نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق بررسی نقش کلیت کننده های کلسیم بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ بود.
مواد و روش ها: ناحیه سینهای نخاع موش بالغ توسط دستگاه قطعه کننده بافت به قطعات 400 میکرونی بریده و به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر 2- قطعات کنترل 3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA). قطعات کنترل و تیمار به مدت 6 ساعت در محیط کشت انکوبه شدند. سنجش MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات نخاع مورد استفاده قرار گرفت. جهت مطالعه مورفولوژیکی نورونهای حرکتی از رنگ آمیزی پروپیدیوم آیوداید و هوخست 33342 استفاده شد. دادهها با روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها در سطح p نتایج: نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع پس از 6 ساعت نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نشان دادند. کاربرد جداگانه کلیت کننده های کلسیمی (EDTA و EGTA) نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت را افزایش دهد بلکه توانست مرگ سلولی اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی این قطعات مهار و همچنین درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را افزایش دهد.
نتیجه گیری: از آنجا که کاربرد کلیت کننده های کلسیمی درمحیط کشت قطعات نخاع توانست قابلیت حیات این قطعات را افزایش، نشانه های اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در این قطعات افزایش دهند، بیانگر آن است که افزایش کلسیم داخل سلولی احتمالا یکی از دلایل اپوپتوزیس نورون های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع می باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The inhibitory effect of calcium chelators on the apoptosis of motor neurons in cultured adult mouse spinal cord slices
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the inhibitory effect of calcium chelators on apoptosis of motor neurons in adult spinal cord slices.
Materials and Methods: The thoracic region of adult mouse spinal cord was sliced by a tissue chopper into 400 µm sections and divided into four groups: 1- freshly dissected slices (0 hour), 2- control slices, 3- slices treated by ethylene deamin tetra acetic acid (EDTA) and 4- slices treated by ethylene glycol tetra acetic acid (EGTA). The control and treated slices were incubated in a culture medium for 6 hours. MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] assay was used to evaluate the viability of the slices. To study motor neurons morphology, propidium iodide and Hoechst 33342 were used. Data were analyzed using one- way ANOVA and Tukey test, and means difference was considered significant at p < 0.05.
Results: Motor neurons from slices cultured for 6 hours displayed morphological features of apoptosis. The application of calcium chelators (EDTA and EGTA) not only increased the viability of the cultured slices, but also inhibited apoptosis in the motor neurons and increased the percentage of viable motor neurons.
Conclusion: It could be concluded that apoptosis in motor neurons of cultured spinal cord slices might be due to increased level of intracellular calcium.
کلیدواژه‌ها [English]
- Apoptosis
- Spinal cord
- Motor neuron
- EDTA
- EGTA
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 8-1
تأثیر کلیت کننده های کلسیمی بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ
حمید رضامومنیPh.D.1*، ملک سلیمانی مهرنجانیPh.D.1، سید محمد علی شریعت زادهPh.D.1 ، مهسا جراح زاده. M.Sc2
1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156
2- دانش آموخته کارشناسی ارشد زیست شناسی تکوینی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم ، گروه زیست شناسی
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: h-momeni@araku.ac.ir
تاریخ دریافت: 20/10/ 1389 تاریخ پذیرش: 22/12/1389
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق بررسی نقش کلیت کننده های کلسیم بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ بود.
مواد و روش ها: ناحیه سینهای نخاع موش بالغ توسط دستگاه قطعه کننده بافت به قطعات 400 میکرونی بریده و به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر 2- قطعات کنترل 3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA). قطعات کنترل و تیمار به مدت 6 ساعت در محیط کشت انکوبه شدند. سنجش MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات نخاع مورد استفاده قرار گرفت. جهت مطالعه مورفولوژیکی نورونهای حرکتی از رنگ آمیزی پروپیدیوم آیوداید و هوخست 33342 استفاده شد. دادهها با روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها در سطح p
نتایج: نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع پس از 6 ساعت نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نشان دادند. کاربرد جداگانه کلیت کننده های کلسیمی (EDTA و EGTA) نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت را افزایش دهد بلکه توانست مرگ سلولی اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی این قطعات مهار و همچنین درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را افزایش دهد.
نتیجه گیری: از آنجا که کاربرد کلیت کننده های کلسیمی درمحیط کشت قطعات نخاع توانست قابلیت حیات این قطعات را افزایش، نشانه های اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در این قطعات افزایش دهند، بیانگر آن است که افزایش کلسیم داخل سلولی احتمالا یکی از دلایل اپوپتوزیس نورون های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع می باشد.
واژگان کلیدی: اپوپتوزیس، نخاع، نورون حرکتی، EDTA و EGTA
مقدمه
کلسیم به عنوان پیامبر ثانویه نقش مهمی در پدیدههای زیستی از بقا تا مرگ سلولها ایفا می نماید. به عنوان مثال نقش کلسیم در لقاح و تشکیل سلول تخم تا مرگ برنامهریزی شده سلولی (اپوپتوزیس) به اثبات رسیده است (1). تحت شرایط فیزیولوژیکی غلظت کلسیم خارج سلولی 3/1 میلی مولار و غلظت سیتوپلاسمی آن در حدود 100 نانو مولار می باشد (2)، در حالیکه تحت شرایط پاتولوژیک غلظت داخل سلولی کلسیم افزایش مییابد (3). افزایش غیر طبیعی کلسیم داخل سلولی نه تنها موجب فعال شدن پروتئازها و اندونوکلئازهای وابسته به کلسیم میشود (4)، بلکه این امر موجب اختلال در عملکرد ارگانلهایی همچون میتوکندریها میگردد (5). بدین ترتیب اگر چه غلظت طبیعی یون کلسیم در پدیدههای حیاتی سلول مهم است، افزایش غیر طبیعی داخل سلولی این یون منجر به مرگ سلولی میشود.
مطالعات نشان میدهد که در برخی بیماریهای کبدی افزایش کلسیم داخل سلولی منجر به اپوپتوزیس هپاتوسیتها میشود (6). همچنین گزارشهائی وجود دارد که نشان میدهد تیمار سلولها با یونوفورهای کلسیم(Calcium ionophores)(7) و یا مهار کنندههای پمپهای کلسیم موجود بر روی غشا سیتوپلاسمی (8) موجب مرگ سلولها میگردد. در مورد سیستم عصبی نیز میتوان به مرگ نورونی ناشی از افزایش کلسیم داخل سلولی در بیماریهایی مثل ایسکمی (Ischemia)، تروما (Trauma) (9) و بیماریهای ناشی از دژنره شدن نورونها (10) اشاره کرد.
مرگ نورونهای حرکتی یکی از وقایع بحرانی است که در بیماری Amyotrophic Lateral Sclerosis ، بیماری که طی آن نورونهای حرکتی در نخاع، ساقه مغز و قشر حرکتی میمیرند و موجب آتروفیه شدن عضلات میگردد (11)، اتفاق میافتد که تا کنون درمان قطعی برای آن ارائه نشده است. بنابراین طراحی مدلهای مناسب که بتواند بر روی مطالعه مکانیسمهای دخیل در مرگ این نورونها متمرکز گردد احتمالا میتواند با افزایش دانش پایهای در این خصوص پنجرهای را فراسوی درمان این بیماران در آینده فراهم نماید. از اینرو، کشت قطعات نخاع جانور بالغ بعنوان یک مدل in vitro میتواند برای بررسی مکانیسمهای دخیل در مرگ نورونهای حرکتی مفید باشد. گزارشات معدودی وجود دارد که به مطالعهی مکانیسمهای دخیل در مرگ نورونهای حرکتی در قطعات نخاع حیوانات بالغ در شرایط طبیعی و بدون تأثیر هر گونه عامل خـارجـی پـرداخـته بـاشـد. در تحقیق قبلی (12) ما نشان دادیم که اپوپتوزیس عامل اصلی مرگ نورونهای حرکتی در قطعات کشت شده نخاع موش بالغ میباشد. در مطالعه دیگر کلپین (پروتئاز وابسته به کلسیم) به عنوان یک مکانیسم احتمالی برای اپوپتوزیس نورونهای حرکتی موش بالغ گزارش شده است (4).
با توجه به اینکه افزایش کلسیم درون سلولی میتواند عاملی برای القا اپوپتوزیس سلولی باشد، این احتمال وجود دارد که این عامل نیز بتواند بعنوان یکی از دلایل اپوپتوزیس نورونهای حرکتی در قطعات نخاع در نظر گرفته شود. در صورتی که این احتمال درست باشد میتوان با جلوگیری از افزایش کلسیم داخل سلولی، مرگ این نورونها را به تأخیر انداخت. یکی از این روشها میتواند استفاده از کلیت کنندههای کلسیمی باشد که قادر است کلسیم را در خارج سلول کلیت نماید. بنابراین پژوهش حاضر با این هدف طراحی شد تا با کاربرد کلیت کنندههای کلسیمی به بررسی نقش آنها در مهار اپوپتوزیس نورونهای حرکتی در قطعات کشت شده نخاع موش بپردازد.
مواد و روش ها
حیوانات: در این مطالعه تجربی از موشهای مادهی بالغ ن‍ژاد Balb/c با میانگین وزنی 3±22 گرم از انستیتو پاستور ایران خریداری شده بودند استفاده شد. حیوانات و در خانهی حیوانات در شرایط استاندارد با دسترسی کامل به آب و غذا نگهداری شدند.
تهیه قطعات نخاع: حـیـوانات بـا استفاده از تزریق داخل صفاقی سدیـم پنـتـوبـاربیتال (mg/kg60) کاملاً بیهوش و توسط شکافتگی قلب کشته شدند. سپس نخاع خارج و به پتری حاوی سالین فسفاته سرد PBS (phosphate buffer saline, pH=7.4) منتقل گردید. پس از جدا نمودن ناحیه سینهای نخاع (4)، این بخش با استفاده از دستگاه قطعه کننده بافت Tissue chopper)، استولتینگ، آمریکا) به صورت برشهای عرضی به قطعاتی با ضخامت 400 میکرون بریده شد. این قطعات سپس به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر2- قطعات کنترل3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) با غلظت نهایی 5 میلی مولار4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA) با غلظت نهایی 5 میلی مولار. سپس قطعات تیمار و کنترل به پلیتهای چهار خانه حاوی 450 میکرو لیتر محیط کشت شامل 50 درصد (MEM) Minimum Essential Medium، 25 درصد سرم اسب، 25 مولار HEPES (N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)،25 درصد Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)، یک درصد پنی سیلین - استرپتومایسین و 6 گرم در لیتر D- گلوکز با pH=7.3-7.4 انتقال (هر چهار قطعه در یک خانه) و به مدت 6 ساعت در انکوباتور CO2 دار در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
فیکس و برش گیری:قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) بلافاصله پس از تهیه و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل و تیمار) برای مدت زمان حداقل 2 ساعت در فیکساتور Steffanini (2/0درصد پارافرمالدهید، 2/0درصد اسید پیکریک، 1/0 مولار فسفات بافر 7.2 pH=) قرار گرفتند. سپس قطعات توسط PBS شستشو شد (3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه) و برای مدت یک شب در محلول ساکاروز 20 درصد در PBS، در یخچال قرار گرفتند. سرانجام قطعات با استفاده از دستگاه کرایوستت (لایکا، آلمان) با ضخامت 10 میکرون برشگیری و بر روی لام های آغشته به پلی- ال- لایزین (1:9 در آب مقطر) قرار گرفته و سپس در فریزر 20- درجه سانتیگراد تا هنگام استفاده نگهداری شدند.
سنجش قابلیت حیات: سنجش MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (سیگما، آمریکا) جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع به کار گرفته شد (13). قطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل و تیمار) به پلیتهای چهارخانه حاوی 450 میکرولیتر محیط کشت انتقال یافتند. به هر کدام از خانههای پلیت 50 میکرو لیتر از محلول غلیظ MTT ( mg/ml5) اضافه شد. سپس پلیتها برای 20 دقیقه در انکوباتور Co2 دار با دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه شدند. قطعات نخاع با استفاده از میکروسکوپ معمولی بررسی و از آنها عکس تهیه گردید.
سنجش اپوپتوزیس با استفاده از رنگ آمیزی فلئورسنت: در این تحقیق با تأکید بر بررسی جنبههای مورفولوژیکی اپوپتوزیس در نورونهای حرکتی از رنگهای فلئورسنت شامل پروپیدیوم آیوداید (سیگما، آمریکا) و هوخست33342 (سیگما، آمریکا) استفاده شد (4). ابتدا لامهای حاوی برشهای نخاع به وسیلهی PBS شستشو شدند (3 بار و هر بار 5 دقیقه). سپس رنگ آمیزی توسط پروپیدیوم آیوداید (10 میکرو گرم بر میلی لیتر) به مدت 12 دقیقه انجام شد. لامها مجدداً به وسیلهی PBS شستشو (3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه) توسط هوخست33342 (5 میکرو گرم بر میلی لیتر) به مدت 30 ثانیه رنگ آمیزی شدند. پس از آن لامها به وسیله ی PBS شستشو (3 بار و هر بار 5 دقیقه)، به برش ها محلول گلیسرول/PBS (1:1) اضافه و سرانجام توسط لامل پوشیده شدند. لامها توسط میکروسکوپ فلئورسنس (المپیوس، ژاپن) مجهز به دوربین، با استفاده از فیلتر مناسب مشاهده و از آنها عکس تهیه شد.
شمارش نورونهای حرکتی:تعداد نورونهای حرکتی از هر نمونه، از طریق شمارش حداقل 12 شاخ شکمی از برش های مربوط به قطعات متفاوت نخاع که بطور تصادفی انتخاب شده بودند انجام شد و سپس درصد تعداد نورونهای حرکتی زنده بر اساس تعداد کل نورونهای حرکتی برای هر نمونه محاسبه گردید (14).
آنالیز آماری داده ها:دادههای حاصل توسط نرم افزار SPSS با استفاده از آنالیزواریانس مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها در سطح 05/0 P<معنی دار در نظر گرفته شد.
نتایج
سنجش MTT در قطعات نخاع
جهت بررسی قابلیت حیات قطعات نخاع، قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل
و تیمار با EDTA و EGTA) از روش MTT استفاده شد. نتایج نشان داد که توزیع رنگ بنفش MTT فورمازان(که بیانگر قابلیت حیات میباشد) در قطعات تازه تهیه شده در مادهی خاکستری و سفید زیاد و قابل توجه بود (شکل A-1). بر عکس در ماده خاکستری و سفید قابلیت حیات در قطعات کشت شده برای 6 ساعت نسبت به قطعات تازه تهیه شده به طور قابل ملاحظهای کاهش یافت (شکل B-1). کاربرد جداگانه EDTA با غلظت 5 میلی مولار (شکل C-1)و EGTA با غلظت 5 میلی مولار (D-1)، توانست بطور قابل ملاحظهای قابلیت حیات قطعات نخاع کشت شده برای 6 ساعت را نسبتبه گروه کنترل افزایش دهد.
شکل 1: سنجش MTT در قطعات نخاع در حضور و عدم حضور کلیت کنندههای کلسیمی. (A) قطعهی نخاع تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر). (B) قطعهی نخاع پس از گذشت مدت زمان 6 ساعت در محیط کشت (کنترل). (C) قطعه ی نخاع تیمار شده با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید(EDTA، 5 میلی مولار) پس از گذشت 6 ساعت. (D) قطعه ی نخاع در حضور اتیلن گلیکول تترا استیک اسید(EGTA، 5 میلی مولار) پس از گذشت 6 ساعت. توزیع رنگ بنفش فورمازان در ماده سفید و خاکستری قطعات نخاع که نمایانگر قابلیت حیات سلولی است در قطعات کشت شده با EDTA و EGTA به طور قابل ملاحظهای نسبت به گروه کنترل بیشتر بود.
مطالعه مورفولوژیکی نورون های حرکتی توسط رنگ آمیزی فلئورسنت
نورونهای حرکتی به واسطه دارا بودن جسم سلولی و هسته بزرگ و محل قرار گیری آنها در شاخهای شکمی از سایر نورونها قابل تشخیص میباشند. نورونهای حرکتی در برشهای مربوط به قطعات تازه تهیه شده (لحظهی زمانی صفر)، دارای جسم سلولی و هسته بزرگ، هستک مشخص و بدون هیچ گونه علامت اپوپتوزیس بودند (شکل -A2). در حالیکه نورونهای حرکتی در برشهای قطعات کشت شدهی برای زمان 6 ساعت (کنترل)، تغییرات مورفولوژیکی اپوپتوزیس از قبیل چروکیدگی سیتوپلاسم و غشاء سلول (کوچک شدن سلول)، متراکم شدن هسته (کوچک شدن هسته) و تراکم کروماتین را نشان دادند (شکل B-2). پس از گذشت مدت زمان 6 ساعت در محیط کشت، کاربرد جداگانه EDTA با غلظت 5 میلی مولار (شکل-C 2) و EGTA با غلظت 5 میلی مولار (شکلD -2) توانست نشانههای مورفولوژیک اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی نسبت به گروه کنترل به طور قابل ملاحظهای مهار نمایند. در این زمان، استفاده از غلظتهای پائین تر این کلیت کننده تأثیر قابل ملاحظهای در مهار اپوپتوزیس این نورونها نداشت (دادهها نشان داده نشده است)
شکل 2: نقش کلیت کنندههای کلسیم در مهار اپوپتوزیس نورونهای حرکتی نخاع.(A) نورونهای حرکتی طبیعی و بدون علائم اپوپتوزیس از قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر). (B) نورونهای حرکتی قطعات کشت شده پس از گذشت زمان 6 ساعت (کنترل) نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نمایان ساختند. کاربرد اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA ، 5 میلی مولار) (C)، و اتیلن گلیکول تترا استیک اسید(EGTA، 5 میلی مولار) (D)، بطور جداگانه توانست نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را در نورونهای حرکتی از قطعات کشت شده برای 6 ساعت به طور قابل ملاحظهای نسبت به گروه کنترل مهار نماید. فلش ها نمایانگر نورون های حرکتی می باشند. رنگ آمیزی فلئورسنت: پروپیدیوم آیوداید (قرمز) و هوخست (آبی). : Scale bar 25 میکرون
مطالعه کمی (شمارش نورون های حرکتی)
همانطور که نمودار 1 نشان میدهد درصد تعداد نورونهای حرکتی در قطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) صد درصد بود که بیانگر زنده بودن تمام نورونهای حرکتی میباشد. بعد از گذشت مدت زمان 6 ساعت، درصد تعداد نورونهای حرکتی زنده قطعات کشت شده به طور معنیداری (001/0 >P) نسبت به لحظه زمانی صفر به 45 درصد کاهش یافت. در حالیکه درصد تعداد نورونهای حرکتی زنده در حضور ) EDTA5 میلی مولار)72 درصد و در حضور ) EGTA5 میلی مولار) 92 درصد بوده که این افزایشها نسبت به گروه کنترل معنیدار (001/0 P<) بودند.
نمودار1: تأثیر کلیت کننده های کلسیمی بر تعداد نورون های حرکتی زنده.درصد تعداد نورون های حرکتی زنده درقطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) صد درصد بود. در حالیکه درصد تعداد نورون های حرکتی زنده در قطعات کشت شده برای6 ساعت (گروه کنترل) در مقایسه با لحظه زمانی صفر به طور معنی داری کاهش یافت. کاربرد جداگانه اتیلن دی آمین تترا استیک اسیدEDTA (5 میلی مولار) و اتیلن گلیکول تترا استیک اسید EGTA (5 میلی مولار) در محیط کشت به طور معنی داری درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد. (12,Mean±SD,n=001/0*P<)
بحث
کشت قطعات نخاع گرفته شده از جانور بالغ بعنوان یک مدل in vitro، از جمله تکنیک های پر اهمیتی است که برای مطالعه آسیب های نخاعی، ارزیابی قابلیت حیات سلولی و مکانیسمهای دخیل در مرگ نورونی بکار می رود (13). در پژوهش حاضر کشت قطعات نخاع موش بالغ مورد استفاده قرار گرفت تا تاثیر کلیت کننده های کلسیمی در مهار اپوپتوزیس نورونهای حرکتی این قطعات مورد مطالعه قرار گیرد.
نظر به اینکه سنجش MTT برای ارزیابی قابلیت حیات سلولها و قطعات گرفته شده از سیستم اعصاب مرکزی یک روش سریع و معتبر محسوب میشود (13و 15) ، برای سنجش قابلیت حیات قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده مورد استفاده قرار گرفت. در این روش نمک زرد رنگ MTT توسط دهیدروژنازهای میتوکندریهای فعال در سلولهای زنده احیا و به بنفش فورمازان (MTT فورمازان) تبدیل میشود (16). بنابراین میزان رنگ بنفش تولید شده با تعداد سلولهای زنده و بنابراین قابلیت حیات سلولی مرتبط میباشد. در سایر روشهای بررسی قابلیت حیات که از تریپان بلو و پروپیدیوم آیوداید استفاده میگردد، تنها تمامیت غشاء سلولها سنجش میشود (17) و اطلاعاتی در خصوص فعالیت متابولیکی و میتوکندریهای سلول در اختیار نمیگذارند. اگرچه در این روش عمل احیا MTT بر اساس میتوکندریهای فعال سلولی صورت میگیرد، اما باید توجه داشت که احیاء MTT همچنین میتواند به وسیلهی دهیدروژنازهای متعلق به دیگر ارگانلهای سلولی مانند لیزوزومها نیز انجام شود (18). صرف نظر از این موضوع، سلولهایی که از نظر متابولیکی فعال میباشند میتوانند این احیا را انجام دهند و بدین ترتیب این روش میتواند برای سنجش قابلیت حیات سلولی مفید باشد.
جهت مشخص شدن نوع مرگ نورونهای حرکتی، از رنگ آمیزی فلئورسنت استفاده شد. در مطالعات متعدد این رنگها برای بررسی مورفولوژیک هسته سلول ها مورد استفاده قرار میگیرند (19و20). رنگ هوخست با اتصال به DNA توانایی رنگ آمیزی هسته را داشته و متراکم شدن هسته و کروماتین را در سلولهای اپوپتوتیک مشخص مینماید (21). در پژوهش حاضر نورونهای حرکتی قطعات کشت شده برای مدت زمان 6 ساعت، مشخصات مورفولوژیکی مانند چروکیدگی سلول، متراکم شدن هسته و کروماتین را از خود نشان دادند. از آنجا که در مطالعات متعدد این مشخصات به عنوان ویژگیهای مرگ سلولی اپوپتوزیس معرفی شدهاند (12، 22و 23)، اینطور میتوان نتیجه گرفت که مرگ این نورونها در قطعات کشت شده از نوع اپوپتوزیس بوده است.
نشان داده شده است که در طی آسیب های نخاعی، یکی از علل مرگ نورونها افزایش بیش از اندازه غلظت کلسیم داخل سلولی میباشد (24). این طور میتوان فرض کرد که این عامل نیز ممکن است دلیلی بر اپوپتوزیس نورونهای حرکتی در قطعات کشت شده نخاع باشد. در صورتی که این احتمال درست باشد، جلوگیری از ورود بیش از اندازه کلسیم از محیط کشت به درون سلول و نهایتاَ جلوگیری از افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی به عنوان مثال با استفاده از کلیت کنندههای کلسیمی مثلEDTA وEGTA میتوانست اپوپتوزیس را در این نورونها مهار نماید. Liu و همکارانش نشان دادند که با استفاده از EGTA، مرگ سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو کاهش مییابد (25). علاوه بر آن Zhang و همکارانش (26) شکسته شدن DNA و تراکم کروماتین هسته را با استفاده از کلیت کننده کلسیم مهار کردند. در مطالعه حاضر کاربرد EDTA و EGTA پس از 6 ساعت توانست به طور قابل ملاحظهای قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع را افزایش دهد. علاوه بر آن این کلیت کنندهها توانستند اپوپتوزیس را در نورونهای حرکتی مهار و درصد تعداد نورونهای زنده را به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل افزایش دهند. این نتایج می توانست موید این مطلب باشند که EDTA و EGTA در طی ساعتهای کشت، کلسیم را در محیط خارج سلولی کلیت و از افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی جلوگیری نمودهاند. بنابراین نتایج حاصله احتمالاً میتوانست تأیید کننده فرضیه افزایش کلسیم داخل سلولی در اپوپتوزیس نورونهای حرکتی باشد. نتایج حاضر نشان داد که درصد تعداد نورونهای حرکتی زنده در قطعات تیمار شده با EGTA نسبت به EDTA بیشتر بود. دلیل این امر احتمالاً مربوط به اختصاصی تر بودن EGTA برای کلیت نمودن کاتیونهای دو ظرفیتی از جمله کلسیم می باشد.
مکانیسمی که از طریق آن کلسیم توانسته است اپوپتوزیس را در نورونهای حرکتی القا نماید قابل بحث میباشد. این احتمال وجود دارد که افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی باعث ورود سلول به مرحله آغازی اپوپتوزیس شده باشد (27). در این صورت افزایش کلسیم داخل سلولی از طرق مختلف میتواند اپوپتوزیس را در سلولها آغاز نماید. اختلال در عملکرد اندامکهای سلولی از جمله میتوکندریها و شبکه اندوپلاسمی و همچنین فعال نمودن برخی از آنزیم ها از آن جمله اند. افزایش کلسیم داخل سلولی باعث تغییر در آرایش سه بعدی اجزای پرواپوپتوتیک خانواده Bcl2 شده و موجب تشکیل منافذی بر روی غشای میتوکندری و شبکه آندوپلاسمی را میدهد. این امر به نوبه خود باعث ورود هر چه بیشتر کلسیم به درون سیتوزول و به هم خوردن تعادل پتانسیل غشا میتوکندری (Ψ∆) میگردد (28). کلسیم همچنین در فعال کردن کلپینها بعنوان پروتئازهای وابسته به کلسیم و اندونوکلئازهای وابسته به کلسیم (29) نقش دارد. کلپین ها به نوبه خود با فعال نمودن کاسپاز ها میتوانند در القای اپوپتوزیس نقش داشته باشند (30) کلپینها و کاسپازهای فعال شده درون سلول میتوانند با حمله به سوبستراهای پروتئینی خود در سیتوپلاسم (بعنوان مثال فودرین و اکتین) و یا هستهای (مثل لامین ها)، آنها را تجزیه نموده و موجب فروپاشی ساختار سلولی و سرانجام اپوپتوزیس گردند (31). بنابراین این احتمال وجود دارد که افزایش کلسیم داخل سلولی در نورونهای حرکتی قطعات کشت شده موجب فعال شدن پروتئازها و اندونوکلئازهای داخل سلولی شده باشد و بدین ترتیب موجب اپوپتوزیس در این نورون ها گردد. عدم افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی از طریق کلیت شدن کلسیم توسط EDTA و EGTA و مهار اپوپتوزیس در این نورونها احتمالاً میتواند تأییدی بر این مطلب باشد.
نتیجه گیری
کاربرد کلیت کنندههای کلسیمی نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع را افزایش دهد بلکه موجب مهار اپوپتوزیس در نورون های حرکتی شده و درصد تعداد نورونهای حرکتی زنده را به طور معنی داری افزایش داد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می دانند که از کمکهای ارزشمند خانم منیره محمودی و آقای مهدی نوده فراهانی تشکر و سپاسگزاری نمایند.
)