فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد علوم تشریح، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ایران

2 گروه علوم تشریح، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی مولکولی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مازندران، ایران

چکیده

هدف: هدف این مطالعه بررسی تاثیر لپتین بر میزان بلوغ، لقاح  و تکوین رویانی تخمک‏های نابالغ موش در شرایط آزمایشگاهی بود.
مواد و روش‏ها: تخمک‏های نا بالغ موش (GV) از موش‏های ماده NMRI جدا شده و  به‏طور تصادفی درگروه‏های: کنترل (لپتین               0 نانوگرم بر میلی‏لیتر )، اول (لپتین 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر)، دوم (لپتین50 نانوگرم بر میلی‏لیتر) و سوم (لپتین100 نانوگرم بر میلی‏لیتر ( قرارداده شدند. 24 ساعت بعد تخمک‏های بالغ شده (MII) شناسایی و با اسپرم انکوبه شده لقاح داده شدند. تکوین رویانی هر 24 ساعت با استفاده از میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرارگرفت.
نتایج: از مجموع  تخمک‏های GV جدا شده 1/53 درصد در گروه کنترل 2/56 درصد در گروه اول، 4/42  درصددر گروه دوم  و3/38 درصد در گروه سوم به مرحله متافاز II رسیدند. میزان  GVBD، 27/31 درصد در گروه اول، 63/40 درصددر گروه دوم و39/36 درصد در گروه سوم بود که در مقایسه با گروه کنترل 05/22 درصد تفاوت معنی‏داری داشت (05/0p <). غلظت فیزیولوژیک لپتین (10 نانوگرم بر میلی‏لیتر)  میزان MII را در مقایسه با غلظت‏های بالاتر لپتین به‏صورت معنی‏داری افزایش داد. درحالی‏که میزان وقوع GVBD در غلظت‏های بالای لپتین بیشتر از غلظت فیزیولوژیک لپتین بود.
نتیجه‏گیری: تفاوت معنی‏داری در میزان تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر مراحل مختلف تکوین رویانی بعد از IVF در بین گروه‏های تیمار در مقایسه با گروه کنترل مشاهده نگردید.
 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effect of Leptin During In Vitro Maturation, Fertilization and Embryonic Development of Mouse Germinal Vesicle Oocyte

نویسندگان [English]

  • R E 1
  • M M 2
  • H Gh 2
  • A E 2
  • N R 2

چکیده [English]

Aim: The purpose of this study was to investigate the effects of leptin on in vitro maturation, fertilization and embryonic development of immature mouse oocytes.
Material and Methods: Immature oocytes were isolated from NMRI female mice and divided randomly into 4 groups: leptin 0 ng/ml (control), 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml. 24 h later matured (MII) oocytes were identified and fertilized with incubated sperm. Embryonic development was investigated every 24 h using inverted microscope.
 Results: From isolated oocytes 53/1% in control group, 56/2% in first group,42/4% in second group and 38/3% in third group developed to MII. The rate of GVBD was 22/05% in control group, 31/27% in first group, 40/63% in second group and 36/39% in third group. The physiologic concentration of leptin (10 ng/ml) considerably increased the rate of MII when compared to other groups (p < 0.05), whereas the GVBD rate was higher in group treated with concentrations more than physiologic dose.
Conclusion:  When different concentration of leptin was applied after IVF, no significant effects were observed between four treatment groups in different stages of embryonic development.
 Keywords:

کلیدواژه‌ها [English]

  • Leptin
  • Immature oocytes
  • maturation
  • Fertilization
  • Embryonic development

مقدمه

لپتین یک پپتید 16 کیلو دالتونی و فراورده  ژن (obesity; ob) می‏باشد که عمدتا از بافت چربی سفید و نیز به‏میزان کمتر از هیپوفیز، هیپوتالاموس، کبد، چربی قهوه‏ای و برخی بافت‏های دیگر ترشح می‏شود. شواهد و مدارک شاخص‏هایی را آشکار ساخته است که نشان‏دهنده نقش مستقیم لپتین در تنظیم عمل‏کرد تخمدانی پستانداران و همچنین تکوین جنینی قبل از لانه گزینی می‏باشد (1).  لپتین در عمل‏کرد تولید مثلی گونه‏های مختلف از طریق مداخله در آبشاری از رخدادهای مرتبط با بلوغ تخمک (2)، باروری، کسب توانایی تکوین جنینی، کلیواژ، میزان بلاستوسیست و آپوپتوزیس (3) دارای نقش به‏سزایی می‏باشد. لپتین  و یا mRNA آن در تخمک موش (4 و 5) و انسان، در سلو‏ل‏های احاطه کننده آن از قبیل گرانولوزا، کومولوس و تکا (6)، تخمدان‏ها (7 و 8)، جنین قبل از لانه گزینی (9) و نیز در سلول‏های جفت با غلظت‏های مشابه سرم (10) یافت می‏شوند. علاوه بر این رسپتورهای لپتین در سلول‏های تکا، گرانولوزا، تخمک و جنین ( 11) شناسایی شده‏اند. مایع فولیکولی (11 و 12) و رحمی هم شامل لپتین می‏باشند که حاکی از در دسترس بودن این هورمون برای تاثیر بر رسپتورهای لپتین در فولیکول و جنین قبل از لانه گزینی می‏باشد. از آنجایی‏که جنین و تخمک هر دو دارای رسپتور لپتین هستند مطالعات اخیر روی توانایی تاثیر مستقیم لپتین بر روی بلوغ تخمک و تکامل زودرس جنینی متمر کز شده است ( 13 و 14).

همچنین مشاهده شده است که بیان ob-Rb در تخمدان رت در پاسخ به تجویز (Human Chorionic Gonadotropin) HCG تغییر می‏کند و در هنگام تخمک‏گذاری به اوج خود می‏رسد. این رخداد پیشنهاد کننده نقش احتمالی لپتین در عملکرد تخمدانی در این نقطه زمانی می‏باشد لپتین به‏دست آمده از بافت چربی می‏تواند سیستم تولید مثلی را از این نظرکه آیا ذخیره مناسب انرژی‏ برای تولید مثل نرمال در دسترس می‏باشد یا خیر، مورد پیام رسانی قرار دهد (15) .

 از طرفی غلظت سیستمیک لپتین در هنگام هضم غذا و در افرادی که دارای چربی های اضافی در بدن هستند بالا می‏باشد (16). تحقیقات نشان داده است که موش‏های فاقد لپتین (ob/ob) و یا رسپتور لپتین (db/db) هم چاق و هم غیر بارور می‏باشند (118) و نیز درمان موش‏های ob/ob با استفاده از لپتین اگزوژن باروری آن‏ها را بهبود می‏بخشد (18 و 19).

گرچه در سال‏های اخیر نقش عملکردی یک میانجی تهیه شده از این هورمون جهت القا بلوغ تخمک در محیط آزمایشگاهی درگونه‏های مختلف نظیر خوک و اسب (20 و 21) مورد مطالعه قرار گرفته است اما علیرغم تحقیقات انجام شده در این خصوص، به‏علت تناقضات موجود پژوهش‏ها در این زمینه همچنان ادامه دارد. Kun و همکاران (21) نیز ارتقا تکوین جنینی تخمک‏های خوک را در حضور لپتین گزارش کردند. یافته‏های Fabíola و همکاران (22) حاکی از آن است  که غنی سازی با  1 و 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین تاثیر مثبتی بر بلوغ تخمک دارد  . Jason  و همکاران (23) نشان دادند که پیشرفت MII به‏طور واضحی تحت تاثیر هورمون لپتین قرار نگرفت و افزایش هورمون لپتین منجر به کاهش وقوع MII در تخمک‏های فاقد کومولوس می‏گردد.

   با توجه به اینکه در مطالعات قبلی تاثیر دوزهای مختلف لپتین در تمام مراحل بلوغ‏، لقاح و تکوین رویانی قبل از لانه گزینی تخمک نابالغ موش در شرایط آزمایشگاهی(in vitro)  به‏طور یک‏جا مورد بررسی قرار نگرفته است و  نیز به‏علت وجود تناقضات فوق الذکر، دوز مناسب و نهایی لپتین در بلوغ، لقاح و تکوین رویانی قبل از لانه گزینی تعین نشده است. لذا این مطالعه با هدف بررسی تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر روی بلوغ میوزی، لقاح و تکوین رویانی  قبل از لانه گزینی تخمک‏های نابالغ موش در شرایط آزمایشگاهی انجام گردید.

 

مواد و روش‏ها

جمع آوری تخمک‏ها: دراین مطالعه ازموش های ماده NMRI، 4 تا 6 هفته‏ای با وزن تقریبی 20 الی 25 گرم که در شرایط استاندارد (12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی) نگه‏داری می‏شدند استفاده گردید. تحریک تخمک‏گذاری از طریق تزریق 5/7 واحد بین المللی (Pregnant Mare Serum Gonadotropine) PMSG (Sigma G4877) به‏صورت داخل صفاقی (Intraperitoneal) انجام شد. بعد از 46 تا 48 ساعت، موش‏ها از طریق جابه‏جایی مهره­های گردنی (Cervical Dislocation) کشته شده وسپس تخمدان‏های آن‏ها در شرایط حتی المقدور استریل از بدن خارج و به‏درون قطرات 200 میکرولیتری محیط کشت  (Gibco 11900-073)α (Minimal Essential Medium- Alpha) MEM - حاوی پنج درصد FBS (Fetal Bovine Serum, Sigma F2442) منتقل گردید. پس از حذف چربی‏های اضافی، تخمدان‏ها به‏درون قطرات 300 میکرولیتری منتقل شده و با استفاده از سرنگ انسولین زیر لوپ تشریح و تخمک‏های نابالغ در مرحله وزیکول زایا  GV (Germinal vesicle) با یا بدون سلول‏های کومولوس آزاد شدند. سپس با روش پیپت کردن سلول‏های کومولوس اطراف تخمک‏ها جدا شدند. تخمک‏های نابالغ هسته‏دار با اندازه تقریبی 60 تا 65 میکرون و سیتوپلاسم روشن با فضای دور زرده‏ای مناسب با استفاده از میکروسکوپ معکوس شناسایی و برای بلوغ آزمایشگاهی(In Vitro Maturation) IVM مورد استفاده قرارگرفتند.

بلوغ تخمک‏ها  IVM: برای تهیه محلول استوک لپتین  (Sigma L 4146,1mg)ویال آن را با Tris-HCL,PH 8.0 20 mM حل کردیم تا محلول 1 نانوگرم بر میلی‏لیتر به‏دست آمد. سپس غلظت‏های کاری مختلف تهیه شده ودر 20-  درجه سانتی‏گراد نگه‏داری و استفاده شد. تخمک‏هایGV  جمع آوری شده به‏شرح ذیل به‏طور تصادفی بین گروه‏های کنترل و تیمار تقسیم شدند:

گروه کنترل (0 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین): تخمک‏های نابالغ درون محیط بلوغ پایه شامل MEM-α غنی شده با FBS پنج درصد،100 mIU/ml rFSH (recombinant Follicle Stimulating Hormone)،IU/ml  5/7 HCG، 5/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر استرپتومایسین،  5/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر پنی‏سیلین.

گروه تیمار1 (10 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین): تخمک‏ها در محیط بلوغ پایه حاوی 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین کشت داده شدند.

گروه تیمار2 (50 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین): تخمک‏ها در محیط  بلوغ پایه حاوی 50 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین کشت داده شدند.

گروه تیمار 3 (100 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین): تخمک‏ها در محیط  بلوغ پایه حاوی100 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین کشت داده شدند.

تخمک‏های هر گروه به مدت ٢٤ ساعت در زیر روغن (Sigma M8410)  داخل انکوباتور CO2  5 درصد و دمای 37 درجه سانتی‏گراد کشت داده شدند. سپس مراحل بلوغ آزمایشگاهی در تمام گروه‏ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Nikon Eclipse TS 100) بررسی و با لنز Moticam 2000 2 Mpixel  مورد عکس‏برداری قرار گرفت. تخمک‏های بدون تغییر شکل در هسته به‏عنوان GV، تخمک‏های با هسته شکسته شده و نشانه شروع میوز به‏عنوان (Germinal Vesicle Break Down) GVBD و تخمک‏های دارای اولین جسم قطبی به‏عنوان تخمک‏های بالغ یا(Metaphase II) MII   در نظر گرفته شدند. تخمک‏هایی که اولین جسم قطبی را آزاد کردند برای لقاح آزمایشگاهی مورد استفاده  قرار گرفتند (شکل 1).

 

 

 

 

شکل 1: مراحل بلوغ تخمکA : ؛ وزیکول زایا  ×100 (GV) ..B ؛ از سرگیری میوز(GVBD)   ×100. C ؛ بلوغ تخمک  (MII)×200.

 

 

لقاح آزمایشگاهی (IVF): اسپرم‏ها از دم اپی‏دیدیم موش‏های نر نژاد  NMRIجدا شده و به قطرات 500 میکرولیتری محیط T6 حاوی   15 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma A3311-10G) منتقل شدند و قبل از عمل تلقیح برای ظرفیت‏گیری به‏مدت 5/1 ساعت در همان محیط  درون انکوباتور37 درجه سانتی‏گراد با CO2 5 درصد انکوبه شدند. تخمک‏های بالغ در قطرات 50 میکرولیتری محیط لقاح شامل محیط T6 حاوی 15 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر BSA درگروه‏های 4 تا 6 تایی در زیر روغن قرار گرفتند. سپس اسپرم انکوبه با غلظت 106×1 اسپرم بر میلی‏لیتر به‏قطرات حاوی تخمک اضافه شدند. 4 الی 6 ساعت بعد از آن تخمک‏ها در قطراتی از همان محیط شستشو شده و با استفاده از میکروسکوپ معکوس جهت بررسی وجود دو پیش هسته به‏منظور ارزیابی میزان لقاح مورد بررسی قرار گرفتند. سپس تخمک‏های دارای دو پیش هسته جدا شده  و به محیط کشت T6 حاوی 4 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر BSA در گروه‏های 8 تا 10‏تایی درون قطرات 50 میکرولیتری منتقل و کشت داده شدند. جنین‏ها 24، 48، 72 و 96 ساعت بعد از تلقیح به‏وسیله میکروسکوپ معکوس برای ثبت مراحل تکوین جنینی مورد ارزیابی و عکس‏برداری قرارگرفتند (شکل2).

 

 

 

شکل 2: مراحل تکوین رویانی بعد از لقاح : A؛ جنین دو سلولی، بزرگنمایی ×200،  B؛ جنین چهار سلولی، بزرگنمایی ×400،C؛ بلاستوسیست، بزرگنمایی ×200.

 

 

آنالیز آماری: نتایج حاصل از تاثیر لپتین بر میزان درصد بلوغ و لقاح آزمایشگاهی تخمک و نیز تکوین جنین‏ها تا مرحله بلاستوسیست  با استفاده از آزمون کوای دو تجزیه و تحلیل شد. هر آزمایش حداقل شش بار تکرار شد و در تمامی موارد      05/0 p< معنی‏دار تلقی گردید.

 

نتایج

اضافه کردن لپتین به محیط کشت بلوغ تخمک‏های نابالغ موش منجر به افزایش میزان GVBD در دوز‏های بالاتر این هورمون گردید به‏طوری‏که بیشترین میزان افزایش در غلظت 50 نانوگرم بر میلی‏لیتر مشاهده گردید. در‏حالی‏که میزان تخمک‏هایی که به مرحله MII رسیدند با افزایش غلظت هورمون لپتین کاهش پیدا کرد. اضافه سازی غلظت فیزیولوژیک لپتین 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر منجر به افزایش بلوغ تخمک‏های نابالغ موش تا مرحله MII گردید که در مقایسه با سایرگروه‏های تیمار وگروه کنترل تفاوت معنی‏داری داشت (05/0p<). میزان وقوع GVBD با حضور 50 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین در مقایسه با سایر گروه‏های تیمار و گروه کنترل تفاوت معنی‏داری را به‏دنبال داشت. میزان دژنراسیون تخمک‏های نابالغ موش در محیط بلوغ با حضور 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر لپتین کاهش چشمگیری در مقایسه با سایر گروه‏های تیمار داشت. در حالی‏که میزان دژنراسیون تخمک‏ها در محیط بلوغ با افزایش غلظت هورمون لپتین افزایش پیدا کرد (نمودار 1).

ارزیابی‏های انجام شده  در فواصل زمانی معین بعد از لقاح نشان داد که هیچ تفاوت معنی‏داری در میزان کلیواژ جنین‏ها تا مرحله مورولا، وقوع بلاستوسیست  و دژنراسیون جنین‏ها  ما بین گروه‏های تیمار و نیز در مقایسه با گروه کنترل وجود نداشت (نمودار 2).

 

 

 

نمودار 1: تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر بلوغ تخمک‏های نابالغ موش در شرایط آزمایشگاهی. تخمک‏های بالغ شده در مرحله IVM (In Vitro Maturation) توانستند پس از انجام IVF ،تکوین رویانی قبل از لانه گزینی را در محیط آزمایشگاهی تا مرحله بلاستوسیست طی کنند.

 

 

 

 

نمودار 2: تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر لقاح و تکوین رویانی قبل از لانه گزینی اووسیت‏های نابالغ موش در شرایط آزمایشگاهی

 

 

 

بحث

در این مطالعه ابتدا تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر بلوغ تخمک‏های نابالغ موش (GV) در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل حاکی از آن بود که اضافه سازی غلظت فیزیولوژیک لپتین 10 نانوگرم بر میلی‏لیتر منجر به افزایش بلوغ تخمک‏های نابالغ موش تا مرحله MII گردید که در مقایسه با سایرگروه‏های تیمار وگروه کنترل تفاوت معنی‏داری داشت و میزان تخمک‏هایی که به‏مرحله MII رسیدند با افزایش غلظت لپتین کاهش پیدا کرد. اضافه کردن لپتین به محیط کشت بلوغ تخمک‏های نابالغ موش منجر به افزایش میزان GVBD در دوزهای بالاتر این هورمون گردید به‏طوری‏که بیشترین میزان افزایش در غلظت 50 نانو گرم بر میلی‏لیتر مشاهده گردید.سپس تاثیر غلظت‏های مختلف لپتین بر روی لقاح و میزان تکوین رویانی تخمک‏های بالغ شده موش در شرایط آزمایشگاهی که در مرحله اول همین مطالعه به‏دست آمده بودند مورد بررسی قرار گرفت.  نتایج مطالعه حاضر نشان داد تفاوت قابل ملاحظه‏ای بین گروه های تیمار 10، 50 و 100 نانو گرم بر میلی‏لیترو گروه کنترل از نظر میزان کلیواژ و تکوین جنینی قبل از لانه گزینی وجود نداشت.

 Fabíolaوهمکاران(22) نشان دادند که غنی سازی با 1 و 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین تاثیر مثبتی بر بلوغ تخمک داشته که در مورد غلظت 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر با نتایج به‏دست آمده در این مطالعه مطابقت دارددر مطالعه حاضر از سر‏گیری میوز (GVBD) در حضور غلظت‏های بالاتر لپتین افزایش می‏یابد.علی‏رغم اینکه JasonES و همکاران (23) نشان دادند که پیشرفت MII به‏طور واضحی تحت تاثیر هورمون لپتین قرار نگرفت. و افزایش هورمون لپتین منجر به کاهش وقوع MII در تخمک‏های فاقد کومولوس می‏گردد. از آن‏جایی‏که لپتین می‏تواند ساخت و رها سازی فاکتورهای مشتق از سلول‏های کومولوس را که از طریق اتصالات شکاف دار  به تخمک یا محیط خارج سلولی وارد می‏شوند تحت تاثیر قرار دهد، کاهش وقوع متافاز II در تخمک‏های فاقد کومولوس می‏تواند به‏علت فقدان تعاملات حیاتی تخمک با سلول‏های کومولوس اطراف باشد که منجر به توانایی تکوینی معیوب گردیده است.  در این مطالعه اثر مشخصی را روی GVBD طی 2 الی 18 ساعت بعد از کشت گزارش نکرد در حالی‏که یافته‏های ما حاکی از افزایش میزان GVBD با حضور غلظت‏های بالاتر لپتین می‏باشد و نیز گزارش شده بود که حضور 100 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین منجر به بلوغ تخمک تا مرحله‏ی پایین‏تر از MII در مقایسه با گروه کنترل گردید که دستاورد‏های ما نیز موید همین مطلب می‏باشد. در خصوص تاثیر لپتین بر وقوع کلیواژ و مراحل تکاملی بعد از آن تا بلاستوسیست در حضور غلظت‏های مختلف 0، 10، 50 و 100 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین در این مطالعه به‏دست آمد با یافته‏های آن‏ها مطابقت دارد. البته نکته قابل توجه در مطالعه آن‏ها این است که جنین‏های استفاده شده توسط ایشان از محیط زنده به‏دست آمد، به‏طوری‏که جنین های احتمالی 18 ساعت بعد از جفت گذاری موش های نر و ماده CF1 از طریق تشریح لوله‏های رحمی جداسازی و در محیط کشت تحت تاثیر غلظت‏های متفاوت لپتین  قرار گرفته و سپس در فواصل زمانی معین مورد ارزیابی قرار گرفتند. از این‏رو این محققان کمتر با مشکل توقف تکوین جنینی در مرحله دو سلولی (developmentalblock) در‏گیر بودند حال آنکه در مطالعه ما تخمک‏های بالغ شده در فرآیند بلوغ آزمایشگاهی(IVM) پس از تایید حضور اولین جسم قطبی در زیر میکروسکوپ معکوس جداسازی شده و پس از لقاح در محیط آزمایشگاهی (IVF) هر 24 ساعت از نظر وقوع مراحل تکوین جنینی قبل از لانه گزینی مورد ارزیابی قرار گرفتند. همین تفاوت بیانگر مشکلات عدیده‏ای بر سر راه مطالعاتی می‏باشد که صرفا در محیط آزمایشگاهی انجام می‏گیرند. لذا کنترل شرایط مختلف آزمایشگاهی جهت به‏دست آوردن نتایج مطلوب یکی از چالش‏های مهم بر سر راه محققان می‏باشد.

نتایج به‏دست آمده در مطالعه BladimirC و همکاران (24) در خصوص تاثیر دوز‏های مختلف لپتین10، 100 و 1000 نانو گرم بر میلی‏لیتربر میزان کلیواژ و وقوع بلاستوسیست کاملا با نتایج حاصل از مطالعه انجام شده توسط ما مطابقت دارد.  در مطالعه انجام شده توسط M Boelhanve و همکاران (25) هیچ تاثیری بر روی میزان وقوع کلیواژ در حضور لپتین گزارش نگردید که این یافته با نتایج به‏دست آمده در این مطالعه مطابقت دارد. در همین مطالعه افزایش در میزان وقوع بلاستوسیست در حضور 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین گزارش شد که با یافته‏های ما در تناقض می‏باشد.در مطالعه انجام شده توسط LangeCA و همکاران (26) غلظت مطلوب لپتین برای افزایش میزان بلوغ تخمک‏ها  100 نانو گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد  که در تناقض با یافته‏های ما می‏باشد. حال آنکه غلظت مطلوب لپتین در افزایش میزان باروری 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد که همان غلظت فیزیولوژیک لپتین می‏باشد و یافته های این مطالعه را تایید می کند.  یافته‏هایKakisina P(27) در خصوص میزان وقوع MII در حضور غلظت‏های مختلف لپتین حاکی از افزایش آن در غلضت‏های بالای لپتین در مقایسه با گروه کنترل می‏باشدکه در تعارض با نتایج مطالعه ما بوده است.

 لذا با توجه به نتایج به‏دست آمده در مطالعه حاضر می‏توان گفت که غلظت فیزیولوژیک لپتین (10 نانو گرم بر میلی‏لیتر) غلظت مناسبی برای تحریک بلوغ تخمک‏های نابالغ و وقوع MII می‏باشد زیرا تماس تخمک با غلظت فیزیولوژیک لپتین باعث افزایش فسفریلاسیون STAT3 و کاهش میزان  Monophosphate) cAMP (CyclicAdenosine می‏شود که همین امر منجر به بلوغ تخمک می‏گردد. بلوغ تخمک، فعال‏سازی مسیر‏های پیام رسانی مختلف نظیر MAPK از طریق رسپتور بلند لپتین (Ob-Rb) را شامل میشود که در نهایت منجر به فعال سازی فاکتور پیش برنده بلوغ(MaturationPromotingFactor) MPF شده که خود نیز مرکب از cyclin-B1 وCdc2 می‏باشد (28). در مطالعه انجام شده توسط Guo Z و همکاران (29) نیزهمانند این مطالعه افزایش میزان MII  در حضور 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین گزارش شد و نتیجه اضافه سازی لپتین بر روی میزان کلیواژ  در مطالعه ما همانند دستاوردهای حاصل از مطالعه آنها بوده است حال آن‏که میزان بلاستوسیست در حضور 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر لپتین افزایش داشت. لذا  آنها اظهار داشتند که لپتین 10 نانو گرم بر میلی‏لیتر مسیر پیام رسانی MAPK را فعال می‏کند و کاهش توانایی تکوینی تخمک یک اساس و پایه مولکولی دارد به‏طوری‏که تخمک‏های غیر بالغ فعالیت کمتر فاکتور پیش برنده بلوغ،cyclinB ،MAPK ، تغییرات در سنتز پروتئین، متابولیسم ناقص انرژی، ورودی کمتر کلسیم در زمان باروری و کاهش طول عمر جنین بعد از باروری را به نمایش می‏گذارند به‏ویژه این‏که سازمان‏دهی مجدد ارگانل‏های سیتوپلاسمی (Reconstruction) و آغاز ساخت پروتئین‏های متعدد برای تکوین جنین در آینده مهم و ضروری می‏باشد .

 از آنجاییکه یکی از مشکلات اصلی در کشت آزمایشگاهی جنین به‏خصوص در موش فرایندی تحت عنوان توقف در مرحله دو سلولی می‏باشد (30). همین امر منجر به ایجاد چالش بزرگ بر سر راه این گونه مطالعات گردیده است. لذا اعمال تغییرات مختلف در مطالعات متعدد می تواند منجر به شکل گیری راه‏حل‏هایی برای غلبه بر این مشکل در محیط آزمایشگاهی گردد. از آنجایی‏که کمتر از نیمی از تخمک‏های بالغ شده در محیط آزمایشگاهی توانستند مراحل تکوین جنینی قبل از لانه گزینی را تا مرحله بلاستوسیست طی کنند، این امر نشان دهنده بلوغ سیتوپلاسمی ضعیف تخمک‏های بالغ شده در محیط آزمایشگاهی می‏باشد که با یافته های قبلی مطابقت دارد  از این‏رو چالش‏های تحقیقاتی آینده بایستی بر روی ارتقا شرایط  بلوغ آزمایشگاهی تخمک متمرکز گردد. با توجه به این‏که میزان وقوع رخدادهای تکوینی بعد از لقاح دراین مطالعه در مقایسه با مطالعات قبلی انجام شده درمحیط زنده کمتر می‏باشد لذا می‏توان یافته‏های قبلی مبنی برکمتر بودن پتانسیل تکوینی تخمک‏های بالغ شده در محیط in vitro  در مقایسه با محیط in vivo   را مورد تایید قرار داد.

 

نتیجه گیری

در حالی‏که بلوغ تخمک‏های نابالغ موش در حضور غلظت‏های مختلف لپتین در حالت وابسته به دوز افزایش نمی‏یابد، غلظت فیزیولوژیک لپتین (10 نانو گرم بر میلی‏لیتر)  غلظت مناسبی برای تحریک بلوغ تخمک‏های نابالغ موش و وقوع MII در شرایط آزمایشگاهی می‏باشد. غلظت فیزیو لوژیک لپتین (10 نانو گرم بر میلی‏لیتر) هر دو مسیر پیام رسانی لپتین (MAPKandSTAT3)  را فعال می‏کند.پتانسیل تکوینی تخمک‏های بالغ شده در محیط in vitro  در مقایسه با محیط in vivo کمتر می‏باشد.

 

تشکر و قدردانی

از جناب آقای دکتر علیرضا خلیلیان استاد آمارحیاتی دانشگاه علوم پزشکی مازندران به‏خاطر راهنمایی در کار آماری و سرکار خانم سمیه تدینی به‏خاطر کمک در کار اجرایی این پروژه سپاسگزاریم. این مقاله حاصل پایان نامه دوره کارشناسی ارشد مصوب دانشگاه علوم پزشکی مازندران به شماره 1575 در سال 1392 می‏باشد.

1. Almog B, Gold R, Tajima K, et al. leptin attenuates follicular apoptpsis and accelerates the onset of prepuberty in immature rats. Mol Cell Endocrinol. 2001; 183:179-91.
2. Antczak M, J VB. Oocyte influences on early development; the regulatory protein leptin and STAT3 are polarized in mouse and human oocytes and differentially distributed within the cells of the preimplantation stage embryo. Mol Hum Reprod. 1997; 3: 1067–86.
3. Cioffi JA, Van Blerkom J, Antczak M, et al. The expression of leptin and its receptors in pre-ovulatory human follicles. Mol Hum Reprod. 1997; 3: 467–72.
4. Van Tol HT, van Eerdenburg FJ, Colenbrander B, et al. Enhancement of bovine oocyte maturation by leptin is accompanied by an upregulation in mRNA expression of leptin receptor isoforms in cumulus cells. Mol Reprod Dev. 2008; 75: 578-87.
5. Kahraman S, Yakin K, Donmez E, et al. Relation between granular cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome interacytoplasmic sperm injection. Human reproduction. 2000;15(11): 2390-3.
6. Navot D, Bergh P,Williams M, et al. Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female fertility. The Lancet. 1991; 337: 1375–7.
7. Ryan NK, Woodhouse CM, Van der Hoek KH, Gilchrist RB, et al. Expression of leptin and its receptor in the murine ovary: possible role in the regulation of oocyte maturation. Biol Reprod. 2002; 66(5): 1548–54.
8. Kawamura K, Sato N, Fukuda J, Kodama H, et al. Leptin promotes the development of mouse preimplantation embryos in vitro. Endocrinology 2002; 143(5): 1922–31.
9. Gonzalez RR, Caballero-Campo P, Jasper M, Mercader A, et al. Leptin and leptin receptor are expressed in the human endometrium and endometrial leptin secretion is regulated by the human blastocyst. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85: 4883–8.
10.Karlsson C, Lindell K, Svensson E. Expression of functional leptin receptors in the human ovary. J Clin Endocrinol Metab. 1997; 82: 4144–8.
 
11.Agarwal SK, Vogel K, Weitsman SR. Antagonizes the insulin like growth factor I augmentation of steroidogenesis in granulosa and theca cells of the human ovary. J Clin Endo Metab. 1999; 84: 1072–6.
12. Loffler S, August G, Kohler U. Evidence of leptin expression in normal and polycystic human ovaries. Mol Hum Reprod. 2001; 7: 1143–9.
13.Butzow TL, Moilanen JM, Lehtovirta M, Tuomi T, et al. Serum and follicular fluid leptin during in vitro fertilization: relationship among leptin increase, body fat mass, and reduced ovarian response. J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3135–9.
14. Barroso G, Barrionuevo M, Rao P GL, Danforth D, et al. Vascular endothelial growth factor, nitricoxide, and leptin follicular fluid levels correlate negatively with embryo quality in IVF patients. Fertil Steril. 1999; 72: 1024–6.
15.Tataranni PA, Monroe MB. Adiposity, plasma leptin concentration and reproductive function in active and sedentary females. Int J Obes Relat Metab Disord. 1997; 21(9): 818–21.
16. Mantzoros XS, Dunaif A. Leptin concentrations in the polycystic ovarian syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 1997; 82: 1687–91.
17.Mounzih K, Lu R, FF C. Leptin treatment rescues the sterility of genetically obese ob/ob males. Endocrinology. 1997; 138(3): 1190–3.
18. Barash IA, Cheung CC, Weigle DS, Ren H, et al. Leptin is a metabolic signal to the reproductive system. Endocrinology 1996; 137(7): 3144–7.
19. Chehab FF, Lim ME. Correction of the sterility defect in homozygous obese female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nat Genet 1996; 12(3): 318–20.
20.Jesse C, Hai Z, Paul WD, Jim P, et al.Leptin Enhances Oocyte Nuclear and Cytoplasmic Maturation via the Mitogen-Activated Protein Kinase Pathway. Gndocrinology. 2004; 145(11): 5355–63.
21. Kun Z, Shaohua W, Yufang M, Yankun L, et al. Effects of leptin supplementation in in vitro maturation medium on meiotic maturation of oocytes and preimplantation development of parthenogenetic and cloned embryos in pigs. Animal Reproduction Science. 2007; 101: 85–96.
22. Fabíola F, Paula L, Marc B, Felix A. HabermannFred Sinowatz6 and Eckhard Wolf. Leptin Promotes Meiotic Progression and Developmental Capacity of Bovine OocytesVia Cumulus Cell-Independent and -Dependent Mechanisms. Biology of reproduction. 2007; 76: 532-41.
 23. Jason ES, Rodney LD, Daniel M, Janis GM, et al. Direct Effects of Leptin on Mouse Reproductive Function: Regulation of Follicular,Oocyte, and Embryo Development. Biology of reproduction 2004; 71: 1447-552.
24. Bladimir C, Roser M, Celia de F, Pablo B-Á, et al. Effect of leptin during in vitro maturation of prepubertal calf oocytes:Embryonic development and relative mRNA abundances of genes involved in apoptosis and oocyte competence. Theriogenology. 2011; 76: 1706–15.
25. Boelhauve M, Sinowtze F, FF WP-L. Maturation of bovine oocytes in the presence of leptin improves development and reduces apoptosis of in vitro-produced blastocysts. Biology of Reproduction. 2005; 73: 737-44.
26. Lange Consiglio A, Dell Aquila ME, Fiandanese N, Ambruosi B, et al. Effects of leptin in vitro maturation,fertilization and embryonic cleavage after ICSI and early developmental expression of leptin (Ob) and leptin receptor (ObR) proteins in horse. Reprod Biol Endocrinol. 2009;7: (113-120).
27. Kakisina P. The effect of leptin in increasing the quality of goat oocyte maturation in vitro. Environ Biol. 2013; 3(7): 10-5.
28.Craig J, Zhu H, Dyce PW, Petrik J. Leptin enhances oocyte nuclear and cytoplasmatic maturation via the mitogen-activated protein kinase pathway. Endocrinology. 2004; 145(11): 5355-63.
29. Guo Z, wang Y, Zhang Y. Leptin promoted meiotic maturation of bovine oocytes and development of parthenogenetic activation and yak (Bos grunniens)-bovine interspecies cloned embryos. Belg J Zool. 2008; 138 (2): 184-90.
30.Bahadori MH, Azarnia M, Ghasemian F. The effect of hepatocyte growth factor on mouse oocyte in vitro maturation and subsequent fertilization and embryonic development. Zahedan J Res Med Sci (ZJRMS). 2011; 13(2): 26-30.