چکیده
هدف: حرکت آب از عرض غشاءهای سلولی در اثر حضور کانال‌های آبی به نام آکواپورین‌ها (AQPs) تسهیل می‌شود. ترکیبات جیوه یکی از بازدارنده‌های قوی آکواپورین‌های گیاهی و جانوری می‌باشند. به هر حال چندین فرم مشابه از آکواپورین‌ها مانند NtAQP1 در گیاه توتون توسط جیوه ممانعت نمی‌شوند. هدف از این تحقیق بررسی حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 جداسازی شده از توتون نسبت به جیوه است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی پس از سنتز cRNA مربوط به NtPIP2;1، تزریق آن به داخل اووسیت‌های زنوپوس توسط میکرواینجکشن صورت گرفت. پس از دو روز انکوبه کردن اووسیت‌ها، آنها به مدت 10 دقیقه در معرض 1 میلی‌مولار کلرور جیوه قرار گرفته، سپس آزمون انبساط حجم اووسیت در محیط هیپوتونیک انجام و ضریب نفوذپذیری غشاء ( Pf) اووسیت تعیین شد.
نتایج: Pf محاسبه شده برای اووسیت‌های گروه کنترل و تیمار شده با کلرور جیوه که هر دو آکواپورین NtPIP2;1 را بیان می‌کنند به ترتیب برابر با 2-10×99/0 و2-10×98/0 سانتیمتر بر ثانیه بود که تفاوت معنی‌داری با یکدیگر نشان ندادند(p>0.05). مقایسه توالی اسید آمینه آکواپورین NtPIP2;1 با NtAQP1 (غیرحساس به جیوه) نشان داد که NtPIP2;1 همانند NtAQP1 در نزدیک منفذ آبی دارای اسید آمینه ترئونین به جای سیستئین می‌باشد.
نتیجه گیری: NtPIP2;1 یک آکواپورین غیر حساس به جیوه را در گیاه توتون کدگذاری می‌کند و این به دلیل جایگزینی اسیدآمینه سیستئین در نزدیک منفذ آبی با ترئونین می‌باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The Expression of Tobacco (Nicotiana tabacum) NtPIP2; 1 Aquaporin in Xenopus Oocytes and Study of its sensitivity to Mercury
چکیده [English]
Aim: Movement of water across cellular membranes is facilitated by the presence of water channels named aquaporins (AQPs). Mercurial compounds are potent blockers of plant and animal aquaporins. However some aquaporin isoforms such as NtAQP1 in tobacco are mercury-insensitive. The aim of this research was to determine the sensitivity of tobacco NtPIP2;1 to mercury.
Materials and methods: In this experimental study, after invitro transcription of NtPIP2;1 and cRNA synthesis, cRNA was injected to Xenopus oocytes by microinjection. Two days after incubation, oocytes were subjected to 1 mM mercury chloride for 10 min. Then, oocyte volume swelling assay in hypotonic medium was conducted and the membrane osmotic water permeability coefficient (Pf ) was determined.
Results: Pf for control and mercury chloride-treated oocytes expressing NtPIP2;1 was respectively calculated 0.99×10-2 and 0.98×10-2 cm s-1 , which was not significant (P>0.05). Comparing the amino acid sequence of NtPIP2;1 with NtAQP1, a mercury-insensitive aquaporin, revealed the similar to NtAQP1 replacement of cys with Thr in 233 position near the aquaporin pore in NtPIP2;1.
Conclusion: NtPIP2;1 encodes a mercury-insensitive aquaporin in tobacco which could be due to cysteine replacement with threonin near the aquaporin pore.
کلیدواژه‌ها [English]
- Aquaporin
- Tobacco
- Mercury
- Oocyte
- Xenopus
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 26-19
بیان آکواپورین NtPIP2;1 توتون در اووسیت‌های زنوپوس و مطالعه حساسیت آن نسبت به جیوه
مجید مهدیه نجف آبادی PhD.1*، اکبر مستاجران.PhD2،ماکی کاتسوهارا. PhD 3
1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، کدپستی 8349-8-38156
2- دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم پایه ، گروه زیست شناسی
3- دانشگاه اوکایاما ژاپن، کوراشیکی، موسسه تحقیقاتی منابع زیستی
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: m-mahdiyeh@araku.ac.ir
تاریخ دریافت: 2/11/ 1389 تاریخ پذیرش: 17/1/1390
چکیده
هدف: حرکت آب از عرض غشاءهای سلولی در اثر حضور کانال‌های آبی به نام آکواپورین‌ها (AQPs) تسهیل می‌شود. ترکیبات جیوه یکی از بازدارنده‌های قوی آکواپورین‌های گیاهی و جانوری می‌باشند. به هر حال چندین فرم مشابه از آکواپورین‌ها مانند NtAQP1 در گیاه توتون توسط جیوه ممانعت نمی‌شوند. هدف از این تحقیق بررسی حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 جداسازی شده از توتون نسبت به جیوه است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی پس از سنتز cRNA مربوط به NtPIP2;1، تزریق آن به داخل اووسیت‌های زنوپوس توسط میکرواینجکشن صورت گرفت. پس از دو روز انکوبه کردن اووسیت‌ها، آنها به مدت 10 دقیقه در معرض 1 میلی‌مولار کلرور جیوه قرار گرفته، سپس آزمون انبساط حجم اووسیت در محیط هیپوتونیک انجام و ضریب نفوذپذیری غشاء ( Pf) اووسیت تعیین شد.
نتایج: Pf محاسبه شده برای اووسیت‌های گروه کنترل و تیمار شده با کلرور جیوه که هر دو آکواپورین NtPIP2;1 را بیان می‌کنند به ترتیب برابر با 2-10×99/0 و2-10×98/0 سانتیمتر بر ثانیه بود که تفاوت معنی‌داری با یکدیگر نشان ندادند(p>0.05). مقایسه توالی اسید آمینه آکواپورین NtPIP2;1 با NtAQP1 (غیرحساس به جیوه) نشان داد که NtPIP2;1 همانند NtAQP1 در نزدیک منفذ آبی دارای اسید آمینه ترئونین به جای سیستئین می‌باشد.
نتیجه گیری: NtPIP2;1 یک آکواپورین غیر حساس به جیوه را در گیاه توتون کدگذاری می‌کند و این به دلیل جایگزینی اسیدآمینه سیستئین در نزدیک منفذ آبی با ترئونین می‌باشد.
واژگان کلیدی: آکواپورین، توتون، جیوه، اووسیت، زنوپوس
مقدمه
قبلا تصور بر این بود که آب قادر است به سادگی توسط انتشار از خلال دو لایه چربی غشاء سلولی حرکت کند. اما امروزه مشخص شده که دو لایه چربی غشاء، نفوذپذیری محدودی نسبت به آب داشته و مجموعه‌ای از پروتئین‌ها برای انتقال آب در عرض غشاء وجود دارند. پروتئین‌های ناقل آب ابتدا در سلول‌های عدسی چشم گاو شناسایی، سپس در سال 1991 پرستون و آگری (1) یک پروتئین مشابه در گلوبول‌های قرمز خون انسان شناسایی و نام CHIP28 بر آن گذاشتند. مطالعات بعدی پروتئین‌های مشابهی را در دیگر موجودات نشان داد که به آکواپورین‌ها (AQPs) ویا کانال‌های آبی معروف شدند (2 و 3). پروتئین عدسی چشم گاو در حال حاضر به AQP0 و پروتئین گلبول قرمز به آکواپورین AQP1 تغییر نام دادند (4). کشف پروتئین تونوپلاستی (TIP) توسط مورلو همکارانش(5) در سال 1993 در تونوپلاست گیاه توتون نشان داد که آکواپورین‌ها علاوه بر جانوران، در اغلب غشاءهای سلول‌های گیاهی نیز پراکنده‌اند. این پروتئین‌ها مرکب از شش دامین طی کنندة عرض غشاء بوده که توسط 5 لوپ به یکدیگر متصل شده‌اند و N و C ترمینال آنها در داخل سیتوسل قرار دارد (6 و 7).
آکواپورین‌های گیاهی تنوع ایزوفرمی قابل توجهی را نشان می‌دهند. تعیین توالی ژنوم، تعداد دقیق ژن‌های آکواپورین را تا مرز 35 عدد در گیاه آرابیدوپسیس (6 و 7) و 33 عدد در گیاه ذرت (2 و3) تعیین نموده است. بر پایة همولوژی توالی، آکواپورین‌های گیاهی به 4 زیر گروه که تا حدودی مطابق با مکان آنها در سلول است تقسیم می‌شوند (3، 4، 7 و 8). پروتئین‌های نوع تونوپلاستی (TIPs) و نوع غشاء پلاسمایی (PIPs) آکوارپورین‌هایی هستند که به ترتیب در غشاءهای واکوئلی و پلاسمایی به وفور بیان می‌شوند. سومین زیر گروه شامل پروتئین‌های غشایی شبه نودولین26 (NIPs) هستند. به عبارتی این زیر گروه همولوگ‌های نزدیک به GmNod26 (آکواپورین فراوان در غشاء پری باکتروئید گرهک‌های تثبیت کنندة ازت در ریشه‌های سویا) می‌باشند. NIPs در غیر لگوم‌ها نیز وجود داشته و در این گیاهان در غشاءهای پلاسمایی و درون سلولی قرار گرفته‌اند (7). زیر گروه آخر پروتئین‌های بازی کوچک (SIPs) بوده که غالباً در شبکة آندوپلاسمی قرار دارند (7 و 8).
آکواپورین‌های غشاء پلاسمایی یا PIPs خود به دو گروه فیلوژنتیکی PIP1 و PIP2 تقسیم می‌شوند. اعضای این دو گروه نه تنها از نظر طول N و C ترمینال خود متفاوت هستند بلکه فعالیت کانال آب متفاوتی را هنگام بیان در اووسیت‌های زنوپوس نشان می‌دهند(4). PIP1s عموماً در این میزبان هترولوگ خاموش می‌باشند، درحالیکه PIP2s فعالیت کانال آب بالایی را نشان می‌دهند.
ترکیبات جیوه از بازدارنده‌های قوی آکواپورین‌ها می‌باشند و امروزه جهت مطالعه نقش آکواپورین‌ها در هدایت آبی گیاهان از این ترکیبات استفاده می‌شود (5). مشخص شده است که ترکیبات جیوه با گروه سولفیدریل سیستئین در نزدیک منفذ کانال آبی آکواپورین واکنش داده و سبب توقف فعالیت انتقال آب می شود (9و10). به هر حال چندین ایزوفرم از آکواپورین‌ها نسبت به جیوه غیرحساس‌اند. برای مثال RD28 در گیاه آرابیدوپسیس (9) وNtAQP1 در گیاه توتون (10) از این جمله‌اند. در جانوران نیز آکواپورین AQP4 توسط جیوه ممانعت نمی‌شود (4).
شناسایی آکواپورین‌های غیر حساس به جیوه و تفکیک آن از انواع حساس می‌تواند تصویر روشن‌تری از نقش هر یک از ایزوفرم‌های آکواپورینی در روابط آبی گیاهان تحت شرایط محیطی مختلف در هنگام مطالعه آنها با استفاده از ترکیبات جیوه ارائه دهد. همچنین بررسی دلیل عدم حساسیت برخی آکواپورین‌ها نسبت به جیوه در سطح مولکولی می‌تواند در طراحی آکواپورین‌های مقاوم به جیوه برای جذب آب در گیاهان در محیط‌های آلوده به این عنصر مفید باشد. لذا هدف از این تحقیق بررسی حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 کلون شده از گیاه توتون نسبت به جیوه و آنالیز مولکولی آن از طریق مقایسه توالی آمینواسیدی این آکواپورین با NtAQP1 غیر حساس به جیوه در این گیاه می‌باشد.
مواد و روش ها
کلون کردن NtPIP2;1 در وکتور بیانی زنوپوس:ناحیه کدکننده کلون cDNA (Complementary DNA) NtPIP2;1 که قبلا توسط مولفین جداسازی شده بود (11) توسط مجموعه پرایمر اختصاصی ذیل تکثیر شد.
Forward; 5'-GCTCTAGAATGTCAAAGGACGTGATTG-3'
Reverse; 5'-GCAAGCTTTTAGTTGGTTGGGTTACTG-3'
این مجموعه پرایمر محل‌‌‌های برشی مربوط به آنزیم‌های با اثر محدود XbaI و HindIII را به ترتیب به انتهای 5' و 3' قطعات
تکثیر شده آکواپورین1 NtPIP2; اضافه می‌کند.
پس از انجام الکتروفورز قطعات حاصل از تکثیر و انجام مراحل کلون سازی با استفاده از وکتور TOPO (Invitrogene) و تعیین توالی کلون‌های مثبت توسط روش سنگر (12)، کلون‌های فاقد خطا (جهش) شناسایی و سپس ناحیه کدکننده مربوط به این آکواپورین در داخل وکتور بیانی pGEMHE (9) که برای بیان پروتئین در داخل اووسیت‌های زنوپوس طراحی شده است درج گردید (11).
برای قرار دادن NtPIP2;1 در جهت گیری صحیح در داخل وکتور pGEMHE از آنزیم‌های با اثر محدود فوق طبق روش سمبروک (13) استفاده شد. واکنش اتصال با استفاده از کیت Ligation High (TOYOBO, Tokyo, Japan) در دمای 16 درجه سانتیگراد در طول شب با استفاده از نسبت مولی 2 به 1 انجام گرفت (13). سپس 2 میکرولیتر از پلاسمید‌های نوترکیب حاصل از واکنش اتصال به باکتری E. coli(سوش JIM109) منتقل شد. پس از انتخاب کلنی‌های مثبت توسط colony PCR (13) پلاسمید نوترکیب با استفاده از کیت Plasmid MiniPrep (شرکت کیاژن) از باکتری استخراج گردید.
سنتز cRNA (Complementary RNA) در in vitro : برای سنتز cRNA توسط رونویسی در آزمایشگاه (in vitro)، ابتدا پلاسمید نوترکیب با استفاده از آنزیم NheI خطی شد. سپس واکنش با افزودن 10/1 حجم کل از استات سدیم 3 نرمال و 2 حجم از اتانول مطلق متوقف گردید. محتویات لوله به خوبی با یکدیگر مخلوط شده و حداقل 15 دقیقه در دمای 20- درجه سانتیگراد سرد گردید. پس از رسوب دادن پلاسمید خطی شده توسط سانتریفیوژ، شستشو و خشک کردن رسوب، نمونه در بافر TE (pH=8, Tris-ETDA) در غلظت 1 میکروگرم در میکرولیتر حل شد (14). برای واکنش رونویسی در شرایط in vitro از کیت mMESSAG mMACHINET7 (شرکت Ambion، USA) استفاده شده و واکنش به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. برای بازیافت cRNA از مخلوط واکنش فوق از روش رسوب دهی با کلرید لیتیوم (5/7 مولار کلریدلیتیوم، 50 میلی‌مولار EDTA) استفاده شد. پس از شستشوی رسوب با اتانول 70درصد و انجام سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد، cRNA در 10 میکرولیتر آب فاقد نوکلئاز معلق گردیده و غلظت آن بر روی 1 میکروگرم در میکرولیتر تنظیم و سپس در دمای 80- درجه سانتیگراد در حجم‌های کم نگهداری شد (13).
ریز تزریقی cRNA به اووسیت‌های زنوپوس:لوب‌های تخمدانی به طریق جراحی از قورباغه ماده Xenopus laevis بیهوش شده با استفاده از 3-آمینوبنزوئیک اسید اتیل استر متان سولفونات 1/0 درصد (Sigma, Aldrich) جداسازی شدند و در محلول اصلاح شده بارت (Modified Barth Solution، MBS: 88 میلی مولار کلرور سدیم، 1 میلی مولار کلرور پتاسیم، 4/2 میلی‌مولار بیکربنات سدیم، 15 میلی‌مولار تریس، 33/0 میلی‌مولار نیترات کلسیم، 41/0 میلی‌مولار کلرورکلسیم، 82/0 میلی‌مولار سولفات منیزیم، 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر سدیم پنی سیلین و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر سولفات استرپتومایسین) قرار گرفتند. لوب‌های تخمدانی به قطعات کوچکی بریده شدند و در محلول MBS حاوی 1 میلیگرم بر میلی‌لیتر کلاژناز B (Boehringer, Germany) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و بر روی شیکر انکوبه شدند. در پایان کلاژناز با شستشوی اووسیت‌ها (5 مرتبه) در محلول MBS حذف شدند. اووسیت‌های مرحله V و VI جمع‌آوری و در دمای 18 درجه سانتیگراد در محیط MBS حاوی آنتی‌بیوتیک به مدت 1 روز انکوبه شدند. روز بعد اووسیت‌ها برای آزمایشات تزریق cRNA مورد استفاده قرار گرفتند (14). تزریق cRNA به اووسیت‌های زنوپوس توسط دستگاه NanojectII Auto/Oocytes Injector (Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA) انجام گرفت. حجم مورد نیاز برای تزریق روی 50 نانولیتر تنظیم و به آرامی 50 نانولیتر نمونه cRNA و یا آب (کنترل منفی، NC, negative control) به هر اووسیت از محل قطب روشن اووسیت تزریق شد. اووسیت‌های تزریق شده در دمای 18 درجه سانتیگراد در تاریکی به مدت 1 الی 2 روز قبل از سنجش انبساط و تعیین ضریب نفوذپذیری غشاء ( Pf) انکوبه شدند (14).
سنجش انبساط حجم اووسیت‌ها و محاسبه Pf : ضریب نفوذ پذیری آبی (Pf) غشاء اووسیت‌ها طبق روش پرستون و همکاران (15) 1 تا 2 روز بعد از تزریق تعیین گردید. اووسیت‌ها از محیط MBS ایزوتونیک به محیط MBS با رقت 1 به 5 (محیط هیپوتونیک) در زیر میکروسکوپ معکوس مجهز به دوربین دیجیتال سیاه و سفید (Cool SNAP, Roper Scientific, Tucson, USA) منتقل شدند. تصاویر دیجیتال از اووسیت‌های در حال انبساط در فواصل زمانی 20 ثانیه به مدت 3 دقیقه با استفاده از نرم افزار (Universal Imaging, Westchester, PA, USA) MetaView تهیه شدند و مساحت سطحی اووسیت‌ها با استفاده از نرم افزار WinRoof ver3.51 (MITANI Corporation, Fukui, Japan) آنالیز گردیده وسپس Pf با استفاده از معادله زیر از محدوده خطی نمودار تغییر حجم نسبی اووسیت در برابر زمان محاسبه شد:
در این رابطه حجم اولیه اووسیت (4-10×9 سانتیمترمکعب) و S مساحت سطحی اولیه اووسیت (045/0 سانتیمترمربع) و Vw حجم مولی آب (18 سانتیمتر مکعب بر مول)، dt مدت زمان، Osmin اسمولاریته داخل اووسیت (200 میلی اسمول) و Osmout اسمولاریته محیط هیپوتونیک (40 میلی اسمول) می‌باشد.
تیمار اووسیت‌ها با کلرور جیوه: به منظور بررسی حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 توتون نسبت به جیوه، اووسیت‌های تزریق شده با cRNA آکواپورین NtPIP2;1 و همچنین اووسیت‌های کنترل منفی به مدت 10 دقیقه در معرض 1 میلی‌مولار کلرور جیوه در محیط MBS قرار داده شدند. سپس انبساط حجم آنها طی زمان در مقایسه با اووسیت‌های شاهد (بدون تیمار با جیوه) مورد بررسی قرار گرفت.
هم ردیفی (Alignment) توالی آمینواسید NtPIP2;1 با NtAQP1 : به منظور مقایسه توالی آمینواسیدی آکواپورین NtPIP2;1 با آکواپورین غیر حساس به جیوه NtAQP1 از نرم افزار GENETYX-MAC ver. 7 (GENETYX CORPORATION, Tokyo, Japan) استفاده شد. به این ترتیب که توالی آمینواسیدی آکواپورین‌های مذکور از بانک ژن NCBI استخراج و توسط نرم افزار هم ردیفی توالی آمینواسیدی آنها صورت گرفت.
آنالیز آماری: داده‌های مربوط به Pfبا استفاده از آزمون آماری T-test و نرم افزار Excel مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و تفاوت میانگین‌ها در سطح P<0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.
نتایج
ناحیه کد کننده ژن NtPIP2;1 با استفاده از کلون‌های cDNA مربوط به آن(11) به عنوان الگو توسط پرایمرهای اختصاصی طراحی شده در ابتدا و انتهای این ناحیه که به ترتیب جایگاه اثر آنزیم‌های XbaI و HindIII را به قطعات حاصل از تکثیر اضافه می کنند تکثیر شد (شکل 1). چنانکه در شکل1 مشاهده می‌شود قطعه تکثیر شده دارای 860 جفت باز می‌باشد. قطعه تکثیر شده با جهت‌گیری صحیح در وکتور بیانی pGEMHE قرار گفت. این وکتور حامل پروموتر آنزیم‌های RNA پلیمراز فاژهای T7 و SP6 می‌باشد که برای انجام رونویسی در شرایط آزمایشگاهی لازم است (9). همچنین وکتور مذکور دارای نواحی غیر قابل ترجمه (UTR, Untranslational Region) ژن بتاگلوبین قورباغه است که ترجمه cRNA را در داخل اووسیت امکان پذیر می‌سازد (9). به منظور بررسی حساسیت فعالیت آکواپورین NtPIP2;1 نسبت به جیوه، تاثیر آن بر سرعت تغییر حجم نسبی و نفوذپذیری آبی غشاء اووسیت‌هایی که NtPIP2;1 را بیان می کنند، بلافاصله پس از انتقال آنها به محیط هیپوتونیک مطالعه شد. نتایج نشان داد که بیان NtPIP2;1 در اووسیت‌ها سبب افزایش سریع در انبساط حجم آنها در محیط هیپوتونیک می‌شود به طوری که حتی پس از گذشت مدت زمان 180 ثانیه اغلب اووسیت‌ها به دلیل ورود بیش از حد آب به داخل آنها پاره شده، در حالیکه در اووسیت‌های کنترل منفی (NC, Negative Control، تزریق شده با آب) روند افزایش حجم نسبی بسیار کند بود (شکل 3). از طرفی مشاهده شد که تیمار اووسیت‌های بیان کننده NtPIP2;1 با جیوه تاثیری بر سرعت تغییر حجم نسبی آنها نداشت (شکل 3). محاسبه ضریب نفوذپذیری آبی غشاء (Pf) اووسیت نشان داد که بیان NtPIP2;1 در اووسیت موجب افزایش معنی‌داری (T-test, P<0.05) در میزان Pf غشاء اووسیت نسبت به آب از 12/0 سانتیمتر بر ثانیه در کنترل منفی (NC، اووسیت های تزریق شده با آب) به بیش از 99/0 سانتیمتر بر ثانیه شد (شکل 4). در مقابل افزودن جیوه به اووسیت‌هایی که آکواپورین NtPIP2;1 را بیان می‌کنند کاهش معنی‌داری را در میزان Pf غشاء اووسیت موجب نشد (شکل 4). مقایسه توالی اسید آمینه آکواپورین NtPIP2;1 با NtAQP1 که یک آکواپورین شناخته شده غیر حساس به جیوه است نشان داد که NtPIP2;1 دارای اسیدآمینه ترئونین در محلی مشابه با NtAQP1 می‌باشد (شکل 5، در محل فلش) که به نظر می‌رسد این عامل منجر به عدم حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 نسبت به جیوه می‌شود. آکواپورین دیگری از گیاه توتون به نام NtPIP1;1 نیز در همین موقعیت دارای اسید آمینه ترئونین است (شکل 5). لازم به ذکر است که آکواپورین NtPIP1;1 فاقد فعالیت انتقال آب بوده پس امکان بررسی حساسیت آن نسبت به جیوه وجود ندارد (11).
شکل 1: ژل الکتروفورز قطعات حاصل از تکثیر ناحیه کدکننده ژن NtPIP2;1 از کلون‌های cDNA (به ترتیب از چپ به راست، مارکر وزن مولکولی، چاهک های شماره 1 تا 4 کلون‌های مختلف cDNA و چاهک شماره 5 کنترل منفی). اعداد بر حسب base paires(bp) بیان شده اند.
شکل 2: نقشه وکتور بیانی pGEMHE (9)
شکل 3: تاثیر جیوه بر فعالیت انتقال آب آکواپورین NtPIP2;1 بیان شده در اووسیت‌های زنوپوس. مقادیر تغییر حجم نسبی 8-10 اووسیت در هر تیمار نسبت به زمان به صورت نمودار ترسیم شده است.NC (کنترل منفی)، گروه اووسیت‌های تزریق شده با آب، NC+Hg، گروه کنترل منفی تیمار شده با 1 میلی مولار کلرور جیوه، NtPIP2;1 گروه اووسیت‌های تزریق شده با cRNA NtPIP2;1 و NtPIP2;1+Hg، گروه تیمار شده با کلرور جیوه می‌باشند.
شکل 4: مقادیر ضریب نفوذپذیری آبی اسموتیک (Pf) اووسیت‌های تزریق شده با 50 نانوگرم cRNA مربوط به NtPIP2;1 و یا 50 نانولیتر آب (کنترل منفی، NC) در حضور و عدم حضور جیوه (Hg). نتایج میانگین 8 اندازه‌گیری همراه با خطای معیار می‌باشند.
شکل5: ردیف کردن (alignment) توالی آمینو اسیدی آکواپورین‌های غشاء پلاسمایی در گیاه توتون توسط نرم افزار GENETYXبا استفاده از توالی موجود در بانک ژن NCBI. فلش در شکل نشاندهنده اسید آمینه ترئونین است که جایگزین سیستئین حساس به جیوه در این محل شده است
بحث
ترکیبات جیوه به طور معمول سبب بلوکه کردن آکواپورین‌ها می‌شوند (3 و 5). این ترکیبات از طریق اتصال به گروه‌های سولفیدریل اسید آمینه سیستئین موجود در پروتئین ایفای نقش می‌کنند (4 و 9). به هر حال تمام اسیدهای آمینه سیستئین در این امر نقش ندارند. برای مثال 4 سیستئین در آکواپورین حساس به جیوه AQP1 یافت می‌شود ولی تنها باقیمانده سیستئین در لوپ E (Cys-189 مجاور دومین توالیNPA) توسط جیوه ممانعت می‌شود. جهش این سیستئین به سرین (Cys-189-Ser) تاثیری بر فعالیت انتقال آب توسط این آکواپورین ندارد ولی منجر به تبدیل آن به یک آکواپورین غیر حساس به جیوه می‌شود. از طرفی هنگامی که آلانین جایگزین سیستئین در لوپ B شود (Ala-73-Cys)، پروتئین نفوذپذیری آبی حساس به جیوه را نشان می‌دهد (15). همچنین آکواپورین غیر حساس به جیوه RD28 از گیاه آرابیدوپسیس قادر است حساسیت به جیوه را در صورت معرفی اسید آمینه سیستئین بعد از دومین توالی NPA کسب نماید (9). به هر حال در برخی آکواپورین‌ها نظیر AtPIP2;2 در گیاه آرابیدوپسیس اسید آمینه سیستئین قبل از دومین توالی NPA می باشد که موجب حساسیت آنها نسبت به جیوه می‌شود. در آکواپورین غیر حساس به جیوه NtAQP1 توتون اسید آمینه ترئونین (ترئونین شماره 233) دقیقا در این محل جایگزین سیستئین شده است (10). گزارش شده است هنگامی که این اسید آمینه ترئونین در آکواپورین NtAQP1 با اسیدآمینه سیستئین دقیقا در مکانی مشابه با سیستئین موجود در آکواپورین حساس به جیوه AtPIP2;2 تعویض شود، آکواپورین NtAQP1 نیز نسبت به جیوه حساس می‌شود (10). هم ردیف کردن توالی آمینواسیدی آکواپورین NtPIP2;1 کلون شده از گیاه توتون با آکواپورین شناخته شده NtAQP1 غیر حساس به جیوه نشان می‌دهد که در NtPIP2;1 نیز ترئونین جایگزین سیستئین در محلی درست مشابه با NtAQP1 شده است که این خود تائیدی بر آزمایشات انبساط حجم انجام گرفته در اووسیت زنوپوس می‌باشد. به هر حال برای آزمایشات تکمیلی لازم است فرم جهش یافته NtPIP2;1 از طریق تعویض سیستئین با ترئونین مورد بررسی قرار گیرد.
نتیجه گیری
NtPIP2;1 یک آکواپورین غیر حساس به جیوه را در گیاه توتون کد گذاری می‌کند و احتمالا جایگزینی اسید آمینه ترئونین در موقعیت 222 به جای سیستئین قبل از دومین توالی حفاظت شده NPA در این آکواپورین عامل عدم ممانعت آن توسط جیوه است.
تشکر و قدردانی
مولفین بر خود لازم می‌دانند از دانشگاه اراک به دلیل حمایت مالی این تحقیق تشکر نمایند.
)