قابلیت ترانسفکشن و ترانسدوکشن سلول‏های جوجه رده LMH و مقایسه آن با سلول‏های انسانی رده HEK-293T

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی کارائی جذب DNA و انتقال ژن به سلول‏های کبدی جوجه نژاد لگهورن در دو سطح ترانسفکشن و ترانسدوکشن با لنتی ویروس‏های نوترکیب و شدت بیان ترانسژن می‏باشد.
مواد و روش‏ها: برای ترانسفکشن یا ترانسدوکشن ویروسی، سلول‏ها در پلیت‏های 96 خانه کشت داده شدند و در مراحل مختلف با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده گردیدند. تعداد سلول‏های GFP (Green Fluorescent Protein-positive) با نرم‏ افزار Grid Cell Counter و شدت بیان ترانسژن با نرم ‏افزار ImageJ محاسبه و داده‏ها با نرم افزار SPSS آنالیز شدند.
نتایج: بیان ژن GFP، در سطح ترانسفکشن، در سلول‏های HEK Human Embryonic Kidney)) و LMH (Chicken hepatoma cell line) به ترتیب 6 ساعت و 9 ساعت بعد از انتقال ژن و در مرحله ترانسدوکشن به ترتیب 22 ساعت و 36 ساعت بعد مشاهده شدند. شمارش سلول‏های GFP+، 48 ساعت پس از ترانسفکشن نشان دادکه سلول های HEK و LMH به ترتیب 40 درصد و 35 درصد DNA را دریافت و بیان کرده‏اند. این مقادیر در 72 ساعت بترتیب به  95 درصد و 48 درصد رسید. شمارش سلول‏های مثبت 72 و 96 ساعت پس از ترانسدوکشن ویروسی نیز الگوئی مشابه از نظر دریافت DNA توسط دو رده سلولی مزبور را به اثبات رسانید. لیکن آنالیز شدت بیان GFP نشان داد که رده HEK و LMH بترتیب 74 درصد و 89 درصد GFP را با اختلاف معنی‏داری (P<0.01) بیان کردند.
نتیجه گیری: نتایج حاصله نشان داد که سلول‏های HEK از قدرت جذب بالاتری برای دریافت DNA برخوردار هستند با این حال سلول‏های LMH قادرند ژن‏های خارجی را با شدت بیشتری بیان نمایند.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                          مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                            جلد 1، شماره 2، زمستان 1389، 56-47

 

قابلیت ترانسفکشن و ترانسدوکشن سلول‏های جوجه رده LMH و مقایسه آن با سلول‏های انسانی رده HEK-293T

 

عباس رحیمی شم‏آبادی1، موسی گردانه  Ph.D.2*، مسعود علی‏پناه Ph.D.3، احسان قریب4

 

1- دانشجوی کارشناسی ارشد ژنتیک و اصلاح نژاد دام, دپارتمان ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران و دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، سیستان و بلوچستان

2- دپارتمان ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

3- دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، سیستان و بلوچستان

۴- دانشجوی کارشناسی ارشد سلولی و مولکولی، دپارتمان ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، و پردیس کیش دانشگاه تهران

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: mossa65@nigeb.ac.ir

 

تاریخ دریافت: 19/11/ 1389                               تاریخ پذیرش: 31/1/1390

 


چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی کارائی جذب DNA و انتقال ژن به سلول‏های کبدی جوجه نژاد لگهورن در دو سطح ترانسفکشن و ترانسدوکشن با لنتی ویروس‏های نوترکیب و شدت بیان ترانسژن می‏باشد.

مواد و روش‏ها: برای ترانسفکشن یا ترانسدوکشن ویروسی، سلول‏ها در پلیت‏های 96 خانه کشت داده شدند و در مراحل مختلف با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده گردیدند. تعداد سلول‏های GFP (Green Fluorescent Protein-positive) با نرم‏ افزار Grid Cell Counter و شدت بیان ترانسژن با نرم ‏افزار ImageJ محاسبه و داده‏ها با نرم افزار SPSS آنالیز شدند.

نتایج: بیان ژن GFP، در سطح ترانسفکشن، در سلول‏های HEK Human Embryonic Kidney)) و LMH (Chicken hepatoma cell line) به ترتیب 6 ساعت و 9 ساعت بعد از انتقال ژن و در مرحله ترانسدوکشن به ترتیب 22 ساعت و 36 ساعت بعد مشاهده شدند. شمارش سلول‏های GFP+، 48 ساعت پس از ترانسفکشن نشان دادکه سلول های HEK و LMH به ترتیب 40 درصد و 35 درصد DNA را دریافت و بیان کرده‏اند. این مقادیر در 72 ساعت بترتیب به  95 درصد و 48 درصد رسید. شمارش سلول‏های مثبت 72 و 96 ساعت پس از ترانسدوکشن ویروسی نیز الگوئی مشابه از نظر دریافت DNA توسط دو رده سلولی مزبور را به اثبات رسانید. لیکن آنالیز شدت بیان GFP نشان داد که رده HEK و LMH بترتیب 74 درصد و 89 درصد GFP را با اختلاف معنی‏داری (P<0.01) بیان کردند.

نتیجه گیری: نتایج حاصله نشان داد که سلول‏های HEK از قدرت جذب بالاتری برای دریافت DNA برخوردار هستند با این حال سلول‏های LMH قادرند ژن‏های خارجی را با شدت بیشتری بیان نمایند.

واژگان کلیدی: جوجه، LMH، لنتی ویروس، ترانسفکشن، ترانسدوکشن

 

 


مقدمه

سالیان زیادی است که تخم مرغ و جنین جوجه بعنوان مدلی مناسب برای مطالعات فیزیولوژیکی، تهیه آنتی بادیهای تجاری و واکسن بیماریها مورد استفاده قرار می‏گیرد. از دلایل این رویکرد می‏توان هزینه پائین تولید انبوه تخم مرغ، دوره کوتاه انکوباسیون، سیکل زندگی و تولید مثل کوتاه طیور نسبت به پستاندارانی که بعنوان حیوان آزمایشگاهی مطرح هستند و وجود محیط استریل داخل تخم مرغ را نام برد. بدین علت روشهای استخراج و تخلیص پروتئینهای مختلف از تخم مرغ نیز چندین دهه قبل ابداع شده (1) و به سهولت قابل انجام است (2 و3).

در عرصه مطالعات و تولیدات بیوتکنولوژی، تولید حیوانات تراریخته بعنوان مدل بیماریهای صعب العلاج و نیز بعنوان بیوراکتورهای قابل دسترس و مطمئن در سالهای اخیر مرسوم شده است (4-7). جوجه طیور از جمله حیواناتی است که بصورت تراریخته تولید و گزارش شده است (8-10). در مقایسه با سایر مدلهای حیوانی، طیور از مزایای خاصی بخصوص در عرصه تولید مولکولهای آنتی بادی برخوردار است. این مزایا عمدتا بر سه دسته تقسیم بندی می‏شوند: 1) مزایای بیولوژیکی که بیان درست پروتئینها و پردازش مناسب آنها در طی بیان (مثل گلیکوزیلاسیون و سیالیلاسیون آنتی بادیها متناسب با آنچه در سلولهای انسانی روی می‏دهد) (11) را شامل می‏شود، 2) مزایای سرعت و میزان تولید بدلایلی از قبیل زمان کوتاه انکوباسیون یعنی ۳ هفته و زمان نسبتا کوتاه پرورش یک نسل یعنی حدود ۲۰ هفته و سرعت و سهولت افزایش سطح تولید محصول (Scale-up) نسبت به سیستمهای دیگر و 3) هزینه پائین تولید از جمله عدم نیاز به فرمانتورهای بزرگ و روشهای پیچیده و پرهزینه استریلیزاسیون، تخلیص و تغلیظ محصول (12).

انتقال ژن خارجی به درون سلولها که لازمه ایجاد حیوانات تراریخته می‏باشد عمدتا بدو روش غیر ویروسی و ویروسی انجام می‏پذیرد. در روش‏های غیر ویروسی میزان موفقیت انتقال ژن پایین بوده و نمی‏توان انتظار داشت که قطعه ژن هدف بمیزان بالایی وارد ژنوم سلول شود. درصد الحاق ترانسژن در ژنوم سلول و میزان بیان آن نیز عموما پایین می‏باشد (13). این در حالیست که ویروس‏ها به طور طبیعی از توانایی بالایی در انتقال و الحاق ژنوم خود در سلول میزبان برخوردارند (14). بعلاوه با افزایش اطلاعات در مورد چرخه زندگی و ساختار ژنتیکی ویروسها و نتیجتا دستکاری‏های هدفمند بر روی ژنوم آنها، کارائی و پتانسیل ناقلین ویروسی برای انتقال ژنهای خارجی و الحاق آنها در ژنوم میزبان بهینه سازی می‏شود (15).

رده سلول‏های  Chicken hepatoma cell line LMH در سال 1981 توسط کیتاگاوا در پی تیمار سلول‏ها با دی اتیل نیتروز آمین تثبیت گردید (16). این رده سلولی از سلول‏های سرطانی کبد جوجه نژاد لگهورن جدا شده‏اند و از مورفولوژی دندریتی برخوردار هستند. از این سلول‏ها رده دیگری بنامLMH-2A  مشتق شده است که در آنها ژن گیرنده استروژن با         استفاده از تکنیک ترانسفکشن تثبیت شده است (17 و 18).              بنابر اطلاعات موجود درسایت ATCC                   (American Type CultureCollection) سلول‏های LMH  از قابلیت نسبتاً خوبی برای ترانسفکشن و دریافت توالی‏های نوکلئوتیدی برخوردار می‏باشند.

پتانسیل سلولهای جوجه در دریافت و بیان ژن خارجی برای تولید جوجه‏های تراریخته اهمیت زیادی دارد. در این راستا و در مطالعه حاضر قابلیت ترانسفکشن سلولهای LMH و دریافت توالی نوکلئوتیدی خارجی با استفاده از روش رسوب          DNA – فسفات کلسیم بررسی و با سلول‏های استاندارد             Human Embryonic Kidney (HEK)-293T مقایسه شده است. ما همچنین قابلیت ترانسداکشن رده سلولی LMH بالنتی ویروسهای نوترکیب با منشاء انسانی را بررسی و با سلول‏های HEK-293T مقایسه کردیم.

 

مواد و روش ها

بیولوژی مولکولی: ناقلین لنتی ویروسی بنامهای           pNL-EGFP/CMV-WPRE (ناقل انتقال یا ترانسفر)، pCD/NL-BH*ΔΔΔ (ناقل بسته بندی ویروس) و LTR-G (ناقل غشائی) از آزمایشگاه Dr. J. Reiser تهیه شد (19). خالص سازی نمونه‏های پلاسمیدی با استفاده از کیت Maxiprep از کیاژن و براساس دستورالعمل سازنده آن انجام شد.

 

کشت سلول: بر طبق گزارش قبلی ما (20) سلولهای مولد ویروسی از رده HEK-293T (یا مختصرا HEK) در محیط DMEM)) Dulbecco’s Minimal Eagle Medium بهمراه 10 درصد سرم FBS در شرایط 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت و در حد 80-90 درصد Confluency پاساژ داده شدند. برای ترانسفکشن و تولید ویروس 2 میلیون سلول در پتری دیشهای 10 سانتی‏گراد و مخصوص کشت سلول 24 ساعت قبل از ترانسفکشن کشت داده شدند تا در روز بعد حدودا 50-60 درصد فضای پتری دیش را پر نمایند.

سلول‏های LMH با مشخصات ATCC, CRL-2117 از بانک سلولی ایران (انستیتو پاستور ایران-تهران) تهیه شده و عینا مطابق گزارش قبلی کشت و تکثیر داده شدند (21).           بطور خلاصه برای کشت این سلولها از محیط         Waymouth MB 752/1 (از شرکت GIBCO) با 10 درصد FBS، 100 میکرو گرم بر میلی لیتر پنی‏سیلین و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر استرپتومایسین و انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد CO2 استفاده شد. برای کشت مجدد سلولها، کف فلاسکها و پلیتهای سلولی در ابتدا با ژلاتین 1 درصد  برای مدت 30 دقیقه پوشانده شد تا از چسبندگی کامل سلولها اطمینان حاصل شود. برای سهولت در شمارش سلولهای GFP+، ترانسفکشن و ترانسدوکشن هر دو رده سلولی در پلیتهای 96 خانه و با کاشت اولیه 3000 سلول  از هر دو رده صورت پذیرفت.

 

تولید و تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلولهای هدف: تمامی مراحل فوق الذکر مطابق گزارش قبلی انجام گردید (21). بطور خلاصه برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب و فعال، سلولهای مولد ویروس همزمان با سه ناقل لنتی ویروسی به میزان  15 میکروگرم از ناقل ترانسفر، و 10 میکروگرم از هریک از ناقلین بسته بندی و غشائی با روش استاندارد رسوب     DNA- فسفات کلسیم ترانسفکت شد. توضیح بیشتر آنکه مقادیر DNA بهمراه 125 میلی مولار فسفات کلسیم با افزوده آب استریل به 500 میکرولیتر رسانده و بصورت قطره ای به 500 میکرولیتر محلول((2 X HBS 2 X Hepes Buffered Saline اضافه شد. (2 X HBS: NaCl: 174 mM, KCl: 10 mM,  Na2HPO4.7H2O: 1.4 mM, D-Glucose: 15 mM, HEPES: 42 mM) . پس از 20 دقیقه انکوباسیون مخلوط بدست آمده در دمای اطاق، قطره قطره به سلولهای زنده در پلیت کشت اضافه شد. بدنبال آن سلولها تا تولید ویروس و رها سازی ذرات ویریون به محیط در شرایط انکوباتوری مذکور در بالا نگهداری شدند. محیط سلولهای ترانسفکت شده در 24 ساعت و 48 ساعت بعد جمع آوری شده و پس از فیلتراسیون با استفاده از Amicon-100 MW (Millipore) عینا مطابق گزارش قبلی تغلیظ گردید (21) . برای آلوده ساختن سلولهای هدف حجم‏های معینی (به بخش نتایج رجوع شود) از این استوک تغلیظ شده ویروسی به آرامی به سلولها اضافه شد و در شرایط رشد ذکر شده در بالا انکوبه گردید تا بیان ترانسژن فلورسنتی رویت شود. تصاویر سلولها در مراحل ترانسفکشن سلولی و ترانسدوکشن ویروسی را با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس جمع آوری و برای آنالیزهای بعدی ذخیره گردید.

 

محاسبه سلولهای GFP+: برای شمارش سلول‏ها حدود 10 میدان میکروسکوپی مختلف از هر چاهک 96 خانه مورد استفاده قرار گرفت و با استفاده از تصاویر این میادین، درصد سلولهای GFP+ با استفاده از نرم افزارGrid Cell Counter  محاسبه گردید(22).

 

محاسبه شدت بیان GFP: برای آنالیز شدت بیان در مرحله ترانسدوکشن ویروسی، سلولها بصورت تریپلیکیت (3 چاهک) برای هر رده سلولی در چاهکهای پلیت 96 خانه کشت و با یک دهم از استوک ویروسی آلوده گردید. هفتاد و دو ساعت پس از ترانسدوکشن تصاویر فلورسنتی از سلولها گرفته شد تا برای آنالیز بعدی بکار رود. این آزمایش برای 3 بار و هر بار بطور مجزا تکرار گردید و در مجموع از 9 چاهک از هر نمونه تصویر برداری شده و مورد آنالیز قرار گرفت. علاوه بر 9 چاهک تیمار شده با ویروس، از 6 چاهک دست نخورده از هر رده سلولی (2 چاهک در هر آزمایش) نیز در زیر نور فلورسنت عکسبرداری شد تا بعنوان زمینه در محاسبات بکار رود. پس از این مرحله مجموع سلولهای موجود در هر چاهک تیمار شده  با ویروس به روش رنگ آمیزی تریپان بلو شمارش گردید. برای آنالیز شدت بیان در تصاویر از نرم افزار ImageJ  (23) استفاده شد بدین ترتیب که ابتدا ارقام مربوط به میزان کل فلورسنت هر چاهک و سپس مقادیر فلورسنت زمینه با این نرم افزار بدست آمد. پس از تفریق مقادیر زمینه از مقادیر کل، میزان فلورسنت حاصله از هر چاهک را به نسبت مجموع سلولهای موجود در آن چاهک محاسبه گردید. نهایتا متوسط مقادیر مربوط به همه 9 چاهک از هر نمونه را بدست آورده و داده‏های حاصله را جهت تجزیه و تحلیل آماری بکاربرده شد.

 

آنالیز آماری: داده های مندرج در تصاویر نماینده متوسط (Mean±SEM) حد اقل 3 آزمایش جداگانه است که بصورت تریپلیکیت و یا بیشتر تکرار شده اند. برای آنالیز تفاوت بین دو گروه از تست Student (Student’s t-test) استفاده شد و متعاقبا با استفاده از نرم افزار SPSS version 16 مورد بررسی قرار گرفت. ارزش P<0.05 بصورت معنی‏دار و ارزشهای P<0.01 بصورت بسیار معنی‏دار تفسیر گردید.

 

نتایج

آغاز بیان ترانسژن در مرحله ترانسفکشن

مشاهده مستقیم سلولها در فواصل زمانی متوالی بعد از ترانسفکشن نشان داد که GFP در سلولهای HEK و LMH به ترتیب 6 و 9 ساعت پس از پایان ترانسفکشن قابل رویت می‏باشد. پس از گذشت 12 ساعت از ترانسفکشن، تعداد سلولهای HEK مثبت بطور متوسط به1 ±51 عدد در هر میدان میکروسکوپی رسید. این در حالیست که تعداد سلولهای LMH مثبت 20 ساعت پس از ترانسفکشن بطور متوسط 2±32 عدد در هر میدان بود (نمودر 1- الف). آنالیز آماری تفاوت این دو گروه را بسیار معنی‏دار نشان داد (Student's t-test; P<0.01).

 

آغاز بیان ترانسژن در مرحله ترانسدوکشن

برای مشاهده بیان در اولین فاصله زمانی پس از ترانسدوکشن، دو

رده سلولی با حداقل حجم استوک ویروسی آلوده شدند. متعاقبا سلولهای HEK و LMH بترتیب 22 و 36 ساعت بعد شروع به بیان GFP نمودند. بکارگیری حجم‏های سریالی از استوک ویروسی و سپس شمارش سلولهای GFP+ در مقاطع زمانی 36 ساعت برای سلولهای HEK و 48 ساعت برای سلولهای LMH نشان داد که در یک محدوده از تیتر ویروسی، غلظت ویروس نوترکیب با تعداد سلولهای بیان کننده ترانسژن در مورد هر دو رده سلولی رابطه مستقیم دارد (نمودار 1- ب). ترانسدوکشن سلولهای رده HEK و LMH با یک بیستم استوک ویروسی بترتیب 16و 10 سلول GFP+ایجاد نمود که 3 برابر بیشتر از زمانی است که سلولها رقت یک پنجاهم ویروسی را دریافت کردند. از نقطه نظر آماری این تفاوت نتیجه بین رقت‏های یک پنجاهم و یک بیستم برای هردو رده سلولی بسیار معنی‏دار بود (Student t-test; P<0.001). افزایش غلظت ویروس از یک بیستم به یک دهم نیز تعداد سلولهای مثبت در هر دو رده را 3 برابر دیگر افزایش داد و برای رده HEK و  LMHبترتیب به 4 ±51 و 3 ±32 رسانید و این افزایش برای هر دو رده سلولی بسیار معنی‏دار بود (P<0.001).

 

 

 

   

الف

ب

 

نمودار 1: الف- شمارش سلولهای GFP+ در آغاز ترانسفکشن: این شمارش برای سلولهای HEK و LMH بترتیب 12 و 20 ساعت پس از ترانسفکشن و یا استفاده از میکروسکوپ فلورسنس صورت گرفت. هر ستون نماینده متوسط تعداد سلولهای شمارش شده در 10 میدان میکروسکوپی است (این میادین در بزرگنمایی 100x ایجاد شدند) که با استفاده از نرم افزار Grid Cell Counter و با پیروی از دستورالعمل وبسایت محاسبه گردید. تفاوت آماری بین دو گروه با علامت   *** (P < 0.001) نشان داده شده است ب- سلولها با رقتهای سریالی از استوک ویروسی آلوده شدند. شمارش سلولی برای سلولهای HEK و LMH بترتیب 36 و 48 ساعت پس از ترانسدوکشن صورت گرفت. هر ستون نماینده متوسط تعداد سلولهای شمارش شده در 10 میدان میکروسکوپی (بزرگنمایی 100x) میباشد که با استفاده از نرم افزار Grid Cell Counter و با پیروی از دستورالعمل وبسایت محاسبه گردید. علائم موجود در دیاگرام حاصل آنالیز آماری داده ها بشرح زیر است: علامت  ** (P <0.01) و یا *** (P<0.001) برای تفاوتهای آماری بین دو رده سلولی در هر گروه از داده ها، علامت  (P <0.01)##  برای تفاوتهای آماری بین سلولهای یک رده که با رقتهای یک دهم و یک پنجم از استوک ویروس تیمار شده اند، علامت  (P <0.001)‡‡‡ برای تفاوتهای آماری بین سلولهای یک رده که با رقتهای یک پنجاهم و یک بیستم و یک دهم از استوک ویروس تیمار شده اند.

 

بررسی سلولهایی که حجم یک پنجم (یعنی 100 میکرولیتر از کل 500 میکرولیتر استوک ویروسی) و حجم‏های بالاتر استوک ویروس را دریافت کرده بودند نشان داد که مصرف بیش از حد مقدار ویروس باعث کاهش محسوس رشد و بقاء سلولها می‏شد. به این علت و همانطور که در نمودار1- ب مشخص است تعداد سلولهای GFP+ که با این حجم از استوک ویروسی تیمار شده بودند به مراتب کمتر از تعداد سلولهایی بودند که حجم‏های پائین تر ویروس را دریافت کرده بودند. به این ترتیب روند افزایش سلولهای GFP+ با افزایش بیشتر غلظت ویروسی نه تنها متوقف شد بلکه در حضور یک پنجم از استوک ویروسی معکوس گردید: تعداد سلولهای HEK و LMH که GFP+بودند بترتیب به 2 ± 36 و 2 ±26 کاهش پیدا کرد و این کاهش از نظر آماری برای هر دو رده سلولی بسیار معنی‏دار بود (P<0.01).

مقایسه سلولهای بین دو رده مختلف در هر 3 گروه از رقت‏های ویروسی (یعنی یک بیستم، یک دهم و یک پنجم) نیز نشانگر آن است که تعداد سلولهای GFP+ از رده HEK به مراتب بیشتر از رده LMH می‏باشد بطوریکه این تفاوت از نظر آماری در هر 3 گروه مزبور بسیار معنی‏دار بود (P<0.01) (نمودار 1- ب).

 


 

 

 

شکل 1: ترانسفکشن سلولهای LMH و HEK: تصویر فاز کنتراست و فلورسنت از سلولهای ترانسفکت شده. این تصاویر نمایانگر بیان ژن GFP در هر دو رده سلولی میباشد. بزرگنمایی: 100x

 

 

 

نمودار2: شمارش سلول های GFP+ در 48 و 72 ساعت پس از ترانسفکشن هر ستون نماینده متوسط تعداد سلولهای شمارش شده در 10 میدان میکروسکوپی میباشد که با استفاده از نرم افزار Grid Cell Counter و با پیروی از دستورالعمل موجود در وبسایت آن محاسبه گردید.  تفاوت آماری بین دو رده سلولی در هر مقطع زمانی با علامت (P <0.01)## و برای تفاوتهای آماری  بین 48 و 72 ساعت در داخل یک رده سلولی با علامت *** (P <0.001)

 


مقایسه ترانسداکشن سلول­هایHEK و LMH

با توجه به اینکه حجم های بالای استوک ویروسی، رشد سلولها را تحت تاثیر قرار داد ما برای ایجاد ترانسدوکشن حداکثری، سلولها را با یک دهم از استوک اولیه ویروسی (یعنی 50 میکرولیتر از کل 500 میکرولیتر) آلوده شدند. 72 ساعت و 96 ساعت بعد از آلوده کردن سلول‏ها با ویروس نو ترکیب این سلول‏ها در زیر میکروسکوپ بررسی و برای آنالیز و محاسبه میزان بیان از بخشهای مختلف چاهک کشت سلول عکسبرداری شد (شکل 2). بدین منظور حداقل 10 میدان میکروسکوپی مشخص برای هر نمونه چاهک مورد بررسی قرار گرفت. نمودار 3 درصد سلولهای مثبت را در این بررسی نشان می‏دهد. بر این اساس، در72 ساعت میزان سلولهای HEK و LMH به ترتیب  4 ± 87 درصد و 3 ± 41 درصد و در 96 ساعت به ترتیب  2 ± 97 درصد و 5 ± 58 درصد بوده است. آنالیز آماری این داده ها نشان داد که تفاوت بسیار معنی داری بین دو رده سلولی در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن وجود دارد (P<0.001).


 

 

 

شکل 2: ترانسدوکشن سلولهای HEK و LMH : تصویر فاز کنتراست و فلورسنت از سلولهای آلوده شده با ویروس. این تصاویر نمایانگر بیان ژن GFP در هر دو رده سلولی میباشد. بزرگنمایی: 100x

 

 

 

نمودار3: شمارش سلولهای GFP+ در 48 و 72 ساعت پس از ترانسدوکشن. سلولها با رقت یک دهم  از استوک اولیه ویروسی آلوده شدند. هر ستون نماینده متوسط تعداد سلولهای شمارش شده در 10 میدان میکروسکوپی میباشد که با استفاده از نرم افزار Grid Cell Counter و با پیروی از دستورالعمل موجود در وبسایت آن محاسبه گردید.  تفاوت آماری بین دو رده سلولی در هر مقطع زمانی با علامت  *** (P <0.001)و برای تفاوتهای آماری  بین 72 و 96 ساعت در داخل یک رده سلولی با علامت(P <0.01) ##نشان داده شده است.

 

 


مقایسه شدت بیان GFP در سلول­های رده HEK-293T و LMH

شکل 3 تصاویر میکروسکوپی سلولها پس از ترانسدوکشن و نیز دیاگرام حاصل از آنالیز آنها با ImageJ را نشان می‏دهد. مطابق آنچه در بخش روشها گفته شد تصاویر فلورسنتی از 9 چاهک از رده سلولی آنالیز شد و نشان داد که متوسط شدت بیان در رده HEK 3 ± 74 درصد و در رده LMH  7 ± 89 درصد می‏باشد. آنالیز آماری این داده‏ها نشان داد که سلولهای LMH نسبت به سلولهای HEK قادرند پروتئین ترانسژن را در سطح نسبتا بالاتری بیان نمایند و این اختلاف شدت بیان بین دو رده سلولی معنی‏دار می‏باشد(P<0.05) (نمودار4).

 

 

 

شکل3: شدت بیان در سلولهای HEK پس از ترانسدوکش: این تصاویر سلولی 72 ساعت پس از ترانسدوکشن با رقت یک دهم از استوک ویروسی با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت تهیه شده اند (بزرگنمایی: 100x. سپس با قرار دادن تصاویر در نرم افزار  ImageJ کل فیلد هر تصویر انتخاب شده و میزان Pixelهای موجود که نمایانگر شدت بیان میباشد محاسبه گردید که حاصل آن بصورت دیاگرام نشان داده می‏شود.

 

 

 

 

نمودار4: آنالیز میزان فلورسنت ناشی از بیان GFP توسط سلولهای HEK و LMH 72 ساعت پس از ترانسدوکشن ویروسی. هر ستون نماینده متوسط شدت بیان حاصل از 9 میدان میکروسکوپی (یک میدان فراگیر از هر چاهک) میباشد  که با آنالیز آماری داده های شکل 4-الف و 4-ب بدست آمد. تفاوتهای آماری بین دو رده سلولی با علامت * (P <0.05) مشخص شده است.

 

بحث

در این مطالعه، پتانسیل سلولهای کبدی جوجه را در جذب DNA خارجی، در پذیرفتن لنتی ویروس نوترکیب و الحاق و بیان ترانسژن آن بررسی شد. سلولهای انسانی HEK بعنوان سلولهای استاندارد برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب با منشاء HIV-1 بطور وسیع بکار برده می‏شود. در مقایسه با آنها، سلولهای LMH توانایی ضعیف تری برای ترانسفکت شدن و نیز آلودگی با لنتی ویروس را نشان دادند. در عین حال تعداد بیشتری از سلولهای LMH را نسبت به مرحله ترانسفکشن بیان کردند. جالب آنکه شدت بیان در سلولهای LMH نسبت به سلولهای HEK در هر مرحله بیشتر بود. نهایتا ما توانستیم قدرت سلولهای جوجه را در تولید و بسته بندی لنتی ویروسهای نوترکیب به اثبات برسانیم.

سلولهای HEK-293T با برخورداری از آنتی ژن T متعلق به ویروس SV40 و در نتیجه مهار فعالیت پروتئین ضد توموری pRb  (24)  از توانایی بالایی برای بیان اجزاء ویروسی و بسته بندی ویروس‏های کامل برخور می‏باشند. بنابراین سلولهای مزبور به سهولت ژنهای خارجی را جذب می‏کنند و درصد بالای سلولهای GFP+ در بین جمعیت HEK نسبت به جمعیت LMH غیر منتظره نیست بخصوص که سازه‏های لنتی ویروسی از ویروس انسانی HIV-1 منشاء می‏گیرند.

عوامل مختلفی مانند نوع و سلامت سلول، نحوه رشد و پاساژ سلولی، کمیت و کیفیت DNA پلاسمیدی مورد استفاده، ترکیبات مورد استفاده برای ترانسفکشن، و نهایتا تیتر ویروسی و اندازه توالی ترانسژن در جذب و الحاق ترانسژن در ژنوم سلول هدف موثر می‏باشد. نتایج آزمایشات ما در مراحل ابتدائی ترانسفکشن نشان می‏دهد که قابلیت ترانسفکشن سلول‏های LMH حدود463% سلول‏های استاندارد HEK می‏باشد که البته این نسبت در 72 ساعت بعد به 50 درصد کاهش پیدا کرد. یکی از دلایل مهم قابلیت ترانسفکشن پایین سلول‏های LMH می‏تواند کوچکتر بودن اندازه این سلول‏ها باشد به طوری که اندازه این سلول‏ها حدود یک سوم سلول‏های HEK است که این موضوع می‏تواند باعث تماس کمتر سطح سلول با رسوبات  DNA – فسفات کلسیم شده و ورود سازه ژنی به داخل سیتوپلاسم سلول کمتر گردد. این در حالیست که سلول‏های HEK علاوه بر اندازه بزرگتر و رشد سریعتر، دارای چسبندگی زیادی بوده و سلول در حالت چسبیده به کف فلاسک پهن شده و دارای سطح تماس زیادی می‏باشند که این موضوع می‏تواند باعث افزایش ورود سازه‏های ژنی طی مکانیسم فاگوسیتوزی به درون سلول باشد. سلول های LMH تمایل زیادی به گروه بندی در کف فلاسک و پلیت کشت دارند و به دست آوردن یک کشت یکنواخت از سلول های LMH بسیار دشوار می‏باشد. بدین علت تجمع غیر همگون این سلول‏ها در نواحی مختلف فلاسک و پلیت می‏تواند کارائی ترانسفکشن را نسبت به سلول‏های HEK کاهش دهد. از سوی دیگر قابلیت ترانسدوکشن سلولها با ویروسهای نوترکیب، در کنار ویژگیهای خود سلول و نوع پروموتر بکار رفته به عواملی همچون نوع ویروس، ساختار پوششی آن و نحوه ترانسدوکشن بستگی دارد. نتایج بدست آمده در سطح ترانسدوکشن نشان می‏دهد که از نظر تعداد سلولهای GFP+، سلول‏های LMH حدود 58 درصد  قابلیت ترانسدوکشن داشته و ژن هدف با این نسبت وارد ژنوم سلول‏ها شده است. این نسبت برای سلول‏های HEK حدود 96 درصد بود. قابلیت ترانسداکشن سلول‏های LMH نسبت به سلول های HEK293T حدود 60 درصد برآورد شد. با انجام مطالعات بیشتر با پروموترهای مختلف، ترکیبات شیمیایی مثل پولی برن و غیره میزان ترانسدوکشن را بالا می‏برد. بنابراین می‏توان درصد مزبور را بالاتر برد تا میزان بیان نیز افزایش یابد.  

آزمایشات ما همچنین نشان داد که با وجود قابلیت پائین تر سلولهای LMH در جذب DNA خارجی، شدت بیان ترانسژن در این سلولها به مراتب بیشتر از شدت بیان در سلولهای HEK بوده است. تاکنون هیچگونه مطالعه‏ای راجع به شدت بیان ترانسژن در سلولهای LMH و مکانیسمهای درون سلولی و مولکولی آن گزارش نشده است. بنابراین جوانب مختلف این موضوع از دیدگاه سلولی و مولکولی قابل بررسی است. از جمله تفاوتهای دو رده سلولی در تنظیم بیان ژن و فاکتورهای رونویسی موجود بایستی مطالعه و روشن شود. با این وصف، شاید بالا بودن شدت بیان بتواند ضعف این سلولها در جذب DNA خارجی را جبران نماید. به این ترتیب فزونی شدت بیان با اهداف متعددی از نظر استفاده از سلولهای جوجه و بخصوص تخم مرغ بعنوان بیوراکتور هم راستا خواهد بود.

 

نتیجه گیری

در مجموع مطالعه حاضر قابلیت ترانسفکشن و ترانسدوکشن ویروسی دو رده سلولی HEK و LMH را با همدیگر مقایسه کرده است. نتایج حاصله نشان می‏دهد که قدرت جذب سلولهای LMH نسبت به سلولهای HEK در جذب DNA خارجی بطور معنی‏دار پایین می‏باشد. در عین حال سلولهای LMH از توانایی بالایی در بیان ژنهای خارجی برخور دارند، موضوعی که بایستی در سطح مولکولی بررسی گردد. نتایج ما می‏تواند در انتقال ژن به سلولهای جوجه با اهداف مختلف تشخیصی و تولیدی در کنار مطالعات بنیادی موثر واقع شود.

 

تشکر و قدردانی

از همکاری تکنیکی آقای یاسین پناهی و خانم سحر شجاعی سپاسگزاری می‏شود.

 


 

 

1. Rhodes MB, Azari PR, Feeney RE. Analysis, fractionation and purification of egg white proteins with cellulose-cation exchanger. J Biol Chem. 1958; 230(1): 399-408.

2. Guérin-Dubiard C, Pasco M, Hietanen A, Quiros del Bosque A, Nau F, Croguennec T. Hen egg white fractionation by ion-exchange chromatography. Chromatogr A. 2005; 1090(1-20):58-67.

3. Tankrathok A, Daduang S, Patramanon R, Araki T, et al. Purification process for the preparation and characterizations of hen egg white ovalbumin, lysozyme, ovotransferrin, and ovomucoid. Prep Biochem Biotechnol. 2009; 39(4):380-99.

4. Houdebine LM. Transgenic animal models in biomedical research. Methods Mol Biol. 2007; 360:163-202. Review.

5. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009; 32(2):107-21.

6. Lonberg N. Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol. 2005; 23(9):1117-25. Review.

7. Goldman IL, Kadulin SG, Razin SV. Transgenic animals in medicine: integration and expression of foreign genes, theoretical and applied aspects. Med Sci Monit. 2004; 10(11):RA274-85.

8. Harvey AJ, Speksnijder G, Baugh LR, Morris JA, et al. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high-throughput screening procedures. Poult Sci. 2002a; 81(2):202-12.

9. Harvey AJ, Speksnijder G, Baugh LR, Morris JA, et al.  Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens. Nat Biotechnol. 2002b; 20(4):396-9.

10. Lillico SG, McGrew MJ, Sherman A, Sang HM. Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs. Drug Discov Today. 2005; 10(3):191-6.

11. Raju TS, Briggs JB, Borge SM, Jones AJ. Species-specific variation in glycosylation of IgG: evidence for the species-specific sialylation and branch-specific galactosylation and importance for engineering recombinant glycoprotein therapeutics. Glycobiology. 2000; 10(5):477-86.

12. Harvey AJ, Ivarie R. Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white. Poult Sci. 2003; 82(6):927-30.

13. Twyman RM. Gene Transfer to Animal Cells (Advanced Methods). UK. BIOS Scientific Publishers. 2005; 28-41.

14. Houdebine LM. The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression . J Biotechnol. 2002; 98 (2-3): 145-160.

15. Blomer U., Ganser  A and Scherr  M. Invasive drug delivery. Adv Exp Med Biol. 2002; 513: 431-451.

16. Kawaguchi T, Nomura K, Hirayama Y, Kitagawa T. Established and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH. Cancer Res. 1987; 47: 4460-4.

17. Binder R, MacDonald CC, Burch JB, Lazier CB, et al. Expression of endogenous and transfected apolipoprotein II and vitellogenin II genes in an estrogen responsive chicken liver cell line. Mol Endocrinol. 1990; 4: 201 -208.

18. Sensel MG, Binder R, Lazier CB, Williams DL. Reactivation of apolipoprotein II gene transcription by cycloheximide reveals two steps in the deactivation of estrogen receptor-mediated transcription. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 1733-1742.

19. Pluta K, Luce ML, Bao L, Agha-Mohammadi S, Reiser J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 2005; 7:803–817.

20. Gardaneh M, Gholami M and Maghsoudi M. Synergy between glutathione peroxidase-1 and astrocytic growth Factors suppresses free radical generation and protects dopaminergic neurons against 6-hydroxydopamine. Rejuven Res. 2011; Jan 11. [Epub ahead of print]

21. [Rahimi A, Gardaneh M, Alipakah M, Panahi Y. Recombinant lentivirus-mediated gene transfer into chickenliver cell line LMH. Modares Biological Science and Technology. 2010; 1: 53-60]. Persian.

23. http://rsbweb.nih.gov/ij 

24. Graham FL, Smiley J. Russel WC, Nairn R; Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol. 1977; 36 (1): 59-72.