نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کدپستی: 8349-8-38156
چکیده
هدف: در این پژوهش تاثیر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی زیستی، مورفولوژی و خصوصیات بیوشیمیایی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) بررسی شد. مواد و روشها: MSCs تا سه پاساژ کشت و سپس با غلظت های 6/0، 3 و 6 نانوگرم، میکروگرم و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در زمان‌های 12، 24 و 36 ساعت تیمار شد. توانایی زیستی با تست متیل تیازول تترازولیوم بررسی و دوزهای 6 نانوگرم، میکروگرم و میلیگرم بر میلیلیتر و زمان 36 ساعت برای ادامه مطالعه انتخاب گردید. تکثیر سلولی بر اساس توانایی تشکیل کلونی و دو برابر شدگی جمعیتی (PDN) ارزیابی و مورفولوژی سلولها توسط رنگ آمیزی فلوروسنت بررسی شد. همچنین میزان کلسیم تام و فعالیت آنزیمهای آلکالین فسفاتاز، لاکتات دهیدروژناز، آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانس آمیناز مورد مطالعه قرار گرفت. دادهها با روش ANOVA آنالیز شد. نتایج: توانایی زیستی در زمان 36 ساعت توسط همه غلظتها کاهش معنیدار داشت. دوزهای تیماری باعث تغییر در مورفولوژی هسته و سیتوپلاسم و همچنین کاهش معنیدار تعداد و قطر کلونی بهصورت وابسته به دوز شد. تیمار با دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر باعث کاهش معنیدار PDN در روزهای 1، 3 و 6 روز و کاهش فعالیت آنزیمهای لاکتات دهیدروژناز، آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانس آمیناز نیز توسط همه دوزها مشاهده شد. افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و میزان کلسیم تام در اثر تیمار با دوزهای 6 نانوگرم و میکروگرم مشاهده شد. در حالیکه دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر هیچگونه اثری بر میزان کلسیم تام و آلکالین فسفاتاز نداشت. نتیجه گیری: غلظتهای میلیگرم اسید بوریک اثر سمی بر MSCs دارد ولی در مورد غلظتهای نانو و میکروگرم با توجه به تاثیر مثبت بر برخی فاکتورها تحقیقات بیشتر پیشنهاد میشود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigation of the effect of boron on the rat bone marrow mesenchymal stem cells
نویسندگان [English]
- MH A
- B M
چکیده [English]
Aim: In the present study, the effect of different dose of boric acid (B) on viability, morphology and some biochemical characteristic of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were investigated. Material and Methods: MSCs after 3rd passage was treated with 0.6,3 and 6 nano,micro and milligram/ml of B for 12,24 and 36hrs. The viability was estimated using 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and the dose of 6 Nano, micro and milligram/ml and 36hrs was chosen to continue the investigation. The cell proliferation base on colony forming assay and population doubling number (PDN) was studied; also the morphology of the cells was investigated using florescent dye. The concentration of total calcium and the activity of the enzymes Alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase and alkaline phosphatase was estimated. Data was analyzed using ANOVA. Results: Treatment of the cells with all the doses caused the viability to decrease significantly after 36hrs. Morphology of the nuclei and cytoplasm as well as number and diameter of the colonies showed significant reduction due to the treatments. Whereas treatment with 6mg/ml caused significant decrease of the PDN after 1, 3 and 6days. In addition significant decrease of the activity of Alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase were observed in response to treatment with all the doses. Treatment with 6ng and µg/ml caused significant increase in the alkaline phosphatase activity and total calcium concentration, whereas 6mg/ml left no effect on total calcium level and alkaline phosphatase activity. Conclusion: Treatment of MSCs with mg dosage of B showed toxicity, but regarding some factors we observed positive results with respect to nano and microgram dosage, therefore more research is recommended.
کلیدواژه‌ها [English]
- Alkaline phosphatase
- bone marrow mesenchymal stem cells
- boric acid
- Viability
- Transaminase
مقدمه
بور (B) با عدد اتمی 5، تنها نافلز در میان عناصر گروه IIIA جدول تناوبی و دارای خواص بین فلز و نافلز می‌باشد. بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و نتایج مطالعات نشان داده که این عنصر میتواند بهعنوان یک ریزمغذی اساسی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود (1). غذاها با منشا گیاهی نظیر خشکبار، میوههای خشک و تازه، بقولات، سبزی ها منبع اصلی این عنصر هستند (2). بور در حالت طبیعی از مواد غذایی مختلف در روده و معده جذب و بهشکل اسید بوریک در خون بهگردش در می‌آید (3). با وجود اینکه از کلسیم، فسفر و ویتامین D (کله کلسیفرول) بهعنوان ریزمغذی‌های اصلی در فرایند معدنی شدن استخوان نام برده میشود، اما علاوه بر این عناصر، بور دارای خواص مهمی است که از نظر بالینی توجه زیادی را به خود معطوف داشته است و به عنوان عنصر مکمل، از عملکرد کلسیم، منیزیم و ویتامین D حمایت می‌کند (4). بور از طریق تاثیرگذاری بر عملکرد کلیه، دفع ادراری کلسیم و منیزیم را کاهش داده و میزان کلسیم یونیزه در خون را افزایش می‌دهد (5). در سالهای اخیر مطالعاتی بر روی تاثیر بور و مشتقات آن بر توانایی زیستی سلولهای مختلف انجام گرفته است. از جمله این تحقیقات مطالعه هاآکی و همکاران (6) بر روی اثرگذاری اسید بوریک بر سلولهای پیش استئوبلاست MC3T3-E1 می‌باشد. توانایی زیستی این سلولها در دوز 1000 نانوگرم بر میلیلیتر در مدت زمان 24 ساعت کاهش داشت ولی در طولانی مدت (2، 5 و 14 روز) تفاوتی با گروه کنترل نشان نداد. علاوه بر توانایی زیستی، میزان تکثیر سلولها در طولانی مدت کاهش کمی داشت اما این کاهش نسبت به کنترل دارای تفاوت معنیدار نبود. در حالیکه در مطالعهای که توسط یینگ و همکاران (7) بر روی تمایز سلولهای مزانشیم مغز استخوان (BMSCs) انجام شد، غلظت 1000 نانوگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در تیمار 4، 7 و 14 روز، میزان تکثیر سلولها را در مقایسه با کنترل کاهش داد. دیمرسی و همکاران (8) بر روی تیمار سلولهای بنیادی مزانشیم دندان انسان (hTGSCs) با سدیم پنتابورات پنتاهیدرات (NaB) پرداختند. در این تحقیق که در جهت بررسی اثر NaB بر شاخصهای زیستی و تمایزی سلولهای مزانشیم دندان پس از انجماد و ذوب نمودن در حضور Me2SO انجام گرفت، دوز 20 میکروگرم بر میلیلیتر NaB با غلظت 5 درصد Me2SO نقش محافظتی بر حیات سلولها را نشان داد ولی دوز 200 تا 700 میکروگرم بر میلیلیتر اثر سمی بر سلولها داشت.
سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سلولهای پرتوانی بوده که بهراحتی تخلیص و تکثیر شده و توانایی تمایز به انواع سلولهای استخوانی، غضروفی و چربی را دارا میباشند و میتوان از آن‌ها در پیوندهای اتولوگ استفاده کرد (9). این سلولها علاوه بر مغز استخوان در بافت هایی نظیر بافت چربی، پرده سینویال و عضله اسکلتی یافت میشوند (10). بهدلیل اهمیت سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان در فرآیند تشکیل و ترمیم بافت استخوان و با توجه وجود گزارشاتی مبنی بر اثر مثبت بور بر سلامت استخوان از یک طرف و وجود برخی از تناقضات موجود در مطالعات پیشین در رابطه با میزان دوز و زمان تاثیر عنصر بور بر سلولهای مزانشیم از طرف دیگر، هدف از این مطالعه بررسی تاثیر دوزهای متفاوت در زمان‌های متفاوت از عنصر بور بر توانایی زیستی، تکثیر، مورفولوژی و برخی خواص بیوشیمیائی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان بود تا بتوان درک بهتری از اثرات مثبت یا منفی دوزهای متفاوت از این عنصر بهدست آورد.
مواد و روشها
کلیه مواد مورد استفاده در این تحقیق از شرکت Sigma-Aldrich تهیه شد مگر در مواردی که ذکر شده است. در این مطالعه تجربی از موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 50 روز و وزن 20 ± 140 گرم استفاده شد. حیوان مورد استفاده در این پژوهش پس از خریداری از انسیتو پاستور در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط دمایی 3 ± 27 درجه سانتیگراد و با دسترسی مناسب به غذا و آب در قفسهای پلی اتیلن نگهداری شد. با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، موشها بهکمک دی اتیلن اتر بیهوش شده، استخوانهای ران و ساق پای آن‌ها جدا و سپس بافت‌های پیوندی اطراف استخوان‌ها به طور کامل پاک گردید. استخوان‌ها در محیط کشت DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco Company) حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco Company) و پنی‌سیلین- استرپتومایسین (Gibco Company) در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفته، به زیر هود لامینار منتقل شد. دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با عمل فلاشینگ خارج و بهداخل لوله فاکون حاوی محیط کشت کامل هدایت و سپس بهمدت 5 دقیقه در rpm2500 سانتریفیوژ شد. محیط رویی خارج و رسوب سلولی در پنج میلیلیتر محیط تازه معلق گردید و در فلاسک T25 کشت و در انکوباتور CO2 دار (دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO2) انکوبه گردید. بعد از 24 ساعت محیط رویی که دارای سلولهای غیرچسبنده بود، خارج شده و سپس بهمدت 14 روز هر سه روز یکبار محیط سلولها تعویض گردید. زمانیکه کف فلاسک به تراکم بالایی از سلول رسید، سلولها با کمک Trypsin/EDTA(Gibco Company) از کف فلاسک جدا و به فلاسکهای جدید منتقل شدند. برای بهدست آوردن خلوص بالا از این سلولها سه مرحله پاساژ تکرار شد.
سنجش توانایی زیستی: برای بررسی تاثیر اسید بوریک (شرکت مرک آلمان) بر توان زیستی سلولها و یافتن دوز موثر، سلولهای پاساژ سوم با تراکم 15000 سلول در پلیت 96 خانه کشت داده شدند، پس از 24 ساعت تحت تیمار با غلظتهای 6/0، 3 و 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در زمان‌های 12، 24 و 36 ساعت قرار گرفته و تعویض محیط کشت هر سه روز یکبار انجام و در پایان این زمان‌ها درصد بقای سلولی با روش MTT مورد بررسی قرار گرفت.
در تست متیل تیازول تترازولیوم (MTT) سلولهای تیمار شده پس از زمان های تیمار دو بار با PBS شستشو داده شد و به آن‌ها 100 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم و 10 میکرولیتر MTT (5 میلیلیتر بر میلیلیتر) اضافه و در انکوباتور بهمدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد، انکوبه شد. پس از آن محیط رویی بهآرامی حذف گردیده و به کریستالهای فورمازان حاصل، محلول دی متیل سولفوکسید (DMSO) اضافه و جذب نوری محلول حاصله با دستگاه ELISA-reader (مدل Elisa Reader Medical ساخت شرکت SCO GmbH کشور آلمان) در طول موج 505 نانومتر اندازه گیری شد. تعداد سلولهای زنده پس از رسم گراف استاندارد با استفاده از فرمول Y=0.016X+0.037 و R2=0.996 محاسبه گردید، لازم بهذکر است در این فرمول Y جذب و X تعداد سلولهای زنده می باشد (11).
از آنجائیکه در مدت زمان 36 ساعت همگی دوزها باعث کاهش توانائی حیات بود، لذا دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک و مدت زمان تیمار 36 ساعت برای ادامه مطالعه انتخاب و مابقی تستها با این دوزها و زمان انجام گردید.
بررسی مورفولوژی: پس از تیمار سلولها، مورفولوژی هسته با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست (1 میکروگرم) و مورفولوژی سیتوپلاسم با استفاده از رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ (0.01gr/ml) بررسی و توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus IX70-Japan) مجهز به دوربین (مدل DP71) عکسبرداری شدند. سپس قطر هستهها و مساحت سیتوپلاسم بهکمک نرم افزار موتیک (Motic) اندازهگیری و مقایسه گردید (12).
بررسی میزان توان تکثیر: برای بررسی توان کلونیزایی، سلولهای پاساژ سوم با تراکم 50000 در پلیتهای تکخانه، بهمدت 7 روز کشت شد. در پایان سلولها دو بار با PBS شسته و با رنگ کریستال ویولت بهمدت 5 دقیقه رنگ آمیزی گردید. کلونیهای تشکیل شده در گروه کنترل و تیمار در زیر میکروسکوپ مشاهده و شمارش گردید، همچنین قطر کلونیها نیز با کمک نرم افزار موتیک اندازهگیری شد (13).
برای بررسی میزان دوبرابرشدگی جمعیت (PDN)، تعداد 20 هزار سلول در پلیت تکخانه کشت داده شد و سپس محیط سلولها با غلظتهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک در زمان‌های 1، 3 و 6 روز جایگزین گردید. سلولها تریپسینه و مورد شمارش قرار گرفتند و PDN با استفاده از فرمول logN/N0×3.31، (N0 تعداد سلول در آغاز کشت و N تعداد سلول در پایان کشت) محاسبه گردید (13).
اندازه گیری فاکتورهای بیوشیمیایی: سلولهای تیمار داده شده با غلظتهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر بهمدت 36 ساعت، پس از تریپسینه شدن و شستشو با بافر (4/7pH= ، Tris-Hcl)، بهکمک نیتروژن مایع سائیده و پس از لیز شدن در rpm12000 بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. میزان پروتئین موجود در محلول رویی بهکمک روش لاوری و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) بهعنوان استاندارد اندازه گیری شد. بهمنظور بهدست آوردن فعالیت آنزیمی بر حسب واحد بین المللی در لیتر بر گرم پروتئین (U/L) میزان فعالیت آنزیم هر نمونه بهمقدار پروتئین تام آن نمونه تقسیم شد.
جهت بررسی فعالیت آنزیمهای لاکتات دهیدروژناز (LDH) (کد محصول 1400022)، آلانین ترانس آمیناز (ALT) (کد محصول 1400019) و آسپارتات ترانس آمیناز (AST) (کد محصول 1400018) از کیتهای شرکت پارس آزمون (تهران- ایران) استفاده شد. طبق پروتکل کیتها 10 میکرولیتر از نمونه را با یک میلیلیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England) قرائت شد.
همچنین در بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) از کیت پارس آزمون (کد محصول 1400002) استفاده شد و بر اساس روش ارائه شده توسط شرکت میزان 20 میکرولیتر از نمونه با یک میلیلیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 405 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England) قرائت شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد بر میلیگرم پروتئین محاسبه گردید.
میزان کلسیم تام داخل سلولی با کمک کیت کلسیم شرکت پارس آزمون ( کد محصول 1400007) اندازهگیری شد. در این روش 20 میکرولیتر نمونه سلولی با یک میلیلیتر محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 570 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر (PG Instrument Company, England) اندازهگیری شد.
آنالیز آماری: با استفاده از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (one way) و تست Tukey دادههای بهدست آمده آنالیز و تفاوت میانگینها در سطح 05/0p< معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
در این مطالعه نتایج تست MTT نشان داد که کاهش توانایی زیستی سلولها وابسته بهزمان است (جدول 1). کاهش معنیدار توانایی زیستی سلولها در تیمار 12 ساعته از دوز 6 میکروگرم شروع شد، در صورتیکه این کاهش معنی دار (05/0p<) در تیمار 24 ساعته از دوز 6 نانوگرم و در 36 ساعته از دوز 6/0 نانوگرم مشاهده شد. در 36 ساعت دوزهای میلیگرم نیز نسبت به هم دارای تفاوت معنیدار بودند (001/0(p<. از طرفی با توجه به اینکه دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم در زمان 36 ساعت نسبت به یکدیگر اختلاف معنیدار داشتند برای ادامه بررسیها تیمار سلولها با این دوزها در زمان 36 ساعت انجام شد.
جدول 1: مقایسه میانگین توانایی زیستی سلولها پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف اسید بوریک توسط تست MTT. مقادیر به صورت mean±SD می‌باشد. میانگین ها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می‌باشد(05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).
|
زمان (ساعت) دوز |
12 |
24 |
36 |
|
0 |
68/32a ±59/0 |
56/34a ±10/0 |
93/34a ±31/0 |
|
ng/ml6/0 |
06/32a ±68/0 |
06/34a ±22/0 |
06/28 b ±34/0 |
|
ng/ml3 |
43/31a ±43/0 |
03/34a ±06/0 |
81/27 b ±22/0 |
|
ng/ml6 |
31/31a ±56/0 |
12/33b ±25/0 |
75/27 b ±25/0 |
|
µg/ml6/0 |
20/31a ±78/0 |
12/33b ±43/0 |
70/27 b ±34/0 |
|
µg/ml3 |
12/31a ±81/0 |
12/33b ±43/0 |
68/27 b ±25/0 |
|
µg/ml6 |
62/30b ±43/0 |
77/29c ±15/0 |
50/26 c ±16/0 |
|
mg/ml6/0 |
37/30b ±59/0 |
75/29c ±16/0 |
37/26 c ±40/0 |
|
mg/ml3 |
75/30b ±37/0 |
68/29c ±12/0 |
93/23 d ±22/0 |
|
mg/ml6 |
06/30b ±66/0 |
56/29c ±06/0 |
75/22 e ±22/0 |
دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر باعث کاهش معنی دار(05/0p<) PDN(جدول 2) در روزهای 1 و 3 در مقایسه با کنترل شد ولی این تغییر در دوزهای 6 نانو و میکرو گرم مشاهده نشد. در صورتیکه در تیمار 6روزه، تمام دوزها کاهش معنیداری (05/0p<) را نسبت به کنترل نشان دادند. از طرفی مشاهدات نشان داد که تیمار سلولها در مدت زمان 7 روز باعث کاهش معنیدار (05/0p<) در تعداد و قطر کلونیها نسبت به کنترل شد. این در حالی است که دوز 6 میلی گرم بر میلیلیتر مانع تشکیل کلونی توسط سلولها در مدت زمان 7 روز شد لذا در نتایج هیچگونه کلونی گزارش نشده است (جدول 3). مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی در شکل 1 نیز تایید کننده نتایج کمی موجود در رابطه با تعداد و قطر کلونی می‌باشد.
جدول2: مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونیهای تشکیل شده توسط سلولهای مزانشیم مغز استخوان رت پس از 7روز تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک. مقادیر بهصورت mean±SD می‌باشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می‌باشد(05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).
|
زمان (7روز) دوز |
میانگین تعداد |
میانگین قطر (میلی متر) |
|
0 |
33/86a ±51/3 |
95/2a ±11/0 |
|
ng/ml6 |
67/80b ±30/2 |
83/1b ±05/0 |
|
µg/ml6 |
66/75c ±50/6 |
00/1c ±04/0 |
|
mg/ml6 |
00/0 d ±00/0 |
00/0 d ±00/0 |
جدول 3: مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در روزهای 1، 3 و 6 روز پس از تیمار با اسید بوریک (6 نانو، میکرو و میلی گرم). مقادیر بهصورت mean±SD می‌باشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می‌باشد (05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).
|
زمان
دوز |
میانگین logN/N0 × 3.31 1روز |
میانگین logN/N0 × 3.31 3روز |
میانگین logN/N0 × 3.31 6روز |
|
0 |
10/2a ±38/0 |
31/3a ±04/0 |
95/3a ±02/0 |
|
ng/ml6 |
08/2a ±10/0 |
27/3a ±02/0 |
75/2b ±04/0 |
|
µg/ml6 |
05/2a ±07/0 |
25/3a ±07/0 |
42/1c ±03/0 |
|
mg/ml6 |
25/1b ±30/0 |
11/2b ±17/0 |
00/1 d ±03/0 |
شکل 1: تصاویر میکروسکوپی (بزرگنمایی ×200) و ماکروسکوپی کلونیهای تشکیل شده توسط سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان تیمار شده با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک پس از مدت زمان 7 روز.
در مدت زمان 36 ساعت تغییرات مورفولوژیک هسته سلولها شامل متراکم شدن و تغییر شکل هسته در مقایسه با کنترل مشاهده شد (شکل 2). در آنالیز آماری داده ها نیز کاهش معنیدار (05/0p<) قطر هسته ها (جدول 4) بهصورت وابسته به دوز نسبت به گروه کنترل دیده شد. رنگ آمیزی آکریدین اورنژ نیز چروکیدگی و کوچک شدن سیتوپلاسم را در دوزهای 6 میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر در مقایسه با کنترل نشان داد، درصورتیکه این تغییرات در دوز 6 نانو گرم نسبت به کنترل مشاهده نمیشود (شکل 3). آنالیز آماری دادهها نیز موید نتایج میکوسکوپی بوده و کاهش معنیدار (05/0p<) مساحت سیتوپلاسم (جدول 4) را در دوزهای 6 میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به گروه کنترل نشان می‌دهد.
فعالیت آنزیمهای آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز در دوز 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل کاهش معنیدار داشتند(05/0p<). علاوه بر این میزان کاهش فعالیت این آنزیمها در تیمار 6 میلیگرم بر میلیلیتر نسبت به دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر نیز معنیدار(001/0(p< بود (جدول 5). میزان فعالیت آنزیمهای آلکالین فسفاتاز در دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و تیمار 6 میلیگرم افزایش معنی دار(05/0p<) نشان داد. در حالیکه مشاهده شد تیمار سلولها با دوز 6 میلیگرم بر میلیلیتر تفاوت معنیداری نسبت به کنترل نداشت است (جدول 5). از طرفی نیز غلظت کلسیم تام در دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر نسبت به کنترل و دوز 6 میلی گرم بر میلیلیتر افزایش معنی دار(05/0p<) داشت، لازم بهذکر است میزان کلسیم تام دردوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر نسبت به یکدیگر نیز دارای تفاوت معنیدار بودند (05/0p<) (جدول 6).
جدول4: مقایسه میانگین قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک. مقادیر بهصورت mean±SDمی‌باشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می باشد (05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).
|
زمان (7روز) دوز |
میانگین قطر هسته (µm) |
میانگین مساحت سیتوپلاسم (sqµm) |
|
0 |
93/11a ±15/0 |
83/4001a ±52/35 |
|
ng/ml6 |
23/11a ±11/0 |
56/3998a ±40/28 |
|
µg/ml6 |
63/9b ±15/0 |
96/2752b ±05/20 |
|
mg/ml6 |
83/6 c ±11/0 |
33/1550 c ±52/12 |
شکل 2: رنگآمیزی فلورسنت سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ هوخست پس از 36 ساعت. a) کنترل، (b) 6 نانو، (c) 6 میکرو و (d) 6 میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک (بزرگنمایی ×200).
شکل 3: رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت بار رنگ فلوروسنت آکریدین اورنژ پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای (b) 6 نانو، (c) 6 میکرو و (d) 6 میلی گرم بر میل لیتر اسید بوریک در مقایسه با گروه کنترل (a) (بزرگ نمایی ×200).
جدول 5: مقایسه میانگین فعالیت (U/L) آنزیمهای آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، آلانین ترانس آمیناز (ALT)، لاکتات دهیدروژناز (LDH) و آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک. مقادیر بهصورت mean±SD می‌باشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می‌باشد (05/0p<)، Tukey,s، one way ANOVA).
|
آنزیم دوز |
AST |
ALT |
LDH |
ALP |
|
0 |
34/0a ±00/0 |
39/0a ±00/0 |
51/0a ±10/0 |
04/0a ±00/0 |
|
ng/ml6 |
29/0b ±00/0 |
33/0b ±01/0 |
43/0b ±01/0 |
08/0b ±00/0 |
|
µg/ml6 |
28/0b ±01/0 |
34/0b ±01/0 |
39/0b ±02/0 |
15/0b ±01/0 |
|
mg/ml6 |
11/0 c ±10/0 |
12/0 c ±1/0 |
17/0 c ±00/0 |
03/0 a ±01/0 |
جدول 6: مقایسه میانگین میزان کلسیم تام داخل سلولی (میلیگرم بر دسیلیتر) سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک. مقادیر به صورتmean±SDمی‌باشد. میانگینها با کد حرفهای متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنیدار می باشد (05/0p<)، Tukey,s ، one way ANOVA).
|
غلظت کلسیم (میلیگرم بر دسیلیتر) |
زمان (36 ساعت) دوز |
|
01/1a ±10/0 |
0 |
|
03/2b ±05/0 |
ng/ml6 |
|
60/3 c ±11/0 |
µg/ml6 |
|
03/1a ±01/0 |
mg/ml6 |
بحث
علیرغم بدیهی بودن ضرورت بور برای گیاهان، تاکنون اهمیت آن برای انسان و جانوران بهطور کامل مشخص نشده است. گزارش شده است که بور بهدلیل وجود کنترل هموستاتیکی مانند سیستم دفعی بدن (ادرار و عرق)، برای انسان و جانوران فاقد مسمومیت می‌باشد (14). از طرفی نیز تحقیقات در زمینههای گوناگون تاثیرات مثبت بور را بر تشکیل، ترکیب و شاخصه های فیزیکی استخوان نشان می‌دهد (15 و 16). لذا این مطالعه سلولی در جهت مشخص نمودن نقش بور بر روی برخی از شاخصه های بیوشیمیایی، مورفولوژی و توانائی حیات سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان بهعنوان پشتوانهای در ترمیم و بازسازی استخوان، در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) انجام گرفت.
این تحقیق بر روی سلولهای مزانیشمی مغز استخوان نشان داد که عنصر بور در هر غلظتی میتواند باعث کاهش توانائی حیات و تغییرات مورفولوژیک شامل کاهش در قطر هسته و مساحت سیتوپلاسمی، احتمالا بهدلیل اختلال در تشکیل نوکلئوپروتئینها و پروتئینهای سیتواسکلتون سلولی، پس از چندین ساعت شود، این کاهش اگر چه وابسته به زمان است ولی وابسته به دوز نمیباشد. در مطالعهای که توسط هاآکی و همکاران (6) انجام شده است، مشخص گردید که اسید بوریک در غلظت 1 میکروگرم بر میلیلیتر در کوتاه مدت (24 ساعت) موجب کاهش توانایی زیستی سلولهای پیش استئوبلاست MC3T3-E1 میگردد. در مطالعه فوق الذکر اگرچه سلولهای از نظر رده با سلولهای مزانشیم مشابه نیستند ولی تیمار کوتاه مدت هاکی و همکاران موید نتایح حاضر است.
نتایج دوبرابر شدگی جمعیت سلولی (PDN)، کاهش تعداد جمعیت سلولی را پس از 6 روز در تیمار با همه دوزها نشان داد. در صورتیکه تنها دوز 6 میلی گرم بر میلیلیتر باعث کاهش تعداد جمعیت سلولی در 1و 3 روز شد. از طرفی تست توانایی تشکیل کلونی (CFA) پس از 7 روز نیز نشان داد که با افزایش دوز، تعداد کلونی و قطر آن‌ها کاهش یافت. به گونهای که در دوز 6 میلی گرم بر میلیلیتر هیچگونه کلونی تشکیل نشد. در مطالعه هاآکی و همکاران (6) در تیمار طولانی مدت (5 و 14 روز) سلولها با دوز 1 میکروگرم هیچگونه کاهشی در توانائی تکثیر و حیات سلولی مشاهده نشد. در صورتی که یینگ و همکاران (7) در مطالعه ای که بر روی تمایز سلولهای مزانشیم مغز استخوان انسان به استئوبلاست انجام دادند اعلام نمودند که تیمار با دوز 1 میکروگرم بر میلیلیتر (معادل 1000 نانوگرم گرم) اسید بوریک در طولانی مدت (4، 7 و 14 روز) کاهش توانائی تکثیر و توانائی زیستی را بهدنبال دارد.
در مطالعات فوق الذکر که اثر طولانی مدت بور را بررسی کردهاند علاوه بر اینکه نوع مطالعه و رده سلولی متفاوت است نتایج نیز کاملا با یکدیگر مغایرت دارند. مطالعه حاضر نیز بر روی سلولهای مزانشیم مغز استخوان به عنوان پیش ساز سلولهای استئوبلاست انجام شده است ولی بهر حال مشخص می کند که غلظتهای کم ( نانو و میکروگرم بر میلیلیتر) اگرچه در 1 و 3 روز تاثیری ندارند ولی در طولانی مدت دارای اثر مسمومیت می‌باشد و حتی اثرات مسمومیت در غلظتهای زیاد (میلیگرم بر میلیلیتر) بهصورت بارزتر دیده میشود. این مطالعه تایید کننده مطالعه یینگ و همکاران می‌باشد. بهصورتی که با گذشت زمان احتمالا تحمل مسمومیت در سلولهای مزانشیم نسبت به دوزهای کم از بین رفته و لذا این تحمل در رابطه با دوزهای نانو و میکروگرم از بور دیده نمیشود. در تحقیقی که توسط دیمرسی و همکاران (8) بر روی تاثیر سدیم پنتابورات پنتاهیدرات (NaB) بر توانایی زیستی سلولهای مزانشیم دندان انسان در فرآیند انجماد در زمان‌های 1، 2 و 3 روز صورت گرفت، مشخص شد که غلظت 20 تا 100 میکروگرم بر میلیلیتر هیچگونه اثر منفی بر روی سلولها نداشته است و حتی در غلظت 20 میکروگرم بر میلیلیتر باعث افزایش مقاومت غشایی در سلول شده است، اما در غلظتهای بالاتر (200 تا 700 میکروگرم بر میلیلیتر) القا سمیت را در سلولها بههمراه داشت است، که میتواند تاییدی باشد بر اینکه عنصر بور بر سیستمهای بیولوژیک و حیات سلولی در صورت استفاده مداوم دارای اثر سوء است.
برای بررسی بیشتر اثر عنصر بور، در مطالعه حاضر میزان سطح آنزیمهای آلکالین فسفاتاز و غلظت کلسیم تام سنجیده شد. آنزیم آلکالین فسفاتاز، آنزیم غشایی بوده (17 و 18) و باعث تجزیه پیروفسفات در سلول میشود که متعاقبا ورود کلسیم را نیز امکانپذیر میسازد (19). میزان فعالیت این آنزیم و غلظت کلسیم تام در غلظتهای کم (نانو و میکروگرم بر میلیلیتر) اسید بوریک نسبت به گروه کنترل افزایش معنیدار را نشان داد درصورتیکه سطح آنزیمهای آلکالین فسفاتاز و کلسیم تام، در تیمار 6 میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک تفاوتی با کنترل نداشت. در مطالعه یینگ غلظت 10 و 100 نانوگرم اسید بوریک در 7 روز منجر به افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و افزایش بیان ژنهای این آنزیم نسبت به گروه کنترل شد، همچنین از طرفی رسوب کلسیم تام در دوز 1 و 10 نانوگرم اسید بوریک در تیمار 21 روز افزایش و در دوز 100 و 1000 نانوگرم اسید بوریک کاهش داشت (7). با توجه به هم راستا بودن نتایج ما با مطالعات قبلی در زمینه تاثیرگذار بودن مقادیر کم بور بر میزان فعالیت آنزیمهای آلکالین فسفاتاز و همچنین میزان کلسیم تام به عنوان فاکتورهای کلیدی در استخوان سازی، میتوان گفت که این عنصر نقش مثبتی را بازی می‌کند، ولی از طرف دیگر ممکن است افزایش میزان کلسیم بهدلیل اختلال بهوجود آمده از تاثیر بور بر روی کانالهای کلسیم در غشا سلولی یا رسپتورهای کلسیم وابسته به ATPase شبکه آندوپلاسمی باشد که در غلظتهای کم این عنصر بهوجود آمده است. در مطالعه حاضر غلظت کلسیم تام در دوز بالا اسید بوریک در سطح کنترل قرار گرفت، این ممکن است بهدلیل آن باشد که در این دوز عنصر بور با تاثیر بر پتانسیل غشا باعث ایجاد مسمومیت شده که میتواند 1) جایگزین کلسیم در سلول شده و از ورود کلسیم بهداخل سلول ممانعت کند و حتی باعث خروج کلسیم از سلول شود 2) در غلظتهای بالا، بور باعث غیر فعال شدن کانالهای کلسیم شده و نقش مهار کنندگی بر آن‌ها دارد. نتایج مطالعه هیندرسون و همکاران (20) نشان می‌دهد که اسید بوریک با مهار رسپتورهای ریانودین (ryanodine) مانع آزادسازی کلسیم از شبکه آندوپلاسمی به سیتوزول میشود. لذا این امکان وجود دارد که دوزهای پایین تر بور بتواند اثر مثبت را بر رسپتورهای کلسیم بگذارد و افزایشی که در میزان آن رخ می‌دهد را ناشی شود ولی در غلظتهای بالا تر این اثر مثبت از بین میرود.
در ادامه مطالعه حاضر تاثیر عنصر بور بر فعالیت آنزیمهای دخیل در متابولیزم سلولی مانند فعالیت آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز مورد بررسی قرار گرفت که با افزایش دوز تیماری، کاهش فعالیت این آنزیمها را شاهد بودیم. در مطالعه انجام شده بر روی سلولهای سرتولی که توسط کییو و همکاران (21) انجام گرفت، دوز 3 تا 10 میلیمولار (معادل 18/0 تا 6/0 میلیگرم بر میلیلیتر) اسید بوریک باعث کاهش معنیدار سطح لاکتات، پیروات و ATP (بهترتیب بهمیزان 30، 60 و 17 درصد) در مدت زمان 24 ساعت شد (21). از آنجاییکه بور مهارکننده رقابتی دو دسته از آنزیمها شامل دسته اول: آنزیمهای اکسیدوردوکتاز و دسته دوم: آنزیمهایی که وابسته به کوآنزیمهای نوکلئوتیددار چون NAD و FAD می‌باشد (22)، لذا کاهش فعالیت مشاهده شده در آنزیمهای کلیدی متابولیسم دور از انتظار نیست. مطالعه کییو و مطالعه حاضر نشان داد که عنصر بور باعث تغییر در متابولیزم عمومی سلول میشود بهصورتیکه متابولیزم اسیدهای آمینه و تولید لاکتات را کاهش داده ولی باعث افزایش مصرف گلوکز و پیروات از طریق واکنشهای هوازی میگردد تا بتواند فقر ATP بهوجود آمده در سلول را جبران نماید.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج بهدست آمده، اسید بوریک در دوزهای بالا باعث تخریب غشا سلولی و اختلال در فعالیتهای متابولیکی سلولهای مزانشیم مغز استخوان رت میشود. همچنین اگرچه دوز پایین این عنصر در برخی از جهات اثرات مثبت بههمراه دارد ولی با افزایش زمان باعث کاهش توانایی حیات، تغییر در سیتواسکلتون سلولی (سیتوپلاسم و هسته) و کاهش فعالیت برخی از آنزیمهای متابولیکی شد لذا از طرف این تیم تحقیقاتی ادامه پژوهش بهخصوص در رابطه با تمایز سلولهای مزانشیم مغز استخوان به استئوبلاست و ضرورت حضور این عنصر به مقدار کم در رژیم غذائی روزانه پیشنهاد میگردد.
تشکر و قدردانی
پروژه تحقیقاتی حاضر در غالب پایان نامه دانشجویی مصوب 17/12/92 به شماره 13499/92 با حمایت مالی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه اراک انجام شده است، لذا بدینوسیله از دانشگاه اراک تشکر و قدردانی میشود.
.
)