مقایسه پارامترهای اسپرمی و ویژگی‏های عملکردی آن بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل

برکت, فروغ; تولایی, مرضیه; آزادی, لیلا; نصراصفهانی, محمد حسین

doi:10.52547/JCT.6.4.523

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران

https://doi.org/10.52547/JCT.6.4.523

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه، مقایسه پارامترهای اسپرمی(غلظت، تحرک و مورفولوژی)، آسیب DNA، درصد و شدت ROS (Reactive Oxygen Species) و همچنین ارتباط بین این پارامترها، در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل می‌باشد.
مواد و روش‏ها: این مطالعه بر روی نمونه مایع ‌منی 83 فرد مبتلا به واریکوسل و 32 فرد بارور می‏باشد. پارامترهای اسپرمی بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (WHO: World Health Organization)، درصد کمبود پروتامین (رنگ آمیزی کرومایسین A3)، آسیب DNA اسپرم (روش TUNEL)، درصد و شدت ROS (رنگ‌آمیزی H2DCFDA) در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که غلظت، درصد تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم در افراد مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنی‌داری کمتر است. علاوه بر این، درصد آسیبDNA ، کمبود پروتامین و درصد اسپرم های ROS مثبت به‏طور معنی‏داری در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل بالاتر می‌باشد.
نتیجه‌گیری: افزایش استرس اکسیداتیو و دمای بیضه در افراد مبتلا به واریکوسل علاوه بر کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی، بر سلامت کروماتین اسپرم‌ نیز تاثیر منفی داشته و در نتیجه، روند اسپرماتوژنز و میزان باروری را تحت تاثیر قرار می‏دهد.

تازه های تحقیق

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Comparison of sperm parameters and its functional characteristics between fertile and infertile men with varicocele

نویسندگان [English]

F B
M T
L A
MH N

چکیده [English]

Aim: The aim of this study is to compare sperm parameters (concentration, motility and morphology), DNA damage, percentage and intensity of ROS (Reactive Oxygen Species) and relationship between these parameters in the fertile and infertile men with varicocele.
Material and Methods: In this study, the semen samples from 83 individuals with varicocele and 32 fertile men were studied. Sperm parameters according WHO (World Health Organization) guidelines, protamine deficiency (chromomycin A3 staining), sperm DNA damage (TUNEL assay), percentage and intensity of ROS (DCFH-DA staining) were assessed in fertile and infertile men with varicocele.
Results: The results of this study showed that sperm concentration, percentage of motility and normal morphology were significantly lower in individuals with varicocele compared to fertile individuals. In addition, percentage of sperm DNA damage, protamine deficiency and ROS positive were significantly higher in infertile men with varicocele.
Conclusion: The increase of stress oxidative and testicular temperature in infertile men with varicocele, lead to decrease the quality of sperm parameters as well as negative effects on sperm chromatin integrity. Therefore the process of spermatogenesis and the rate of fertility were affected in these individuals.

کلیدواژه‌ها [English]

Varicocele
DNA fragmentation
Sperm parameters
Stress oxidative

اصل مقاله

دستگاه تناسلی در مردان مسئول تولید، بلوغ و انتقال اسپرم است که هر گونه ناهنجاری ساختاری و مولکولی در این سیستم موجب ناباروری میشود (1). یکی از رایجترین ناهنجاری‏های ساختاری دستگاه تناسلی که میتواند در روند اسپرماتوژنز اختلال ایجاد کند، اتساع و پیچش غیرطبیعی وریدهای طناب اسپرماتیک بیضه است که واریکوسل نامیده می‏شود (2). مکانیسمهای پاتولوژیکی پیشنهادی برای افراد مبتلا به واریکوسل شامل هیپوکسی بیضه، اتساع وریدها، افزایش دمای بیضه، افزایش استرس اکسیداتیو و غیره میباشد. طبق مطالعات گذشته روند اسپرماتوژنز به افزایش دمای بیضه حساس میباشد. با توجه به اینکه در افراد مبتلا به واریکوسل افزایش دما به‏ میزان 6/2 درجه سانتی‏گراد گزارش شده است، لذا این افزایش دما بر روی تکوین اسپرم تاثیر گذاشته و میتواند منجر به تولید اسپرمهای نابالغ و احتمالا با آسیب ساختار کروماتین شود (3). یکی از رویدادهای مهم در روند اسپرماتوژنز جایگزینی هیستون با پروتامین است که نقش مهمی در بستهبندی کروماتین اسپرم ایفا میکند (4). همچنین یکی از دلایل آسیب DNA اسپرم، ناشی از نقص در بستهبندی کروماتین است که میتواند منجر به آپوپتوزیس ناقص و تولید بیش از حد استرس اکسیداتیو شود (5).

گونه‏های فعال اکسیژن (ROS: Reactive Oxygen Species)، از مولکول‏های اکسیژن مشتق شدهاند که در صورت فعالیت بیش از حد، جزء اکسیدانتهای مضر در نظر گرفته میشوند و شامل آنیون سوپراکسید (°O2)، پرکسیدهیدروژن(H₂O₂)، رادیکال پرکسیل (°ROO)، یون هیپوکلریت (°ClO) و رادیکال بسیار فعال هیدروکسیل (°OH) می‏باشند (6).

در شرایط فیزیولوژیک، مقادیر کمی از استرس اکسیداتیو توسط اسپرم تولید میشود که برای ظرفیتیابی، واکنش آکروزومی و نهایتا لقاح لازم است. اما تولید بیش از حد استرس اکسیداتیو توسط اسپرم و سایر سلولها مانند لوکوسیتها میتواند منجر به آسیب DNA، کاهش تحرک و اختلال در سلامت غشای اسپرم شود (7 و 8). لکوسیتها به‏طور طبیعی در پروستات و سمینال وزیکول وجود دارند و مسئول بخشی از استرس اکسیداتیو ایجاد شده در انزال میباشد. همچنین در افراد مبتلا به واریکوسل، افزایش سلولهای التهابی موجود در بیضه مانند سلول‏های ماست‏سل، به‏عنوان منبع مهم دیگر ایجادکننده استرس اکسیداتیو در این افراد است (9).

مطالعات نشان میدهد که اسپرم افراد مبتلا به واریکوسل به‏دلیل کمبود آنزیمهای آنتیاکسیدانتی در سیتوپلاسم و همچنین وجود اسیدهای چرب غیر اشباع در غشای پلاسمایی در برابر شوکهای اکسیداتیو بسیار آسیبپذیر است. بنابراین استرس اکسیداتیو و آسیب DNA ناشی از استرس، از عوامل عمده کاهش کیفیت مایع منی در این افراد است، که در نهایت می‏تواند موفقیت در باروری را تحت تاثیر قرار دهد (10 و 11). همچنین علاوه بر کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی، افزایش خطر نقصهای ژنتیکی در نسل‏های بعد را به‏همراه دارد (12). بیشتر مطالعات در افراد مبتلا به واریکوسل، کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی و افزایش آسیب DNA را نشان میدهند. بنابراین، روش های مختلفی جهت درمان واریکوسل استفاده می شود، که در برخی موارد، واریکوسل را به هدف جلوگیری از پیشروی آن درمان میکنند ولی در بیشتر موارد، هدف از درمان واریکوسل افزایش میزان باروری از طریق بهبود عملکرد بیضه و پارامترهای مایعمنی می باشد، به‏طوری‏که در برخی از مطالعات پس از درمان از طریق عمل جراحی، بهبودی در پارامترهای اسپرمی، کاهش در آسیب DNA و به‏دنبال آن ایجاد حاملگی در همسران این افراد مشاهده میشود (13 و 14).

با وجود نظریههای متعددی که مکانیسم پاتوژنز واریکوسل بر عملکرد بیضه را بیان میکند، اما هیچ یک نمیتواند به‏طور قطعی و واضح، اثر واریکوسل را بر روند اسپرماتوژنز و باروری مردان بیان کند (15).

هدف از این مطالعه، مقایسه پارامترهای اسپرمی(غلظت، تحرک و مورفولوژی)، سلامت DNA و سطح استرس اکسیداتیو بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل میباشد. همچنین ارتباط بین پارامترهای اسپرمی با درصد آسیبDNA، کمبود پروتامین، درصد و شدت ROS در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد بررسی قرار می‏گیرد.

مواد و روش‏ها

انتخاب بیماران: این مطالعه در کمیته اخلاق برای تحقیقات انسانی، در پژوهشکده رویان و مرکز باروری و ناباروری اصفهان به تصویب رسیده است. افراد شرکت کننده در این مطالعه به دو گروه تقسیم شدند، که گروه اول شامل 88 مرد نابارور مبتلا به واریکوسل می‏باشند. معیارهای ورود این افراد به مطالعه، شامل اندازه بیضه طبیعی و واریکوسل بالینی درجه II (در این‏ حالت اتساع وریدهای بیضه قابل لمس است) و درجه III (در این حالت اتساع وریدهای بیضه قابل رؤیت است) میباشد. افراد آزواسپرمی، لوکوسیتواسپرمی، دارای سابقه عفونت ادراری، سندرم کلاینفلتر و ناباروری با فاکتور زنانه از مطالعه حذف شدند. گروه دوم شامل 32 فرد بارور (افراد کاندید اهدای جنین یا تعیین جنسیت) میباشند که به‏عنوان گروه کنترل در نظر گرفته میشوند. از افراد شرکت کننده در این مطالعه رضایت نامه کتبی گرفته شد و یک پرسشنامه حاوی اطلاعات شخصی، نوع ناباروری و مدت زمان ناباروری تکمیل گردید.

جمعآوری مایع منی: نمونه مایع منی افراد، بعد از 3 تا 4 روز پرهیز از مقاربت جمعآوری شد. نمونه مایع منی افراد از لحاظ پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک، مورفولوژی) بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (2010WHO: World Health Organization)، کمبود پروتامین (رنگ آمیزی کرومایسین A3)، آسیب DNA (روش TUNEL) و سطح استرس اکسیداتیو (رنگH2DCFDA) مورد بررسی قرار گرفت.

ارزیابی پارامترهای اسپرم: غلظت نمونه اسپرمی با استفاده از دستگاه شمارش اسپرم (Makler Counting Chumber) بر حسب میلیون بر لیتر و میزان تحرک اسپرم به‏وسیله نرم افزار CASA (Computer Aided Sperm Analysis)، بر اساس معیار سازمان بهداشت جهانی (16) مورد ارزیابی قرار گرفت. مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگآمیزی دیفکوئیک (Diff Quik) بررسی شد، که به‏صورت خلاصه به این ترتیب میباشد:

حدود 20 تا 30 میکرولیتر از نمونه رقیق شده را بر روی لام قرار داده و پس از تهیه اسمیر و خشک شدن در دمای اتاق، در سه محلول متانول (جهت تثبیت بر روی لام)، ائوزین (جهت رنگ‏آمیزی سیتوپلاسم) و Thiazine-like (جهت رنگآمیزی DNA) به‏ترتیب به‏مدت 30 ثانیه قرار میگیرد. پس از خشک شدن در دمای اتاق، در هر لام حدود 200 اسپرم با استفاده از میکروسکوپ نوری و نرم افزار CASA از لحاظ مورفولوژی بررسی میشود.

ارزیابی آسیب DNAبا استفاده از روش TUNEL: میزان آسیبDNA با استفاده از روش TUNEL (Apoptosis Detection System Fluorescein, Promega, Mannheim, Germany) که توسط خیرالهی و همکاران (17) قبلا توضیح داده شده، بررسی شد که به شرح زیر می‏باشد.

ابتدا مایعمنی را توسط محلول بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate Buffer Saline) شستشو داده و با تهیه اسمیر بر روی لام، طبق دستورالعمل کیت TUNEL رنگآمیزی شد. بر اساس این روش رنگ فلئورسنت توسط آنزیم rTdTبه انتهای 3DNA-OH (قطعات شکسته DNA) اتصال مییابد وfluorescein-12-dUTP ، DNA را نشاندار میکند. بررسی رنگ سبز فلئورسنت مشاهده شده به‏وسیله میکروسکپ فلئورسانس با بزرگنمایی 100(BX51; Olympus; Japan) در ناحیه خلفی سر اسپرم، بیانگرTUNEL مثبت (اسپرمهای دارای آسیبDNA) می‏باشد و رنگ قرمز نشان‏ دهنده اسپرمهای TUNEL منفی (اسپرمهای با DNAسالم) می‏باشد که به‏صورت درصد گزارش میشود. برای هر نمونه در حدود 500 اسپرم بررسی می‏شود.

کمبود پروتامین با استفاده از رنگآمیزی کرومایسین A3(CMA3): درصد کمبود پروتامین اسپرم توسط رنگآمیزی CMA3 که قبلا توسط نصر و همکاران (18) بیان شده، مورد بررسی قرار گرفت که به‏شرح زیر می باشد. نمونه مایعمنی را در محلول کارنوی (متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 3:1) به‏مدت 5 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد فیکس کرده و از آن اسمیر تهیه میشود. هر اسلاید توسط 100 میکرو لیتر محلول کرومایسین A3(CMA3,Sigma, USA)، (25/0 میلی‏گرم در میلی لیتر بافر مکالوین (Mcllvain Buffer)که حاوی 10 میلی‏مولار کلرید منیزیم با 7pH=) به‏مدت 20 دقیقه رنگ‏آمیزی شده و برای حذف باقیماندهی رنگ اضافی، لامها را در محلول بافر فسفات سالین(PBS) شسته و توسط میکروسکوپ فلئورسانس با بزرگنمایی ×100 بررسی میشود. برای هر نمونه در حدود 500 اسپرم بررسی می‏شود. سر اسپرمهایی که دارای کمبود پروتامین بوده، زرد درخشان(CMA3مثبت) که به‏صورت درصد اسپرمهای CMA3+ گزارش میشود و آن‏هایی که دارای پروتامین طبیعی بوده، رنگ زرد کم رنگ (CMA3 منفی) می‏باشد و به‏صورت درصد اسپرمهای CMA3- گزارش میشود.

ارزیابی سطح استرس اکسیداتیو: در این مطالعه ارزیابی اسپرم‏ های ROS مثبت با استفاده از رنگ H2DCFDA (DCFH-DA: 2’, 7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetat, Sigma Co, USA) و آنالیز با دستگاه فلوسایتومتری انجام شد که این نشانگر، حساسیت بالایی نسبت به H₂O₂ دارد. همان‏طور که قبلا در مطالعه کیانی و همکاران (19) توضیح داده شده است، رنگ DCFH-DA به‏طور فعال به سلول وارد شده و با عمل استراز سلولی، گروههای دیاستات از هم شکافته شده و ترکیب غیر فلوئورسنتی DCFH تشکیل میشود. در حضور پراکسید هیدروژن،DCFH به DCF اکسید میشود و رنگ فلوئورسنت سبز از خود ساطع میکند. این ترکیب قادر به خروج از سلول نیست و با دستگاه فلوسایتومتری قابل ارزیابی است.

آنالیز آماری

آنالیز آماری به‏وسیله نرم افزار 18SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA) با استفاده از آنالیز Descriptive، Correlation Coefficient، Independent- Sample T Testمورد ارزیابی قرار گرفت. 05/0 pvalues<از لحاظ آماری معنیدار در نظر گرفته میشود.

نتایج

جمعیت مورد بررسی در این مطالعه شامل 83 فرد مبتلا به واریکوسل با درجه II و III و 32 فرد بارور میباشد. جدول 1 اطلاعات مربوط به پارامترهای توصیفی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور را نشان میدهد. در این مطالعه، میانگین سن افراد مبتلا به واریکوسل 5/0±7/30، میانگین سن افراد بارور 08/1±6/36 و میانگین سن همسران آن‏ها به‏ترتیب 5/0±7/26 و 8/0±2/32 سال می‏باشد. همچنین میانگین مدت زمان ناباروری افراد مبتلا به واریکوسل 1/0±1/2 سال است (جدول1).

جدول 1: پارامترهای توصیفی در افراد نابارور واریکوسل و بارور

پارامترها	گروه	حداقل	حداکثر	میانگین ± خطای استاندارد
غلظت اسپرم(10⁶میلیون / میلیلیتر)	واریکوسل	2/0	127	1/27 ± 8/2
غلظت اسپرم(10⁶میلیون / میلیلیتر)	بارور	25	200	3/77 ± 2/6
درصد تحرک اسپرم	واریکوسل	00	6/84	9/39 ± 4/2
درصد تحرک اسپرم	بارور	9/23	4/94	5/66 ± 9/2
درصد مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم	واریکوسل	98	100	2/99 ± 07/0
درصد مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم	بارور	71	97	5/88 ± 9/0
حجم ( میلی لیتر)	واریکوسل	5/0	7/9	4/3 ± 19/0
حجم ( میلی لیتر)	بارور	5/1	6/8	7/3 ± 28/0
سن مرد (سال)	واریکوسل	22	46	7/30 ± 5/0
سن مرد (سال)	بارور	28	55	6/36 ± 08/1
سن خانم (سال)	واریکوسل	17	40	7/26 ± 5/0
سن خانم (سال)	بارور	26	45	2/32 ± 8/0
مدت ازدواج (سال	واریکوسل	2	17	8/3 ± 3/0
مدت ازدواج (سال	بارور	2	21	4/11 ± 9/0
مدت ناباروری (سال)	واریکوسل	08/0	17	1/2 ± 1/0

مقایسه پارامترهای اسپرمی در افراد بارور و نابارور واریکوسل

نمودار 1 میانگین پارامترهای اسپرمی شامل غلظت، درصد تحرک و درصد مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم را در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل نشان میدهد. غلظت اسپرم در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (8/2±1/27) به‏طور معنیداری کمتر از افراد بارور (2/6±3/77) میباشد (001/0p<). همچنین درصد تحرک اسپرم در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (4/2±9/39) به‏طور معنیداری کمتر از افراد بارور (9/2±5/66) است (001/0p<). به‏علاوه درصد مورفولوژی غیرطبیعی در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (07/0±2/99) به‏طور معنیداری بیشتر از افراد بارور (9/0±5/88) میباشد (001/0p<).

نمودار 1: مقایسه پارامترهای اسپرم بین افراد بارور و نابارور واریکوسل (میانگین ± انحراف معیار، 05/0p<*)

نمودار2: مقایسه شدت و درصد ROS، درصد اسپرم های CMA3 مثبت و TUNL مثبت بین افراد بارور و نابارور واریکوسل (میانگین ± انحراف معیار، 05/0p<*)

مقایسه آسیب DNA، کمبود پروتامین و استرس اکسیداتیو اسپرم بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل

درصد آسیب DNAاسپرم با استفاده روش TUNEL ارزیابی شد. درصد اسپرمهای دارای آسیب DNA (TUNEL مثبت) در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور به‏ترتیب 9/0±2/16 و 7/0±1/8 است. بنابراین درصد آسیب DNAدر افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنیداری (001/0p<) بیشتر میباشد. نتایج بررسی کمبود پروتامین با استفاده از رنگآمیزی CMA3 نشان می‏دهد که درصد اسپرم های CMA3 مثبت در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور به‏ترتیب 6/1±07/46 و 9/1±1/28 می‏باشد که این پارامتر نیز در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنیداری (001/0p<) بالاتر است.

سطح استرس اکسیداتیو با رنگآمیزی DCF و با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری ارزیابی شده است. درصد اسپرمهای ROS مثبت در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل و بارور به‏ترتیب 6/3±7/38 و 6/3±7/21 بود که در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنی‏داری بالاتر بوده (001/0p<)، اما شدت ROS در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل (9/1±04/35) در مقایسه با افراد بارور (05/7±92/80) به‏طور معنی‏داری (001/0p<) پایین‏تر است (نمودار 2).

ارتباط پارامترهای اسپرمی با درصد آسیبDNA، کمبود پروتامین، درصد و شدت استرس اکسیداتیو

ارتباط بین پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک، مورفولوژی غیرطبیعی) با درصد آسیبDNA ، کمبود پروتامین، درصد و شدت استرس اکسیداتیو در افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج ارائه شده در جدول 2 نشان میدهد که در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، بین غلظت اسپرم با درصد و شدت ROS ارتباط مثبت و معنیداری وجود دارد (05/0(p

جدول 3 ارتباط بین میزان آسیبDNA (درصد اسپرم‏های TUNEL مثبت)، کمبود پروتامین (درصد اسپرم‏های CMA3 مثبت)، درصد و شدتROS را با یکدیگر نشان می‏دهد. در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، رابطه مثبت و معنیداری بین درصد اسپرم‏های ROSمثبت و شدت ROS(01/0>p) وجود دارد. همچنین در این افراد، رابطه معنیدار و منفی بین درصد آسیب DNA و درصد ROS مثبت (05/0>p) وجود دارد. به‏علاوه ارتباط معنیدار و مثبت بین درصد کمبود پروتامین و شدت ROS در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل مشاهده شد (05/0>p)(جدول3).

جدول 2: ارتباط بین پارامترهای اسپرمی با درصد و شدت ROS،درصد اسپرم‏های TUNEL مثبت و CMA3 مثبت اسپرم در افراد بارور و نابارور واریکوسل.

پارامترها	گروه	غلظت (10⁶میلیون در هر میلیلیتر)	درصد تحرک اسپرم	درصد مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم
مثبت ROS درصد اسپرم های	واریکوسل	^** 4/0	^** 3/0	03/0 -
مثبت ROS درصد اسپرم های	بارور	03/0	1/0	05/0 -
ROS شدت	واریکوسل	^* 2/0	02/0	01/0
ROS شدت	بارور	07/0	3/0 -	06/0 -
مثبتTUNEL درصد اسپرم	واریکوسل	09/0 -	^* 2/0 -	1/0
مثبتTUNEL درصد اسپرم	بارور	2/0 -	2/0 -	3/0
مثبت CMA₃ درصد اسپرم	واریکوسل	1/0 -	1/0-	06/0
مثبت CMA₃ درصد اسپرم	بارور	^* 4/0 -	^* 4/0 -	2/0

**05/0p< معنیدار در نظر گرفته میشود. * 01/0 p<معنیدار در نظر گرفته میشود.

جدول 3: ارتباطبیندرصد اسپرمهای TUNEL مثبت، CMA3مثبت، درصد و شدت ROSبایکدیگر در افراد نابارور واریکوسل و بارور.

پارامترها	گروه	ROS شدت	درصد اسپرمهای مثبت TUNEL اسپرم	درصد اسپرمهایمثبت CMA₃
مثبت ROS درصد اسپرم های	واریکوسل	^* 2/0	^** 3/0-	07/0
مثبت ROS درصد اسپرم های	بارور	3/0 -	03/0	1/0
ROS شدت	واریکوسل	--------	2/0	^** 4/0
ROS شدت	بارور	--------	04/0-	1/0
مثبت CMA₃ درصد اسپرم	واریکوسل	2/0	--------	2/0
مثبت CMA₃ درصد اسپرم	بارور	04/0-	--------	2/0

** 05/0p< معنیداردر نظر گرفته میشود. * 01/0p< معنیدار در نظرگرفته میشود.

بحث

واریکوسل به اتساع وریدهای شبکه پامپینی فرم طناب اسپرماتیک اطلاق می‏شود (3). در دهههای گذشته تا حدودی ارتباط بین ناباروری و واریکوسل مشخص شده، اما تحقیقات اخیر، بیشتر بر اساس مطالعات مولکولی و ژنتیکی میباشد، به این امید که با بررسیهای بیشتر در این زمینه افقهای جدیدی برای درمان ناباروری در مردان مبتلا به واریکوسل، باز شود. مهم‏ترین نظریه در مورد تاثیر واریکوسل بر روی عملکرد بیضه، تغییر در کارایی تبادل دما در داخل بیضه و اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز می‏باشد (3 و 11). یکی از عوامل اختلال در عملکرد اسپرم در افراد مبتلا به واریکوسل، استرس اکسیداتیو ناشی از استرس دمایی در این افراد است (20). تولید بیش از حد ROS باعث آسیب به غشای اسپرم، کاهش تحرک و توانایی اسپرم در اتصال به تخمک شده و همچنین آسیب مستقیم به DNA اسپرم و اثرات غیرمستقیم بر سلامت ژنوم جنین و در نهایت کاهش باروری را به همراه دارد (20 و 21).

نتایج این مطالعه نشان میدهد که در افراد مبتلا به واریکوسل غلظت، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم به‏طور معنیداری نسبت به افراد بارور پایینتر است که با نتایج مطالعات دیگر مطابقت دارد (22 و 23). این نتایج تاکید بیشتری بر این تئوری دارد که افزایش دمای بیضه میتواند منجر به نقص در روند اسپرماتوژنز و در نتیجه مختل شدن تولید و تمایز اسپرم در بیضهها شود. مطالعات نشان می‏دهد که در افراد مبتلا به واریکوسل، با افزایش میزان آپوپتوزیس، جمعیت رده‏های مختلف سلول‏های زایا، مانند اسپرماتوگونیا، اسپرماتوسیت، اسپرماتید و اسپرم کاهش می‏یابد. به‏علاوه، عبور اسپرم‏های تولید شده از لوله‏های منی ساز، تحت تاثیر واریکوسل قرار گرفته و در نهایت، باعث کاهش تعداد اسپرم انزالی در این افراد می شود (26-24). از طرفی واریکوسل می‏تواند با تاثیر بر سلول‏های سرتولی باعث واکوئله شدن و آزاد شدن اسپرم‏ها قبل از بلوغ کامل شده، که از این طریق باعث حضور اسپرم‏های نابالغ و دارای مورفولوژی غیر طبیعی در انزال می‏شود (22). همچنین در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، افزایش سطح رادیکالهای آزاد، باعث پراکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع در ساختار غشای سر اسپرم و قطعه میانی شده و با تغییر در سیالیت غشا، باعث کاهش میزان تحرک اسپرم می‏شود (27).

اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز منجر به تولید اسپرمهایی میشود

که علاوه بر نقص در پارامترهای اسپرمی، سطوح متفاوتی از میزان نقص در ساختار کروماتین و افزایش سطح استرس اکسیداتیو را نشان می‏دهند. بنابراین در این مطالعه سلامت کروماتین اسپرم و سطح استرس اکسیداتیو نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه، سلامت ژنوم اسپرم با استفاده از روش TUNEL و CMA3 بررسی شد و اختلاف معنیداری در گروه واریکوسل و بارور مشاهده شد، به‏طوری‏که میزان آسیب DNA و کمبود پروتامین در افراد مبتلا به واریکوسل در مقایسه با افراد بارور بیشتر است که با نتایج مطالعات دیگران در این زمینه مطابقت دارد. بر طبق نتایج Blumer و همکاران (28)، مردان مبتلا به واریکوسل درصد بالاتری از آسیب DNA در مقایسه با افراد سالم دارند. همچنین Fuse و همکاران (29) گزارش کردند که میزان آسیب DNA، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل در مقایسه با افراد نابارور بدون واریکوسل و افراد بارور، به‏طور قابل ملاحظهای بیشتر است. در تایید موارد فوق میتوان بیان کرد که در افراد مبتلا به واریکوسل فاکتورهای مختلفی منجر به آسیب DNA میشود که ممکن است در هر یک از مراحل اسپرماتوژنز رخ دهد. در این رابطه فرضیههای متعددی وجود دارد که به‏شرح زیر می‏باشد: 1) کمبود پروتامین در هسته اسپرم و یا عدم جایگزینی مناسب پروتامین به‏جای هیستون در مرحله اسپرمیوژنز، DNAرا مستعد آسیب میکند. 2)گونه‏های فعال اکسیژن می‏تواند مستقیما به بازهای DNA اسپرم متصل شده و یا با فعال کردن آپوپتوزیس سبب آسیب DNA شود (4 و 11).

مطالعات مختلف نشان میدهد که چندین روش برای بررسی استرس اکسیداتیو وجود دارد که از آن جمله می‏توان به اندازه‏‏گیری مارکرهای اختصاصی و کلی افزایش ROS (مانند مالون دیآلدئید، پراکسید هیدروژن، نیتریک اکساید و پراکسید هیدروژن) و یا اندازهگیری ظرفیت کل آنتیاکسیدانتهای پلاسما (TAC: Total Antioxidant Capacity) (اندازهگیری آنتی‏اکسیدانتهای آنزیمی و غیر آنزیمی) اشاره کرد (30). در این مطالعه، ارزیابی اسپرمهای ROS مثبت با استفاده از نشانگر H2DCFDA و آنالیز فلوسایتومتری انجام شد که این نشانگر حساسیت بالایی نسبت به H₂O₂ دارد. نتایج این مطالعه نشان می‏دهد که درصد اسپرم های ROS مثبت به‏عنوان شاخص تولید ROS، در گروه واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنیداری بالاتر است. این نتیجه مطابق با نتایج مطالعات دیگری میباشد که نشان میدهند در مردان نابارور مبتلا به واریکوسل، افزایش سطح استرس اکسیداتیو، نیتریک اکساید و پراکسیداسیون لیپید بیش از افراد نابارور بدون واریکوسل میباشد (21 و 31). همچنین بسیاری از مطالعات بیان کردند که در افراد واریکوسل علاوه بر افزایش سطح استرس اکسیداتیو، میزان آنتیاکسیدانتها در مایعمنی نیز نسبت به افراد بارور کاهش مییابد. بنابراین میتوان بیان کرد که احتمالا کاهش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی میتواند باعث افزایش سطح استرس اکسیداتیو و بر هم خوردن تعادل در مایع منی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل شود (31 و 32). برای مثال، آنزیم‏های کاتالاز و پراکسیداز گلوتاتیون که وظیفه سم زدایی H₂O₂ را بر عهده دارند، حساس به حرارت می باشند که افزایش دمای اسکروتوم می‏تواند منجر به کاهش فعالیت و یا غیر فعال شدن آن‏ها شود. در نتیجه کاهش فعالیت آنزیمی ممکن است که توجیهی برای افزایش سطح H₂O₂ مشاهده شده در مایع منی افراد نابارور مبتلا به واریکوسل باشد (33).

در مطالعه حاضر، شدت ROSدر افراد نابارور مبتلا به واریکوسل نسبت به افراد بارور به‏طور معنیداری پائین‏تر است. طبق مطالعه‏ای که Aitkenو همکاران (34) بر روی افراد نابارور انجام دادند، اسپرمهایی که ROS مثبت هستند به‏تدریج به سمتTUNEL مثبت و مرحله آخر آپوپتوزیس پیش میروند و در نتیجه تولید بیش از حد ROS باعث مرگ سلولی شده که در نهایت در این افراد، شدت ROS کاهش مییابد.

در این مطالعه، در افراد مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنی‏داری بین شدت ROS با کمبود پروتامین وجود دارد. از مهم‏ترین عملکردهای پروتامین، حفاظت و حمایت ژنوم اسپرم می‏باشد، که نقص در جایگزین شدن پروتامین به‏جای هیستون، میتواند ژنوم را نسبت به عوامل اندوژن و اگزوژن نظیر نوکلئازها، موتاژنها و رادیکال‏های آزاد آسیبپذیر نماید و در نتیجه باعث افزایش شدت استرس اکسیداتیو شود (10).

در این مطالعه، در افراد مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنی‏داری بین درصد اسپرمهای ROSمثبت و درصد تحرک اسپرم وجود دارد، همچنین ارتباط منفی و معنیداری بین درصد اسپرمهای ROSمثبت با آسیبDNA وجود دارد. بر اساس تئوری پیشنهاد شده در مقالات قبلی، اسپرم متحرک، توانایی تولید ROS تا سطح فیزیولوژیک، جهت انجام عملکردهای فیزیولوژیک مانند فرآیند ظرفیت یابی، تحرک هایپراکتیو و واکنش آکروزومی را دارد (7 و 34). بنابراین رابطه به‏دست آمده از نتایج این مطالعه، می‏تواند نشان‏دهنده حالت فیزیولوژیک خود اسپرم باشد و بیانگر این مسئله است که، اسپرمی که متحرک تر است از تولید ROS بالاتری جهت انجام فرآیند های فیزیولوژیک برخوردار می‏باشد، به‏علاوه اسپرم‏هایی با ROS بیشتر از آسیب DNA کمتری برخوردارند. بنابراین ROS تولید شده احتمالا در سطح فیزیولوژیک بوده و در صورتی‏که در سطح غیر فیزیولوژیک بود، احتمالا ارتباط عکس مشاهده می‏شد.

همچنین در این مطالعه، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، ارتباط مثبت و معنیداری بین کمبود پروتامین و آسیب DNA مشاهده شد. در این رابطه میتوان بیان کرد که احتمالا در این افراد کمبود پروتامین در هسته اسپرم و یا نقص در جایگزینی پروتامین به‏جای هیستون سبب کاهش تراکم کروماتین شده و در نتیجهDNA اسپرم مستعد آسیب میشود. به‏عبارت دیگر میزان آسیب DNA در افراد دارای نقص‏های پروتامین بیشتر است و میتوان بیان کرد که کمبود پروتامین منجر به کاهش باندهای دی سولفیدی شده که این امر موجب آسیب پذیرتر شدن DNA می‏شود (4). بنابراین میتوان به نقش حفاظتی پروتامین در جهت جلوگیری از آسیب به DNAهسته اسپرم اشاره کرد.

در این مطالعه، در افراد نابارور مبتلا به واریکوسل، ارتباط منفی و معنیداری بین تحرک اسپرم و آسیب DNA وجود دارد. کروماتین هسته اسپرم به‏‏وسیله جایگزینی پروتامینها به جای هیستون کاملا متراکم شده و باعث ایجاد سر هیدرودینامیک در اسپرم می‏شود که میتواند در افزایش سرعت حرکت اسپرم نقش داشته باشد. در نتیجه میتوان بیان کرد که کاهش تراکم و آسیب DNA، تاثیر منفی بر تحرک اسپرم دارد (35).

در این مطالعه، در افراد بارور، فقط بین درصد کمبود پروتامین (اسپرمهای CMA3مثبت) با غلظت و تحرک اسپرم ارتباط منفی و معنیداری وجود دارد، که نشان‏ دهنده این مسئله است که انجام روند صحیح اسپرماتوژنز و جایگزینی مناسب پروتامین به‏جای هیستون، باعث تولید تعداد بیشتر اسپرم در بیضه می‏شود، همچنین روند صحیح جابجایی هیستون با پروتامین منجر به تراکم صحیح کروماتین و در نتیجه تحرک مناسب اسپرم می‏شود (13).

نتیجه گیری

مطالعه حاضر نشان میدهد که در افراد مبتلا به واریکوسل پارامترهای اسپرمی از جمله غلظت، درصد تحرک اسپرم و مورفولوژی طبیعی نسبت به افراد بارور پائین تر میباشد. همچنین میزان آسیب DNA، کمبود پروتامین و سطح استرس اکسیداتیو نسبت به افراد بارور بالاتر است. افزایش دما و اختلال در روند اسپرماتوژنز، استرس اکسیداتیو و آسیب DNA ناشی از استرس، از عوامل عمده کاهش کیفیت مایع منی دراین افراد است که در نهایت می تواند موفقیت در باروری را تحت تاثیر قرار دهد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از مسئولین پژوهشکده رویان اصفهان ابراز می‏دارند.

مراجع

1. Chemes HE, Rawe VY. The making of abnormal spermatozoa: cellular and molecular mechanisms underlying pathological spermiogenesis. Cell Tissue Res. 2010; 341(3): 349-357.

2. Redmon JB, Carey P, Pryor JL. Varicocele- the most common cause of male factor infertility? Hum Reprod Update. 2002; 8(1):53-58.

3. Naughton CK, Nangia AK, Agarwal A. athophysiology of varicocele in male infertility. Hum Reprod Update. 2001; 7(5):473-481.

4. Tavalaee M, Razavi S, Nasr-Esfahani MH. Influence of sperm chromatin anomalies on assisted reproductive technology outcome. Fertil Steril. 2009; 91(4): 1119-1126.

5. Moustafa MH, Sharma RK, Thornton J, Mascha E, et al. Relationship between ROS production, apoptosisand DNA denaturation in spermatozoa from patients examined for infertility. Hum Reprod. 2004; 19 (1):129–138.

6. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine. New York: Oxford University Press; 1999: 617–783.

7. Griveau JF, Le Lannou D. Reactive oxygen species and human spermatozoa: physiology and pathology. Int J Androl. 1997; 20(2): 61-69.

8. Henkel RR. Leukocytes and oxidative stress: dilemma for sperm function and male fertility. Asian J Androl. 2011; 13(1): 43-52.

9. Yamanaka K, Fujisawa M, Tanaka H, Okada H, et al. Significance of human testicular mast cells and their subtypes in male infertility. Hum Reprod. 2000; 15(7): 1543–1547.

10. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Steril. 2003; 79(4):829-843.

11. Shiraishi K, Matsuyama H, Takihara H. Pathophysiology of varicocele in male infertility in the era of assisted reproductive technology. Int J Urol. 2012; 19(6): 538-550.

12. Zini A, Dohle G. Are varicoceles associated with increased deoxyribonucleic acid fragmentation? Fertil Steril. 2011; 96(6): 1283-1287.

13. Azadi L, Abbasi H, Deemeh MR, Tavalaee M, et al. Zaditen (Ketotifen), as mast cell blocker, improves sperm quality, chromatin integrity and pregnancy rate after varicocelectomy. Int J Androl. 2010; 34(5): 446–452.

14. Nasr-Esfahani MH, Abasi H, Razavi S, Ashrafi S, et al. Varicocelectomy: semen parameters and protamine deficiency. Int J Androl. 2009; 32(2):115-122.

15. Onozawa M, Endo F, Suetomi T, Takeshima H, et al. Clinical study of varicocele: statistical analysis and the results of long-term follow-up. Int Jurol. 2002; 9(8): 455-461.

16. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen - 5th ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2010; 1-271. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. ISBN 9789241547789.

17. Kheirollahi-Kouhestani M, Razavi S, Tavalaee M, Deemeh MR, et al. Selection of sperm based on combined density gradient and Zeta method may improve ICSI outcome. Hum Reprod. 2009; 24(10): 2409-2416.

18. Nasr-Esfahani MH, Razavi S, Mardani M. Relation between different human sperm nuclear maturity tests and in vitro fertilization. J Assist Reprod Genet. 2001; 18(4): 219-225.

19. Kiani-Esfahani A, Tavalaee M, Deemeh MR, Hamiditabar M, et al. DHR123: an alternativeprobe for assessment of ROS in humanspermatozoa. Syst Biol Reprod. 2012; 58(3): 168-174.

20. Agarwal A, Hamada A, Esteves SC. Insight into oxidative stress in varicocele-associated male infertility: part 1. Nat Rev Urol. 2012; 9(12): 678-690.

21. Blumer CG, Restelli AE, Giudice PT, Soler TB, et al. Effect of varicocele on sperm function and semen oxidative stress. BJU Int. 2012; 109(2):259-265.

22. Villanueva-Diaz CA, Vega-Hernandez EA, Diaz-Perez MA, Echavarria-Sanchez M, et al. Sperm dysfunction in subfertile patients with varicocele and

marginal semen analysis. Andrologia. 1999; 31(5):263-267.

23. NavaeianKalat E, Tavalaee M, Abasi H, Nasr Esfahani MH. Comparison of sperm parameters and DNA integrity between fertile and varicocele individuals. Journal of Cell. 2012; 3(2): 171-177.

24. Wu GJ, Chang FW, Lee SS, Cheng YY, et al. Apoptosis-related phenotype of ejaculated spermatozoa in patients with varicocele. Fertil Steril. 2009; 91(3): 831-837.

25. Mann SL, Patton WC, King A, Chan PJ. Comparative genomic hybridization analysis of sperm DNA apoptosis after exposure to heat shock. J Assist Reprod Genet. 2002; 19(4): 195-200.

26. Hikim AP, Wang C, Lue Y, Johnson L, et al. Spontaneous germ cell apoptosis in humans: evidence for ethnic differences in the susceptibility of germ cells to programmed cell death. J Clin Endocrinol Metab. 1998 Jan; 83(1): 152-156.

27. Kemal Duru N, Morshedi M, Oehninger S. Effects of hydrogen peroxide on DNA and plasma membrane integrity of human spermatozoa. Fertil Steril. 2000; 74(6): 1200-1207.

28. Blumer CG, Fariello RM, Restelli AE, Spaine DM, et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele.Fertil Steril. 2008; 90(5): 1716-1722.

29. Fuse H, Akashi T, Mizuno I, Nozaki T, et al. Post-operative changes of sperm chromatin heterogeneity, using acridine orange staining, in varicocele patients. Arch Androl.2006; 52(3): 223-226.

30. Sakamoto Y, Ishikawa T, Kondo Y, Yamaguchi K, et al. The assessment of oxidative stress in infertile patients with varicocele. BJU Int. 2008; 101(12): 1547-1552.

31. Pasqualotto FF, Sundaram A, Sharma RK, Borges E Jr, et al. Semen quality and oxidative stress scores in fertile and infertile patients with varicocele. Fertil Steril. 2008; 89(3): 602-607.

32. Mostafa T, Anis T, Imam H, El-Nashar AR, et al. Seminal reactive oxygen species-antioxidant relationship in fertile males with and without varicocele.Andrologia.2009; 41(2): 125-129.

33. Mostafa T, Anis TH, El-Nashar A, Imam H, et al. Varicocelectomy reduces reactive oxygen species levels and increases antioxidant activity of seminal plasma from infertile men with varicocele. Int J Androl. 2001. 24(5): 261-265.

34. Aitken RJ, De Iuliis GN, Finnie JM, Hedges A, et al. Analysis of the relationships between oxidative stresses, DNA damage and sperm vitality in a patient population: development of diagnostic criteria. Hum Reprod. 2010; 25(10): 2415-2426.

35. Plastira K, Msaouel P, Angelopoulou R, Zanioti K, et al. The effects of age on DNA fragmentation, chromatin packaging and conventional semen parameters in spermatozoa of oligoasthenoteratozoospermic patients. J Assist Reprod Genet. 2007; 24(10): 437-443.

سلول و بافت

مقایسه پارامترهای اسپرمی و ویژگی‏های عملکردی آن بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل

اصل مقاله

اصل مقاله

مراجع

مراجع

دوره 6، شماره 4 - شماره پیاپی 4
اسفند 1394
صفحه 523-532

مقایسه پارامترهای اسپرمی و ویژگی‏های عملکردی آن بین افراد بارور و نابارور مبتلا به واریکوسل

اصل مقاله

اصل مقاله

مراجع

مراجع

دوره 6، شماره 4 - شماره پیاپی 4اسفند 1394صفحه 523-532

دوره 6، شماره 4 - شماره پیاپی 4
اسفند 1394
صفحه 523-532