نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، قزوین، ایران
2 کارشناس ارشد دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، قزوین، ایران
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش بررسی تاثیر سیلیکون بر شدت بیان ژن پراکسیداز و برخی صفات ریخت شناسی آن در دو لاین مقاوم و حساس گیاه جو تحت تنش خشکی بود. مواد و روش‌ها: میزان پروتئین محلول کل، رنگدانههای فتوسنتزی، RNA کل از برگهای تیمارهای مختلف استخراج شد. ژن هدف پس از ساخت cDNA با استفاده از RT-PCR بهصورت نیمهکمی بررسی شد. همچنین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز با روش Chance و پرولین نیز با روش Bates تحت تنش خشکی مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، آزمایشی بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون –خشکی (2میلیمولار سیلیکات‌سدیم/ کیلوگرم خاک) با سه تکرار در گلخانه اجرا شد. نتایج: کاربرد سیلیکون در هر دو لاین، میزان پروتئین محلول کل و رنگدانههای فتوسنتزی را تحت شرایط تنش خشکی افزایش داد. آنالیز نیمهکمی RT-PCR اختلاف معنیداری را بین تیمارها نشان داد. بیشترین میزان بیان ژن پراکسیداز در تیمار سیلیکون-خشکی مشاهده شد. افزایش فعالیت آنزیمهای ضداکسنده و بررسی الگوی باندی این آنزیمها بر روی ژل آکریل‌آمید نشان داد که شدت باندها در تیمار سیلیکون بیشتر بود. میزان پرولین در شرایط تنش در مقایسه با تیمار شاهد افزایش یافت و با کاربرد سیلیکون افزایش بیشتری مشاهده شد. نتیجه‌گیری: سیلیکون به تاثیر کاهش خسارت اکسیداتیو ناشی از گونههای فعال اکسیژن کمک میکند و با افزایش در فعالیت آنزیمهای ضداکسنده، موجب حفاظت گیاه در برابر تنشهای محیطی میشود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of Silicon on the Peroxidase Gene Expression and Morphological Traits of Barley Under Drought Stress
نویسندگان [English]
- R H 1
- S M 2
چکیده [English]
Aim: The purpose of the present research project was evaluation of the effect of silicon on the severity of peroxidase genes expression and some morphological traits in both resistant and susceptible barley lines under drought stress. Material and Methods: Total soluble protein content, photosynthetic pigments, and total RNA were extracted from the leaves affected by various treatments. Target gene was evaluated by Semi-quantitative RT-PCR analysis using synthesized cDNA. Both the peroxidase enzyme activity by Chance method and proline with Bates method were also evaluated under drought stress treatment. Accordingly, the experiment was analyzed in a factorial test based on the completely randomized design with three treatments of control, drought and silicon-drought (sodium silicate 2 mg / 1 Kg soil) with three replications in a greenhouse. Results: Silicon application caused to increase the amount of total soluble protein and photosynthetic pigments in both lines under drought stress. Semi-quantitative RT-PCR analysis of treatments observed significant differences. Maximum of peroxidase gene expression was observed in the silicon-drought treatment. Antioxidant enzyme activities were at the highest level as shown by gene expression pattern of polyacrylamide gel analysis for treated silicon samples. A further increase was exhibited for proline accumulation caused by silicon application rather than such accumulation in stress treatment compared to control. Conclusion: Silicon reduces oxidative damage induced by reactive oxygen species and with the increase in antioxidant enzyme activities caused to protect plants against environmental stresses.
کلیدواژه‌ها [English]
- Antioxidant enzymes
- Gene expression
- Drought stress
- Silicon
خشکی علت اصلی کاهش رشد گیاهان و عملکرد آنها در مناطق خشک و نیمهخشک محسوب شده و موجب تحریک سلسله پاسخهای دفاعی در سطوح مختلف مولکولی، سلولی و فیزیولوژیکی میشود (1). تنش خشکی با علائم کاهش محتوای آب، کم شدن پتانسیل آب برگها، کاهش حالت تورم سلولهای نگهبان روزنه، بستن روزنهها و کاهش در توسعه و رشد سلول مشخص میشود (2، 3 و 4). پیری، تنش و تحریکات رشدی در گیاه باعث افزایش مقادیر مختلف اکسیژن فعال از قبیل: آنیون سوپراکساید، پراکسیدهیدروژن، رادیکال هیدروکسیل و اکسیژن منفرد میشود. این مولکولهای فعال موجب صدمه به ماکرومولکولها و نیز ساختار سلولی شده یا اینکه بهعنوان مولکول منفرد موجب فعال شدن سلسله پاسخهای دفاعی گیاه میشوند. گیاهان از دو سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی برای دفاع در مقابل گونههای اکسیژن فعال ((ROS Reactive Oxygen) (Species استفاده میکنند (5 و 6). سیستم آنزیمی شامل آنزیمهای ضداکسنده مانند کاتالاز ((CAT، پراکسیداز (POX)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربیت پراکسیداز ((APX و گلوتاتیون ردوکتاز(GR) بوده که وظیفه عمده این آنزیمها تجزیه پراکسید هیدروژن میباشد (8،7). از پاسخهای بیوشیمیایی به تنش نیز میتوان به تجمع متابولیتهایی که قابلیت انحلال داشته ولی متابولیسم طبیعی گیاه را مختل نمیکنند، اشاره کرد. این مواد که به اسمولیتها معروف هستند شامل قندها و متابولیتهای دارای بار الکتریکی مثل گلایسین بتائین و اسیدهای آمینهای چون پرولین است (9، 10 و 11). تجمع پرولین در شرایط تنش شوری و بیآبی صورت میگیرد، بهطوریکه پرولین در بسیاری از گیاهان بهعنوان نشانگر بیوشیمیایی برای تشخیص تحمل به تنش مورد استفاده قرار میگیرد (12). پرولین یکی از تنظیمکنندههای اسمزی است که موجب سازش سلول گیاهی برای زنده ماندن در شرایط تنشزا و حفاظت آنزیمها و پروتئینهای غشایی در برابر تغییرات ساختاری میشود. جهت حفظ لیپیدهای غشا از خسارت القا شده توسط رادیکالهای آزاد اکسیژن، افزایش پرولین مشاهده میشود و با افزایش مقدار و فعالیت آنزیمها و پروتئینهای دفاعی، در حفظ ساختمان کلروپلاست دستگاه فتوسنتز و کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از تنش نقش دارد (13، 14 و 15). تجمع پرولین در سلول از طریق دو کاتالیز متوالی بهوسیله پرولین-5-کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) و پرولین-5-کربوکسیلات ردوکتاز(P5CR) انجام میشود. در واقع در شرایط تنش خشکی فعالیت آنزیم P5CS افزایش یافته و مقدار پرولین را در داخل سلول بهحدی بالا میبرد که از خسارت زیاد کم آبی به گیاه جلوگیری میکند (16). سیلیکون بعد از اکسیژن دومین عنصر فراوان در خاک است. دیاکسیدسیلیکون دربرگیرنده 50 تا 70 درصد توده خاک است، در نتیجه همهی ریشه گیاهان در خاک مقداری سیلیکون در بافت خود دارند (17). با اینحال نقش سیلیکون در رشد و توسعه گیاهان نادیده گرفته شده است. از آنجاییکه فراوانی این عنصر بهدلیل نشانههای قابل مشاهده در طبیعت، کمبود و یا سمی بودن آن آشکار نیست، بهنظر میرسد فیزیولوژیستهای گیاهی تا حدودی آن را نادیده گرفته اند. سیلیکون در ریشهها بهفرم سالیسیک اسید جذب میشود. گیاهان مختلف در جذب سیلیکون مقادیر متفاوتی از 1/0 تا 10 درصد وزن خشک را از خود نشان میدهند (18). نقش سیلیکون در کاهش خسارت اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی در غلات به اثبات رسیده است. اخیرا در پژوهشهای صورت گرفته به اثرات مفید و حاصلخیزی سیلیکون در زمان بروز تنشهای محیطی که با افزایش در فعالیت آنزیمهای ضداکسنده و بالا رفتن محتوای اسمولیتها، نقش مهمی را در ایجاد تحمل به تنشهای زنده و غیر زنده در گیاهان ایفا میکند، اشاره شده است. این ماده همچنین با کاهش در میزان کاربرد علف کشها و مواد سمی، مانع از آلودگی محیط زیست از اثرات مضر ناشی از استعمال سموم کشاورزی میشود (19، 20، 21 و 22).
جو یکی از مهمترین غلاتی است که در بسیاری از کشورهای جهان کاشته میشود. در این کشورها جو بیشتر در مزرعه و در شرایط دیم کشت میشود و اغلب تحت تاثیر کمبود شدید آب در طی فصول خشک قرار میگیرد. بنابراین تنش خشکی یکی از مشکلات اساسی تولید جو در این مناطق میباشد و شناسایی راههای افزایش محصول و کاربرد موادی که در بالا بردن مقاومت گیاهان به این تنشها موثر هستند، ضروری میباشد. بدینمنظور در این تحقیق، تاثیر سیلیکون بر محتوای پروتئین محلول کل، رنگدانههای فتوسنتزی، میزان بیان ژن POX، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز و پرولین در دو لاین جو با تحمل متفاوت به خشکی در شرایط گلخانه بررسی شد.
مواد و روش‌ها
در این بررسی از دو لاین گیاه جو دوردیفه (Hordeum) vulgare L. با تحمل متفاوت به خشکی بهنام 20315-CB (مقاوم) و 20213CB- (حساس) تهیه شده از بخش تحقیقات غلات موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج استفاده شد. این تحقیق بر اساس طرح کاملا تصادفی در سه تکرار با سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون- خشکی در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) در سالهای 1392 تا 1393 مورد ارزیابی قرار گرفت. بذرها پس از ضد عفونی بهمدت 10 دقیقه در هیپوکلریتسدیم یک درصد، در گلدانهای پلاستیکی حاوی خاک زراعی معمولی در شرایط گلخانه کاشته شدند. میانگین دما در طی رشد (2±25 درجه سانتیگراد) و طول روز تقریبا 10 ساعت بود. تنش خشکی با کار گذاشتن بلوک گچی در گلدانها کنترل شد. نمونهبرداری در مرحله چهار برگی زمانی که پتانسیل آب خاک در تیمارهای خشکی و سیلیکون- خشکی به 1- مگاپاسگال رسید، انجام شد. نمونههای یک گرمی از برگهای سالم هر بوته برداشت شده و پس از انجماد فوری در نیتروژن مایع در فریزر 80 – درجه سانتیگراد بهمنظور استفاده در سنجشهای بعدی نگهداری شد.
سنجش میزان پروتئین محلول کل و رنگدانههای فتوسنتزی: استخراج پروتئین با استفاده از 100 میلیگرم پلیوینیلپیرولیدن در حضور 3 میلیلیتر بافر استخراج (بافر فسفاتپتاسیم 50 میلیمولار با 7pH= و سدیم متابایبیسولفیت 1 میلیمولار) صورت گرفته و پس از سانتریفیوژ بهمدت 25 دقیقه در 15000 rpm و دمای 4+ سانتیگراد توسط دستگاه سانتریفیوژ رومیزی (Allegra 64R-Beckman Coulter)، عصاره با 25 درصد حجم از گلیسرول 50 درصد (v/v) ترکیب و در دمای 80- درجه سانتیگراد تا زمان مصرف ذخیره شد. میزان پروتئین محلول کل با دستگاه اسپکتروفوتومتر (UV-3200-Labomed) بهروش Bradford سنجش شد (23). جهت اندازهگیری میزان غلظت پروتئین نمونههای گیاهی، با استفاده از غلظتهای مختلف پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA)، منحنی استاندارد رسم شد. سپس 20 میکرولیتر از نمونههای عصاره آنزیمی با یک میلیلیتر معرف بردفورد 20 درصد مخلوط شده و میزان جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر قرائت شد. جهت سنجش ژلی پروتئین محلول کل از ژل SDS-PAGEبهروش لاملی استفاده شد. برای استخراج و اندازهگیری میزان کلروفیل نیز از روش Arnon استفاده شد (24). بدینمنظور 200 ماکرولیتر بافت خرد شده برگ را با 800 ماکرولیتر استون 100 درصد v/v)) مخلوط کرده و مخلوط حاصله بهآرامی ورتکس شده و بهمدت یک ساعت در فریزر 20- درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس نمونهها با دور rpm 13000 بهمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. در ادامه محلول رویی را برداشته و برای اندازهگیری میزان کلروفیل از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده گردید. مقادیر جذب در طول موجهای 645A= و 663= B نانومتر قرائت شده و اعداد بهدست آمده در فرمولهای زیر بر حسب (µg/ml) محاسبه گردید.
(A× (2.96– (B×12.7) =کلروفیل a
B)×4.68) – (A×22.9) =کلروفیل b
(B×+ (8.02 (A×20.2) =کلروفیل کل
استخراج RNA: استخراج RNA توسط کیت RNX-plus شرکت سیناکلون از نمونههای برگ فریز شده، طبق دستورالعمل صورت گرفت. کیفیت RNA استخراج شده توسط الکتروفورز روی ژل 5/1 درصد تایید شد. تشکیل دو باند RNA ریبوزومی 28S و 18S در روی ژل نشاندهنده کیفیت سلامت RNA تخلیص شده بود. برای بررسی کمی میزان استخراج از اسپکتروفتومتر استفاده شد. در مرحله بعد RNA استخراج شده با آنزیم DNase1 بر اساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز تیمار شد.
ساخت cDNA: تهیه cDNA با استفاده از کیت RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase شرکت سیناکلون صورت گرفت. 1/0 تا 5 میکروگرم از محلول RNA کل بههمراه 1 میکرولیتر Oligo-dT و 6 میکرولیتر آب دیونیزه درون میکروتیوپ مخلوط گردید. سپس بهمدت 5 دقیقه در دمای 65+ درجه سانتیگراد و بلافاصله بهمدت 5 دقیقه روی یخ قرار داده شد. مقدار 2 میکرولیتر از محلول بافر واکنش، 1 میکرولیتر از آب دیونیزه، 2 میکرولیتر از مخلوطdNTP و 1 میکرولیتر از آنزیم RT به مخلوط واکنش اضافه شد. تیوپها بهمدت 60 دقیقه در دمای 45+ درجه سانتیگراد قرار گرفته و سپس بهمنظور توقف واکنش در دمای 70+ درجه سانتیگراد قرار داده شد. نمونهها تا زمان مصرف در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
طراحی آغازگرها برایکمیتسنجىباواکنشزنجیرهاىپلیمراز: برای طراحی آغازگرها ابتدا توالی ژن پراکسیداز و ژن خانهدار اَکتین از بانک اطلاعاتی NCBI گرفته شد و سپس با استفاده از نرمافزار Oligo5 آغازگرهای مورد نظر طراحی شد (جدول1). واکنش PCR جهت بررسی سنتز cDNA در 35 چرخه دمایی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد. شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای94 درجه سانتیگراد و بهمدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 53 درجه سانتیگراد و بهمدت 30 ثانیه، مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد و بهمدت 20 ثانیه بود .مرحله واسرشتگی اولیه در دمای94 درجه سانتیگراد و بهمدت سه دقیقه و مرحله تکثیر نهایی در دمای72 درجه سانتیگراد و بهمدت یک دقیقه انجام گرفت. نمونهها روی ژل آگارز 2/1 درصد (W/V) بارگذاری شدند و پس از الکتروفورز، عکس ژلها با استفاده از برنامه Image J آنالیز شدند.
جدول 1: مشخصات آغازگرها
|
TM (درجه سانتیگراد) |
طول قطعه |
توالی آغازگر (5´-3´) |
نام آغازگر |
|
58/32 57/25 |
132 |
AGC TGT CAC CAA ACT TCC AC AAC AGT CGT GGA AGA GGA TG |
POX |
|
58/01 51/08 |
143 |
ACC CAA AAG CCA ACA GAG AG ACC ATC ACC AGA GTC GAG AA |
ACTIN |
سنجش فعالیت پراکسیداز: فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از روشChance بهوسیله اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد (25). مخلوط واکنش شامل 750 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 70 میلیمولار با 7pH=، محلول بافر فسفات پتاسیم 100 میلیمولار با 7pH=، 750 میکرولیتر آب مقطر استریل شده، 750 میکرولیتر گوئیکول 10 میلیمولار محلول در آب مقطراستریل بود. فعالیت آنزیم پراکسیداز در طول موج 470 نانومتر و در زمان واکنش 180 ثانیه، اندازهگیری شد. برای سنجش این آنزیم روی ژل از روش Hart و همکاران استفاده گردید (26). در این روش ژل جداکننده 10 درصد و ژل متراکم کننده 4 درصد مورد استفاده قرار گرفت.
سنجش پرولین: استخراج پرولین از روش Bates و همکاران با استفاده از بافت تر برگی و معرف ناین هیدرین اسید انجام شد (27). غلظت پرولین نمونهها از روی منحنی استاندارد و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 520 نانومتر تعیین گردید.
آنالیز آماری
این تحقیق به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون –خشکی انجام شد. آنالیز دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS16 صورت گرفت و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال مربوطه و رسم نمودارها با استفاده از نرمافزار Excel انجام شد.
نتایج
در این تحقیق، اثر لاین، تیمار و اثر متقابل لاین در تیمار برای پروتئین محلول کل، رنگدانههای فتوسنتزی، بیان نیمهکمی ژن POX و میزان فعالیت پراکسیداز و پرولین مورد بررسی قرار گرفت که خلاصه تجزیه واریانس دادهها برای صفات مختلف در جدول 2 ارائه شده است.
جدول2: میانگین مربعات صفات مورد آزمایش
|
پرولین |
کلروفیل کل |
کلروفیل b |
کلروفیل a |
پروتئین محلول کل |
فعالیت پراکسیداز |
Gene POX |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
|
262/358** |
1/568** |
0/690** |
0/168** |
8/547** |
1/814** |
291/136** |
1 |
لاین |
|
5108/797** |
7/342** |
2/979** |
0/963** |
61/345** |
2/055** |
342/610** |
2 |
تیمار |
|
26/922* |
0/006ns |
0/025ns |
0/009ns |
0.000ns |
0/270** |
21/837** |
2 |
لاین× تیمار |
|
4/497 |
0/016 |
0/029 |
0/012 |
0/356 |
0/026 |
1/180 |
12 |
خطا |
|
2/15 |
5/86 |
3/13 |
10/21 |
8/29 |
4/33 |
12/77 |
|
ضریب تغییرات |
تحت تنش خشکی، میزان پروتئین کل نسبت به شاهد در هر دو لاین بهطور معنیداری کاهش یافت. کاهش محتوای پروتئین محلول کل در تیمار خشکی نسبت به شاهد در لاین مقاوم و حساس به ترتیب به میزان 2/6 و 21/6 mg/g.FW بود. در حالی که کاربرد سیلیکون میزان پروتئین محلول کل را افزایش داد. تحت تاثیر این تیمار میزان کاهش پروتئین محلول کل نسبت به شاهد 76/1 و 78/1 mg/g.FW بود. تفکیک باندهای پروتئینی نشاندهنده کاهش میزان پروتئین آنزیم روبیسکو در اثر تنش خشکی میباشد ولی با کاربرد سیلیکون شدت باندهای پروتئینی نسبت به خشکی افزایش یافت (شکل 1).
|
سیلیکون خشکی شاهد سیلیکون خشکیشاهد KDa |
|
116 2/66 45 35 25 4/18
4/14
|
شکل 1: تغییرات محتوای پروتئین کل (سمت چپ) و باندهای پروتئین محلول کل بر روی ژل SDS-PAGE در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی در دو لاین مقاوم و حساس.
میزان رنگدانههای فتوسنتزی تحت تیمار خشکی بهطور معنیداری کاهش یافت. در تیمار خشکی کاهش محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در مقایسه با تیمار شاهد در لاین مقاوم بهترتیب 74/0، 43/1 و 19/2 mg/g.FW و در لاین حساس به میزان 86/0، 29/1 و 17/2 mg/g.FW بود. سیلیکون باعث کاهش خسارات ناشی از تنش شده و میزان رنگدانههای فتنوسنتزی در اثر سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی بهطور معنیداری افزایش یافتند. بهطوریکه میزان کاهش محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در مقایسه با تیمار شاهد در لاین مقاوم بهترتیب 41/0، 3/0 و 71/0 mg/g.FW و در لاین حساس به میزان 39/0، 41/0 و 81/0 mg/g.FW بود (شکل 2). نتایج حاصل از سنجش بیان ژن POX بهصورت نیمهکمی اختلاف معنیداری را بین تیمارهای مختلف، دو لاین و اثر متقابل لاین×تیمار در سطح احتمال یک درصد نشان داد (شکل 3). میزان بیان ژن POX در تیمار سیلیکون-خشکی در هر دو لاین نسبت به تیمارهای دیگر افزایش داشته و در لاین CB-20315 میزان بیان ژن نسبت به لاین CB-20213 بیشتر بود. تجزیه واریانس دادهها (جدول 2) برای میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تنش خشکی اختلاف معنیداری را بین تیمارهای مختلف، دو لاین و اثر متقابل لاین×تیمار در سطح احتمال یک درصد نشان داد. تحت تاثیر تیمار خشکی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز نسبت به شاهد در هر دو رقم بهطور معنیداری افزایش پیدا کرد (شکل4). در این تحقیق سیلیکون باعث افزایش معنیداری در میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در هر دو رقم گردید، بهطوریکه افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تیمار سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی معنیدار بود. همچنین در تغییراتی که در مورد فعالیت آیزوزایمهای آنزیم پراکسیداز بر روی ژل اکریل آمید مشاهده شد نشان داد که تحت تیمار خشکی و سیلیکون-خشکی شدت باندها نسبت به تیمار شاهد بیشتر است که با نتایج حاصل از سنجش اسپکتروفتومتری انطباق داشت. محتوای پرولین در تیمارهای خشکی و سیلیکون + خشکی بهطور معنیداری افزایش یافت. افزایش محتوای پرولین تحت تیمار خشکی و سیلیکون + خشکی نسبت به شاهد در لاین مقاوم به میزان 2/46 و 67/59 U mol/g.FWو در لاین حساس به میزان 11/40 و 52/51 U mol/g.FWبود. سیلیکون باعث افزایش میزان پرولین تحت تنش خشکی گردید (شکل 5).
شکل 2: تغییرات محتوای رنگدانههای فتوسنتزی در تیمارهای شاهد، خشکی وسیلیکون+خشکی در لاین مقاوم و حساس.
|
سیلیکون خشکی شاهد سیلیکون خشکی شاهد |
|
POX ACTIN |
شکل 3: بیان ژن POX تحت تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی در دو لاین مقاوم و حساس.
|
سیلیکون خشکی شاهد سیلیکون خشکی شاهد
|
شکل 4: تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز (سمت چپ) و فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از ژلNative- PAGE در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی.
شکل 5: تغییرات محتوای پرولین در تیمارهای شاهد، خشکی و سیلیکون+خشکی.
بحث
در برخی از منابع پیشنهاد شده است که سیلیکون میتواند تحمل به خشکی را در گیاهان افزایش دهد. بدینمنظور در این تحقیق اثرات سیلیکون بر تنش خشکی در دو لاین گیاه جو بررسی شد. در نتایج تحقیق ما مشاهده شد که در هر دو رقم تیمار خشکی سبب کاهش میزان پروتئین میشود که این کاهش توسط سیلیکون بهطور قابل توجهی جبران گردید. Ahmad Tale و همکاران در آزمایشی اثر سیلیکون را در گیاه گندم تحت تنش خشکی در سه مرحله رشدی مورد بررسی قرار دادند. به اینمنظور از سه تیمار شاهد، خشکی و سیلیکون-خشکی استفاده کردند. نتایج نشان داد که در تیمار سیلیکون + خشکی، سیلیکون مانع از کاهش پروتئینی در شرایط تنش میشود. بهنظر میرسد که افزایش در میزان پروتئین محلول در تیمار سیلیکون در مقایسه با تیمار خشکی، بهدلیل سنتز پروتئینهای جدید و یا افزایش سطح پروتئینهای مرتبط با سازگاری و تطابق گیاه با تنش خشکی میباشد که میتوان به آنزیمهای ضداکسنده اشاره کرد که در تیمار سیلیکون بهمیزان زیادی افزایش پیدا کرده است (7). کمبود آب بهعلت کاهش دادن رنگدانههای فتوسنتزی، کاهش در فعالیت آنزیمهای فتوسنتزی به ویژه آنزیم روبیسکو، کاهش فتوسنتز و رشد، نتیجه خود را بهصورت کاهش عملکرد نمایان میسازد. در تحقیقات مختلف بین میزان فتوسنتز برگ و محتوای کلروفیل در واحد سطح همبستگی مثبتی بهدست آمده است. در این تحقیق خشکی سبب کاهش میزان رنگدانههای فتوسنتزی گردید، اما کاربرد سیلیکون سبب افزایش میزان کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل گردید. در آزمایش انجام شده توسط Shenو همکاران (28)، اثر سیلیکون و اشعه ماوراء بنفش را در جوانهزنی گیاه لوبیا در شرایط تنش خشکی مطالعه کردند. نتایج نشان داد که تنش خشکی سبب کاهش رنگدانههای فتوسنتزی میشود که با افزودن تیمار سیلیکون خسارات ناشی از تنش اکسیداتیو به رنگدانههای فتوسنتزی کاهش مییابد. آنها نشان دادند که سیلیکون باعث افزایش محتوای کلروفیل و در نهایت افزایش فتوسنتز شد. نتایج نشان داد که سیلیکون میزان بیان ژن pox و نیز میزان فعالیت آنزیم را نسبت به تیمار خشکی و شاهد افزایش میدهد. این نتایج با نتایج محققین دیگر مشابه بود. Bai و همکاران (29) تحت شرایط تنش خشکی تاثیر سیلیکون بر میزان فعالیت آنزیمهای ضداکسنده را در گیاه ذرت بررسی کردند. تحت شرایط تنش خشکی تغییر معنیداری بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در مقایسه با نمونههای شاهد مشاهده نگردید. ولی سیلیکون باعث افزایش در میزان فعالیت آنزیمهای ضداکسنده CAT،SOD ، APX و POX در هر دو رقم شد. بهطوریکه افزایش فعالیت این آنزیمها در تیمار سیلیکون+خشکی در مقایسه با تیمار خشکی معنیدار بود. Sharma و همکاران (1) افزایش در فعالیت آنزیم پراکسیداز در اثر تنش خشکی در برنج را نیز گزارش کردند. در بررسیهایی که بر روی برنج در مرحله نشاء صورت گرفت، مشخص شد که افزایش فعالیت پراکسیداز در گیاهان تحت تنش خشکی با واکنشهای اکسیدکننده بهوجودآورنده رادیکالهای آزاد و پراکسیدهای آلی همبستگی دارد و POX نقش موثری در پاکسازی H2O2 دارد. در آزمایش اثرات سیلیکون بر گیاه لوبیا توسط Polanco و همکاران (30)، غلظت سیلیکون در برگهای گیاهان تحت تیمار سیلیکون در مقایسه با گیاهان شاهد بهمیزان 33 درصد افزایش یافت. جذب کربن خالص، سرعت هدایت روزنهای، مقدار تعرق و فعالیت آنزیمهای ضداکسنده در گیاهان تحت تیمار سیلیکون نسبت به گیاهان شاهد بالاتر بود. نتایج نشان داد که سیلیکون مقاومت گیاهان را با افزایش فعالیت آنزیمهای ضداکسنده افزایش میدهد. سیلیکون باعث افزایش قابل توجهای در میزان پرولین در شرایط تنش خشکی میشود. اخیرا به نقش حفاظتی پرولین در جلوگیری از مرگ سلولی ایجاد شده توسط تنشهای اکسیداتیو توجه زیادی شده است. در این تحقیق در شرایط تنش خشکی میزان پرولین افزایش یافت، ولی با کاربرد سیلیکون افزایش قابل ملاحظهای در میزان تجمع پرولین در شرایط تنش خشکی مشاهده شد. Ozturk و همکاران (31) نیز اثرات تنش شوری بر میزان پرولین در برگهای نخود در شرایط مزرعه مورد آزمایش قرار دادند. نتایج آزمایش نشان داد که تنش شوری موجب افزایش محتوای پرولین، ولی در مقابل باعث کاهش میزان H2O2 میشود. توانایی پرولین بهواسطه تنظیمات اسمزی، ایجاد ثبات در ساختارهای سلولی و رادیکالهای آزاد بهخوبی شناخته شده است و افزایش پرولین نقش مهمی در حفاظت از آنزیمهای دخیل در سیستمهای آنتیاکسیدانتی در برابر اثرات مخرب تنش شوری دارد. کاهش در میزان H2O2 بهعلت افزایش فعالیت آنتیاکسیدانتهای آنزیمی و غیرآنزیمی میباشد که نقش مهمی را در حفاظت گیاهان از تنشهای محیطی بازی میکنند. در آزمایشی دیگر Moussa (32) اثر سیلیکون را در شرایط تنش شوری در گیاه ذرت مورد مطالعه قرار داد. میزان پرولین در تیمار شوری و تیمار سیلیکون بدون NaCl افزایش یافت، ولی در اثر تیمار سیلیکون-شوری تجمع میزان پرولین در مقایسه با نمونه شاهد معنیدار نشد.
نتیجه گیری
نتایج تحقیق حاضر نشان میدهد که سیلیکون با افزایش بیان و فعالیت آنزیمهای ضداکسنده تحت اثر تنش خشکی و کاهش محتوای رادیکالهای آزاد در سلول، مانع از خسارات اکسنده به سلولهای گیاه جو میشود. همچنین سیلیکون موجب افزایش میزان پروتئین محلول کل، رنگدانههای فتوسنتزی و میزان تجمع پرولین در هنگام تنش خشکی در این گیاه شد. در نتیجه سیلیکون میتواند در بهبود تحمل گیاه جو نسبت به تنش خشکی نقش داشته باشد. با توجه به اینکه این پژوهش در شرایط گلخانهای انجام شد، پیشنهاد میشود که در شرایط مزرعه و در شرایط تنشهای مختلف محیطی نیز مورد ارزیابی قرار بگیرد و مقادیر مختلف این عنصر بر روی این گیاه یا گیاهان دیگر برای تولید گیاهان مقاوم به تنش استفاده گردد.
- Sharma P, Dubey RS. Drought induces oxidative stress and enhances the activities of antioxidant enzymes at growing rice seedlings. Plant Growth Regulation. 2005; 46(3): 209-221.
- Anjum SA, Xie XY, Wang LC, Saleem MF, et al. Morphological, physiological and biochemical responses of plants to drought stress. African Journal of Agricultural Research. 2011; 6(9): 2026-2032.
- Ashraf M. Inducing drought tolerance in plants: recent advances. Biotechnology advances. 2010; 28(1): 169-183.
- Jaleel CA, Manivannan P, Wahid A, Farooq M, et al. Drought stress in plants: A review on morphological characteristics and pigmentscomposition. International Journal of Agriculture & Biology. 2009; 1814- 959608(305): 100-105.
- Srivalli S, Khanna-Chopra R. Delayed wheat flag leaf senescence due to removal of spikelets is associated with increased activities of leaf antioxidant enzymes, reduced glutathione/oxidized glutathione ratio and oxidative damage to mitochondrial proteins. Plant Physiology and Biochemistry. 2009; 47:663-670.
- Ariano S, Bartolomeo D, Cristos X, Andras M. Antioxidant defences in Olive trees during drought stress: changes in activity of some antioxidant enzymes. Functional Plant Biology. 2005; 32:45-53.
- Tale Ahmad S, Haddad R, Study of silicon effects on antioxidant enzyme activitie and osmotic adjustment of wheat under drought stress. Czech Journal of Genetics and Plant Breed. 2011; 47(1): 17-27.
- Vinocur B, Altman A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Current opinion in biotechnology. 2005; 16(2): 123-132.
- Yamchi A, Rastegari jazi F, Ghobadi S, Mosavi A, et al. Abundant expression of p5cs gene with the aim of increasing resistance to osmoti stresses in transgenic tobacco plants. Science and Technology of Agriculture and Natural Resources. 2004; 4: 31-39.
10. Rains D.W. Plant tissue and protoplast culture: application to stress physiology and biochemistry. In: Jones, H.G., Flowers, T.J., Jones, M.B. (eds.), Plants Under Stresses: Biochemistry, Physiology and Ecology and their Application to Plant Improvement. Cambridge University Press, Cambridge. 1989; pp: 181–196.
11. Hsu SY, Hsu YT, Kao CH. The effect of polyethylene glycol on proline accumulation in rice leaves. Biol. Plant. 2003; 46: 73–78.
12. Srinivas V, Balasubramanian D. Proline is a protein-compatible hydrotrope. Langmuir. 1995; 11(7): 2830–2833.
13. Yancey P.H. Compatible and counteracting solutes. In: Strange, K. (eds.), Cellular and Molecular Physiology of Cell Volume Regulation. CRC Press, Boca Raton, FL. 1994; pp: 81–109.
14. Kavi Kishore PB, Sangam S, Amrutha RN, Laxmi PS, et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Curr. Sci. 2005; 88(3): 424–438.
15. Ashraf M, Foolad M. Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance. Environmental and Experimental Botany. 2007; 59(2): 206-216.
16. Delauney AJ, Verma DPS. Proline biosynthesis and osmoregulationin plants. Plant J. 1993; 4(2): 215–223.
17. Balakhnina T, Borkowska A. Effects of silicon on plant resistance to environmental stresses: review. International Agrophysics. 2013; 27(2): 225-232.
18. Lovering TS, Engel C. Significance of accumulator plants in rock weathering. Bulletin of the Geological Society of America. 1959; 70(12): 781–800.
19. Sonobe K, Hattori T, An P, Tsuji W, et al. Diurnal variations in photosynthesis, stomatal conductance and leaf water relation in sorghum grown with or without silicon under water stress. Journal of plant nutrition. 2009; 32(3): 433-442.
20. Liu JJ, Lin SH, Xu PL, Wang XJ, et al. Effects of exogenous silicon on the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation in chilling-stressed cucumber leaves. Agricultural Sciences in China. 2009; 8: 1075-1086.
21. Lee SK, Sohn EY, Hamayun M, Yoon JY, et al. Effect of silicon on growth and salinity stress of soybean plant grown under hydroponic system. Agroforestry systems. 2010; 80(3): 333-340.
22. Ma JF, Yamaji N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in plant science. 2006; 11(8): 392-397.
23. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976; 72: 248-254.
24. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology. 1949; 24(1):1-15.
25. Chance B, Maehly AC. Assay of catalases and peroxidases. Methods in enzymology. 1955; 2: 764-775.
26. Hart MA, Tyson H. Bloomberg R. Measurement of activity of peroxidase isoenzymes in flax (Linum usitatissimum). Canadian Journal of Botany. 1971; 49: 2129-2137.
27. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and soil. 1973; 39: 205-207.
28. Shen X, Zhou Y, Duan L, LI Z, et al. Silicon effects on photosynthesis and antioxidant parameters of soybean seedlings under drought and ultraviolet-B radiation. Journal of plant physiology. 2010; 167(15): 1248-1252.
29. Bai L, Sui F. Effect of soil drought stress on leaf of maize. Pedosphere. 2006; 16(3): 326-332.
30. Polanco LR, Rodrigues FA, Nascimento KJT, Cruz MFA, et al. Photosynthetic gas exchange and antioxidative system in common bean plants infected by Colletotrichum lindemuthianum and supplied with silicon. Tropical Plant Pathology. 2014; 39(1): 35-42.
31. Ozturk L, Demir Y, Unlukara A, Karatas I, et al. Effects of long-term salt stress on antioxidant system, chlorophyll and proline contents in pea leaves. Rom Biotech Lett. 2012; 17: 7227-7236.
32. Moussa HR. Influence of exogenous application of silicon on physiological response of salt-stressed maize (Zea mays L.). International Journal of agriculture and Biology. 2006; 8(2): 293-297.
)