تاثیر ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 روی فرایند گلیوزیس در ساقه مغز رت های مبتلا به انسفالومیلیت آلرژیک تجربی– مدل حیوانی مالتی پل اسکلروزیس

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: با توجه به نقش ویتامین  B12در تنظیم واکنشهای ایمنی در این مطالعه به عنوان یک عامل کمکی همراه با زهر زنبور عسل برای کاهش التهاب استفاده شد. این مطالعه برای بررسی اثر زهر زنبور عسل و ویتامین B12 روی التهاب و گلیوزیز در رتهای همراه با  انسفالومیلیت آلرژیک انجام پذیرفت.
مواد و روش‏ها: ترکیب هموژنه نخاع خوکچه هندی به همراه ادجوانت کامل فروند برای القاء انسفالومیلیت در رت‏های لویس جهت ایجاد یک مدل از بیماری مالتی پل اسکلروزیز استفاده شد. بیماری در 40 رت القاء شد و آنها به طور تصادفی در 4 گروه قرار گرفتند و با زهر زنبورعسل و ویتامین B12 درمان شدند. درمان از روز بعد از القاء بیماری به وسیله GPSCH آغاز وبه مدت 10 روز طول کشید. روش ایمنو هیستوشیمی برای بررسی پروتئین اسیدی رشته‏ای گلیالی و از روش الایزا برای بررسی میزان تومور نکروزیز فاکتور- آلفا در سرم رت‏ها استفاده شد.
نتایج : درمان با زهر زنبور عسل  و ویتامین B12، نشانه‏های بد کلینیکی، سطح سرمی تومور نکروزیز فاکتور - آلفا و فرایند گلیوزیس در رتهای لویس القاء شده با ترکیب نخاع تازه خوکچه هندی را کاهش داد.
نتیجه گیری: ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 به خاطر ممانعت از فعالیت‏های سلول‏های T خود واکنشگر، دارای خاصیت ضد التهابی بوده و آسیب به سیستم عصب مرکزی و گلیوزیز را کاهش می‏دهد.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                          مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                            جلد 1، شماره 2، زمستان 1389، 45-37

 

تاثیر ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 روی فرایند گلیوزیس در ساقه مغز رت های مبتلا به

انسفالومیلیت آلرژیک تجربیمدل حیوانی مالتی پل اسکلروزیس

 

اکبر کریمی دانشجوی Ph.D.1*، کاظم پریور Ph.D.1، محمد نبیونی Ph.D.2،

سعید حقیقی Ph.D. 3، سهراب ایمانیPh.D.4

 

1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران

2- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه تربیت معلم تهران

3- دانشکده داروسازی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم دارویی

4- گروه سم شناسی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: Karimiakbar38@yahoo.com

 

تاریخ دریافت: 7/12/ 1389                               تاریخ پذیرش: 21/1/1390

 


چکیده

هدف: با توجه به نقش ویتامین  B12در تنظیم واکنشهای ایمنی در این مطالعه به عنوان یک عامل کمکی همراه با زهر زنبور عسل برای کاهش التهاب استفاده شد. این مطالعه برای بررسی اثر زهر زنبور عسل و ویتامین B12 روی التهاب و گلیوزیز در رتهای همراه با  انسفالومیلیت آلرژیک انجام پذیرفت.

مواد و روش‏ها: ترکیب هموژنه نخاع خوکچه هندی به همراه ادجوانت کامل فروند برای القاء انسفالومیلیت در رت‏های لویس جهت ایجاد یک مدل از بیماری مالتی پل اسکلروزیز استفاده شد. بیماری در 40 رت القاء شد و آنها به طور تصادفی در 4 گروه قرار گرفتند و با زهر زنبورعسل و ویتامین B12 درمان شدند. درمان از روز بعد از القاء بیماری به وسیله GPSCH آغاز وبه مدت 10 روز طول کشید. روش ایمنو هیستوشیمی برای بررسی پروتئین اسیدی رشته‏ای گلیالی و از روش الایزا برای بررسی میزان تومور نکروزیز فاکتور- آلفا در سرم رت‏ها استفاده شد.

نتایج : درمان با زهر زنبور عسل  و ویتامین B12، نشانه‏های بد کلینیکی، سطح سرمی تومور نکروزیز فاکتور - آلفا و فرایند گلیوزیس در رتهای لویس القاء شده با ترکیب نخاع تازه خوکچه هندی را کاهش داد.

نتیجه گیری: ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 به خاطر ممانعت از فعالیت‏های سلول‏های T خود واکنشگر، دارای خاصیت ضد التهابی بوده و آسیب به سیستم عصب مرکزی و گلیوزیز را کاهش می‏دهد.

کلمات کلیدی: زهر زنبور عسل، انسفالومیلیت آلرژیک تجربی، گلیوزیس، مالتی پل اسکلروزیس، ویتامین B12

 

 

 


مقدمه

مالتی پل اسکلروزیس (MS)یک بیماری التهابی مزمن می‏باشد که در آن ماده سفید سیستم عصبی مرکزی توسط سلولهای التهابی وT فعال شده مورد هدف قرار می‏گیرد و با نشانه‏هائی شامل: التهاب، میلین زدایی و از بین رفتن اعمال نورولوژیک و افزایش فعالیت آستروسیت ها (گلیوزیس) مشخص می‏شود (1). انسفالومیلیت آلرژیک تجربی(EAE)  بعنوان یک مدل حیوانی با ارزش برای بیماری  MSدر نظر گرفته می‏شود و دانشمندان از آن جهت ارزیابی روند بیماری و فرایند درمانی استفاده می‏کنند (2). EAE در حیوانات توسط  تزریق بافت سیستم عصب مرکزی و یا برخی از پروتئین‏های ویژه میلین  گونه جانوری دیگر مثل، Myelin Basic Protein (MBP) و یا oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) Myelin همراه با ادجوانت ایجاد می‏شود. در EAE  نشانه‏هایی شامل فلج، التهاب، نواحی میلین زدایی شده در ماده سفید سیستم عصبی مرکزی، آسیب به سد خونی– مغزی، نفوذ سلولهای T (CD4+) و ماکروفاژها به سیستم عصبی مرکزی وگلیوزیس دیده می‏شود (3). میکروگلیاها و آستروسیتها نقش خود را در ایجاد بیماری با ترشح کردن ملکولهایی به عنوان واسطه‏های تخریب کننده بافتی انجام می‏دهند (4).

در بررسی بیماری MS و مدل حیوانی آن یعنی EAE بیومارکرهایی را در نظر می‏گیرند. یکی از این بیومارکرها پروتئین اسیدی رشته‏ای گلیالی(GFAP) می‏باشد که به عنوان مارکر آستروسیتها بوده و برای ارزیابی یکی از وقایع بیماری که همانا روند گلیوزیس می‏باشد استفاده می‏شود (5). آستروسیتها و میکروگلیاها در سیستم عصب مرکزی بعد از EAE و MS فعال شده و گلیوزیس بوجود می‏آید و فرایند التهاب در این زمینه نقش بسیار مهمی ایفا می‏کند(6).

زهر زنبور عسل (Apis melifera ) شامل انواع متفاوتی از پپتیدها با وزن ملکولی سبک و سنگین و پروتئینهایی شامل آپامین، آدولاپین، فسفو لیپاز A2 می‏باشد. بعلاوه اینکه شامل آمین‏های فعال بیولوژی (هیستامین، اپی نفرین) و چندین نوع ترکیب غیر پپتیدی مشتمل بر لیپیدها، کربوهیدراتها و اسید‏های آمینه آزاد می‏باشد(7). ملیتین و فسفولیپاز A2 دو ترکیب عمده زهر زنبور عسل می‏باشند که عمدتا نقش مهمی در القاء و شروع واکنشهای آلرژیک مرتبط با نیش زنبور ایفا می‏کنند (8). زهر زنبور درمانی به طور گسترده‏ای در درمان بیماریهای ضد التهابی مزمن موثر است(9). همچنین ویژگیهای ضد التهابی کل زهر زنبور عسل در مدل رت دارای آرتریت القاء شده، گزارش شده است و در آن دیده شده است که تزریق زهر زنبور عسل موجب سرکوب لوکوسیت‏ها و کاهش غلظت تومور نکروزیز فاکتور-آلفا (TNF-a) می‏شود(7).

التهاب مزمن اغلب با استرس‏های اکسیداتیو همراه بوده و زمینه ساز بسیاری از بیماریهای وابسته به سن شامل سرطان، آترواسکلروزیس، بیماریهای همراه با تخریب سیستم عصبی و آرتریت می‏باشد مشاهدات جدید پیشنهاد می‏کند که کوبالامین‏ها (مشتقات ویتامین B12 ) ممکن است پاسخ‏های استرس اکسیداتیو را مدوله کند. بیماریهای التهابی با افزایش سطوح ترانس کوبالامین‏ها همراه هستند. غلظت کوبالامین‏ها سطوحTNF-a  را در مایع مغزی نخاعی مدوله می‏کند. TNF-a در پاسخ‏های التهابی مهم می‏باشند و پیشنهاد شده که افزایش کوبالامین می‏تواند به عنوان مکمل در پاسخ‏های سلولی به التهاب، مورد استفاده قرار گیرد(10). فعالیتهای میلین زدایی و التهابی در بیماران MS با احیای مجدد میلین همراه است و به مصرف ویتامین B12 می‏انجامد(11).

از آنجایی که در طی EAE و ادامه روند التهاب، فعالیت آستروسیت‏ها و نهایتا گلیوزیس افزایش پیدا می‏کند ما در این مطالعه از خاصیت ضد التهابی زهر زنبور عسل و ویتامین B12 استفاده کرده و اثرات آن را روی فعالیت آستروسیت‏ها و روند گلیوزیس بررسی نمودیم تا ببینیم که این ترکیب درمانی تا چه اندازه می‏تواند جلوی یکی از مهمترین وقایع بیماری زایی EAE را بگیرد تا در آینده از آن به عنوان ترکیب درمانی جهت درمان MS  استفاده شود.

 

مواد و روش ها

در این مطالعه تجربی جهت ایجاد مدل EAE ازروش Schnider وهمکارانش(12) استفاده شد. برای این منظور پس از تهیه ترکیب هموژنه نخاع خوکچه هندی (GPSCH) آن را به نسبت 1به 1 با ادجوانت کامل فروند (CFA) مخلوط کرده تا امولوسیونی از نخاع خوکچه هندی و ادجوانت کامل فروند (GPSCH-CFA) تهیه شد. با تزریق آن به رت‏های لوئیس EAE در آنها القا گردید.

رت‏های لوئیس استفاده شده خالص بوده و در مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی شرکت کارخانجات دارو پخش تهران نگهداری می‏شدند. حیوانات دسترسی آزادانه به            آب و غذا داشته و کلیه شرایط نگهداری آنها استاندارد             و مطابق با کتاب راهنمای نگهداری و مراقبت و              استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انتشار یافته توسط     (National Academy Press Washington , D.C , 1996 ) بود.

 

دارو درمانی: EAE در 40 رت القاء شد و سپس به صورت تصادفی در 4 گروه 10 تایی به شرح ذیل تقسیم شدند:

گروه 1: تحت عنوان گروه E-S نامگذاری شدند و روزانه نرمال سالین را به صورت داخل صفاقی دریافت می‏کردند.

گروه 2: تحت عنوان E-B12 نامگذاری شدند و یک روز در میان ویتامین B12  را به میزان mg/kg 15دریافت می‏کردند(13) .

گروه 3: تحت عنوان E-BV نام گرفتند و روزانه زهر زنبور عسل را به میزان mg/kg 2 از طریق داخل صفاق دریافت می‏کردند (14).

گروه 4: با نام E-BB بودند  که هر روز زهر زنبور عسل را به میزان  mg/kg2و ویتامین B12 را یک روز در میان به میزان mg / kg 15 از طریق داخل صفاقی دریافت می‏کردند.

درمان‏ها از روز اول بعد از تزریق GPSH –CFA آغاز شد و تا روز دهم به طول انجامید.

 

ارزیابی‏های کلینیکی EAE: روز تزریق ترکیب           GPSH –CFA به عنوان روز صفر بعد از تزریق (0dpi) در نظر گرفته شد. رت‏ها به طور روزانه جهت بررسی علائم و نشانه‏های کلینیکی و تغییرات وزن بدن مورد ارزیابی قرار گرفتند. ارزیابی‏ها تا 19dpi  به طول انجامید و در هر روز بر اساس درجه‏بندی ذیل امتیاز بندی شدند:

صفر: نرمال و بدون نشانه‏های کلینیکی، یک: دم فاقد کشیدگی طبیعی باشد، دو: فلج دم، سه: فلج جزئی در اندام حرکتی عقبی، چهار: فلج کامل در اندام حرکتی عقبی، پنج: فلج کامل اندام حرکتی عقبی و فلج جزئی در اندام حرکتی فوقانی، شش: مرگ و میر.

 

اندازه گیری پارامترهای سرمی: درروز (dpi14) نمونه خون از آنها گرفته شد. سپس سرم آنها را جدا کرده و میزان TNF-α در سرم رت‏ها از طریق روش الایزا و با استفاده ازکیت مخصوص تعیین  TNF-aدر سرم رت ساخت شرکت (Abcam) اندازه گیری شد.

 

بررسی‏های ایمنو هیستوشیمیایی برای ارزیابی فعالیت آستروسیت‏ها: در  dpi19 پس از بیهوش کردن رت‏ها مغز آنها خارج کرده و به دقت ساقه مغز جدا شد و سپس به مدت 24 ساعت در محلول فیکساتیو نگهداری شدند. با استفاده از میکرتوم برشهای 5 میکرومتری از بافت تهیه شد و فرایندهای پارافین زدایی و به آبدهی در مورد آنها اجرا شد. برای باز آرایی آنتی ژنی، برش‏ها داخل بافر Tris-EDTA قرار داده و به مایکروویو 850 W منتقل شدند. سپس برشها با آب سرد جاری شستشو داده و در ادامه با محلول TBS شستشو شدند. برای متوقف کردن فعالیت Endogenous peroxidase از محلول بلاکر شامل H2O2 1 درصد در متانل استفاده شد. در ادامه        برش‏ها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد با Rabbit anti –Rat GFAP  ساخت شرکت (Abcam) به عنوان آنتی بادی اولیه، انکوبه شدند. سپس لام ا با TBSشستشو و سپس با HRP anti-rabbits IgG (Abcam) به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. برای pvisualization از تکنیک استانداردDiaminobenzidine (DAB) استفاده شد. برای نمونه‏های کنترل هم تمامی روش فوق بدون کاربرد آنتی بادی اولیه اجرا شد. از هرگروه 5 برش به طور تصادفی انتخاب و تعداد سلولهای GFAP مثبت در هر برش به صورت تصادفی در زمینه‏هایی با بزرگ نمایی بالا (×400) توسط فردی که اطلاعی از گروهای درمانی نداشت، مورد شمارش قرار گرفت(15).

 

روشهای آماری: تمام تستها با استفاده از نرم افزار SPSS و با روش Mann Whitney U-test  به لحاظ آماری مورد بررسی قرار گرفت. P<0.05 به عنوان سطح معنی‏دار بودن داده‏ها در نظر گرفته شد.

 

نتایج

تاثیر ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین  B12 روی تحرک و شرایط کلینیکی رت‏های EAE:

 

بعد از تزریق امولوسیون GPSCH-CFA  به رت‏ها، برخی از آنها در گروه‏‏های مختلف، از  9dpiنشانه‏هایی مثل کاهش فعالیت‏های جستجویی، کاهش رفتارهای تغذیه‏ای و کاهش وزن بدن را بروز دادند. در روز 11dpi علائمی همانند از دست دادن کشیدگی دم، فلج جزئی در ناحیه دم در گروههای  E-S و E-B12  دیده شد و این در حالی بود که این نشانه‏ها در گروهE-BV از 12dpi و در گروه E-BB از روز 13dpi مشاهده شد. نشانه‏های یاد شده به تدریج بیشتر و بیشتر شده و در نهایت به بروز فلج کامل در اندام تحتانی منجر گردید. این نشانه‏ها در گروه  E-S باشدت بیشتر دیده شد. (نمودار1).

با توجه به این نمودار دیده می‏شود که میانگین شدت بیماری در گروه‏های تحت درمان نسبت به گروه  E-S کاهش پیدا کرده است. میانگین شدت بیماری در گروه‏های E-BB و E-BV نسبت به گروه   E-S به صورت معنی‏داری کاهش یافته بود(p<0.05). نتایج نشان می‏دهند که ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین  B12 به صورت معنی‏داری می‏توانند نشانه‏های سخت کلینیکی را در رت‏های EAE کاهش دهند.

 

تاثیر ترکیب درمانی روی سطح سرمی TNF-a:

میزان TNF-a در سرم رت‏ها در گروه‏های مختلف با روش الیزا اندازه گیری شد. نتایج آن به صورت خلاصه در شکل (1) نشان داده شده است. میزان  TNF-aدر گروه‏هایی که تحت درمان قرار گرفته بودند نسبت به گروه E-S کاهش پیدا کرده بود و این روند کاهشی در گروه‏های  E-BBو E-BV به صورت معنی‏داری (p<0.05) مشهود بود.

این نتایج نشان می‏دهد که ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 توانسته است به صورت معنی‏داری(p<0.05) میزان    TNF-a را در سرم رت‏هایEAE  کاهش دهد.

 

تاثیر ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 روی فعالیت آستروسیت‏ها:

تاثیر ترکیب درمانی روی فعالیت آستروسیت‏ها با روش ایمینو هیستوشیمی روی برش‏های بافت مغزی با هدف قرار دادن مارکر GFAP  (بعنوان شاخص عملکرد آستروسیت‏ها) انجام گرفت. سلولهای GFAP مثبت و تفاوت در تعداد آنها در گروه‏های مختلف در شکل(2) نشان داده شده است. نتایج حاصل از شمارش سلولهای GFAP  مثبت در برش‏های ساقه مغزی به صورت خلاصه در شکل (3) آمده است. تعداد سلولهای GFAP مثبت در گروه E-S به صورت قابل توجهی افزایش یافته بود. کاهش تعداد سلولهای GFAP مثبت در گروه E-BB نسبت به گروه E-S در ناحیه ساقه مغزی به صورت معنی‏داری کاهش یافته بود (p<0.05) این روند کاهشی در گروه E-B12  دیده شد ولی معنی‏دار نبود.

نتایج نشان می‏دهد که ترکیب درمانی زهر زنبور عسل و ویتامین B12 موجب کاهش تعداد سلولهای GFAP و در نهایت موجب کاهش فعالیت آستروسیتها وگلیوزیس در رت‏های EAE  می‏شود.

 

 

نمودار1: نمودار تغییرات شدت بیماری در روزهای مختلف بعد از واکسینه کردن با نخاع خوکچه هندی در گروههای تحت درمان. همانطور که در شکل دیده می شود در گروهی که هر دوی زهر زنبور و ویتامین B12 را دریافت کرده اند شدت علائم کلینیکی یافته است، هرچند که این کاهش علائم کلینیکی در سایر گروههای تحت درمان هم دیده می شود ولی روند آن در گروه E-BB معنی دار تر ((p< 0.05 است.

 

 

شکل 1: سطوح TNF- در سرم رت ها در گروههای مختلف بیشترین مقدار TNF-α و نیترات در سرم مربوط به گروه  E-S وکمترین آنها مربوط به گروه E-BB می باشدP<0.05)*(. کاهش سطوح یاد شده در مقایسه با گروه E-S را نشان می دهد.

 

 

 

شکل 2: سلولهایGFAP مثبت در ساقه مغز در گروههای مختلف

برشهایی از ساقه مغز که با روش ایمنوهیستوشیمی با هدف تعیین آستروسیت ها و مارکر GFAP رنگ آمیزی شده است

A-گروه E-S (گروهی که مبتلا به EAE بوده وفقط نرمال سالین به عنوان درمان دریافت می کردند) روند گلیوزیس در این گروه از سایرین بیشتر است. B- گروه E-B12 (گروهی که مبتلا به EAE بوده و ویتامین B12 رادریافت کرده اند). C- گروه E-BV (گروهی که مبتلا به EAE بوده و زهر زنبور رادریافت کرده اند). D- گروه E-BB (گروهی که مبتلا به EAE بوده و زهر زنبور و ویتامین  B12را دریافت کرده اند.

 

 

شکل 3: تعداد سلولهای GFAP مثبت در ساقه مغز رتها در گروههای مختلف نحوه شما رش سلولهای GFAP مثبت درقسمت مواد و روشها آمده استP<0.05)*.( کاهش سلولهای GFAP مثبت را در مقایسه با گروه E-S نشان می‏دهد.

 

 

بحث

کاربرد پزشکی محصولات زنبور عسل از زمان‏های قدیم مورد استفاده قرار گرفته است و امروزه زهر زنبور عسل به طور گسترده‏ای در درمان آرتریت و دیگر بیماریهای التهابی، خود ایمنی و تخریب کننده مورد استفاده قرار می‏گیرد (16) . زهر زنبور عسل اثرات ضد التهابی و ضد دردی روی واکنش‏های التهابی دارد. زهر زنبور عسل شامل انواعی از پپتیدها، آنزیم‏ها و آمین‏های فعال و ترکیبات دیگر است که به عنوان عوامل کمکی در بهبودی MS می‏تواند موثر باشد. برای مثال ملیتین سوبسترای اصلی زهر زنبور عسل، یکی از قوی‏ترین عوامل شناخته شده ضد التهابی می‏باشد و همچنین آدولاپین یک سوبسترای ضد التهابی قوی دیگر است که فعالیت سیکلو اکسیژنازی را مهار می‏کند (14) .گزارش شده است که زهر زنبور عسل از تولید اینترلوکین 1ß (IL-1ß) و TNF-α از ماکروفاژها در رت‏ها در پاسخ به تحریک داخلی با لیپو پلی ساکارید باکتریایی ممانعت بعمل می‏آورد (17). ترکیبات آلرژیکی اولیه زهر زنبور عسل مثل هیستامین و فسفولیپاز A2 ، تولید اینترلوکین -10( IL-10 ) را به وسیله سلولهای Th2 القاء کرده و تکثیر سلولهای  Tرا سرکوب می‏کند و می‏تواند در کاهش التهاب و نهایتا کاهش میلین زدایی نقش داشته  باشد(18). با توجه به مطالعات انجام گرفته درمورد تاثیرات زهر زنبور عسل روی بیماریهای التهابی و خود ایمنی و خواص و ترکیبات ضد التهابی و تعدیل کنندگی ایمنی آنها، انتظار آن می‏رفت که در مطالعه خود این اثرات را مشاهده نماییم. با توجه به نتایج بدست آمده در زمینه‏های علائم کلینیکی، سطح سرمی TNF-a، انتظارات ما برآورده شد و مشاهده نمودیم که ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12، این علائم را کاهش داده است(7و14). علاوه بر تأثیرات ضد التهابی واکنش اکسیدانی زهر زنبور عسل که در مطالعات مختلف دیده شده و در بالا نیز به آنها اشاره شده است می‏توان از نقش کمکی ویتامین B12 هم یاد کرد خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی ویتامین B12، احتمالاً نتیجه‏ای از یک ترکیب اثرات مستقیم و غیر مستقیم است این تأثیرات شامل تحریک فعالیت میتونین سنتتاز، واکنش مستقیم با اکسیژن reactive، گونه‏های نیتروژن، تأثیر در ذخیره جزئی گلوتاتیون و تعدیل کردن ملکولهای پیام رسان می‏باشد. می‏توان گفت که کوبالامینها دارای فعالیتهای آنتی اکسیدانی شاخص در جایگاههای فارماکولوژی بوده و موجب حفاظتهای سلولی مهم علیه استرسهای اکسیداتیو و التهاب می‏شوند(10). TNF-α و اینترفرون گاما از جمله سیتوکین‏های پس التهابی هستند که عمدتا به توسط سلولهای T خود ایمنی ترشح شده و مستقیما سد خونی– مغزی را تخریب کرده و آپوپتوزیس اولیگودندروسیت‏ها را القاء می‏کند و عاملی در جهت میلین زدایی محسوب می‏شود(19). در رت‏های مدل EAE سطح سرمی TNF-α در شروع بیماری، تنظیم افزایشی پیدا نمود، که بیانگر آن است که TNF-α نقش مهمی در شروع وگسترش بیماری دارد (12). با توجه به نقش TNF-α در گسترش بیماری و حالات EAE   و هدف درمانی آن، در این مطالعه نیز به اندازه گیری آن در سرم رتهای مدل EAE واقع در گروههای مختلف پرداخته شد و که مشاهده شد که میزان آن در گروهی که درمانی را دریافت نکرده بودند افزایش یافت. این نتایج Shnider  و همکارانش (12) و Pollak و همکارانش (20) مطابقت دارد. سطوح پلاسمایی TNF-α با شدت و سختی EAE و بیماری MS ارتباط داشته و بیانگر حالات ایمنی است.

در مطالعه حاضر سطح سرمی  TNF-aدر گروهی که هر دو ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 را در یافت کرده بودند کاهش یافت که موافق با نتایج کار Nam و همکارانش(21) می‏باشد. این تحقیق اعلام نمود که زهر زنبور عسل می‏تواند از تولید سیتوکین‏های پس التهابی مانند TNF-α ممانعت بعمل آورد. مطالعات از اهمیت اثرات ایمنی ویتامین B12 حمایت می‏کند این اثرات شامل مدوله کردن فعالیت سیتو کین TNF-α می‏باشد(11) .

ما در مطالعه خود مشاهده نمودیم  که رت‏های مبتلا به EAE دارای افزایش میزان GFAP در ساقه مغز خود بودند و این نتایج موافق با مطالعه Nylen و همکارانش(22) ‏اشد، چرا که افزایش بیان GFAP ممکن است در ارتباط با صدمه مغزی و گلیوزیس باشد و GFAP مارکری است که با وسعت آسیب مغزی مرتبط است.

GFAP عضوی از خانواده اسکلت سلولی محسوب می‏شود و در فرایندهای حرکتی آستروسیتی و شکلی آن، با ایجاد ساختارهای تثبیتی شرکت می‏کند. در سیستم اعصاب مرکزی مهره داران عالی در پی جراحت و صدمات ناشی از تروما، بیماریها، اختلالات ژنتیکی و تاثیرات شیمیایی، آستروسیت ها باز فعال شده و حالت آستروگلیوزیس را بوجود می‏آورند. در آستروگلیوزیس سنتز سریع GFAP را شاهد هستیم (23).

مطالعه حاضر نشان داد که ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامین B12 منجر به کاهش بیان GFAP (به عنوان مارکر آستروسیتها) شده است که این نتایج درمانی با نتایج کار Wang و همکارانش (15) مخالف است. وی در بررسی خود اعلام کرده بود که ماده Idazoxan باعث کاهش GFAP در رت‏های مبتلا به EAE می‏شود این پدیده را می‏توان این گونه توجیه کرد که اعمال بیولوژیکی آستروسیتها هم در فرایندهای محافظتی و هم در فرایندهای تخریبی می‏تواند نمود داشته باشد.

نقش GFAP در توسعه حالات  EAEو درمان آن پیچیده است به خاطر آنکه آستروسیت‏ها در فعالیتهای چند گانه‏ای شامل تنظیم جریان گلوتامات، فعالیت سیکلو اکسیژناز -2  (COX-2 ) و فعالیت سنتز و تولید نیتریک اکساید ( NO ) و همینطور تولید سیتوکین‏های ضد التهابی و پس التهابی و فاکتورهای ترو فیک دخالت دارد(15). در موشهایی که فاقد بیان GFAPهستند گزارش شده است که بیشتر مستعد گسترش بیماری EAE هستند و با علائم شامل نفوذ بیشتر سلولهای التهابی به سیستم عصب مرکزی مشخص می‏شوند(24). نتایج حاصل از کار ما با نتایج حاصل از کار Mastronardi و همکارانش (13) موافق است. وی در مطالعه‏اش نشان داد که ترکیب اینتر فرون بتا و ویتامین B12 منجر به کاهش بیانGFAP  در مدلهای  EAE  می‏شود. یک مکانیزم ممکن برای این قضیه شاید متیلاسیون نواحی پروموتر ژنها باشد که به  سبب آن اثر شان غیر فعال می‏شود. برای  مثال ژن  GFAPتوسط متیلاسیون کاستهای CPG در پروموترهایش تنظیم شده است.

 

نتیجه گیری

ترکیب زهر زنبور عسل و ویتامیین B12 باعث کاهش شرایط سخت کلینیکی، سطح سرمی TNF-a و گلیوزیس در رت‏های مبتلا به EAE می‏شود و این تاثیرات در راستای خواص ضد التهابی زهر زنبور عسل و در کنار آن ویتامین B12 می‏باشد که با تعدیل کردن سیستم ایمنی وجلوگیری از تکثیر سلولهای T خود واکنشگر باعث تخریب کمتر بافت سیستم عصب مرکزی شده و در نهایت فرآیند گلیوزیس که یکی از مهمترین نتایج تخریب است، با شدت کمتری بروز می‏کند.

 

تشکر و قدردانی

از مدیر عامل محترم شرکت کارخانجات دارو پخش، جناب آقای دکتر ناصر نقدی و جناب آقای دکتر سعید حقیقی معاونت  محترم کنترل کیفیت به دلیل فراهم نمودن شرایط کار و همکاری با انجام این مطالعه در شرکت کارخانجات داروپخش صمیمانه قدردانی می‏شود.

 


 

 

1. Blakemore WF. Regeneration review repair in MS: the view of experimental pathology. J  Neurological Sci. 2007; 125:1-4.

2. Hedreul MT, Gillett A, Olsson T, Jagodic M, et al. Characterization of multiple sclerosis candidate gene expression kinetics in rat experimental autoimmune encephalomyelitis. J of       Neuroimmunol. 2009; 210, 30-39.

3. Ferguson C, Sarlieve LI, Vincendon G. Multiple sclerosis: review of Main experimental data and pathogenic hypotheses. Rev. Med. Intern. 1990; 11, 201 – 208.

4. Miller A, Shapiro S, Gershtein R, Kinarty A, et al. Treatment of multiple sclerosis with copolymer-1 (copaxone): implicating mechanisms of Th1 to Th2/Th3 immun- deviation. J Neuroimmunol. 1998; 92: 113-21.

5. Bielekova B, Martin R. Development of biomarkers in multiple sclerosis, Brain. 2004; 127, 1463-1478

6. Wu J, Ohlsson  M, WarnerE A, Loo KK, et al., Glial reaction and degeneration of myelinated processes in spinal cord gray matter in chronic experimental aoutoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 2008; 156, 586-596

7. Mirshafiey A. Venom therapy in multiple Sclerosis. Neuropharmacol. 2007; 53, 353 – 361.

8. Kim HW, Kwon YB, Ham TW, Roh DH, et al. Acupoint Stimulation using bee venom attenuates formalin- induced pain behavior and spinal cord fos expression in rats. J. Vet. Med. Sci. 2003; 65, 349 – 355.

9. Han SM, Lee KG, Yeo JH, Kweon HY, et al. Effect of honey bee Venom on Microglial cells nitric oxide and tumor necrosis factor –α production stimulated by LPS. J. of Enthno- pharmacol. 2007; 111, 176 – 181.

10.  Birch CS, Brasch NE, McCaddon A, Williams JHH. A novel role for vitamin B12; Cobalamins are intracellular antioxidant in vitro,  Free Radical Biology and Medicine. 2009; 47; 184-188.

11. Miller JW. Vitamin B12 deficiency, tumor necrosis factor-alpha, and epidermal growth factor: a novel function for vitamin B12 ? Nutr Rev. 2002; 60, 142-4.

12. Schnider C, Shuetz G, Zollner TM. Acute neuroinflammation in Lewis rats – A model for acute multiple sclerosis relapses. J.of Neuroimmunol. 2009; 213, 84-90.

13. Mastronardi FG, Min W, Wang H, Winer S, et al. Attenuation of experimental autoimmune encephalomyelitis and nonimmune demyelination by IFN-beta plus vitamin B12: treatment to modify notch-1/sonic hedgehog balance. J Immunol. 2004; 172: 6418-26.

14. Son DJ, Lee JW, Lee YH, Song HS, et al. Therapeutic application of anti-arthritis, pain –releasing, and anti-cancer effects of bee venom and its constituent compounds.  Pharmacol. & Therap. 2007; 115, 246-270.

15. Wang XS, Chen YY, Shang XF, Zhu ZG, et al. Idazoxan attenuates spinal cord injury by enhanced astrocytic activation and reduced microglial activation in rat experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res. 2009; 1253: 198–209.

16. Kang SS, Pak SC, Choi SH. The effect of whole bee venom on arthritis. Am. J. Clin. Med. 2002; 30, 73-80. 

17. Kwon YB, Lee HJ, Han HJ, Mar WC, et al. The water – soluble Fraction of bee venom produces antinociceptive and anti – inflammatory effects on rheumatoid arthritis in rats. Life Sci. 2002; 71, 191 – 204. 

18. Jutel M, Akdis M, Blaser K. Are regulatory T cells the target at venom immunotherapy?. Curr opin Allergy Clin Immunol. 2005; 5, 365 – 369.

19. Akassoglu K, Bauer G, Kassiatis. Oligodendrocyte apoptosis and  primary demyelination induced by local TNF/P55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: models for multiple sclerosis with primary oligodenrogliopathy. Am. J. Path. 1998; 153, 801-813.

20. Pollak Y, Ovadia H, Orion E, Weidenfeld J, et al. The EAE-associated behavioral syndrome: I Temporal correlation with inflammatory mediators. J. of Neuroimmunol. 2003; 137, 94-99.

21. Nam KW, Je KH, Lee JH, Han HJ, et al. Inhibition of cox-2 activity and proinflammatory cytokines (TNF-alpha and IL-1beta) production by water – soluble sub – fractionated parts fron bee (Apis Mellifera) venom. Arch. Pharm. Res. 2003; 26, 383 – 388.

22. Nylen K, Csajbok LZ, Ost M, Rashid A, et al. Serum glial fibrillary acidic protein is related to focal brain injury and outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. 2007; Stroke 38, 1489–1494.

23. Eng LF, Chirnikar RS, Lee YL,  Glial Fibrillary acidic protein: GFAP–Thirty–one Years. Neurochem.Res. 2000; 25: 1439–1451.   

24. Liedtke W, Edelmann W, Chiu FC, Kucherlapati R,et al. Experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking glial fibrillary acidic protein is characterized by a more severe clinical course and an infiltrative central nervous system lesion. Am. J. Pathol. 1998; 152, 251–259.