نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه، مقایسه پارامترهای اسپرمی(غلظت، تحرک و مورفولوژی)، آسیب DNA، درصد و شدت ROS (Reactive Oxygen Species) و همچنین ارتباط بین این پارامترها، در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل میباشد.
مواد و روشها: این مطالعه بر روی نمونه مایع منی 83 فرد مبتلا به واریکوسل و 32 فرد بارور میباشد. پارامترهای اسپرمی بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (WHO: World Health Organization)، درصد کمبود پروتامین (رنگ آمیزی کرومایسین A3)، آسیب DNA اسپرم (روش TUNEL)، درصد و شدت ROS (رنگآمیزی H2DCFDA) در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: نتایج این مطالعه نشان میدهد که غلظت، درصد تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم در افراد مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری کمتر است. علاوه بر این، درصد آسیبDNA ، کمبود پروتامین و درصد اسپرم های ROS مثبت بهطور معنیداری در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل بالاتر میباشد.
نتیجه‌گیری: افزایش استرس اکسیداتیو و دمای بیضه در افراد مبتلا به واریکوسل علاوه بر کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی، بر سلامت کروماتین اسپرم نیز تاثیر منفی داشته و در نتیجه، روند اسپرماتوژنز و میزان باروری را تحت تاثیر قرار میدهد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Comparison of sperm parameters and its functional characteristics between fertile and infertile men with varicocele
نویسندگان [English]
- F B
- M T
- L A
- MH N
چکیده [English]
Aim: The aim of this study is to compare sperm parameters (concentration, motility and morphology), DNA damage, percentage and intensity of ROS (Reactive Oxygen Species) and relationship between these parameters in the fertile and infertile men with varicocele.
Material and Methods: In this study, the semen samples from 83 individuals with varicocele and 32 fertile men were studied. Sperm parameters according WHO (World Health Organization) guidelines, protamine deficiency (chromomycin A3 staining), sperm DNA damage (TUNEL assay), percentage and intensity of ROS (DCFH-DA staining) were assessed in fertile and infertile men with varicocele.
Results: The results of this study showed that sperm concentration, percentage of motility and normal morphology were significantly lower in individuals with varicocele compared to fertile individuals. In addition, percentage of sperm DNA damage, protamine deficiency and ROS positive were significantly higher in infertile men with varicocele.
Conclusion: The increase of stress oxidative and testicular temperature in infertile men with varicocele, lead to decrease the quality of sperm parameters as well as negative effects on sperm chromatin integrity. Therefore the process of spermatogenesis and the rate of fertility were affected in these individuals.
کلیدواژه‌ها [English]
- Varicocele
- DNA fragmentation
- Sperm parameters
- Stress oxidative
دستگاه تناسلی در مردان مسئول تولید، بلوغ و انتقال اسپرم است که هر گونه ناهنجاری ساختاری و مولکولی در این سیستم موجب ناباروری میشود (1). یکی از رایجترین ناهنجاریهای ساختاری دستگاه تناسلی که میتواند در روند اسپرماتوژنز اختلال ایجاد کند، اتساع و پیچش غیرطبیعی وریدهای طناب اسپرماتیک بیضه است که واریکوسل نامیده میشود (2). مکانیسمهای پاتولوژیکی پیشنهادی برای افراد مبتلا به واریکوسل شامل هیپوکسی بیضه، اتساع وریدها، افزایش دمای بیضه، افزایش استرس اکسیداتیو و غیره میباشد. طبق مطالعات گذشته روند اسپرماتوژنز به افزایش دمای بیضه حساس میباشد. با توجه به اینکه در افراد مبتلا به واریکوسل افزایش دما به میزان 6/2 درجه سانتیگراد گزارش شده است، لذا این افزایش دما بر روی تکوین اسپرم تاثیر گذاشته و میتواند منجر به تولید اسپرمهای نابالغ و احتمالا با آسیب ساختار کروماتین شود (3). یکی از رویدادهای مهم در روند اسپرماتوژنز جایگزینی هیستون با پروتامین است که نقش مهمی در بستهبندی کروماتین اسپرم ایفا میکند (4). همچنین یکی از دلایل آسیب DNA اسپرم، ناشی از نقص در بستهبندی کروماتین است که میتواند منجر به آپوپتوزیس ناقص و تولید بیش از حد استرس اکسیداتیو شود (5).
گونههای فعال اکسیژن (ROS: Reactive Oxygen Species)، از مولکولهای اکسیژن مشتق شدهاند که در صورت فعالیت بیش از حد، جزء اکسیدانتهای مضر در نظر گرفته میشوند و شامل آنیون سوپراکسید (°O2)، پرکسیدهیدروژن(H2O2)، رادیکال پرکسیل (°ROO)، یون هیپوکلریت (°ClO) و رادیکال بسیار فعال هیدروکسیل (°OH) میباشند (6).
در شرایط فیزیولوژیک، مقادیر کمی از استرس اکسیداتیو توسط اسپرم تولید میشود که برای ظرفیتیابی، واکنش آکروزومی و نهایتا لقاح لازم است. اما تولید بیش از حد استرس اکسیداتیو توسط اسپرم و سایر سلولها مانند لوکوسیتها میتواند منجر به آسیب DNA، کاهش تحرک و اختلال در سلامت غشای اسپرم شود (7 و 8). لکوسیتها بهطور طبیعی در پروستات و سمینال وزیکول وجود دارند و مسئول بخشی از استرس اکسیداتیو ایجاد شده در انزال میباشد. همچنین در افراد مبتلا به واریکوسل، افزایش سلولهای التهابی موجود در بیضه مانند سلولهای ماستسل، بهعنوان منبع مهم دیگر ایجادکننده استرس اکسیداتیو در این افراد است (9).
مطالعات نشان میدهد که اسپرم افراد مبتلا به واریکوسل بهدلیل کمبود آنزیمهای آنتیاکسیدانتی در سیتوپلاسم و همچنین وجود اسیدهای چرب غیر اشباع در غشای پلاسمایی در برابر شوکهای اکسیداتیو بسیار آسیبپذیر است. بنابراین استرس اکسیداتیو و آسیب DNA ناشی از استرس، از عوامل عمده کاهش کیفیت مایع منی در این افراد است، که در نهایت میتواند موفقیت در باروری را تحت تاثیر قرار دهد (10 و 11). همچنین علاوه بر کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی، افزایش خطر نقصهای ژنتیکی در نسلهای بعد را بههمراه دارد (12). بیشتر مطالعات در افراد مبتلا به واریکوسل، کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی و افزایش آسیب DNA را نشان میدهند. بنابراین، روش های مختلفی جهت درمان واریکوسل استفاده می شود، که در برخی موارد، واریکوسل را به هدف جلوگیری از پیشروی آن درمان میکنند ولی در بیشتر موارد، هدف از درمان واریکوسل افزایش میزان باروری از طریق بهبود عملکرد بیضه و پارامترهای مایعمنی می باشد، بهطوریکه در برخی از مطالعات پس از درمان از طریق عمل جراحی، بهبودی در پارامترهای اسپرمی، کاهش در آسیب DNA و بهدنبال آن ایجاد حاملگی در همسران این افراد مشاهده میشود (13 و 14).
با وجود نظریههای متعددی که مکانیسم پاتوژنز واریکوسل بر عملکرد بیضه را بیان میکند، اما هیچ یک نمیتواند بهطور قطعی و واضح، اثر واریکوسل را بر روند اسپرماتوژنز و باروری مردان بیان کند (15).
هدف از این مطالعه، مقایسه پارامترهای اسپرمی(غلظت، تحرک و مورفولوژی)، سلامت DNA و سطح استرس اکسیداتیو بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل میباشد. همچنین ارتباط بین پارامترهای اسپرمی با درصد آسیبDNA، کمبود پروتامین، درصد و شدت ROS در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد بررسی قرار میگیرد.
مواد و روشها
انتخاب بیماران: این مطالعه در کمیته اخلاق برای تحقیقات انسانی، در پژوهشکده رویان و مرکز باروری و ناباروری اصفهان به تصویب رسیده است. افراد شرکت کننده در این مطالعه به دو گروه تقسیم شدند، که گروه اول شامل 88 مرد نابارور مبتلا به واریکوسل میباشند. معیارهای ورود این افراد به مطالعه، شامل اندازه بیضه طبیعی و واریکوسل بالینی درجه II (در این حالت اتساع وریدهای بیضه قابل لمس است) و درجه III (در این حالت اتساع وریدهای بیضه قابل رؤیت است) میباشد. افراد آزواسپرمی، لوکوسیتواسپرمی، دارای سابقه عفونت ادراری، سندرم کلاینفلتر و ناباروری با فاکتور زنانه از مطالعه حذف شدند. گروه دوم شامل 32 فرد بارور (افراد کاندید اهدای جنین یا تعیین جنسیت) میباشند که بهعنوان گروه کنترل در نظر گرفته میشوند. از افراد شرکت کننده در این مطالعه رضایت نامه کتبی گرفته شد و یک پرسشنامه حاوی اطلاعات شخصی، نوع ناباروری و مدت زمان ناباروری تکمیل گردید.
جمعآوری مایع منی: نمونه مایع منی افراد، بعد از 3 تا 4 روز پرهیز از مقاربت جمعآوری شد. نمونه مایع منی افراد از لحاظ پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک، مورفولوژی) بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (2010WHO: World Health Organization)، کمبود پروتامین (رنگ آمیزی کرومایسین A3)، آسیب DNA (روش TUNEL) و سطح استرس اکسیداتیو (رنگH2DCFDA) مورد بررسی قرار گرفت.
ارزیابی پارامترهای اسپرم: غلظت نمونه اسپرمی با استفاده از دستگاه شمارش اسپرم (Makler Counting Chumber) بر حسب میلیون بر لیتر و میزان تحرک اسپرم بهوسیله نرم افزار CASA (Computer Aided Sperm Analysis)، بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (16) مورد ارزیابی قرار گرفت. مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگآمیزی دیفکوئیک (Diff Quik) بررسی شد، که بهصورت خلاصه به این ترتیب میباشد:
حدود 20 تا 30 میکرولیتر از نمونه رقیق شده را بر روی لام قرار داده و پس از تهیه اسمیر و خشک شدن در دمای اتاق، در سه محلول متانول (جهت تثبیت بر روی لام)، ائوزین (جهت رنگآمیزی سیتوپلاسم) و Thiazine-like (جهت رنگآمیزی DNA) بهترتیب بهمدت 30 ثانیه قرار میگیرد. پس از خشک شدن در دمای اتاق، در هر لام حدود 200 اسپرم با استفاده از میکروسکوپ نوری و نرم افزار CASA از لحاظ مورفولوژی بررسی میشود.
ارزیابی آسیب DNAبا استفاده از روش TUNEL: میزان آسیبDNA با استفاده از روش TUNEL (Apoptosis Detection System Fluorescein, Promega, Mannheim, Germany) که توسط خیرالهی و همکاران (17) قبلا توضیح داده شده، بررسی شد که به شرح زیر میباشد.
ابتدا مایعمنی را توسط محلول بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate Buffer Saline) شستشو داده و با تهیه اسمیر بر روی لام، طبق دستورالعمل کیت TUNEL رنگآمیزی شد. بر اساس این روش رنگ فلئورسنت توسط آنزیم rTdTبه انتهای 3DNA-OH (قطعات شکسته DNA) اتصال مییابد وfluorescein-12-dUTP ، DNA را نشاندار میکند. بررسی رنگ سبز فلئورسنت مشاهده شده بهوسیله میکروسکپ فلئورسانس با بزرگنمایی 100(BX51; Olympus; Japan) در ناحیه خلفی سر اسپرم، بیانگرTUNEL مثبت (اسپرمهای دارای آسیبDNA) میباشد و رنگ قرمز نشان دهنده اسپرمهای TUNEL منفی (اسپرمهای با DNAسالم) میباشد که بهصورت درصد گزارش میشود. برای هر نمونه در حدود 500 اسپرم بررسی میشود.
کمبود پروتامین با استفاده از رنگآمیزی کرومایسین A3(CMA3): درصد کمبود پروتامین اسپرم توسط رنگآمیزی CMA3 که قبلا توسط نصر و همکاران (18) بیان شده، مورد بررسی قرار گرفت که بهشرح زیر می باشد. نمونه مایعمنی را در محلول کارنوی (متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 3:1) بهمدت 5 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد فیکس کرده و از آن اسمیر تهیه میشود. هر اسلاید توسط 100 میکرو لیتر محلول کرومایسین A3(CMA3,Sigma, USA)، (25/0 میلیگرم در میلی لیتر بافر مکالوین (Mcllvain Buffer)که حاوی 10 میلیمولار کلرید منیزیم با 7pH=) بهمدت 20 دقیقه رنگآمیزی شده و برای حذف باقیماندهی رنگ اضافی، لامها را در محلول بافر فسفات سالین(PBS) شسته و توسط میکروسکوپ فلئورسانس با بزرگنمایی ×100 بررسی میشود. برای هر نمونه در حدود 500 اسپرم بررسی میشود. سر اسپرمهایی که دارای کمبود پروتامین بوده، زرد درخشان(CMA3مثبت) که بهصورت درصد اسپرمهای CMA3+ گزارش میشود و آنهایی که دارای پروتامین طبیعی بوده، رنگ زرد کم رنگ (CMA3 منفی) میباشد و بهصورت درصد اسپرمهای CMA3- گزارش میشود.
ارزیابی سطح استرس اکسیداتیو: در این مطالعه ارزیابی اسپرم های ROS مثبت با استفاده از رنگ H2DCFDA (DCFH-DA: 2’, 7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetat, Sigma Co, USA) و آنالیز با دستگاه فلوسایتومتری انجام شد که این نشانگر، حساسیت بالایی نسبت به H2O2 دارد. همانطور که قبلا در مطالعه کیانی و همکاران (19) توضیح داده شده است، رنگ DCFH-DA بهطور فعال به سلول وارد شده و با عمل استراز سلولی، گروههای دیاستات از هم شکافته شده و ترکیب غیر فلوئورسنتی DCFH تشکیل میشود. در حضور پراکسید هیدروژن،DCFH به DCF اکسید میشود و رنگ فلوئورسنت سبز از خود ساطع میکند. این ترکیب قادر به خروج از سلول نیست و با دستگاه فلوسایتومتری قابل ارزیابی است.
آنالیز آماری
آنالیز آماری بهوسیله نرم افزار 18SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA) با استفاده از آنالیز Descriptive، Correlation Coefficient، Independent- Sample T Testمورد ارزیابی قرار گرفت. 05/0 pvalues<از لحاظ آماری معنیدار در نظر گرفته میشود.
نتایج
جمعیت مورد بررسی در این مطالعه شامل 83 فرد مبتلا به واریکوسل با درجه II و III و 32 فرد بارور میباشد. جدول 1 اطلاعات مربوط به پارامترهای توصیفی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور را نشان میدهد. در این مطالعه، میانگین سن افراد مبتلا به واریکوسل 5/0±7/30، میانگین سن افراد بارور 08/1±6/36 و میانگین سن همسران آنها بهترتیب 5/0±7/26 و 8/0±2/32 سال میباشد. همچنین میانگین مدت زمان ناباروری افراد مبتلا به واریکوسل 1/0±1/2 سال است (جدول1).
جدول 1: پارامترهای توصیفی در افراد نابارور واریکوسل و بارور
|
پارامترها |
گروه |
حداقل |
حداکثر |
میانگین ± خطای استاندارد |
|
غلظت اسپرم(106میلیون / میلیلیتر) |
واریکوسل |
2/0 |
127 |
1/27 ± 8/2 |
|
بارور |
25 |
200 |
3/77 ± 2/6 |
|
|
درصد تحرک اسپرم |
واریکوسل |
00 |
6/84 |
9/39 ± 4/2 |
|
بارور |
9/23 |
4/94 |
5/66 ± 9/2 |
|
|
درصد مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم |
واریکوسل |
98 |
100 |
2/99 ± 07/0 |
|
بارور |
71 |
97 |
5/88 ± 9/0 |
|
|
حجم ( میلی لیتر) |
واریکوسل |
5/0 |
7/9 |
4/3 ± 19/0 |
|
بارور |
5/1 |
6/8 |
7/3 ± 28/0 |
|
|
سن مرد (سال) |
واریکوسل |
22 |
46 |
7/30 ± 5/0 |
|
بارور |
28 |
55 |
6/36 ± 08/1 |
|
|
سن خانم (سال) |
واریکوسل |
17 |
40 |
7/26 ± 5/0 |
|
بارور |
26 |
45 |
2/32 ± 8/0 |
|
|
مدت ازدواج (سال |
واریکوسل |
2 |
17 |
8/3 ± 3/0 |
|
بارور |
2 |
21 |
4/11 ± 9/0 |
|
|
مدت ناباروری (سال) |
واریکوسل |
08/0 |
17 |
1/2 ± 1/0 |
مقایسه پارامترهای اسپرمی در افراد بارور و نابارور واریکوسل
نمودار 1 میانگین پارامترهای اسپرمی شامل غلظت، درصد تحرک و درصد مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم را در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل نشان میدهد. غلظت اسپرم در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (8/2±1/27) بهطور معنیداری کمتر از افراد بارور (2/6±3/77) میباشد (001/0p<). همچنین درصد تحرک اسپرم در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (4/2±9/39) بهطور معنیداری کمتر از افراد بارور (9/2±5/66) است (001/0p<). بهعلاوه درصد مورفولوژی غیرطبیعی در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (07/0±2/99) بهطور معنیداری بیشتر از افراد بارور (9/0±5/88) میباشد (001/0p<).
نمودار 1: مقایسه پارامترهای اسپرم بین افراد بارور و نابارور واریکوسل (میانگین ± انحراف معیار، 05/0p<*)
نمودار2: مقایسه شدت و درصد ROS، درصد اسپرم های CMA3 مثبت و TUNL مثبت بین افراد بارور و نابارور واریکوسل (میانگین ± انحراف معیار، 05/0p<*)
مقایسه آسیب DNA، کمبود پروتامین و استرس اکسیداتیو اسپرم بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل
درصد آسیب DNAاسپرم با استفاده روش TUNEL ارزیابی شد. درصد اسپرمهای دارای آسیب DNA (TUNEL مثبت) در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور بهترتیب 9/0±2/16 و 7/0±1/8 است. بنابراین درصد آسیب DNAدر افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری (001/0p<) بیشتر میباشد. نتایج بررسی کمبود پروتامین با استفاده از رنگآمیزی CMA3 نشان میدهد که درصد اسپرم های CMA3 مثبت در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور بهترتیب 6/1±07/46 و 9/1±1/28 میباشد که این پارامتر نیز در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری (001/0p<) بالاتر است.
سطح استرس اکسیداتیو با رنگآمیزی DCF و با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری ارزیابی شده است. درصد اسپرمهای ROS مثبت در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور بهترتیب 6/3±7/38 و 6/3±7/21 بود که در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری بالاتر بوده (001/0p<)، اما شدت ROS در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (9/1±04/35) در مقایسه با افراد بارور (05/7±92/80) بهطور معنیداری (001/0p<) پایینتر است (نمودار 2).
ارتباط پارامترهای اسپرمی با درصد آسیبDNA، کمبود پروتامین، درصد و شدت استرس اکسیداتیو
ارتباط بین پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک، مورفولوژی غیرطبیعی) با درصد آسیبDNA ، کمبود پروتامین، درصد و شدت استرس اکسیداتیو در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج ارائه شده در جدول 2 نشان میدهد که در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، بین غلظت اسپرم با درصد و شدت ROS ارتباط مثبت و معنیداری وجود دارد (05/0(p
جدول 3 ارتباط بین میزان آسیبDNA (درصد اسپرمهای TUNEL مثبت)، کمبود پروتامین (درصد اسپرمهای CMA3 مثبت)، درصد و شدتROS را با یکدیگر نشان میدهد. در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، رابطه مثبت و معنیداری بین درصد اسپرمهای ROSمثبت و شدت ROS(01/0>p) وجود دارد. همچنین در این افراد، رابطه معنیدار و منفی بین درصد آسیب DNA و درصد ROS مثبت (05/0>p) وجود دارد. بهعلاوه ارتباط معنیدار و مثبت بین درصد کمبود پروتامین و شدت ROS در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل مشاهده شد (05/0>p)(جدول3).
جدول 2: ارتباط بین پارامترهای اسپرمی با درصد و شدت ROS،درصد اسپرمهای TUNEL مثبت و CMA3 مثبت اسپرم در افراد بارور و نابارور واریکوسل.
|
پارامترها |
گروه |
غلظت (106میلیون در هر میلیلیتر) |
درصد تحرک اسپرم |
درصد مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم |
|
مثبت ROS درصد اسپرم های |
واریکوسل |
** 4/0 |
** 3/0 |
03/0 - |
|
بارور |
03/0 |
1/0 |
05/0 - |
|
|
ROS شدت |
واریکوسل |
* 2/0 |
02/0 |
01/0 |
|
بارور |
07/0 |
3/0 - |
06/0 - |
|
|
مثبتTUNEL درصد اسپرم |
واریکوسل |
09/0 - |
* 2/0 - |
1/0 |
|
بارور |
2/0 - |
2/0 - |
3/0 |
|
|
مثبت CMA3 درصد اسپرم |
واریکوسل |
1/0 - |
1/0- |
06/0 |
|
بارور |
* 4/0 - |
* 4/0 - |
2/0 |
**05/0p< معنیدار در نظر گرفته میشود. * 01/0 p<معنیدار در نظر گرفته میشود.
جدول 3: ارتباطبیندرصد اسپرمهای TUNEL مثبت، CMA3مثبت، درصد و شدت ROSبایکدیگر در افراد نابارور واریکوسل و بارور.
|
پارامترها |
گروه |
ROS شدت |
درصد اسپرمهای مثبت TUNEL اسپرم |
درصد اسپرمهایمثبت CMA3 |
|
مثبت ROS درصد اسپرم های |
واریکوسل |
* 2/0 |
** 3/0- |
07/0 |
|
بارور |
3/0 - |
03/0 |
1/0 |
|
|
ROS شدت |
واریکوسل |
-------- |
2/0 |
** 4/0 |
|
بارور |
-------- |
04/0- |
1/0 |
|
|
مثبت CMA3 درصد اسپرم |
واریکوسل |
2/0 |
-------- |
2/0 |
|
بارور |
04/0- |
-------- |
2/0 |
** 05/0p< معنیداردر نظر گرفته میشود. * 01/0p< معنیدار در نظرگرفته میشود.
بحث
واریکوسل به اتساع وریدهای شبکه پامپینی فرم طناب اسپرماتیک اطلاق میشود (3). در دهههای گذشته تا حدودی ارتباط بین ناباروری و واریکوسل مشخص شده، اما تحقیقات اخیر، بیشتر بر اساس مطالعات مولکولی و ژنتیکی میباشد، به این امید که با بررسیهای بیشتر در این زمینه افقهای جدیدی برای درمان ناباروری در مردان مبتلا به واریکوسل، باز شود. مهمترین نظریه در مورد تاثیر واریکوسل بر روی عملکرد بیضه، تغییر در کارایی تبادل دما در داخل بیضه و اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز میباشد (3 و 11). یکی از عوامل اختلال در عملکرد اسپرم در افراد مبتلا به واریکوسل، استرس اکسیداتیو ناشی از استرس دمایی در این افراد است (20). تولید بیش از حد ROS باعث آسیب به غشای اسپرم، کاهش تحرک و توانایی اسپرم در اتصال به تخمک شده و همچنین آسیب مستقیم به DNA اسپرم و اثرات غیرمستقیم بر سلامت ژنوم جنین و در نهایت کاهش باروری را به همراه دارد (20 و 21).
نتایج این مطالعه نشان میدهد که در افراد مبتلا به واریکوسل غلظت، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم بهطور معنیداری نسبت به افراد بارور پایینتر است که با نتایج مطالعات دیگر مطابقت دارد (22 و 23). این نتایج تاکید بیشتری بر این تئوری دارد که افزایش دمای بیضه میتواند منجر به نقص در روند اسپرماتوژنز و در نتیجه مختل شدن تولید و تمایز اسپرم در بیضهها شود. مطالعات نشان میدهد که در افراد مبتلا به واریکوسل، با افزایش میزان آپوپتوزیس، جمعیت ردههای مختلف سلولهای زایا، مانند اسپرماتوگونیا، اسپرماتوسیت، اسپرماتید و اسپرم کاهش مییابد. بهعلاوه، عبور اسپرمهای تولید شده از لولههای منی ساز، تحت تاثیر واریکوسل قرار گرفته و در نهایت، باعث کاهش تعداد اسپرم انزالی در این افراد می شود (26-24). از طرفی واریکوسل میتواند با تاثیر بر سلولهای سرتولی باعث واکوئله شدن و آزاد شدن اسپرمها قبل از بلوغ کامل شده، که از این طریق باعث حضور اسپرمهای نابالغ و دارای مورفولوژی غیر طبیعی در انزال میشود (22). همچنین در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، افزایش سطح رادیکالهای آزاد، باعث پراکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع در ساختار غشای سر اسپرم و قطعه میانی شده و با تغییر در سیالیت غشا، باعث کاهش میزان تحرک اسپرم میشود (27).
اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز منجر به تولید اسپرمهایی میشود
که علاوه بر نقص در پارامترهای اسپرمی، سطوح متفاوتی از میزان نقص در ساختار کروماتین و افزایش سطح استرس اکسیداتیو را نشان میدهند. بنابراین در این مطالعه سلامت کروماتین اسپرم و سطح استرس اکسیداتیو نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه، سلامت ژنوم اسپرم با استفاده از روش TUNEL و CMA3 بررسی شد و اختلاف معنیداری در گروه واریکوسل و بارور مشاهده شد، بهطوریکه میزان آسیب DNA و کمبود پروتامین در افراد مبتلا به واریکوسل در مقایسه با افراد بارور بیشتر است که با نتایج مطالعات دیگران در این زمینه مطابقت دارد. بر طبق نتایج Blumer و همکاران (28)، مردان مبتلا به واریکوسل درصد بالاتری از آسیب DNA در مقایسه با افراد سالم دارند. همچنین Fuse و همکاران (29) گزارش کردند که میزان آسیب DNA، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل در مقایسه با افراد نابارور بدون واریکوسل و افراد بارور، بهطور قابل ملاحظهای بیشتر است. در تایید موارد فوق میتوان بیان کرد که در افراد مبتلا به واریکوسل فاکتورهای مختلفی منجر به آسیب DNA میشود که ممکن است در هر یک از مراحل اسپرماتوژنز رخ دهد. در این رابطه فرضیههای متعددی وجود دارد که بهشرح زیر میباشد: 1) کمبود پروتامین در هسته اسپرم و یا عدم جایگزینی مناسب پروتامین بهجای هیستون در مرحله اسپرمیوژنز، DNAرا مستعد آسیب میکند. 2)گونههای فعال اکسیژن میتواند مستقیما به بازهای DNA اسپرم متصل شده و یا با فعال کردن آپوپتوزیس سبب آسیب DNA شود (4 و 11).
مطالعات مختلف نشان میدهد که چندین روش برای بررسی استرس اکسیداتیو وجود دارد که از آن جمله میتوان به اندازهگیری مارکرهای اختصاصی و کلی افزایش ROS (مانند مالون دیآلدئید، پراکسید هیدروژن، نیتریک اکساید و پراکسید هیدروژن) و یا اندازهگیری ظرفیت کل آنتیاکسیدانتهای پلاسما (TAC: Total Antioxidant Capacity) (اندازهگیری آنتیاکسیدانتهای آنزیمی و غیر آنزیمی) اشاره کرد (30). در این مطالعه، ارزیابی اسپرمهای ROS مثبت با استفاده از نشانگر H2DCFDA و آنالیز فلوسایتومتری انجام شد که این نشانگر حساسیت بالایی نسبت به H2O2 دارد. نتایج این مطالعه نشان میدهد که درصد اسپرم های ROS مثبت بهعنوان شاخص تولید ROS، در گروه واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری بالاتر است. این نتیجه مطابق با نتایج مطالعات دیگری میباشد که نشان میدهند در مردان نابارور مبتلا به واریکوسل، افزایش سطح استرس اکسیداتیو، نیتریک اکساید و پراکسیداسیون لیپید بیش از افراد نابارور بدون واریکوسل میباشد (21 و 31). همچنین بسیاری از مطالعات بیان کردند که در افراد واریکوسل علاوه بر افزایش سطح استرس اکسیداتیو، میزان آنتیاکسیدانتها در مایعمنی نیز نسبت به افراد بارور کاهش مییابد. بنابراین میتوان بیان کرد که احتمالا کاهش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی میتواند باعث افزایش سطح استرس اکسیداتیو و بر هم خوردن تعادل در مایع منی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل شود (31 و 32). برای مثال، آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز گلوتاتیون که وظیفه سم زدایی H2O2 را بر عهده دارند، حساس به حرارت می باشند که افزایش دمای اسکروتوم میتواند منجر به کاهش فعالیت و یا غیر فعال شدن آنها شود. در نتیجه کاهش فعالیت آنزیمی ممکن است که توجیهی برای افزایش سطح H2O2 مشاهده شده در مایع منی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل باشد (33).
در مطالعه حاضر، شدت ROSدر افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور بهطور معنیداری پائینتر است. طبق مطالعهای که Aitkenو همکاران (34) بر روی افراد نابارور انجام دادند، اسپرمهایی که ROS مثبت هستند بهتدریج به سمتTUNEL مثبت و مرحله آخر آپوپتوزیس پیش میروند و در نتیجه تولید بیش از حد ROS باعث مرگ سلولی شده که در نهایت در این افراد، شدت ROS کاهش مییابد.
در این مطالعه، در افراد مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنیداری بین شدت ROS با کمبود پروتامین وجود دارد. از مهمترین عملکردهای پروتامین، حفاظت و حمایت ژنوم اسپرم میباشد، که نقص در جایگزین شدن پروتامین بهجای هیستون، میتواند ژنوم را نسبت به عوامل اندوژن و اگزوژن نظیر نوکلئازها، موتاژنها و رادیکالهای آزاد آسیبپذیر نماید و در نتیجه باعث افزایش شدت استرس اکسیداتیو شود (10).
در این مطالعه، در افراد مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنیداری بین درصد اسپرمهای ROSمثبت و درصد تحرک اسپرم وجود دارد، همچنین ارتباط منفی و معنیداری بین درصد اسپرمهای ROSمثبت با آسیبDNA وجود دارد. بر اساس تئوری پیشنهاد شده در مقالات قبلی، اسپرم متحرک، توانایی تولید ROS تا سطح فیزیولوژیک، جهت انجام عملکردهای فیزیولوژیک مانند فرآیند ظرفیت یابی، تحرک هایپراکتیو و واکنش آکروزومی را دارد (7 و 34). بنابراین رابطه بهدست آمده از نتایج این مطالعه، میتواند نشاندهنده حالت فیزیولوژیک خود اسپرم باشد و بیانگر این مسئله است که، اسپرمی که متحرک تر است از تولید ROS بالاتری جهت انجام فرآیند های فیزیولوژیک برخوردار میباشد، بهعلاوه اسپرمهایی با ROS بیشتر از آسیب DNA کمتری برخوردارند. بنابراین ROS تولید شده احتمالا در سطح فیزیولوژیک بوده و در صورتیکه در سطح غیر فیزیولوژیک بود، احتمالا ارتباط عکس مشاهده میشد.
همچنین در این مطالعه، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنیداری بین کمبود پروتامین و آسیب DNA مشاهده شد. در این رابطه میتوان بیان کرد که احتمالا در این افراد کمبود پروتامین در هسته اسپرم و یا نقص در جایگزینی پروتامین بهجای هیستون سبب کاهش تراکم کروماتین شده و در نتیجهDNA اسپرم مستعد آسیب میشود. بهعبارت دیگر میزان آسیب DNA در افراد دارای نقصهای پروتامین بیشتر است و میتوان بیان کرد که کمبود پروتامین منجر به کاهش باندهای دی سولفیدی شده که این امر موجب آسیب پذیرتر شدن DNA میشود (4). بنابراین میتوان به نقش حفاظتی پروتامین در جهت جلوگیری از آسیب به DNAهسته اسپرم اشاره کرد.
در این مطالعه، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، ارتباط منفی و معنیداری بین تحرک اسپرم و آسیب DNA وجود دارد. کروماتین هسته اسپرم بهوسیله جایگزینی پروتامینها به جای هیستون کاملا متراکم شده و باعث ایجاد سر هیدرودینامیک در اسپرم میشود که میتواند در افزایش سرعت حرکت اسپرم نقش داشته باشد. در نتیجه میتوان بیان کرد که کاهش تراکم و آسیب DNA، تاثیر منفی بر تحرک اسپرم دارد (35).
در این مطالعه، در افراد بارور، فقط بین درصد کمبود پروتامین (اسپرمهای CMA3مثبت) با غلظت و تحرک اسپرم ارتباط منفی و معنیداری وجود دارد، که نشان دهنده این مسئله است که انجام روند صحیح اسپرماتوژنز و جایگزینی مناسب پروتامین بهجای هیستون، باعث تولید تعداد بیشتر اسپرم در بیضه میشود، همچنین روند صحیح جابجایی هیستون با پروتامین منجر به تراکم صحیح کروماتین و در نتیجه تحرک مناسب اسپرم میشود (13).
نتیجه گیری
مطالعه حاضر نشان میدهد که در افراد مبتلا به واریکوسل پارامترهای اسپرمی از جمله غلظت، درصد تحرک اسپرم و مورفولوژی طبیعی نسبت به افراد بارور پائین تر میباشد. همچنین میزان آسیب DNA، کمبود پروتامین و سطح استرس اکسیداتیو نسبت به افراد بارور بالاتر است. افزایش دما و اختلال در روند اسپرماتوژنز، استرس اکسیداتیو و آسیب DNA ناشی از استرس، از عوامل عمده کاهش کیفیت مایع منی دراین افراد است که در نهایت می تواند موفقیت در باروری را تحت تاثیر قرار دهد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از مسئولین پژوهشکده رویان اصفهان ابراز میدارند.
)