نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشکده علوم پایه، دانشگاه فردوسی، مشهد، ایران
2 دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه سعی شده است با استفاده از مطالعات ایمونوهیستوشیمی، بررسی اثر هیپوتیروئیدی مادری بر تغییرات بیان لامینین در آلوئولهای ریه نوزادان رت نژاد ویستار مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روش‌ها: در این بررسی از رت‌های ماده باکره نژاد ویستار استفاده شد. رت‌های مادر در دو گروه تجربی (هیپوتیروئید و هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین) و یک گروه کنترل (هر گروه شامل 12 رت) قرار گرفتند. در گروههای تجربی، رتها 14 روز قبل از جفتگیری بهترتیب در معرض داروهای ضدتیروئیدی پروپیل تیواوراسیل، با دوز 50 میلیگرم و بهطور همزمان داروهای پروپیل تیواوراسیل و لووتیروکسین، بهترتیب با دوزهای50 و 1میلیگرم در هر لیتر آب آشامیدنی قرار گرفتند. پس از 14 روز جهت اطمینان از تغییرات سطح هورمونها، از رت‌های مادر تست خون گرفته و به آنها اجازه جفتگیری داده شد. سپس از ریه نوزادان 10 روزه جهت انجام مطالعات ایمنوهیستوشیمیایی نمونه‌برداری بهعمل آمد.
نتایج: در آلوئولهای ریه، در گروه هیپوتیروئید کاهش معنیداری در بیان لامینین (001/0p= ) مشاهده شد، درحالیکه گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین تفاوت معنیداری را نسبت به گروه کنترل نشان نداد.
نتیجه‌گیری: هورمونهای تیروئیدی اثرات بسیار مهمی بر بیان لامینین و تکوین ریه دارند، بهطوریکه هیپوتیروئیدی مادری باعث کاهش قابل توجهی در بیان لامینین در آلوئولها میشود. بنابراین تغییر در میزان طبیعی هورمونهای تیروئیدی مادری میتواند باعث تغییرات گسترده‌ای در تکوین آلوئولهای ریه جنین و نوزاد شود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Immunohistochemical evaluation of the effects of maternal hypothyroidism during pregnancy and lactation on the expression of laminin in the lung alveoli of newborn Wistar rats
نویسندگان [English]
- Z H 1
- M A 1
- N M 1
- M J 2
- MR N 2
چکیده [English]
Aim: In this study, we have used immunohistochemical studies to examine the effects of maternal hypothyroidism on the expression of laminin in the lung alveoli newborn Wistar rats examined.
Material and methods: in this study we have used female virgin rat, wistar strain. Rats were divided in two experimental groups (hypothyroid and hyperthyroid treated with thyroxin) and one control group (n=12). 14 days before mating in the experimental groups, the rats respectively were exposed to Propylthiouracil (50 mg/L) as well as thyroxin (1 mg/L) and Propylthiouracil (50 mg/L) simultaneously. After 14 days, blood test was taken from mothers and in case of desired changes in hormone levels, rats were allowed to mate. After delivery, the lung of the 10 days old newborns were used for immunohistochemical studies.
Results: There was a significant reduction in laminin expression in hypothyroid group (p= 0.001) where as no significant difference was observed in hypothyroid group treated with thyroxin compared to control group.
Conclusion: Thyroid hormones have important role on laminin expression and development of lung, since maternal hypothyroidism causes large reduction in alveiolar laminin expression. Therefore changes in maternal thyroid hormone can cause large changes in alveolar development in newborns.
کلیدواژه‌ها [English]
- Maternal hypothyroidism
- Immonuhistochemistry studies
- Laminin
- Alveoli
مقدمه
بررسیهای بهعمل آمده نشان داده است که هورمونهای تیروئیدی لازمه تکوین طبیعی بافتهای بدن محسوب میشوند تا آنجا که در زمان ارگانوژنز و در شرایطی که هنوز تیروئید جنین تکوین نیافته و قادر به ترشح نیست، جنین به هورمونهای تیروئیدی مادری وابسته است که از طریق جریان خون از سد جفتی گذشته و در روند تکوین بافتهای جنینی بخصوص سیستم عصبی نقشی حیاتی ایفا مینماید (1). در این زمینه مطالعات نشان میدهد که در مخچه رت، مهاجرت نورونها از لایه گرانولار خارجی به لایه گرانولار داخلی در دوران پس از تولد رخ میدهد و وابسته به حضور هورمونهای تیروئیدی است. بهطوریکه در افراد هیپوتیروئید، بسیاری از نورونها مهاجرتشان را کامل نمیکنند و میمیرند (2). بنابراین چنین استنباط میشود که سیستم هورمونی مادری و منجمله هورمونهای تیروئیدی دارای این قابلیت است که به سهم خود در پدیدههای تکوین و ارگانوژنز جنینی مشارکت نماید. با این توصیف بعید بهنظر نمیرسد که در غیاب هورمونهای تیروئیدی مادری، تکامل سیستم تنفسی نیز بمانند بعضی دیگر ارگانها با مشکل مواجه شود. در رابطه با تاثیر هورمونهای تیروئیدی بر روی ریه، این هورمونها بهطور مستقل یا همراه با گلوکوکورتیکوئیدها، برای رشد و تکوین نرمال ریهها ضروری اند (3). افزایش در میل ترکیبی رسپتورهای تیروئیدی و اشغال آنها بهوسیله T3 در طی تکوین ریه در پستانداران (خرگوش)، نیز بیانگر همین موضوع میباشد(3). بررسیها نشان میدهد که هورمونهای تیروئیدی بر روی آلوئول نوع II، سنتز و ترشح سورفاکتانت موثر است، بهطوریکه که تیروئیدکتومی در رت بالغ قطر سلولهای آلوئولی نوع II را به 3/1 میزان طبیعی آنها کاهش میدهد. عکس اینحالت در سلولهای آلوئولی نوع II ریههای بالغ، که بهمدت شش روز در معرض T4 اضافی قرار گرفتند صادق است، این سلولها دستخوش هیپرتروفی میشوند (4). در این مطالعه نقش هورمونهای تیروئیدی برتکوین آلوئولهای ریه مورد مطالعه قرار گرفت .از سوی دیگر درساختارخارج سلولی آلوئولها، پروتئینهای متعددی ایفای نقش میکنند که لامینین یکی از مهمترین آنهاست. اهمیت این پروتئین در ساختار ریه آنقدر مهم است که چنانچه تغییرات تکوینی حاصل از نقایص ژنتیکی یا ترشحات هورمونی یا هر عامل دیگری که بیان ژنهای کد کننده مربوط به آن را با اشکال مواجه کند خواهد توانست تکوین طبیعی ریه را دچار مشکل نماید. بنابراین با توجه به اهمیت فوق العاده آلوئولهای ریه در فرآیندهای مرتبط با تنفس و از آنجا که در ارتباط با اثر هیپوتیروئیدی مادری بر تکوین آلوئولها تحقیقات چندانی صورت نگرفته، در این تحقیق سعی شد تا با استفاده از ردیابی لامینین در ماده خارج سلولی و در ساختار غشای پایه آلوئولهای ریه بهشدت بیان آن بهعنوان یک ابزار مطالعه تلقی گردد.
مواد و روش‌ها
تعداد 36 عدد رت باکره نژاد ویستار دارای سن 5/2 ماه و وزن 200 تا 250 گرم تهیه شد. کلیه مراحل انجام کار با رعایت کدهای اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوبه وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی انجام گرفت. (حیوانات درشرایط استاندارد خانه حیوانات دانشکده علوم، گروه فیزویولوژی دانشگاه فردوسی مشهد با دمای مناسب و آب آشامیدنی و غذای کافی تحت مراقبت بوده و پرفیوژن بطنی و نمونه‌برداری تحت بیهوشی عمیق انجام گرفت. رتها در 3 گروه 12 تایی قرار گرفتند: الف) گروه تجربی1 داروی پروپیل تیواوراسیل (PTU) (ساخت شرکت ایران دارو) را بهصورت محلول درآب آشامیدنی با غلظت50 میلیگرم درلیتر (5) دریافت کردند. گروه تجربی 2 نیز بهطور همزمان داروهای پروپیل تیواوراسیل و لووتیروکسین (ساخت شرکت ایران دارو) را بهترتیب با دوزهای50 میلیگرم و 1 میلیگرم (6) در هر لیتر آب آشامیدنی دریافت کردند. گروه کنترل فقط آب آشامیدنی دریافت کردند. لازم به ذکر است تمام گروههای تجربی بهمدت 14 روز قبل از جفتگیری و در تمام طول دوره بارداری و شیردهی در معرض این داروها قرار گرفتند. به گروه کنترل در تمام طول آزمایش آب لوله کشی شهری داده شد. برای حصول اطمینان از ایجاد کاهش سطح هورمونهای تیروئیدی در گروه هیپوتیروئید و عدم کاهش آن در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین سطوح هورمونهای تیروئیدی در پلاسمای خون رتها بهروش رادیوایمونواسی اندازهگیری شد. به این منظور با استفاده از لولههای شیشهای موئینه استریل و ضد انعقاد خون از ورید چشمی حیوانات بهمیزان 5/0 تا 1 میلیلیتر خونگیری بهعمل آمد و پس از سانتریفوژ کردن آنها، سرم خون جدا شد و در لولههای هپارینیزه اپندرف به آزمایشگاه مرکزی جهاد دانشگاهی مشهد منتقل شد. سپس با استفاده از کیت کاوشیار و بهروش رادیو ایمونواسی (RIA) سطح سرمی هورمونهای T3 و T4 هر یک از نمونهها معین شد و در صورت تغییرات لازم در هر کدام از گروهها به آنها اجازه جفتگیری داده شد. نحوه آمیزش رتها به اینصورت بود که در ابتدای هر شب یک رت ماده به همراه یک رت نر در داخل قفس قرار داده شدند و در صبح روز بعد، با استفاده از سوآپ از ناحیه واژن رت ماده گسترش تهیه شد و در زیر میکروسکوپ جهت اطلاع از وجود یا عدم وجود اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. نوزادان مربوط به گروه کنترل و گروههای تجربی در روز دهم پس از تولد، پس از بیهوشی با کلروفرم و پرفیوژن بطنی (با استفاده از فرمالدئید4 درصد) مورد فیکس اولیه قرار گرفتند و سپس ریه آنها جدا سازی و جهت مطالعات ایمنوهیستوشیمی به الکل 70 منتقل گردید. پس از انجام مراحل آماده سازی بافتی، و قالبگیری، از نمونهها برشهای سریال 5 میکرونی تهیه شد. به فاصله هر 10 برش یک برش انتخاب شد. نمونهها پس ازپارافین زدایی و آبدهی، بهمدت 10 دقیقه با PBS شستشو داده شدند، و بهمدت 10 دقیقهی دیگر، در تریتون ×100 قرار گرفتند، مجددا با محلولPBS شستشو داده شدند و بهمدت 2 ساعت در معرض آنتیبادی آنتیلامینین قرار گرفتند، سپس مجددا با محلول PBS شستشو داده شدند و بهمدت 10 دقیقه در معرض دی آمینو بنزیدین (DAB) قرار گرفتند. سپس لامها، 3 بار با محلول PBS شستشو داده شدند و بهمدت 20 ثانیه در معرض هماتوکسیلین قرار گرفتند و سرانجام با چسب انتلان با لامل پوشانده شدند.
با این تکنیک رنگآمیزی, laminin مورد نظر بر اساس میزان پیدایش، به anti laminin واکنش مثبت نشان داده و بهرنگ قهوهای (برحسب میزان laminin از قهوهای روشن تا تیره) ظاهر شدند. بنابراین پس از عکسبرداری از لامها توسط میکروسکوپ دوربیندار، با استفاده از روش گانگ (7، 8 و 9) درجه رنگناپذیری صفر و رنگپذیری از 1 تا 4 در نظر گرفته شد تا بتوان در ارزیابی تغییرات آن را از حالت کیفی به کمی تغییر داد. در این بررسی با استفاده از نرم افزار آماری spss و تستهای کروسکال والیس و منویتنی اقدام به تجزیه و تحلیل دادهها و رسم جداول و نمودارهای مورد نظر شد.
نتایج
مقایسه تغییرات بیان لامینین بین 3 گروه کنترل، هیپوتیروئید و هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین، تغییرات معنیداری را در بیان لامینین در آلوئولهای نوزادان 10 روزه نشان داد (شکل 1 و نمودار 1). در این نوزادان، واکنشپذیری لامینین در نوزادان مربوط به مادران هیپوتیروئید نسبت به نوزادان مربوط به گروه کنترل بهمیزان قابل توجهی کاهش پیدا کرد (001/0p=) (شکل1 و نمودار1). درحالیکه واکنشپذیری لامینین در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین مشابه گروه کنترل بود (شکل1 و نمودار1).
شکل 1: واکنش اختصاصی لامینین آلوئولهای ریوی در نوزادان 10روزه (×100). بیان لامینین کاهش قابل ملاحظهای را در گروه هیپوتیروئید (H) نسبت به گروه کنترل (C) نشان داد در حالیکه میزان بیان لامینین در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین (HT) مشابه گروه کنترل بود. گرید بندی بر اساس روش گانگ بر اساس درجه رنگ پذیری از 0 تا .4.
نمودار 1: بررسی تغییرات بیان لامینین در آلوئولهای ریه. بیان لامینین در آلوئولهای ریه در گروه هیپوتیروئید (H) نسبت به گروه کنترل (C) بهطور قابل توجهی کاهش یافت در حالیکه در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین (hypo+T4) نسبت به گروه کنترل تفاوتی مشاهده نشد.
علامت **: 01/0p<
بحث
رسپتورهای هورمونهای تیروئیدی در بخشهای مختلف ریه و مخصوصا آلوئولها وجود دارند. در واقع بیان mRNAی یکی از زیرواحدهای این رسپتورها (TRα1)، در مرحله آلوئولار تقریبا به حد ماکزیمم میرسد که این موضوع بیانگر نقش بهسزای این هورمونها بر تکوین آلوئولها میباشد (3). بیان لامینین نیز از نظر تکوینی تنظیم شده است، برای مثال زیر واحدهای 1α و 2α در ششهای جنین بیان میشوند در حالیکه زیرواحدهای 3α، 4α و 5α لامینین در ششهای جنین و بالغ شناسایی شده است (10) و هورمونهای تیروئیدی بر بیان لامینین تاثیرگذار میباشند ( 17-11). از اینرو باتوجه به اثرات گسترده هورمونهای تیروئیدی درتکوین اندامهای مختلف (2، 6، 17 و 18) و با توجه به اینکه ریه یکی از مهمترین ارگانهای بدن و آلوئولها مهمترین بخش آن محسوب میشوند، دراین مطالعه سعی شده است به بررسی اثر هیپوتیروئیدی مادری در دوران بارداری و شیردهی، برتکوین آلوئولهای جنین و نوزاد پرداخته شود. در حقیقت دراین مطالعه سعی بر این است تا با تکیه بر مطالعات ایمونوهیستوشیمی به بررسی تغییرات لامینین درغشای پایه و ماتریکس خارج سلولی آلوئولها، درنوزادانی که مادران آنها درمعرض داروهای ضد تیروئیدی قرارگرفتهاند، پرداخته شود. همانگونه که میدانیم ماتریکس خارج سلولی برای تکوین نرمال ریهها ضروری میباشد، مثلا پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی در بافت ریه در حال تکوین، دارای نقشهای حمایتی و ساختاری هستند. در این میان گلیکوپروتئینهایی مانند فیبرونکتین و لامینین، واکنشهای بین سلولها را میانجیگری میکنند. لامینین در واکنشهای سلول-ماتریکس ایفای نقش میکند و در همئوستاز و بازسازی بافت در طی جنینزایی مهم است (19 و 20). سلولهای آلوئولار روی غشای پایهای قرار گرفتهاند که از کمپلکسی از پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی ساخته شده است. در ریههای سالم ترکیب این ماتریکس باعث اتصال سلولهای اپیتلیالی آلوئولی به یکدیگر میشوند. همچنین در ریه موش، لامینین بهوسیله پیوند با اینتگرینهای سطح سلولی واکنشهای بین سلولهای اپیتلیال و مزانشیم را میانجیگری میکند (21).
در واقع سلولهای آلوئولی احتمال دارد که حداقل 5 ایزوفرم لامینین را بیان کنند، بهعنوان مثال، در زمان تشکیل آلوئول، بیان زیر واحد 1 βاینتگرین در اپیتلیوم آلوئول افزایش پیدا میکند(22). در ریه رت زنجیره 3α لامینین در غشای پایه آلوئول بیان میشود و در این مکان با زیرواحدهای 1β،1Yو 2β متمرکز میشودزنجیره 3α برای آلوئولها بسیار میباشدبهطوریکه جهش در این زنجیره، باعث اختلال در تجمع غشای پایه سلولهای اپیتلیالی آن میشود. همچنین، ایزوفرم زنجیره 2β لامینین در غشای پایه مجاری پریآلوئولاری یافت میشود و بیشتر در طی تکوین ریه (خرگوش) و در زمان تمایز سلولهای آلوئولی نوع II، بیان و در زیر این سلولها متمرکز میشود (22). این مطالب، همه بیانگر نقش مهم لامینین در تکوین آلوئولها میباشد، علاوه بر این هورمونهای تیروئیدی نقش مهمی را در تکوین و بلوغ آلوئولها ایفا میکنند، بهعنوان مثال این هورمونها سنتز سورفاکتانت را تسهیل میکنند. تکوین مناسب سیستم سورفاکتانت ریوی برای تنفس نرمال در زمان تولد لازم است (23)، بهطوریکه کمبود سورفاکتانت در جنینهای نارس، علت اصلی سندرم دیسترس تنفسی نوزاد میباشد. در جنین نارس انسانی که مبتلا به سندرم دیسترس دیسترس تنفسی است، غلظت سرمی T3 و T4 در دوره بعد از تولد پایینتر از جنین نارس بدون سندرم دیسترس تنفسی است (24). همچنین سندرم دیسترس تنفسی به نسبت بالا در کودکانی که در دوران جنینی مبتلا به هیپوتیروئیدی بودهاند، دیده میشود (25 و 26). نمودار 1 و نتایج حاصل ازآنالیزهای آماری در پژوهش حاضر، در رابطه با بیان لامینین درآلوئولهای ریوی نشان داد که هیپوتیروئیدی مادری باعث کاهش معنیداری در میزان بیان لامینین نسبت به گروه کنترل میشود درحالیکه هیچ تفاوت معنیداری دربیان لامینین در آلوئولهای نوزادان گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد. با توجه به مطالعات انجام شده توسط سایر محققان و تایید حضور لامینین در غشای پایه و ماتریکس خارج سلولی و تاثیر هورمونهای تیروئیدی بر آن و نتایج بهدست آمده در این پژوهش میتوان چنین استنباط کرد که هیپوتیروئیدی در آلوئولها میزان بیان لامینین را همانند آن در مخچه کاهش میدهد و با توجه به اینکه این کاهش در مرحله بحرانی تکوین آلوئولها اتفاق میافتد ممکن است تکوین آلوئولها را دچار مشکل کند. همچنین بیان لامینین درآلوئولهای نوزادان 10 روزه در دو گروه کنترل و هیپوتیروئید تیمارشده با تیروکسین مشابه بود که این بیانگر این موضوع است که هورمون تیروکسین میتواند جایگزین خوبی برای درمان افراد هیپوتیرئید و بازگرداندن آنها بهحالت طبیعی باشد.
نتیجه گیری
کم کاری تیروئید بر روی بیان لامینین اثر مستقیمی دارد و باعث کاهش بیان آن میشود از آنجاییکه لامینین یکی از مهمترین عناصر تشکیل دهنده ماده خارج سلولی و غشای پایه آلوئولها محسوب میشود کاهش بیان آن نوعی نقص بشمار میرود که به نوبهی خود تکوین آلوئولها را نیز با مشکل مواجه میکند. از طرف دیگر با توجه به مطالعه حاضر میتوان مشکل کاهش بیان لامینین در اثر کاهش هورمونهای تیروئیدی را با تجویز مقدار مناسبی از هورمون تیروئیدی (T4) بهبود بخشید. تاکنون مطالعهای مبنی بر اثر کمکاری هورمونهای تیروئیدی بر روی بیان لامینین در ریه انجام نشده است. با توجه به مطالعه حاضر میتوان چنین استنباط کرد که کاهش تیروئید در مادر و در طی بارداری و شیردهی میتواند باعث کاهش قابل توجهی در بیان لامینین در نوزاد شده و بنابراین تکوین ریه را نیز تحت تاثیر قرار دهد.
تشکر و قدردانی
این مطالعه با همت و همکاری اساتید راهنما و مشاور و با بهرهگیری از کمکهای آزمایشگاه بافتشناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه فردوسی و آزمایشگاه بافت شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد صورت گرفته. لذا بدینوسیله از همه دست اندرکاران و همچنین مسئول خانه حیوانات گروه فیزیولوژی دانشگاه فردوسی مشهد بهخاطر همکاری صمیمانهشان کمال تشکر و قدردانی را داریم.
)