نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
- علیرضا عبدانی پور 1
- سیده مهسا خاتمی 2
- محسن سقا 3
- فرشید سلیمی ننه کران 1
- داوود نقی زاده 1
- رضا بنابی 1
1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، دانشکده پزشکی، آزمایشگاه سلولهای بنیادی، اردبیل، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، اردبیل، ایران
3 دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، دانشکده پزشکی، گروه علوم تشریحی و پاتولوژی، آزمایشگاه تحقیقاتی جنین شناسی و سلولهای بنیادی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر عصاره هیدروالکلی گل قاصدک (Cirsium vulgare) بر روی تکثیر و رشد سلولهای بنیادی عصبی موش صحرایی در شرایط آزمایشگاهی (In vitro) میباشد.
مواد و روشها: سلولهای بنیادی عصبی از هیپوکمپ مغز نوزاد موش صحرایی استخراج شد. بهمنظور تعیین بهترین غلظت، سلولها بهمدت 48 ساعت با غلظتهای 200، 400، 600، 800 و 1000 میکروگرم بهازای هر میلیلیتر محیط کشت تیمار شدند و میزان تکثیر سلولی با روش MTT بررسی گردید. همچنین میزان بیان ژن Sox2 در سلولهای بنیادی عصبی تیمار شده با روش Real-time PCR بررسی گردید.
نتایج: نتایج بهدست آمده در این مطالعه نشان داد که در حضور عصاره گل قاصدک تکثیر سلولهای بنیادی عصبی و بیان ژن Sox2 بهطور معنیداری نسبت به گروه کنترل افزایش یافت.
نتیجه گیری: با توجه به تاثیر عصاره گل قاصدک بر روی روند تکثیر سلولهای بنیادی عصبی، استفاده از این عصاره گیاهی میتواند جهت مقاصد کلینیکی بهمنظور درمان برخی از بیماریهای سیستم عصبی از جمله ایسکمی مغزی و ضایعات نخاعی مفید باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigating the effect of Cirsium vulgare hydroethanolic extract on neural stem cells proliferation
نویسندگان [English]
- A A 1
- SM Kh 2
- M S 3
- F S 1
- D N 1
- R B 1
چکیده [English]
Aim: In vitro investigation of hydroethanolic extraction of Cirsium vulgare on growth rates of neonate rat neural stem cells. Material and Methods: Neural stem cells were isolated from hippocampus of neonatal rat brain. To determine optimal concentration of Cirsium vulgare extraction, isolated neural stem cells were treated with 200, 400, 600, 800 and 1000 µg/ml for 48 h and then cells proliferation rate were evaluated by MTT assay. In addition Sox2 mRNA expression in neural stem cells was evaluated using quantitative real-time PCR. Results: The results of this study showed that the Cirsium vulgare extract caused significant increase in cell proliferative activity and Sox2 mRNA expression when compared with the control group. Conclusion: with respect to the effect of Cirsium vulgare extract on the proliferation rate of neural stem cells, the use of hydroethanolic extraction of Cirsium vulgare can be used for clinical purposes to treat some of the neurodegenerative disorders such as ischemic stroke and spinal cord injury.
کلیدواژه‌ها [English]
- Cell proliferation
- Cirsium vulgare
- Neural stem cells
مقدمه
بیشترین مکان حضور سلولهای بنیادی عصبی در نواحی ساب ونتریکولار میباشد (1). سلولهای بنیادی عصبی توانایی تبدیل به اکثر سلولهای تخصص یافته مغزی را دارا می باشند و در بیماریهای سیستم عصبی این سلولها قادرند به نقاط آسیب دیده مهاجرت کرده و در ترمیم شرکت کنند (2). این سلولها بعد از تولد با حفظ توانایی خود تجدیدی میتوانند در عملکردهایی مانند یادگیری، حافظه و پاسخ به آسیب، تاثیرگذار باشد (3). استفاده از ظرفیت طبیعی بدن برای بازسازی و ترمیم یکی از اصول مهمی است که دانش سلولهای بنیادی برای درمان بیماریها دنبال مینماید (4). سلولهای عصبی بعد از تولد مراحل پایانی تمایز خود را طی میکنند و توانایی خود تجدیدی را ندارند. بنابراین حضور سلولهایی که نورونزایی میکنند، در درمان ضایعات سیستم عصبی دارای اهمیت ویژهای خواهد بود (5). یکی از مهمترین مسائل در سلول درمانی استفاده از یک محرک مناسب برای افزایش سرعت تکثیر سلولهای بنیادی عصبی در شرایطIn vitro میباشد. ژن Sox2 بهمیزان زیادی در نورواپیتلیوم سیستم عصبی در حال تکوین بیان میشود. بر اساس مطالعات انجام شده این ژن در حفظ و تکثیر سلولهای بنیادی عصبی نقش بسیار مهمی ایفا مینماید (6). گیاه سیرسیوم ولگار Cirsium vulgare که در زبان فارسی به قاصدک و در زبان انگلیسی به Spear Thistle شناخته میشود ، در مناطق مختلفی از اروپا، غرب آسیا و شمال غرب آفریقا یافت میگردد. تمام بخشهای این گیاه بهویژه ریشه آن بهعنوان دارو مورد استفاده قرار میگیرد. این گیاه بهعنوان ضد تهوع، ضد رماتیسم، ضد درد، ضد التهاب و آنتی اکسیدانت مورد استفاده قرار میگیرد (7 و 8). بیشتر بررسیهای انجام شده در رابطه با گیاهان متعلق به رده Cirsium مربوط به گیاه Cirsium japonicum میباشد. مطالعات انجام شده روی این گیاه نشاندهنده وجود فعالیت آنتیاکسیدانتی، ضدسرطانی (9) و ضد دیابتی (10) در این گیاه میباشد. تاکنون هیچگونه مطالعهای درباره اثر گیاه قاصدک بر روی سلولهای بنیادی عصبی صورت نگرفته است. در این مطالعه برای اولین بار تاثیر عصاره هیدروالکلی گل این گیاه بر روی تکثیر سلولهای بنیادی عصبی و بیان ژن Sox2 مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
تهیه ﻋﺼﺎره هیدروالکلی گل ﮔﻴﺎه گل قاصدک: عصاره Cirsium vulgare بهروش سوکسله ﺗﻬﻴﻪ و اﺛﺮ ﻏﻠﻈﺖﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ آن ﺑﺮ روی رشد و تکثیر سلولی بنیادی عصبی(NSCs) مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور گیاه مورد نظر از اطراف شهر اردبیل درخرداد ماه جمع آوری و در سایه و جریان هوا خشک و توسط آسیاب پودر شدند. از پودر تهیه شده برای عصاره گیری بهروش سوکسله استفاده شد. بدینصورت که 100 گرم از پودر آماده در کارتوشهایی که از کاغذ صافی معمولی با اندازه مناسب تهیه شده بود ریخته شد. سپس کارتوشها را درون دستگاه سوکسله قرار داده و تقریبا بهمیزان 300 میلیلیتر مخلوط متانول و آب مقطر بهعنوان حلال به آن اضافه گردید. عصاره گیری بهمدت 12 ساعت ادامه یافت. عصاره بهدست آمده به ظرفهای شیشهای منتقل شده و بهمدت 24 ساعت بدون درپوش در آون 50 درجه نگهداری شد تا حلال باقی مانده تا حد امکان تبخیر شود .سپس عصاره تهیه شده برای آزمایشهای بعدی در یخچال نگهداری شد.
جداسازی سلولهای بنیادی عصبی: برای جداسازی سلولهای بنیادی عصبی از نوزاد موش صحرایی نژاد Sprague استفاده گردید. مراقبت و نگهداری از موشها مطابق با آیین نامه مصوب کار با حیوانات آزمایشگاهی تصویب شده در دانشگاه تربیت مدرس تهران انجام گردید. بعد از بیهوشی کامل، بخش هیپوکامپ از دو نیمکره مغز جدا شده و پس از له کردن مکانیکی بهمیزان دو برابر بافت از آنزیمهای Accutase و کلاژناز برای مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد بهمنظور هضم آنزیمی استفاده گردید. در مرحله بعدی بهمنظور خنثی کردن آنزیمها از سرم FBS (Fetal bovine serum) استفاده شد. سپس سوسپانسیون حاصله از فیلتر مش نایلونی 70 میکرومتری (Falcon 352350) عبور داده شد و بهمدت 10 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ گردید. رسوب سلولی بهدست آمده با محیط کشت DMEM/F12 حاوی فاکتورهای رشد BFGF human recombinant(Millipore)، Epidermal GrowthFactor(sigma) ، B-27 supplement (GIBCO)، پنی سیلین-استرپتومایسین (سیگما) یک درصد بههمراه 3 درصد سرم FBS در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 کشت داده شد. محیط کشت سلولها پس از 24 ساعت تعویض شد و سلولهای بنیادی عصبی که به کف فلاسک چسبیده بودند پس از رسیدن به تراکم 70 تا 80 درصد با استفاده از تریپسین از کف فلاسک جدا و با نسبت 1 به 2 پاساژ داده شدند. در این مطالعه از سلولهای پاساژ سوم استفاده گردید. جهت تایید هویت سلولهای بنیادی عصبی از آنتیبادی نستین و روش ایمونوسیتوشیمی استفاده شد. به این ترتیب که سلولها توسط پارافرمالدهید 4 درصد در دمای اتاق و برای نیمساعت فیکس شدند و پس از فیکساسیون و شستشو توسط PBS (Phosphate buffered saline) با triton-100X/PBS3/0 درصد نفوذ پذیر شدند و سپس برای مدت یک ساعت با 10 سرم ضد بز در PBS انکوبه میگردند. پس از شستشو، سلولها توسط آنتیبادی اولیه برای مدت 12 ساعت در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از شستشوی کامل توسط PBS با آنتیبادی ثانویه کونژوگه به FITC (Fluorescein Isothiocyanate) انکوبه و پس از 2 ساعت سلولها باPBS شسته شده و توسط میکروسکوپ فلورسانس اینورت مشاهده شدند. هستهها نیز مانند قبل با اتیدیوم بروماید رنگآمیزی شدند.
تیمار سلولهای بنیادی عصبی با عصاره Cirsium vulgare: سلولهای بنیادی عصبی ایزوله شده از هیپوکمپ نوزاد موش صحرایی در یک گروه کنترل و پنج گروه تیمار شده با عصاره مورد نظر در پلیت های 96 خانه با غلظتهای 200، 400، 600، 800 و 1000 میکروگرم بر میلیلیتر بهمدت 48 ساعت تیمار و مورد مطالعه قرار گرفتند. تیمار سلولها در محیط کشت سلولهای بنیادی عصبی و فاقد سرم انجام شد. به منظور بررسیهای آماری دقیق 5 تکرار در نظر گرفته شد.
آزمون MTT: برای ارزیابی میزان تکثیر از روش (3-(4,5 Dimethylthiazol-2-Yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) MTT استفاده گردید. پس از 48 ساعت تیمار با عصاره هیدروالکلی گل گیاه قاصدک محیط کشت سلولها با 20 میکرولیتر محلول MTT (سیگما) با غلظت 5 میلیگرم بهازای هر میلیلیتر که بهصورت تازه تهیه شده بود تعویض شد. بعد از 4 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد محلول روی سلولها به آهستگی حذف شد و کریستالهای فورمازون ایجاد شده در اثر واکنش با MTT در 100 میکرولیتر DMSO حل شد. پس از چند دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق و حل شدن کامل کریستالها، جذب در 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا (BioTek) محاسبه شد.
Real-time PCR: برای بررسی مقایسهای بیان ژن Sox2 و ژن β-2M بهعنوان کنترل داخلی در گروه کنترل و سلولهای تیمار شده با 800 میکرو گرم بر میلیلیتر عصاره گل قاصدک از تکنیک Real-time PCR استفاده شد. برای این منظور سلولها در پاساژ سوم برای آزمون انتخاب شدند. در این تکنیک استخراج RNA کل از سلولها با استفاده از کیت Pure link RNA mini kit ( Invitrogen ) و دستورات شرکت سازنده انجام گرفت و با استفاده از آنزیم کپی برداری معکوس به cDNA تبدیل شد. در مطالعه حاضر، جهت ساخت cDNA از پرایمر oligo dT موجود در کیتRevert aid H Minus-First Strand cDNA Synthesis, K1632 مربوط به شرکت Fermentas استفاده شده است و مطابق با دستور شرکت سازنده mRNA به cDNA تبدیل شد. 500 نانوگرم cDNA برای تعیین کمیت بیان mRNA ژن Sox2 استفاده شد. تمامی پرایمرها در جدول شماره یک طبقه بندی شدهاند. واکنشهای PCR در حجم 25 میکرولیتر (Sybergreen) و در 40 چرخه توسط دستگاه (Applied Biosystem cycler) انجام گردید آنالیز نسبی در سطح mRNA با روش Pfaff1 و با استفاده از فرمول ((ΔCT نمونه هدف) – (ΔCT کالیبره کننده)) = ΔΔCT انجام شد. ΔCT عبارت است از CT ژن هدف (یا کالیبراتور) که از CT ژن خانه‌زاد کسر شده است. این عدد بازگو می‌کند که تیمار ما موجب افزایش چند برابری ساخت mRNA هدف شده است (10).
جدول 1: توالی پرایمرهای مورد استفاده در Real-time PCR
|
Size (bp) |
Anti-sense 5 → 3 |
Sense 5 → 3 |
Accession no. |
Gene |
|
197 |
CTGGCGGAGAATAGTTGGGG |
TGCCTCTTTAAGACTAGGGCTG |
NM_001109181 |
Sox2 |
|
243 |
TTACATGTCTCGGTCCCAGGTG |
CCCAACTTCCTCAACTGCTACG |
NM_012512 |
B2M |
آنالیز آماری:
آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS 15.0 انجام گردید و تمامی دادهها بهصورت ± SEM Meanارائه شد. مقایسه آماری بین گروهها با استفاده از Tukey's post hoc test انجام شد و 05/0P < معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج حاصل از کشت سلولهای بنیادی عصبی
سلولها وقتی در محیط مناسب کشت سلول بنیادی عصبی قرار گرفتند زوائد و استطالههایی در سلول ایجاد گردید که گاهی چند برابر جسم سلولی مشاهده شد و با سلولهای جانبی ارتباط برقرار نمود هستهها کشیدهتر بهنظر میرسید و سلولها دوکیتر شده و در حالیکه مرز بین سلولها منظمتر و مشخصتر دیده شد. در روز اول ابتدا این سلولها بهصورت کلونی بودند که به کف پلیت چسبیدهاند در روز دوم و سوم به مرور از حجم کلونی کاسته شد و سلولها کم کم پخش شدند و این در حالی بود که همچنان سلولها قدرت تقسیم داشتند به این ترتیب تا حدودی ظاهر سلولها ویژگیهای یک سلول شبه عصبی را بهدست آوردند که قدرت تقسیم داشتند. سلولهای بنیادی عصبی بعد از 7 روز کاملا فلاسک را پر کردند و نمایی کشیده و دوکی شکل با زوائد سیتوپلاسمی به خود گرفتند (شکل 1 AوB). این سلولها قدرت تکثیر داشتند که برای اثبات عصبی بودن سلولهای NSCs و تعیین خلوص آنها در پاساژ سوم از آنتیبادی Nestin استفاده گردید. در سلولهایی که پروتئین مربوطه وجود داشت بهدلیل استفاده از آنتیبادی ثانویه کنژوکه به FITC سیتوپلاسمشان سبز رنگ دیده شد. برای تعیین درصد سلولهای مثبت، هسته سلولها توسط اتیدیوم بروماید قرمز رنگ شدند (شکل 1 C و D). میانگین درصد سلولهای مثبت برای پروتئین نستین 46/ 0± 12/95 ارزیابی شد.
شکل 1: سلولهای بنیادی عصبی. ( A سلولهای بنیادی عصبی را پس از یک روز نشان میدهد که بهصورت کلونیهای چسبیده به کف پلیت دیده میشود. ( Bسلولهای بنیادی عصبی را پس از یک هفته روز نشان میدهد. این سلولها کف فلاسک را پر کرده و حالت کشیده و دوکی شکل میباشند. C و D) ایمونوسیتوشیمی از سلولهای بنیادی عصبی بهترتیب فاز کنتراست و فلورسنت. رنگ سبز نشاندهنده آنتیبادی نستین و رنگ قرمز اتیدیوم بروماید میباشد. بزرگنمایی × 200.
نتایج MTT
مورفولوژی سلولهای بنیادی عصبی پس از تیمار با عصاره گیاهی تغییری نداشت. نتایج تست MTT نشاندهنده افزایش تکثیر سلولهای بنیادی عصبی در گروه تیمار شده نسبت به گروه کنترل بود (شکل 2). سلولهای تیمار شده با غلظت 800 میکروگرم (01/0±37/0) بالاترین میانگین رشد را نشان داد که نسبت به گروه کنترل (07/0±24/0) اختلاف معنیداری را نشان میدهد (05/0P <). نتایج بهدست آمده نشان میدهد که افزایش سرعت تکثیر در سلولهای بنیادی عصبی به غلظت عصاره موجود در محیط کشت دارد. غلظتهای بالای 800 میکروگرم برای سلولها توکسیک محسوب میشوند و کاهش تعداد سلول بهدلیل مرگ سلولها میباشد.
شکل 2 :A) نمودار مقایسه آماری سلولهای بنیادی عصبی در غلطتهای مختلف با روش MTT: A) نمودار نشاندهنده وجود اختلاف معنیدار میان گروه کنترل و سلولهای بنیادی عصبی تیمار شده با غلطت 800 میکروگرم بر میلیلیتر میباشد. CوB) میکروگرافهای سلولهای بنیادی عصبی قبل و بعد از تیمار با غلظت800 میکروگرم بر میلیلیتر عصاره گل قاصدک. خطای معیار (SEM)، نشاندهنده وجود اختلاف معنیدار با گروه کنترل (05/0P <). بزرگنمایی × 200.
نتایج حاصل از Real –time PCR
بیان کمی mRNA ژن مربوط به رشد و تکثیر سلولهای بنیادی عصبی که با غلظت 800 میکروگرم در میلیلیتر و زمان 48 ساعت تیمار شده بودند با روش Quantitative real-time RT-PCR بررسی شد. الگوی بیان کمی ژن Sox2 در شکل 3 نشان داده شده است. در این مطالعه با استفاده از روش آستانه نسبی (مقایسه نسبی) مقدار دادههای توسط ژن B2M نرمالایز شد و با استفاده از فرمول ΔΔCT 2 (طبق مقاله Pfaffle و همکارانش) افزایش ساخت mRNA محاسبه شد. نتایج نشان داد که میزان کمی mRNA مربوط به این ژن در سلولهای تیمار شده با عصاره گل قاصدک (07/0±73/0) نسبت به نمونه کنترل یا تیمار نشده (03/0±43/0) افزایش داشت (شکل3).
شکل 3: نمودار مقایسه نسبی بیان ژن Sox2 نرمالایز شده با ژن B2M در سلولهای بنیادی عصبی با بهترین غلظت عصاره گل قاصدک (800 میکروگرم در میلیلیتر) برای مدت 48 ساعت.
بحث
نتایج حاصل از این مطالعه نشاندهنده تاثیر افزایش دهنده عصاره هیدروالکلی گل قاصدک در روند تکثیر سلولهای بنیادی عصبی میباشد. همچنین افزایش بیان ژن Sox2 در سلولهای بنیادی عصبی تاییدی بر نتایج MTT میباشد. استراتژی سلول درمانی در بیماریهای مخرب سیستم عصبی توسط لیندوال و همکارانش (11) مطرح شد. هم اکنون سلولهای بنیادی (سوماتیک) بهعنوان منبع قابل دسترس و مناسب برای سلول درمانی محسوب میشوند. این سلولها در بیشتر بافتهای در بالغین حضور دارند (12). هرمن و همکارانش (2) بهمنظور تایید هویت سلولهای بنیادی عصبی ایجاد شده نشان دادند که سلولهای بنیادی عصبی میتوانند نسبت به نشانگر عصبی نستین واکنش مثبت نشان دهند. نتایج بهدست آمده در این مطالعه که بر روی سلولهای بنیادی عصبی مشتق از هیپوکمپ مغز نوزاد موش صحرایی انجام شد تاییدی بر کار هرمن و همکارانش (2) بود. سلولهای بنیادی عصبی دارای ظرفیت خود تکثیری و تمایز به سلولهای عصبی، آستروسیت و الیگودندروسیت هستند (13و 14و 15). در حال حاضر استفاده از عصارههای گیاهی در درمان بسیاری از بیماری گسترش یافته است. در طب سنتی از عصاره گیاه گل قاصدک بهمنظور ضدتهوع، ضد درد و ضدالتهاب استفاده میشود (16). با اینحال در رابطه با اثر این گیاه روی سلولهای بنیادی هیچگونه مطالعهای صورت نگرفته است. بیشتر بررسیهای انجام شده در رابطه با گیاهان متعلق به رده Cirsium مربوط به گیاه Cirsium japonicum میباشد. این گیاه بهعنوان داروی ضد دیابت (17)، ضد اضطراب (18) آنتی اکسیدانت و ضدسرطان (19) معرفی شده است. همچنین گزارش شده است که استفاده از عصاره این گیاه جذب گلوکز را در سلولهای بدن افزایش میدهد (20). مطالعهای دیگر نشان دهنده تاثیر عصاره متانولی گیاه بر روی مهار رشد و القا آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی پستان میباشد (21). همچنین مطالعات نشان میدهد که عصاره متانولی این گیاه تاثیر قابل توجهی بر روی چرخه دو رده سلولی K562 و سلولهای Jurkat ندارد (22). با توجه به بررسیهای انجام شده، این تحقیق اولین مطالعه بر روی تاثیر عصاره گل قاصدک در تکثیر سلولهای بنیادی عصبی میباشد. نتایج بهدست آمده نشان میدهد که تیمار سلولهای بنیادی عصبی با غلظت 800میکروگرم بر میلیلیتر باعث افزایش معنیدار در رشد و تکثیر این سلولها میشود. مطالعات انجام شده توسط محققین نشان داده است که عصاره گل قاصدک دارای خاصیت ضدالتهابی میباشد (3و 16). بنابراین با توجه به نتایج بهدست آمده از این تحقیق و با در نظر گرفتن خاصیت ضدالتهابی میتوان به تاثیرات مثبت استفاده از این گیاه در درمان بیماریهای مخرب سیستم عصبی از قبیل آسیبهای نخاعی بهویژه در فاز اولیه امیدوار بود.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج به دست آمده عصاره گیاه Cirsium vulgare میتواند ماده موثری برای افزایش تکثیر سلولهای بنیادی عصبی در محیط In vitro باشد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق در آزمایشگاه سلولهای بنیادی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل انجام شده است. لذا لازم میدانیم از حمایتهای بیدریغ جناب آقای دکتر سید سعید هاشمین (معاون پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل) نهایت تقدیر و سپاس را داشته باشیم.
)