نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش بررسی بر هم کنش و رفتارهای سلولی بافت بلاستما در مجاورت داربست آئورتی بود.
مواد و روشها: در این تحقیق آئورت گاو به عنوان داربست استفاده شد. ابتدا سلول ها و کلاژن بافت آئورت با استفاده از محلول برمید سیانوژن و فرمیک اسید حذف گردید تا داربستی بسیار متخلخل به دست آید. سپس داربست های تهیه شده درون حلقههایی از بافت بلاستمایی که تجمعی از سلولهای تمایز نیافته با قابلیت تقسیم و تمایز سلولی مشابه با سلولهای بنیادی جنینی میباشند، قرار داده شده و در محیط کشت به مدت 40 روز نگهداری شدند. سپس ارتباط بین بافت بلاستما و داربست الاستیک به فاصله هر 10 روز مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: مطالعات میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت، علاوه بر تایید حذف سلولها و رشته‌های کلاژن، نفوذ تدریجی سلولهای بلاستمایی به داخل داربست الاستیک و تغییراتی از قبیل رگزایی، شکلگیری بافت همبند و تمایز احتمالی سلولهای بلاستمایی به فیبروبلاست و میوسیت در اثر القاء داربست الاستیک را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. از طرف دیگر، این داربست می‌تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد. هرچند مطالعات بیشتری برای اثبات هویت سلولها و سایر ویژگیهای این داربست و همچنین امکان استفاده از آن در روشهای مهندسی بافت عروقی مورد نیاز است.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Histological study of the interactions between blastema tissue originated from the pinna of New Zealand white rabbit and natural 3D elastic scaffold in vitro
چکیده [English]
Aim: The aim was to investigate the interactions and cellular behavior of the blastema tissue and natural 3D elastic scaffold in vitro.
Material and Methods: In this study cows aorta was used as a scaffold. To prepare a very porous elastic scaffold, the cells and collagen were removed by treating that with 50 mg/ml cyanogen bromide in 70% formic acid. The prepared scaffold were then placed inside the blastmea rings and kept in culture media for 40 days. The interaction between blastema tissues and elastic scaffolds were studied in 10 days intervals.
Results: Microscopic studies in different day on blastema tissue and scaffold revealed that the cells and collagen fibers were omitted successfully from the elastic scaffold. Moreover, histological studies indicated that the cells had penetrated into the scaffold. In addition cell devision, probable differentiation of blastema cells to fibroblast and myocyte and also angiogenesis due to inductve effect of elastic scaffold were abserved.
Conclusion: Our results indicated that, it is possible to prepare a natural elastic scaffold from aorta by treatment with cyanogen bromide. On the other hand, this scaffold may have inductive effects on cell behaviors such as migration, adhesion, cell division and probably differentiation. Further studies are required to confirm the indentity of cells and other properties of the scaffold and also its possible use in engineering of vascular tissue.
کلیدواژه‌ها [English]
- Blastema Ttissue
- Decellularization
- Differentiation
- 3D Matrix
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 73-63
مطالعه هیستولوژیکی اثر متقابل بافت بلاستمای لاله گوش خرگوش نژاد نیوزلندی
و داربست سلول زدایی شده سه بعدی طبیعی الاستیک در شرایطin vitro
تهمینه کاظمی. M.Sc1*، ناصرمهدوی شهری. Ph.D1و2، مریم مقدم متینPh.D.3، مسعود فریدونی.Ph.D4،
سید حسن کاظمی M.Sc.5
1- دانش آموخته کارشناس ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
2- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
3- گروه پژوهشی سلولی مولکولی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
4- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم ، دانشگاه فردوسی مشهد
5- دانشجوی دکتری، گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: Tahmineh_kazemi@yahoo.com
تاریخ دریافت: 28/10/ 1389 تاریخ پذیرش: 31/1/1390
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش بررسی بر هم کنش و رفتارهای سلولی بافت بلاستما در مجاورت داربست آئورتی بود.
مواد و روشها: در این تحقیق آئورت گاو به عنوان داربست استفاده شد. ابتدا سلول ها و کلاژن بافت آئورت با استفاده از محلول برمید سیانوژن و فرمیک اسید حذف گردید تا داربستی بسیار متخلخل به دست آید. سپس داربست های تهیه شده درون حلقههایی از بافت بلاستمایی که تجمعی از سلولهای تمایز نیافته با قابلیت تقسیم و تمایز سلولی مشابه با سلولهای بنیادی جنینی میباشند، قرار داده شده و در محیط کشت به مدت 40 روز نگهداری شدند. سپس ارتباط بین بافت بلاستما و داربست الاستیک به فاصله هر 10 روز مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: مطالعات میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت، علاوه بر تایید حذف سلولها و رشته‌های کلاژن، نفوذ تدریجی سلولهای بلاستمایی به داخل داربست الاستیک و تغییراتی از قبیل رگزایی، شکلگیری بافت همبند و تمایز احتمالی سلولهای بلاستمایی به فیبروبلاست و میوسیت در اثر القاء داربست الاستیک را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. از طرف دیگر، این داربست می‌تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد. هرچند مطالعات بیشتری برای اثبات هویت سلولها و سایر ویژگیهای این داربست و همچنین امکان استفاده از آن در روشهای مهندسی بافت عروقی مورد نیاز است.
واژگان کلیدی:بافت بلاستمایی، تمایز، داربست سه بعدی، سلول زدایی
مقدمه
در بسیاری از عرصه‌های پزشکی یکی از متداول ترین راه‌حل‌های نقص عضو یا بافت، پیوند آن ها از اهدا کنندگان است. این اهدا کننده می‌تواند خود بیمار باشد یا افرادی که از نظر ایمنولوژیک با فرد بیمار مشابه می باشند. حتی در مورد پیوند اعضا حیوانات به انسان نیز تلاش‌هایی صورت گرفته است (1و2). یکی از بزرگ‌ترین مشکلات پیوند اندام، کمبود بافت یا اندام دهنده می‌باشد. آنچه در این روند مورد نیاز است فراهم‌‌سازی تسهیلات یا تکنیکی جهت القاء ترمیم و بازسازی در بافت آسیب دیده است تا بتواند خود را ترمیم کند (3).
امروزه با توجه به تعداد کم اهدا کنندگان بافت و آلودگی‌های ویروسی آن، سعی در طراحی بافت به کمک سلول و داربست‌های گوناگون اعم از طبیعی یا سنتزی شده است. این امر منتهی به ایجاد مفهومی جدید در علم شده که مهندسی بافت خوانده می‌شود (4). هدف از مهندسی بافت تقلید از طبیعت برای حل محدودیتهای معالجات کلینیکی و درمانی است (4 و 5(.
یکی از معضلات اصلی بهداشتی در کشورهای مختلف، بیماری‌های قلبی- عروقی است که علیرغم پیشرفت‌های اخیر در درمان بیماری های قلبی، میزان بروز، بستری و مرگ و میر ناشی از آن در حال افزایش است (6). به منظور بهبود و افزایش طول عمر این بیماران و ارتقاء سلامت جامعه، محققان با توجه به اصول مهندسی بافت سعی در ایجاد بافت های قلبی- عروقی مانند دریچههای قلبی، ماهیچه های قلبی، پری کاردیوم و رگ‌ها دارند(7 و 8). ایجاد رگ‌های زیست سازگار با ابعاد مناسب به منظور جایگزینی با رگ‌های محیطی و عروق کرونر آسیب دیده هدف اصلی مهندسی بافت عروقی است (9، 10، 11، 12، 13، 14 و 15). روشی که امروزه بیشتر در مهندسی بافت عروقی متداول است، کشت سلول ها روی یک داربست سه بعدی در شرایط in vitro است. این داربست ها به عنوان یک پشتیبان فیزیکی و قالبی برای اتصال سلول ها و تکوین بافت عمل میکنند. استخراج مواد طبیعی از ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و ساخت داربست‌های طبیعی با استفاده از پروتئین‌های تخلیص شده از ماتریکس خارج سلولی روشی است که به صورت گسترده‌ای در مهندسی بافت استفاده می‌شود (16). الاستین، یکی از عمده‌ترین پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی مهره‌داران و سازنده رشته‌های الاستیک است. الاستین در آئورت، شش‌ها، مثانه و پوست یافت شده و تخمین زده می‌شود که تا 50 درصد وزن خشک رگ‌ها را تشکیل می‌دهد (17). با توجه به گسترش بیماری‌های عروقی و تلاش برای ایجاد رگ‌های خونی به روش مهندسی بافت، استفاده از داربست‌های الاستینی در سطح دنیا مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر، قابلیت مهاجرت و تمایز سلول های بافت بلاستمایی که طی پدیده ترمیم در بخشهایی از بدن برخی جانوران مثل خرگوش نیوزلندی ایجاد میگردند و از نظر قابلیت تکثیر و تمایز، بسیار مشابه سلولهای جنینی بوده و قادرند تحت تأثیر عوامل مختلف به انواعی از سلولهای تخصص یافته تمایز یابند (18 و 19)، در مجاورت داربست سه بعدی طبیعی آئورت با توجه به خصوصیات القایی این داربست بر روی سلول ها مورد بررسی قرار گرفته است. به عبارت دیگر دیواره آئورت به عنوان یک داربست برای کشت سلول های بلاستمایی استفاده شد تا بر هم کنش بین بافت بلاستما و داربست آئورتی به کار برده شدهمشخص گردد. علاوه بر آندر سیر تکوین بافت بلاستما همراه با این داربست چه بافتها و چه رفتارهای سلولی احتمالی مشاهده خواهد شد و سلول های بلاستمایی تحت تاثیر القاء داربست به چه سلولهایی تمایز خواهند یافت مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
به منظور تهیه یک داربست طبیعی سه بعدی الاستیک، باید بافتی از بدن انتخاب می شد که رشته‌های الاستیک یکی از اجزاء اصلی تشکیل دهنده آن باشد. علاوه بر این، بافت انتخاب شده باید از جهت تهیه داربست در ابعاد و تعداد دلخواه نیز مناسب میبود. به همین دلیل آئورت گاو به علت بزرگ و قطور بودن به عنوان بافت منبع تهیه داربست الاستیک انتخاب گردید و قطعاتی استوانه ای شکل از این بافت با ابعاد تقریبی 5×5 میلیمتر به عنوان داربست جدا شدند. سپس با استفاده از محلول mg/ml50 برمید سیانوژن در اسید فرمیک 70% سلول و کلاژن موجود در داربست‌های آماده حذف گردید تا علاوه بر تشکیل یک داربست متخلخل، ماهیت زیستی طبیعی یعنی الاستیک بودن داربستها حفظ گردد. پس از آنکه مطالعات بافت شناسی کارآیی روش فیزیکی به کار رفته را در حذف اجزاء بافت شامل سلولها، کلاژن، عضله و بافت همبند و باقی گذاشتن رشته‌های الاستین به اثبات رساند، اقدام به تهیه بافت بلاستمایی گردید تا با داربست آماده شده الحاق گردد.
به منظور تهیه حلقه بلاستمایی، از گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی (Oryctolagus cuniculus) استفاده گردید و با استفاده از انبرهای ویژه، سوراخ هایی به قطر 2 میلیمتر در مناطق میانی گوش دور از عروق خونی ایجاد گردید. 48 ساعت پس از پانچ اول، بافت اطراف سوراخ توسط انبری با قطر 5/4 میلی متر به صورت یک حلقه برداشته شد. بلافاصله پس از برداشت حلقه ها، مراحل شستشوی بافت روی آنها انجام پذیرفت. مراحل شستشو درحیوان خانه و آزمایشگاه توسط سرم فیزیولوژی صورت پذیرفت و تنها در آخرین مرحله شستشو در زیر هود و قبل از انتقال حلقه ها به پلیت های 6 خانه، شستشو با محیط کشت انجام گرفت. یک روز قبل از جداسازی و شستشوی حلقههای بلاستمایی، داربست‌های آماده شده با سرم فیزیولوژی، محلول فسفات بافر سالین و در مرحله آخر با محیط کشت شستشو و پس از اینکه 24 ساعت در محیط کشت در انکوباتور قرار داده شدند، به حلقههای بلاستمایی شستشو و آماده شده الحاق گردیدند. نمونههای مذکور تا 40 روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 نگهداری شدند. سلول های بلاستمایی حدود 10 روز پس از قرارگیری حلقههای بلاستمایی در محیط کشت، از حلقهها ریزش میکنند، بنابراین پس از طی این مدت و در روزهای دهم، بیستم، سی ام و چهلم پس از کشت اقدام به برداشتن حلقه ها و داربست درون آن از محیط کشت گردید. در ابتدا پس از برداشت هر یک از نمونهها از محیط کشت، برای مطالعه اینکه آیا سلولهای بلاستمایی در سطح داربست آئورت زنده مانده و حضور دارند، از رنگ آمیزی با رنگ حیاتی آبی متیلن استفاده شد. پس از مراحل پاساژ بافتی و تهیه برش، نمونهها با روش های هماتوکسیلین- ائوزین، اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین و آلسیان بلو- پاس رنگ آمیزی شدند. سپس مطالعات هیستولوژیکی صورت گرفتند.
نتایج
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که یک داربست سلول زدایی شده، متشکل از یک پروتئین خالص ماتریکس خارج سلولی می تواند از بافت آئورت تهیه شود، بدون اینکه ساختار طبیعی آن به هم بخورد. با تیمار آئورت توسط برمید سیانوژن تمام سلول ها و کلاژن از آئورت تازه حذف شده (شکل 1-1 و1-2)؛ در نتیجه داربست الاستینی حاصل گردید که از لایه های متعدد فیبرهای هم مرکز با ساختاری تقریبا مشابه با لایه الاستیک آئورت طبیعی تشکیل یافته و دارای ویژگیهای مورد نیاز برای استفاده در مهندسی بافت است.
شکل 1-1(راست): مشاهده حذف سلول ها و در هم ریختن نظم رشته ها در نمونه تست و منفذ دار شدن آن (ب و د) در مقایسه با نمونه کنترل (الف و ج). برخی فضاهای خالی ناشی از حذف سلول ها در تصاویر با پیکان مشخص شده اند. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. الف و ب درشت نمایی X20 و ج و د درشت نمایی X40)
شکل 1-2(چپ): مشاهده حذف کلاژن و سلول های ماهیچه صاف از نمونه تست (ب و د) در مقایسه با نمونه کنترل (الف و ج). حذف کلاژن و سلول ها از فضای بین رشته های الاستیک در تصاویر با پیکان مشخص شده است. (رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف و ب درشت نمایی X20 و ج و د درشت نمایی X40)
این داربست، دارای تخلخل مناسب بوده و سمیتی نشان نداد. علاوه بر این، سطح و ترکیب داربست توانست موجب چسبندگی، تکثیر و نفوذ سلول ها به درون داربست شود، ضمن اینکه ترکیب داربست تا روز چهلم کشت هیچ گونه تغییر و از هم پاشیدگی نشان نداد. به همین دلیل به نظر میرسد این داربست می تواند برای مدت طولانی نگهداری شده و به دلیل خاصیت ارتجاعی بالایی که دارد، به عنوان جایگزینی برای بافتهایی که قابلیت انبساط دارند استفاده گردد.
رنگ آمیزی سلولها با رنگ حیاتی آبی متیلن، زنده بودن و حضور سلولها در سطح داربست را در روزهای دهم، بیستم و سیام پس از کشت تایید کرد، در حالی که در روز چهلم پس از کشت، سلولی در سطح داربست مشاهده نگردید. به نظر می رسد در این روز سلولهای بلاستمایی از بین رفتهاند (شکل 2).
مطالعات بافت شناسی در روز دهم پس از کشت، نشان داد که سلولهای بلاستمایی در قسمتهای ابتدایی داربست که در مجاورت حلقه بلاستمایی قرار داشته، نفوذ کردهاند (شکل 3-1). علاوه بر این در سطح داربست، سلولهای فیبروبلاستی مشاهده میشوند که به صورت نرمال فعالیت داشته و رفتارهایی مانند تقسیم سلولی در آنها مشاهده گردید (شکل 3-2). همچنین فیبروبلاستها، رشته های کلاژن را ساخته اند که به خوبی در سطح داربست مشاهده می‌شود. میتوان نتیجه گرفت که القاء داربست الاستینی موجب تمایز سلولهای بلاستمایی در روز دهم پس از کشت به فیبروبلاست، هر چند به تعداد اندک شده است.
روز بیستم پس از کشت، نفوذ سلولهای بلاستمایی به لایههای درونی داربست افزایش یافته و از تراکم سلولها در حاشیه داربست که در روز دهم مشاهده می‌شود، کاسته شده بود. همچنین در این روز، اپیتلیوم رگی در داربست مشاهده گردید. بنابراین، میتوان نتیجه گرفت داربست آماده شده توانسته زمینه لازم برای رگزایی را فراهم کند. احتمالا القای رگزایی توسط فاکتورهای رشد فیبروبلاستی صورت گرفته که از فاکتورهای اصلی روند رگ زایی میباشند. علاوه بر مشاهده فیبروبلاستها به تعداد فراوان، سلولهایی با ویژگیهای میوسیت نیز مشاهده شد (شکل4).
ممکن است این سلولها از میوفیبرو بلاستها حاصل شده باشند. میوفیبروبلاستها از تغییر شکل و ساختار فیبروبلاست ها حاصل میگردند و خصوصیات فیبروبلاست و عضله صاف را دارا میباشند؛ و علاوه بر دارا بودن ویژگیهای مورفولوژیک یک فیبروبلاست، حاوی مقدار زیادی ریز رشته اکتین و میوزین نیز میباشند که مانند عضلات صاف عمل میکنند. البته خود سلولهای بلاستمایی، ویژگیهایی مشابه سلولهای مزانشیمی دارند و احتمال دارد که به صورت مستقیم به میوسیت تمایز یافته باشند. در روز بیستم، تشکیل رشته‌های کلاژن و بافت همبند نسبت به روز دهم افزایش یافته و فواصل بین رشته‌های الاستین، توسط رشته‌های کلاژن پر شده است (شکل4).
شکل2: مشاهده حضور سلول های بلاستمایی در سطح داربست آئورت در روزهای دهم (الف)، بیستم (ب) و سی ام (ج) پس از کشت. در روز چهلم (د) پس از کشت، سلولی در سطح داربست مشاهده نمی شود. سلول ها در سطح داربست الاستیک با پیکان مشخص شده اند. (رنگ آمیزی آبی متیلن و مشاهده با استرئو میکروسکوپ: عدسی 1، زوم 2) در تصاویر، حلقه بلاستمایی با دایره توخالی و داربست الاستیک با دایره توپر مشخص شده اند.
شکل3-1(راست): مشاهده مهاجرت سلولها از حلقه بلاستمایی به درون داربست و نفوذ آن ها در قسمتهای ابتدایی داربست. سلولهای بلاستمایی در تصاویر ب، ج و د با پیکان مشخص شدهاند. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. الف و ب درشت نمایی X20 و ج و د درشت نمایی X40)
شکل3-2(چپ): مشاهده نفوذ، تقسیم وتمایز سلولهای بلاستمایی به فیبروبلاست و تشکیل بافت همبند. ( رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. درشت نمایی X 100)
ممکن است این سلولها از میوفیبرو بلاستها حاصل شده باشند. میوفیبروبلاستها از تغییر شکل و ساختار فیبروبلاست ها حاصل میگردند و خصوصیات فیبروبلاست و عضله صاف را دارا میباشند؛ و علاوه بر دارا بودن ویژگیهای مورفولوژیک یک فیبروبلاست، حاوی مقدار زیادی ریز رشته اکتین و میوزین نیز میباشند که مانند عضلات صاف عمل میکنند. البته خود سلولهای بلاستمایی، ویژگی هایی مشابه سلولهای مزانشیمی دارند و احتمال دارد که به صورت مستقیم به میوسیت تمایز یافته باشند. در روز بیستم، تشکیل رشته‌های کلاژن و بافت همبند نسبت به روز دهم افزایش یافته و فواصل بین رشته‌های الاستین، توسط رشته‌های کلاژن پر شده است (شکل4).
مشابه با روز بیستم، در روز سیام پس از کشت نیز میوسیتها در سطح داربست مشاهده شدند. در این روز فیبروبلاستی در سطح داربست مشاهده نگردید و علاوه بر تشکیل اپیتلیوم رگی، رشته‌های کلاژن و بافت همبند در تمام سطح داربست به صورت واضحی مشاهده شدند. (شکل 5).
شکل4: مشاهده تشکیل رشته‌های کلاژن درون داربست، وجود سلول های فیبروبلاستی درون داربست و تقسیم آن ها، تشکیل رشته های بافت همبندتوسط فیبروبلاست ها و تشکیل اپی تلیوم رگی (الف و ب). (رنگ آمیزی آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف درشت نمایی X20 و ب درشت نمایی X40). تصویر ج، طرحی شماتیک از یک سلول فیبروبلاستی در حال کلاژن زایی می باشد.
شکل5: مشاهده تشکیل بافت همبند، اپیتلیوم رگی و میوسیت درون داربست در روز سی ام پس از کشت. (رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف درشت نمایی X20 و ب درشت نمایی X40)
به نظر میرسد تا روز سی ام پس از کشت، یک ماتریکس خارج سلولی کاملا جدید شامل رشته‌های کلاژن، رشته های الاستیک، بافت همبند، سلولهای پیش ساز عضلات، مویرگ و... در داربست الاستینی تشکیل یافته است. به عبارتی بافت آئورت که تمام اجزاء آن به غیر از الاستین حذف شده بودند، مجددا ساختاری تقریبا مشابه با حالت طبیعی اولیه خود به دست آورده است. در روز سیام، گسترش سلولها در سطح داربست افزایش یافته و نفوذ سلولها تا قسمتهای میانی و انتهایی داربست قابل مشاهده است (شکل 6). نفوذ سلول ها به درون داربست از روز دهم تا روز سیام به صورت تدریجی افزایش یافته و سطح گسترش سلولها در هر مرحله نسبت به مرحله قبل بیشتر شده است.
در روز چهلم، بر خلاف روزهای قبل، سلول چندانی در سطح داربست قابل مشاهده نبود. به نظر میرسد بازه زمانی بین 10 تا 30 روز مناسبترین زمان جهت نگهداری و تمایز سلولها بوده و در روز چهلم بنا به دلایلی از قبیل تخریب بافتی و مرگ سلولی، سلولها از بین رفتهاند (شکل7).
به موازات این رویدادها، حلقه بلاستمایی نیز از روز دهم تا روز سیام تغییر کرده و بافت غضروفی در آن تشکیل شده که به تدریج تا روز سیام گسترش بیشتری یافته است. همچنین اپیتلیوم زایی در بافت بلاستما مشاهده می‌شود. در روز سیام پس از کشت، از هم پاشیدگی نسبی بافت بلاستما قابل مشاهده بود(شکل8).
شکل6: در روز سی ام پس از کشت، نفوذ سلول ها به درون داربست و گسترش آن ها تا قسمت های میانی و انتهایی آن مشاهده شد. پر شدن داربست الاستیک توسط سلول ها و رشته های کلاژن با پیکان مشخص شده است. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. درشت نمایی X20)
شکل7: از هم پاشیدگی حلقه بلاستمایی و عدم حضور سلول ها درون داربست در روز چهلم پس از کشت. (الف و ب رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت نمایی X10)
شکل 8: مشاهده تغییرات بلاستما در روز بیستم پس از کشت (الف و ب). تشکیل اپی تلیوم جدید و غضروف زایی در حلقه بلاستمایی به خوبی قابل مشاهده بود(ب و ج). در تصویر الف، اپی تلیوم جوان و در تصویر ب، بافت غضروفی و کندروسیت ها با پیکان مشخص شده اند. از هم پاشیدگی نسبی بافت بلاستما در روز سی ام، در تصویر ج قابل مشاهده است. (رنگ آمیزی آلسیان بلو- پاس. الف درشت نمایی X10، ب درشت نمایی X40 و ج درشت نمایی X20)
بحث
سالانه حدود 600000 رگ پیوندی جایگزین عروق آسیب دیده میشوند (20). شریانها عموما در اثر تشکیل پلاکهای آترواسکلروزی آسیب میبینند که باعث تنگ شدن لومن رگ و در نتیجه صدمه دیدن لایه اندوتلیال می گردد. این آسیبها در نهایت باعث ایجاد لخته خون و جلوگیری از جریان خون میشوند. هرچند از مواد سنتزی مختلفی برای ساخت عروق مصنوعی استفاده می‌شود، اما اغلب این مواد برای جایگزینی عروق با قطر کم چندان مناسب نیستند، چون احتمال ایجاد لخته خونی را افزایش میدهند. به همین دلیل برای جایگزینی عروق آسیب دیده، عموما از رگ‌های سالم خود فرد بیمار استفاده می‌شود (21 و 22). استفاده از عروق سایر افراد برای جایگزینی با عروق فرد بیمار، در شرایطی که فرد فاقد عروق مناسب برای پیوند است نیز در مواردی انجام میگیرد. اما مشکلاتی از قبیل کمبود افراد دهنده و همچنین اتساع عروقی از مواردی است که استفاده از چنین پیوندهایی را محدود کرده است (23 و 24). با اینکه استفاده از عروق پیوندی خود فرد بیمار معمولا نتایج بهتری حاصل میکند، اما معایبی از قبیل نیاز به جراحیهای مکرر با ریسک بالا و هزینه زیاد برای بیمار نیز وجود دارد. علاوه بر این، عروق پیوندی که ضخامت دیواره آنها کم است معمولا در جریان پیوند آسیب میبینند و خود فرد بیمار نیز ممکن است به دلایلی از قبیل قطع عضو و جایگزینی مکرر عروق فاقد عروق مناسب به منظور پیوند باشد (25).
به دلیل نیاز فراوان به جایگزینهای عروقی، سالها است که محققان بر روی ایجاد رگ‌های مناسب به منظور جایگزینی با عروق آسیب دیده متمرکز شدهاند (26).
به نظر میرسد بافتهای طبیعی پتانسیل بالایی به عنوان جایگزینهای قلبی- عروقی داشته باشند. استفاده از بافتهای طبیعی انسان و حیوانات مختلف در تحقیقات زیادی مورد بررسی قرار گرفته است (27). نتایج نشان می‌دهد که مواد زیستی طبیعی معمولا به یک تیمار قبلی فیزیکی یا شیمیایی نیاز دارند تا آنها را از تجزیه زیستی حفظ کند، ایمنی زایی آنها را کاهش دهد و همچنین بافت را استریلیزه کند. روشهای مختلفی به این منظور مورد بررسی قرار گرفته تا در نهایت روشی بهینه که در عین حفظ یکپارچگی مکانیکی بافت و حفظ ماهیت طبیعی آن، اهداف فوق را نیز برآورده سازد، یافت شود. در میان روشهای مختلف، سلول زدایی روشی است که به اهداف مورد نظر نزدیکتر شده است. با استفاده از این روش، پاسخهای ایمنی کاهش یافته و همچنین موادی با ماهیت زیستی طبیعی ایجاد میشوند که برای کشت سلولی و کاربردهای مهندسی بافت مناسب هستند. مواد زیستی طبیعی امتیازات مکانیکی، شیمیایی و زیستی فراوانی نسبت به مواد مصنوعی دارند و به همین دلیل دارای پتانسیل چشمگیری به منظور کاربرد در درمان به روش مهندسی بافت میباشند(25). روشهای مختلفی از قبیل تیمار با دترجنتها، هضم آنزیمی و روشهای صوتی برای حذف سلولها از بافت استفاده میشوند. عدم حذف کامل سلولها از بافت می‌تواند باعث وقوع مشکلاتی شود، به عنوان مثال باقیمانده محتویات سلولها و موادی از قبیل فسفولیپیدها، باعث کلسیفیه شدن بافت میشوند، زیرا این مواد میتوانند با کریستالهای کلسیمی پیوند برقرار کنند (28، 29، 30، 31 و 32). همچنین باقیمانده سلولها موجب پاسخهای ایمنی میگردند. به عنوان مثال حضور موادی مانند لیپید ها و پروتئوگلیکانهای سلولی میتوانند باعث پاسخهای ایمنی شوند (33). علاوه بر این، حتی پس از حذف سلولها و باقیمانده آنها، ماتریکس خارج سلولی بافت، سلول زدایی شده می‌تواند به تنهایی باعث ایجاد پاسخهای ایمنی شود (34). در نتیجه، مطالعات پیشنهاد میکنند که گرچه حذف سلولها باعث کاهش پاسخهای ایمنی می‌شود، اما ممکن است برای حذف کامل پاسخهای ایمنی و التهابی کافی نباشد و بهتر است موادی مانند فیبرونکتین نیز از ماتریکس خارج سلولی حذف گردند (35). به طور کلی میتوان گفت پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی از جمله موادی هستند که میتوانند به عنوان یک داربست با ترکیب زیستی طبیعی و ساختار سه بعدی به صورت وسیعی در مهندسی بافت استفاده شوند. این داربستها میتوانند شبکهای چند منظوره جهت ایجاد محیط زیستی خاص به منظور به دست آوردن ویژگیهای بافتی و سلولی تحت شرایط فیزیولوژیکی ایجاد نمایند. علاوه بر این پاسخهای ایمنولوژیک را تحریک نکرده، برای سلولها سمی نیستند و خاصیت هومئوستازی بالایی دارند. تحقیق حاضر نشان داد سلولهای بلاستمایی تحت اثر القایی داربست سه بعدی طبیعی الاستیک، ساختاری مشابه با بافت آئورت اولیه ایجاد کرده اند. با اینکه سلولهای بلاستمایی هنوز به طور کامل تعیین هویت نشدهاند و قابلیتهای تمایزی آنها به طورکامل روشن نیست، اما نتایج حاصل از پژوهشهای مختلف، امید بخش یافتن راهیهای نوین در زمینه استخراج ساده سلولهایی با خاصیت بنیادی و قابلیت تمایز بالا است که بتوان از آنها جهت سلول درمانی استفاده کرد. چنانچه بتوان مکانیسمها و ژنهای دخیل در ایجاد چنین سلولهایی را شناسایی کرد تا بتوان منبع سلولی مشابهی را در انسان به دست آورد، میتوان با استخراج چنین سلولهایی راههایی نوین برای درمان بسیاری از بیماریها از جمله بیماری‌های قلبی- عروقی در آینده گشود. البته هنوز مسائل مهمی چون انتخاب منابع سلولی، ساخت داربست، کشت سلولی، محیط کشت، خواص مکانیکی داربست- سلول و مدلهای حیوانی مناسب در این فرآیند مطرح هستند. بنا بر این چالش های عمده در این امر عبارتند از: تکنولوژی سلول، تکنولوژی ساختار و الحاق ساختارهای طراحی شده در سیستم زنده.
نتیجه گیری
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که یک داربست سلول زدایی شده، متشکل از یک پروتئین خالص ماتریکس خارج سلولی می‌تواند از بافت آئورت تهیه شود، بدون اینکه ساختار طبیعی آن به هم بخورد. آئورت سلول زدایی شده گاو می تواند زمینه مناسب برای تکثیر سلولی را فراهم کرده و به عنوان یک داربست برای مهندسی بافت عروقی خصوصا در مورد دریچههای قلبی و پیوندهای عروقی استفاده شود. هرچند سلول زدایی با روش های مختلفی انجام می‌شود، اما در این پژوهش با استفاده از یک روش فیزیکی نسبتا ساده و ارزان، داربستی آماده شد که درصد تخلخل بالایی داشت و بنابراین مهاجرت و تکثیر سلولی را تسهیل نمود. داربست الاستینی آماده شده از تیمار آئورت تازه گاو با محلول برمید سیانوژن در فرمیک اسید به دست آمد. برمید سیانوژن می‌تواند موجب شکستگی در دنباله متیونین پروتئینها شود. متیونین اسید آمینهای است که در همه پروتئینها از قبیل کلاژن وجود دارد، اما در الاستین حضور ندارد (36). بنا بر این با استفاده از برمید سیانوژن، میتوان همه اجزاء بافت به جز الاستین را حذف نمود. علاوه بر این، مطالعات بافتی در روز دهم نفوذ سلولهای بلاستمایی به داخل داربست الاستیک را نشان داد. در روز بیستم علاوه بر نفوذ، تقسیم و تمایز احتمالی سلولهای بلاستمایی به سلولهای فیبروبلاستی و میوسیت مشاهده گردید. نتایج در روز سیام مشابه با روز بیستم بود و علاوه بر آن، تغییراتی از قبیل رگزایی و شکلگیری بافت همبند نیز دیده شد. در روز چهلم، داربست و سلولهای بلاستمایی احتمالا به دلیل مرگ سلولی از بین رفتند. بنا بر این نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. این داربست می‌تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد.
تشکر و قدردانی
مولفین مراتب تشکر و امتنان خود را از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد بخاطر تامین بخشی از هزینههای این پژوهش که از محل گرانت پژوهشی مربوط به طرح " مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربست‌های سه بعدی ( Bioscaffoldیا (3D matrix بهمنظور کاربرد در مهندسی بافت " فراهم گردیده ابراز مینمایند.
)