل. A) لولههای سمی نیفر واجد دیوارهی طبیعی و نرمال در گروه کنترل. B) حذف وسیع سلولهای زایا در دیواره لوله سمی نیفر و افزایش فضای لومن در گروه تیمار با بوسولفان. (فلش: حذف سلولهای دیواره لولههای سمی نیفر، ستاره: فضای لومن).
درصد لولههای که تخریب دیواره لولههای سمی نیفر را نشان داده و فاقد اسپرم بودند (لولهی نوع 3) و درصد لولههای خالی از سلول (لولهی نوع 4) در گروه تیمار با بوسولفان بهترتیب حدود 52/2±67/62 و 1 ± 16 درصد بود (شکل 2). درصد تخریب دیواره لولههای سمینیفر و لولههای سمینیفر فاقد سلول زایا در موشهای تیمار شده با بوسولفان اختلاف معنیدار را در مقایسه با گروه کنترل نشان داد (05/0(p<.
قطر لولههای سمینیفر در گروههای کنترل و درمان بهترتیب جدود 8/35 ± 93/831 و 32±87/743 میکرومتر بود (شکل 3). بنابراین، قطر لولههای سمی نیفر در گروه درمان کاهش معنیدار را در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0p<).
شکل 2: درصد تخریب دیواره لولههای سمی نیفر و لولههای سمی نیفر فاقد سلول زایا در موشهای تیمار شده و کنترل. A) درصد حذفدیواره لولههای سمی نیفر در گروه تیمار شده در مقایسه با کنترل نشان دهندهی تغییرات معنیدار بود. B) تعداد لولههای سمی نیفرخالی در گروه تیمار با بوسولفان بسیار زیاد و اختلاف معنیداری با گروه کنترل را نشان داد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنیداری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).
شکل 3: بررسی قطر لولههای سمی نیفر در موشهای تیمار شده و کنترل. قطر لولههای سمی نیفر در گروه تیمار با بوسولفان کاهش معنیداری را در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنیداری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).
بررسی پارامترهای اسپرم
نتایج نشان دهندهی تغییرات در تعداد اسپرم و درصد اسپرم با مورفولوژی طبیعی در گروه تیمار در مقایسه با کنترل بود (جدول 1). تعداد اسپرم (شکل 4) و درصد اسپرم واجد مورفولوژی طبیعی (شکل 5) کاهش معنیداری را در گروه درمان در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0p<).
درصد بالای اسپرم غیرطبیعی در گروه درمان در مقایسه با کنترل مشاهده شد (05/0p<). (شکل A5 و جدول 1). علاوه بر آن، اسپرمهای گروه تیمار شده با بوسولفان افزایش معنیداری را در ناهنجاریهای سر، بخش میانی و دم در مقایسه با کنترل نشان دادند (شکلB 5 و جدول 1).
شکل 4: بررسی تعداد اسپرم (×106 / میلی لیتر) در گروههای تیمارشده و کنترل. کاهش تعداد اسپرم در گروه تیمار با بوسولفان درمقایسه با کنترل معنیدار بود. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).
جدول1: نتایح تعداد اسپرم (×106/میلی لیتر)، مورفولوژی طبیعی و اسپرم با مورفولوزی غیرطبیعی در موشهای تیمار شده و کنترل. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنیداری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).
|
Groups |
Sperm Count (×106/ml) |
Normal Morphology (%) |
Head abnormality (%) |
Neck abnormality (%) |
Tail abnormality (%) |
|
Control |
9.78 ± 1.02 a |
75.3 ± 4.7 a |
8.3 ± 1.3 a |
13.5 ± 2.9 a |
2.7 ± 0.9 a |
|
Busulfan treated group |
3.92 ± 0.66 b |
38.5 ± 3.5 b |
30.8 ± 5.1b |
23.1 ± 6.4 b |
7.6 ± 2.2 b |
ارزیابی شکست کروموزومی بهروش TUNEL
قطعه قطعه شدن DNA اسپرمهای اپیدیدیمی توسط سنجش تانل مطالعه شد (شکل 6). اختلاف معنیدار در درصد اسپرمهای تانل مثبت (TUNEL positive) بین گروههای تیمار شده با بوسولفان و کنترل مشاهده شد (شکل 7). درصد اسپرمهای تانل مثبت در گروههای کنترل و تیمار با بوسولفان بهترتیب 18/2 ± 23/4 و 65/9± 07/40 بود. بنابراین، درصد اسپرمهای تانل مثبت در موشهای گروه درمان افزایش معنیداری را در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0p<).
سنجش حیات اسپرم
اختلاف معنیداری در قابلیت حیات اسپرم بین گروههای درمان با بوسولفان و کنترل مشاهده شد (شکل 8). درصد حیات اسپرم در گروههای کنترل و تیمار شده با بوسولفان بهترتیب 100 و 62/7 ± 26/45 درصد بود.
شکل 5: مورفولوژی اسپرم اپیدیدیمی در موشهای تیمار شده و کنترل. A) کاهش معنیدار در تعداد اسپرم با مورفولوژی طبیعی در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل دیده شد. B) گروه تیمار با بوسولفان تعداد بیشتری اسپرم غیرطبیعی را در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p< بیان شد (آزمون t مستقل).
شکل 6: ارزیابی شکستگی DNA اسپرم توسط تکنیک تانل، A) گروه کنترل نشان دهندهی تعداد محدودی اسپرم تانل مثبت بود. B) گروه تیمار شده با دوز درمانگاهی بوسولفان تعداد بالای اسپرم تانل مثبت را نشان داد. C) نمونه کنترل مثبت که تمامی اسپرمهای موجود در نمونه تانل مثبت بودند (فلشها نشان دهندهی اسپرمهای تانل مثبت است. بزرگنمایی x400).
شکل 7: اختلاف در درصد اسپرمهای تانل مثبت در گروههای تیمار شده و کنترل. درصد اسپرمهای تانل مثبت در گروه دریافت کننده بوسولفان در مقایسه با کنترل کاهش معنیداری را نشان داد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنیداری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).
شکل 8: بررسی حیات اسپرم توسط سنجش MTT در موشهای تیمار شده و کنترل. حیات اسپرم کاهش معنیداری را در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل نشان داد. نتایج بهصورت mean ± SD با درجه معنی داری 05/0p< بیان شد (آزمون tمستقل).
بحث
بوسولفان داروی شیمی درمانی است که در کودکان و بالغین بهصورت ترکیب با سیکلوفسفامید و کلوفارابین قبل از پیوند مغز استخوان درسرطان خون کاربرد رایجی دارد (16). بوسولفان در تک دوزهای بیش از 10 میلیگرم بر کیلوگرم اثرات جانبی متعددی بر گنادهای هر دو جنس نر و ماده (1 و 2)، اسپرماتوژنز و تولید اسپرم طبیعی (9 و 10) میگذارد.براساس بررسیهای انجام شده بوسولفان واجد اثرات مضر بر باروری موش بوده (17 و 18) و منجر به آزواسپرمی میشود (10).
سنجش پارامتـرهای کیفی اسپـرم شامل مورفولوژی و تعداد در
موشهای تیمار شده با دوز درمانگاهی 2/3 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان بهمدت چهار روز نشان دهندهی درصد بالایی از آسیب و ناهنجاری اسپرمی در این گروه در مقایسه با کنترل بود. کاهش معنیدار در تعداد اسپرمهای واجد مورفولوژی طبیعی و افزایش ناهنجاریهای سر، قطعه میانی و دم در گروه تیمار شده با بوسولفان در مقایسه با کنترل بیانگر سمیت بالای این دارو بر روند اسپرماتوژنز طبیعی حتی در دوزهای کم و درمانگاهی میباشد.
تحقیقات اخیر نشان داد که تیمار موش با تک دوزهای بالای 20، 30 و 40 میلیگرم بر کیلوگرم منجر به ایجاد حفراتی در ضخامت لولههای سمینیفر اپیدیدیم و کاهش ارتفاع سلولهای دیواره کسیههای منی ساز (10)، دژنراسیون لولههای سمینیفر، لولههای طبیعی فاقد اسپرماوتوزوآ، کاهش تعداد اسپرمها و کاهش ضخامت کپسول در بیضه میشود (1).
از سوی دیگر نتایج ارزیابی مورفولوژیک بافت بیضه در تحقیق حاضر موید تحقیقات اخیر بود و نشان داد که 4 روز تیمار با دوز درمانگاهی روزانه 2/3 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان (گروه تیمار با بوسولفان) منجر به افزایش تخریب بافت بیضه در موشهای بالغ نژاد NMRI شد. کاهش قطر لولههای سمینیفر و حذف وسیع سلولهای زایای دیواره لوله سمینیفر در گروه درمان با بوسولفان در مقایسه با موشهای کنترل معنیدار بود. بنابراین مصرف 4 دوز پایین از بوسولفان بهصورت روزانه میتواند مانند دوزهای بالای این دارو (1، 10 و 19) تخریب بافتی وسیع را در بافت بیضه القا کند.ًًًًًًًًً حذف شدید دیواره لولههای سمینیفر (نوع دوم و سوم) و لولههای سمینیفر خالی از سلول (نوع چهارم) بیانگر سمیت بالای سلولی و بافتی شیمی درمانی با دوز پایین است.
داروهای شیمی درمانی می توانند آپوپتوزیس را در سلولهای زایای بافت بیضه القا کنند (3 و 4). تزریق تک دوز 10، 20 و 40 میلیگرم بر کیلوگرم بوسولفان سبب آپوپتوزیس در سلولهای زایای نر بهخصوص در اسپرماتوگونیا و اسپرماتوسیتهای اولیه شده است (11) و میتواند اشکال فراساختاری آپوپتوزیس را در سیستم تولید مثلی نر القا کند .تغییراتی مانند چروکیدگی هسته سلولهای زایا بهخصوص اسپرماتوگونیها، جدا شدن سلولهای زایا، حضور فضاهای بزرگ بین سلولهای مجاور، چروکیدگی سلولی، حضور واکوئل در سلولهای زایا و اجسام آپوپتوتیک در سلولهای سرتولی غالبا چندین روز بعد از تزریق تک دوز سمی بوسولفان مشاهده میشود (6).
نتایج ارزیابی شکستگی کروموزومی اسپرم در مطالعه حاضر، سطوح بالا و معنیدار از آسیب DNA و آپوپتوزیس را در اسپرم اپیدیدیمی موشهای تیمار شده با بوسولفان در مقایسه با کنترل نشان داد. درصد بالای اسپرمهای تانل مثبت و مرگ سلولی آپوپتوزیس در اسپرمهای اپیدیدیمی موشهای گروه درمان تاییدی بر نتایج مطالعات اخیر بوده (6) و بیانگر نقش ژنوتوکسیک و پرآپوپتوتیک دوزهای پایین بوسولفان بر سلولهای سالم بیماران تحت شیمی درمانی است.
کاهش معنیدار در قابلیت حیات اسپرم در گروه تیمار با بوسولفان در مقایسه با کنترل میتواند ناشی از اسپرماتوژنز ناموفق باشد. نتایج سنجش MTT نشاندهندهی سمیت سلولی بالای شیمی درمانی با دوزهای درمانگاهی طی اسپرماتوژنز در موش است.
بنابراین، جتی دوزهای پایین داروهای آلکیله کننده مورد استفاده در درمان سرطان واجد نتایج ناخواسته ایی در بافتهای سالم بیماران و بهخصوص در سلول های جنسی بوده و منجر به تغییرات در مورفولوژی طبیعی بافت بیضه، پارامترهای منی و آسیب DNA سلولهای جنسی میشوند. عوارض مخرب داروهای مختلف ضد سرطان بهعنوان اثر جانبی درمان سرطان در سلولهای سوماتیک و جنسی قابل توجه هستند.
نتیجه گیری
نتایج ما بیانگر آثار سوء و سمیت بالای دوز پایین و درمانگاهی داروی شیمی درمانی بوسولفان در سیستم تولید مثلی نر میباشد. این مطالعه نشان داد که سمیت بالای سلولی و بافتی حتی طی شیمی درمانی با دوزهای پایین و درمانگاهی در موش مشاهده میشود. این امر موید آثار وسیع سیتوتوکسیک، ژنوتوکسیک و پرآپوپتوتیک بوسولفان در سلولهای سالم فرد تحت شیمی درمانی بوده و لزوم کاربرد درمانهای محافظتی مکمل را طی شیمی درمانی در فرد بیمار نشان میدهد.
تشکر و قدردانی
بر خود لازم میدانیم که از زحمات خانم سمیه بهرام زاده و آقای محسن صارمی در انجام موفق این تحقیق کمال سپاس و تشکر را داشته باشیم.
- Anjamrooz SH, Movahedin M, Mowla SJ, Bairanvand SP. Assessment of morphological and functional changes in the mouse testis and epididymal sperms following busulfan treatment. Iran Biomed J. 2007; 11: 15-22.
- Temitope AA, Tolulope OA, Funlola CT, Khaleed TB, et al. Protective Effect of Tahitian Noni Juice on the Reproductive Functions of Male Wistar Rats Traeted with Cyclophosphamide. Iran J Pharmacol Ther. 2011; 10(1): 39-43.
3. Nieto Y, Thall P, Valdez B, Andersson B, et al. High-Dose Infusional Gemcitabine Combined with Busulfan and Melphalan with Autologous Stem-Cell Transplant in Patients with Refractory Lymphoid Malignancies. Biol Blood Marrow Transplant. 2012; 18(11): 1677–1686.
4. Choi YJ, Ok DW, Kwon DN, Chung JI, et al. Murine male germ cell apoptosis induced by busulfan treatment correlates with loss of c-kit-expression in a Fas/FasL- and p53-independent manner. FEBS Letters. 2004; 575(1-3): 41-51.
5. Probin V, Wang Y, Zhou D. Busulfan – induced upsenescence is dependent upon ROS production upstream of the MAPK pathway. Free Radic Biol Med. 2007; 42(12):1858–1865.
6. Mohammad Ghasemi F, Bahadori MH, Faghani M, Nasiri E, et al. Buserelin Inhibits Apoptosis in Male Germ Cells Induced by Busulfan in Mouse Testis. J of Iran Anat Sci. 2009; 7: 45-54.
7. Probin V, Wang Y, Bai A, Zhou D. busulfan selectively induces cellular senescence but not apoptosis in WI38 fibroblasts via a P53-independent but ERK-P38 MAPK-dependent mechanism. JPET. 2006; 319(2): 551-60.
8. Vahdati A, Fathi AR, Nasimi P, Saki GH. Busulfan induces apoptotic and cytotoxic effects on testis and epididymal sperm of adult male mouse following low dose treatment. IJB. 2015; 6(5):70-78.
9. Khaki A, Fathiazad F, Nouri M, Khaki AA, et al. The effects of Ginger on spermatogenesis and sperm parameters of rat. Iran J Reprod Med. 2009; 7(1): 7-12.
10. Mohamad-Ghasemi F, Faghani M, Fallahkarkan M. The protective effect of melatonin on sperm parameters, epididymis and seminal vesicle morphology in adult mouse treated with busulfan. J Iran Anat Sci. 2010; 8: 25-36.
11. Mohammadghasemi F, Soleimanirad J, Ghanbari AA. An Ultrastructural Study on the Apoptotic Features of Spermatogenic Cells following Busulfan Treatment in Adult Mice. J Reprod Infertil. 2008; 8(4): 319-329.
12. Azizollahi S, Aflatoonian R, Sedigi-Gilani MA, Asghari Jafarabadi M, et al. Recruiting Testicular Torsion Introduces an Azoospermic Mouse Model for Spermatogonial Stem Cell Transplantation. Urol J. 2014; 11(3); 1648-1655.
13. Kawashima A, Osman BAH, Takashima M, Kikuchi A, Kohchi S, Satoh E, Tamba M, Matsuda M, Okamura N. CABS1 is a Novel Calcium-Binding Protein Specifically Expressed in Elongate Spermatids of Mice. Biology of reproduction. 2009; 80: 1293-1304.
14. Momeni HR, Nasimi P. Caspase-dependent apoptosis in motor neurons of adult mouse spinal cord slices. Iran J Sci Technol. 2014; 38A1: 55-60.
15. Nasimi, P, Roohi, S. Cell death in animals and plants; Apoptosis, Necrosis & Autophagy. 1th Ed. Islamic Azad University of Masjed Soleyman press; 2012.
16. Andersson BS, Valdez BC, Lima MD, Wang X. Clofarabine ± Fludarabine with Once Daily IV Busulfan as Pretransplant Conditioning Therapy for Advanced Myeloid Leukemia and MDS. Biol Blood Marrow Transplant. 2011; 17(6): 893–900.
17. Wenzhi M, Lei A, Wu Z, Wang X, et al. Efficient and Safe Recipient Preparation for Transplantation of Mouse Spermatogonial Stem Cells: Pretreating Testes with Heat Shock1. Biol Rep. 2011; 85: 670-677.
18. Olooto WE. Infertility in male; risk factors, causes and management- A review. JMicrobiol. Biotech. Res. 2012; 2(4): 641-645.
19. Stellflug JN, Green JS, Leathers CW. Ant fertility effect of busulfan and procarbazine in male and female coyotes. Biol of Rep. 1983; 33: 1237-1243.
)