بررسی اثرات سمی ذرات خروجی خودروهای دیزل بر برخی از فاکتورهای رشد و پاسخهای سلولی (تولید پروتئین) در بذر و دانه گرده گیاه لوبیا

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: آلودگی هوا یکی از معضلات جهانی است که اثرات سوء بر موجودات زنده دارد. هدف از این پژوهش بررسی اثر بخش محلول در آب ذرات خروجی خودروهای دیزل(DEP) بر برخی از فاکتورهای رشد و الگوی پروتئینی لوبیا بود.
مواد و روش‏ها: گیاهان لوبیا در شرایط آزمایشگاهی کشت و روزانه با 30 میلی لیتر از غلظت‌های مختلف DEP (1/0، 3/0  و 6/0 گرم بر لیتر) تیمار و گیاهان شاهد با آب مقطر اسپری شدند. عوامل رشد از قبیل وزن خشک بخش هوایی، وزن تر بخش هوایی، طول نیام، وزن خشک نیام، درصد جوانه زنی و سطح برگی اندازه‏گیری و در گیاهان تحت تیمار و شاهد با استفاده از نرم افزار SPSS و آنالیز واریانس مقایسه گردید. پروتئین‏های بذر و دانه گرده با روش الکتروفورز مطالعه شد.
نتایج: تیمار با DEP  سبب کاهش وزن ‏تر شد (05/0p≤)، اما در سایر فاکتورها (طول نیام، وزن خشک نیام و بخش هوایی و همچنین درصد جوانه زنی بذر و سطح برگی) فقط در گروه تیمار شده با  محلول 6/0 گرم بر لیتر  DEP کاهش معنی دار مشاهده گردید. الگوی باند‏های پروتئینی بذر آنها مشابه بود اما در نمونه‏های تحت تیمار با غلظت 6/0 گرم بر لیتر افزایش تراکم در باند با وزن مولکولی 62 کیلو دالتون دیده ‏شد. در نیمرخ پروتئینی دانه‏های گرده گیاهان تحت تیمار با  6/0 گرم بر لیتر، یک باند با وزن 55 کیلو دالتون ناپدید شد و باند جدیدی با وزن kDa 80 پدیدار شده گشت.
نتیجه گیری: با توجه به اثرات سوء گزارش شده برای DEP، به نظر می‏رسد گیاهان از مقاومت نسبی برخوردار هستند که می‏تواند مربوط به تغییرات در الگوی پروتئینی و مکانیسم‏های سلولی مرتبط با مقابله با اثرات سمی ذرات DEP و سم‏ زدایی آنها باشد.
 
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                            مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                                 جلد 2، شماره 1، بهار 1390، 66-57

 

بررسی اثرات سمی ذرات خروجی خودروهای دیزل بر برخی از فاکتورهای رشد و پاسخهای سلولی (تولید پروتئین)

در بذر و دانه گرده گیاه لوبیا

 

عبدالکریم چهرگانی  Ph.D.1*، فریبا محسن زاده Ph.D.1، شیوا حسینی روزبهانی M.Sc.2

 

1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه بوعلی سینا، همدان

2- دانشجوی کارشناسی ارشد گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بروجرد

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: chehregani@basu.ac.ir

 

تاریخ دریافت: 13/2/1390                               تاریخ پذیرش: 26/5/1390

 


چکیده

هدف: آلودگی هوا یکی از معضلات جهانی است که اثرات سوء بر موجودات زنده دارد. هدف از این پژوهش بررسی اثر بخش محلول در آب ذرات خروجی خودروهای دیزل(DEP) بر برخی از فاکتورهای رشد و الگوی پروتئینی لوبیا بود.

مواد و روش‏ها: گیاهان لوبیا در شرایط آزمایشگاهی کشت و روزانه با 30 میلی لیتر از غلظت­های مختلف DEP (1/0، 3/0  و 6/0 گرم بر لیتر) تیمار و گیاهان شاهد با آب مقطر اسپری شدند. عوامل رشد از قبیل وزن خشک بخش هوایی، وزن تر بخش هوایی، طول نیام، وزن خشک نیام، درصد جوانه زنی و سطح برگی اندازه‏گیری و در گیاهان تحت تیمار و شاهد با استفاده از نرم افزار SPSS و آنالیز واریانس مقایسه گردید. پروتئین‏های بذر و دانه گرده با روش الکتروفورز مطالعه شد.

نتایج: تیمار با DEP  سبب کاهش وزن ‏تر شد (05/0p≤)، اما در سایر فاکتورها (طول نیام، وزن خشک نیام و بخش هوایی و همچنین درصد جوانه زنی بذر و سطح برگی) فقط در گروه تیمار شده با  محلول 6/0 گرم بر لیتر  DEP کاهش معنی دار مشاهده گردید. الگوی باند‏های پروتئینی بذر آنها مشابه بود اما در نمونه‏های تحت تیمار با غلظت 6/0 گرم بر لیتر افزایش تراکم در باند با وزن مولکولی 62 کیلو دالتون دیده ‏شد. در نیمرخ پروتئینی دانه‏های گرده گیاهان تحت تیمار با  6/0 گرم بر لیتر، یک باند با وزن 55 کیلو دالتون ناپدید شد و باند جدیدی با وزن kDa 80 پدیدار شده گشت.

نتیجه گیری: با توجه به اثرات سوء گزارش شده برای DEP، به نظر می‏رسد گیاهان از مقاومت نسبی برخوردار هستند که می‏تواند مربوط به تغییرات در الگوی پروتئینی و مکانیسم‏های سلولی مرتبط با مقابله با اثرات سمی ذرات DEP و سم‏ زدایی آنها باشد.

واژگان کلیدی: آلودگی هوا، فاکتورهای رشد، پروتئین، لوبیا

 

 

 

 


مقدمه

یکی از مسائلی که امروزه بسیار مورد توجه قرار گرفته بحث آلاینده‏های زیست محیطی می‏باشد. بر اساس گزارش کمیسیون آلودگی آکادمی ملی علوم ایالت متحده آمریکا در سال 1966، آلودگی دگرگونی نامطلوب در خصوصیات فیزیکی، شیمیایی و زیستی هوا، آب و خاک است که می‏تواند آثار زیان بخشی بر زندگی انسان، گیاهان و حیوانات، وضع زندگی و میراث فرهنگی داشته باشد (1).  امروزه آلاینده‏های هوا به خصوص ذرات خروجی خودروهای دیزل نگرانی بزرگی به حساب می‏آیند و این ذرات یکی از مهمترین عوامل آلاینده هوا می‏باشند. ذرات خروجی خودروهای دیزل  Diesel Exhaust Particles (DEP) شامل گازها، بخارات، فلزات و ترکیبات شیمیایی مختلفی می‏باشد. آلاینده‏های موجود در این ذرات شامل هیدروکربن‏های آروماتیک از جمله فنانترن، نفتالن، بنزن و پیرن، گازهایی چون دی اکسید کربن، منوکسید کربن، اکسید نیتروﮊن، دی اکسید نیتروﮊن و دی اکسید گوگرد و فلزاتی چون نیکل، سرب، کادمیوم، جیوه و آرسنیک می‏باشد. اندازه ذرات خروجی خودروهای دیزل 01/0 میکرون تا 10 میکرون می‏باشد. این ذرات بسیار ریز بوده و دارای هسته کربنی هستند و سایر ترکیبات تشکیل دهنده دور این هسته کربنی تجمع یافته‏اند (2).

تحقیقات نشان داده است که ذرات خروجی از خودروهای دیزل دارای اثراتی چون آلرژی زایی، التهاب مجاری تنفسی، سرطان زایی و جهش زایی می‏باشند (3). براساس مطالعات صورت گرفته، ذرات خروجی از خودروهای دیزل در بیماری‏های تنفسی و آلرژی نقش داشته و یا موجب تشدید آلرژی‏زایی دانه‏های گرده گیاهان می‏شوند (4 ،5). ذرات خروجی خودروهای دیزل می‏توانند دانه‏های گرده در حال نمو را از طریق ایجاد تنش در روی خود گیاه و یا پس از انتشار در هوا تحت تاثیر قرار دهند (6). برخی پژوهش‏ها نشان داده که آلودگی هوا می‏تواند موجب القای شکستن پروتئین‏های گرده‏ای و یا موجب ساخت پروتئین‏های جدید شود که نقش سم زدایی دارند (9-7 ،5). افزایش مقدار پروتئین در گیاهان مناطق آلوده نیز گزارش شده است (11، 10). احتمال می‏رود ترکیبات موجود در DEP از قبیل کینون و ساختارهای نیتروآروماتیک بتوانند از طریق تولید سوپراکسید و کاهش چرخه احیا, موجب شکست در DNA نیز شوند (2).

گزارش‏های متعددی در مورد اثر آلاینده­های مختلف هوا  از جمله DEP و محتویات آن بر فاکتورهای رشد و جوانه زنی گیاهانی نظیر Trifolium pretense L.، Lolium perenne L. و Brassica alba (L.) Boiss. (12)، گل جعفری و Spartium junceum L. (13) در دسترس است. کاهش رشد ریشه گیاهان تیمار شده با بنزو آلفا پیرون به عنوان یکی از اجزای DEP در کاهو گزارش شده است (14). کاهش برخی از شاخصه‏های رشد و اختلال در میکرواسپورزایی در      Spartium junceum L.  از تیره Fabaceae  نیز گزارش شده است (15).

مطالعات مرجع شناختی ما نشان داد که گزارشی در مورد اثرات بخش محلول در آب ذرات DEP به ویژه بر شاخصه‏های رشد و الگوی پروتئینی در دسترس نیست. هدف این پژوهش بررسی اثر سمی بخش محلول در آب ذرات DEP بر برخی از فاکتورهای رشد و الگوی پروتئینی در گیاهان است تا علاوه بر شناخت بیشتر اثرات سمی بخش محلول در آب ذرات DEP که پس از بارندگی در مناطق آلوده شهری و صنعتی، گیاهان را تحت تاثیر قرار می‏دهد، برخی از مکانیسم‏های احتمالی مقاومت به مسمومیت در گیاهان نیز شناسایی شوند.

 

مواد و روش‏ها

گیاه مورد مطالعه و تیمارها: گیاه مورد مطالعه در این پژوهش گیاه لوبیای زراعی Phaseolus vulgaris L. ، واریته تلاش به عنوان یک مدل بود. انتخاب گیاه فوق به دلیل سهولت کاشت و رشد، وسعت زیاد کشت و استفاده غذایی از آن است. بذر گیاه مورد استفاده در این پژوهش از موسسه تحقیقات جهاد کشاورزی همدان خریداری و در قطعات زمین مشابه و در گروه‏های مختلف (تیمار و شاهد) کاشته شد. خصوصیات خاک مورد استفاده 60 درصد رس، 30 درصد ماسه و 10 درصد کود حیوانی انتخاب گردید (16). به منظور بررسی اثر ذرات خروجی خودروهای دیزل بر فاکتورهای رشد و الگوی پروتینی لوبیا سه غلظت 1/0، 3/0 و  6/0 گرم بر لیتر از این ذرات در نظر گرفته شد. ذرات خروجی از خودروهای دیزل از سه دستگاه اتوبوس مرسدس بنز 302 واحد نقلیه دانشگاه، به صورت مخلوط جمع آوری گردید. ذرات در مقادیر غلظت‏های ذکر شد در آب دو بار استریل مخلوط شده به مدت 20 دقیقه در دستگاه اولتراسوند با قدرت 200 وات قرار داده شدند تا مخلوط همگن به دست آید و تا حد امکان ذرات خرد و حل شوند. مخلوط‏های تهیه شده به مدت 24 ساعت در شرایط آزمایشگاهی قرار داده شدند و سپس با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 4  صاف شده و بخش محلول در آب پس از صاف کردن، برای استفاده در تیمار به کار رفت. در هفته سوم رویشی و در واقع 20 روز قبل از گل‏دهی، تا شروع گل‏دهی نمونه‏ها تحت تیمارهای مختلف قرار گرفتند. نمونه‏های شاهد با آب مقطر و نمونه‏های تیمار با غلظت‏های مختلف 1/0 ، 3/0 و 6/0 گرم بر لیتر از ذرات خروجی خودروهای دیزل، روزانه دو بار (صبح و عصر) اسپری شدند. در هر بار تیمار هر گیاه به طور تقریبی و متوسط 30 میلی لیتر از محلول را دریافت کرد. به این منظور تعداد گیاهان هر قطعه کشت، شمارش شده و حجم محلول تیماری از رابطه تعداد نمونه × 30 میلی‏لیتر تهیه و سعی شد به طور یکنواخت بر روی گیاهان تیماری اسپری شد (17). تیمار نمونه‏ها تا مرحله شروع گل‏دهی ادامه یافت و دو بار در هر روز، گیاهان با محلول‏های فوق اسپری شدند. گیاهان شاهد و تیمار تا مرحله رشد کامل میوه و دانه تحت مراقبت بوده و پس از اتمام دوره گل‏دهی و تکمیل رشد، در سنجش برخی از فاکتورهای رشد مورد استفاده قرار گرفتند (16).

 

اندازه گیری فاکتورهای رشد:

اندازه گیری تغییرات رشد: برای بررسی تغییرات رشد، به طور تصادفی از هر گروه تیمار و شاهد، ده نمونه انتخاب و طول نیام (سانتی‏متر)، وزن خشک نیام (گرم) و همچنین وزن خشک بخش هوایی (بیوماس یا زی‏توده) (گرم)، وزن‏ تر بخش هوایی (گرم) و سطح برگ‏ها بر حسب سانتی‏متر مربع در گیاهان شاهد و تحت تیمار بعد از 20 روز اسپری کردن مقایسه گردید. برای اندازه‏گیری وزن خشک، بخش‏های هوایی گیاه را در آون 75 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت قرار داده و سپس نمونه‏ها توزین شده و گروه‏های تیماری و شاهد مورد بررسی مقایسه‏ای قرار گرفت (15) .

 

آزمون جوانه‏زنی: به منظور بررسی اثر ذرات خروجی خودروهای دیزل بر میزان جوانه زنی گیاهان تحت تیمار به صورت زیر عمل شد. تعداد 20 بذر لوبیای تهیه شده از گیاهان شاهد و تحت تیمار قبل از کشت به مدت 2 دقیقه در آب ژاول 10درصد استریل گشتند. جهت کشت از ظروف پتری شیشه‏ای استریل شده استفاده شد. سپس یک قطعه کاغذ صافی در هر ظرف پتری قرار داده شده و روی هر یک از آن‏ها 5 عدد بذر سالم و حتی الامکان یکنواخت قرار گرفت. به منظور مطالعات آماری برای هر گروه تیماری و شاهد 5 تکرار در نظر گرفته شد. در کلیه گروه‏ها، ظرف‏ها در ابتدا از آب مقطر پر شدند به طوری که سطح بذرها کاملا مرطوب شود. پس از تبخیر این میزان از آب، مجددا به صورت روزانه آب اسپری شد. میزان جوانه زنی در هر یک از گیاهان تیمار شده با گروه شاهد طی 8 روز مورد مقایسه قرار گرفت. معیار جوانه زنی، بیرون آمدن نوک ریشچه از پوسته دانه و رشد آن است، به طوری که طول آن معادل نصف طول بذر باشد (15).

 

بررسی‏های آماری: در تمام موارد فوق، میانگین داده‏ها با استفاده از نرم افزار SPSS محاسبه شد و آنالیز واریانس داده‏ها با روش ANOVA تجزیه و تحلیل شده و در نهایت نتیجه داده‏ها به صورت جدول ارائه گردید (5).

 

مطالعه پروتئین ها به روش الکتروفورز: برای استخراج پروتئین از بذرهای گیاهان شاهد و تحت تیمار، یک گرم از دانه گیاهان تحت تیمار و شاهد خوب خرد شد تا پودر یکنواختی به دست آید. پودر بذر به دست آمده از هر گروه تیماری به صورت جداگانه با نسبت یک به شش با بافر فسفات سدیم (7pH=) مخلوط گشت. به منظور جلوگیری از فعالیت آنزیم فنل اکسیداز و اثرات سوء آن در سنجش پروتئین و در نتیجه پایدار کردن پروتئین‏ها، از مقدار کمی پلی وینیل پیرولیدن (PVP) استفاده شد. سپس مخلوط حاصل به مدت 24 ساعت در یخچال قرار گرفت تا انحلال و آزاد سازی پروتئین‏ها صورت گیرد. مخلوط‏های فوق در سانتریفوژ یخچال‏دار به مدت 25 دقیقه با 13000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفوژ شد (5، 18). با پایان یافتن عمل سانتریفوژ، محلول شفاف رویی را جدا کرده و در ویال‏های کوچک استریل در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگهداری کردیم تا در مطالعه الکتروفورزی مورد استفاده قرار گیرد. عصاره پروتئینی استخراج شده به نسبت مساوی یک به یک با بافر نمونه مخلوط گردید. مخلوط حاصله در حمام آب گرم (95 درجه سانتی‏گراد) به مدت 3 دقیقه حرارت داده شد. ﮊل اکریل آمید 12 درصد تهیه شد و مقدار 10 میکرولیتر از هر نمونه در چاهک‏ها و در یکی از چاهک‏ها، مارکر پروتئینی تزریق شد. برای انجام الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز مینی ژل کمپانی Bio-Rad (USA) استفاده شد. الکتروفورز با ولتاژ ثابت 70 ولت انجام گرفت. پس از اتمام الکتروفورز با مخلوط اسید استیک و اتانول تثبیت گردید. پس از تثبیت پروتئین‏ها، ژل با آب مقطر شسته شده و به محلول رنگ منتقل شده و رنگ آمیزی با رنگ کوماسی بلو بریلیانت  R250 انجام گرفت (18). پس از چند مرحله رنگ بری ژل، با استفاده از اسکنر از آن عکس تهیه و تغییرات باندها مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت.

الکتروفورز پروتئین دانه‏های گرده, به روش مشابه انجام گرفت، با این تفاوت که به دلیل مقدار کم دانه‏های گرده، از هر گروه تیماری و شاهد مقدار 1/0 گرم دانه گرده انتخاب و با 6/0 گرم بافر استخراج در میکروتیوب مخلوط گردید. میکروتیوب‏ها به مدت 24 ساعت در یخچال نگهداری شدند و در این مدت چند بار با شیکر مخصوص لوله‏ها، هم زده شدند. بعد از آن بقیه مراحل مطابق با روش فوق (مورد بذر) انجام گرفت (5، 15).

 

نتایج

نتایج حاصل از آنالیز رشد

برخی از فاکتورهای رشد از قبیل وزن خشک بخش هوایی، وزن­تر بخش هوایی، وزن خشک نیام  و طول نیام در گروه‏های شاهد وتحت تیمار با ذرات خروجی از خودروهای دیزل مورد مطالعه  مقایسه‏ای قرار گرفتند. بررسی‏های به عمل آمده نشان داد که تیمار با ذرات خروجی از خودروهای دیزل در غلظت‏های (1/0، 3/0 و 6/0 گرم در لیتر) موجب کاهش وزن تر گیاهان تحت تیمار شده است (جدول 1). در گیاهان گروه شاهد میانگین وزن تر 34 گرم به ازای هر بوته، در زمان اندازه گیری به دست آمد، در حالی که بیشترین کاهش در گروه تحت تیمار با 6/0 گرم بر لیتر با میانگین وزنی 23 گرم به ازای هر بوته گیاه مشاهده گردید. اختلاف بین گروه های شاهد و تیماری از نظر آماری در سطح احتمال 05/0 P ≤ معنی‏دار بود.

اندازه گیری وزن خشک نمونه‏های مورد مطالعه نتایج دیگری در بر داشت. در گروه شاهد میانگین وزن خشک 5/4 گرم به دست آمد، در گروه‏های تیماری کاهش وزن خشک مشاهده گردید (جدول 1). بیشترین کاهش وزن خشک مربوط به گیاهان گروه تیمار شده با 6/0 گرم بر لیتر DEP بود که میانگین 4/3 گرم برای وزن هر بوته گیاه اندازه‏گیری گردید. بررسی نشان داد که اختلاف بین گروه شاهد و گروه تیماری با 6/0 گرم بر لیتر DEP از نظر آماری در سطح احتمال  05/0P≤  معنی‏دار ولی با سایر گروه‏های تیماری معنی‏دار نبود.

بررسی طول نیام نشان داد که در گروه شاهد میانگین طول نیام 13 سانتی‏متر بود، در گروه‏های تیماری کاهش نسبی میانگین طول نیام مشاهده گردید (جدول 1). بیشترین کاهش میانگین طول نیام مربوط به گیاهان گروه تیمار شده با 6/0 گرم بر لیتر DEP بود که 10 سانتی‏متر اندازه‏گیری گردید. بررسی نشان داد که اختلاف میانگین طول نیام بین گروه‏های شاهد و دو گروه اول تیماری از نظر آماری در سطح احتمال 05/0P ≤ معنی‏دار نیست و فقط در گروه تیمار شده با  محلول 6/0 گرم بر لیتر  DEP تغییر معنی‏دار مشاهده شد.

بررسی وزن خشک نیام نشان داد که در گروه شاهد میانگین طول نیام 4/2 گرم بود، در گروه‏های تیماری کاهش نسبی وزن خشک نیام مشاهده گردید (جدول 1). بیشترین کاهش وزن خشک نیام مربوط به گیاهان گروه تیمار شده با 6/0 گرم بر لیتر DEP بود که 05/2 گرم اندازه‏گیری گردید. بررسی نشان داد که اختلاف میانگین وزن خشک نیام بین گروه‏های شاهد و تیماری از نظر آماری در سطح احتمال 05/0P ≤ معنی‏دار نبود و فقط در گروه تیمار شده با  محلول 6/0 گرم بر لیتر  DEP تغییر معنی‏دار مشاهده شد.

اندازه‏گیری سطح برگی نیز نتایج مشابهی را نشان داد. بررسی سطح برگ در گروه‏های تحت تیمار با ذرات خروجی از خودروهای دیزل و شاهد نشان داد که در گروه شاهد میانگین سطح برگی 5/2 سانتی‏متر مربع بود، در گروه‏های تیماری, کاهش نسبی سطح برگ مشاهده گردید (جدول 1). بیشترین کاهش سطح برگ مربوط به گیاهان گروه تیمار شده با 6/0 گرم بر لیتر DEP بود که 8/1 سانتی‏متر مربع اندازه‏گیری گردید. بررسی نشان داد که اختلاف میانگین سطح برگ بین گروه‏های شاهد و تیماری از نظر آماری در سطح احتمال 05/0P ≤  معنی‏دار نبود و فقط در گروه تیمار شده با محلول 6/0 گرم بر لیتر DEP تغییر معنی‏دار مشاهده شد.

بررسی درصد جوانه زنی دانه‏ها در گروه‏های تحت تیمار با مقادیر مختلف ذرات خروجی خودروهای دیزل و شاهد نشان داد که در بذرهای گروه شاهد میانگین در صد جوانه زنی 88 درصد بود، در بذرهای تهیه شده از گروه‏های تیماری کاهش درصد جوانه‏زنی مشاهده گردید (جدول 1). بیشترین کاهش درصد جوانه‏زنی مربوط به گیاهان گروه تیمار شده با 6/0 گرم  بر لیتر DEP بود که 58 درصد اندازه‏گیری گردید. بررسی نشان داد که اختلاف میانگین درصد جوانه زنی بین گروه تیمار شده با غلظت 6/0 گرم بر لیتر DEP با گروه شاهد از نظر آماری معنی‏دار است (P≤0.01).


 

جدول 1: جدول آنالیز واریانس اثر غلظت‏های مختلف بخش محلول در آب ذرات خروجی خودروهای دیزل (1/0، 3/0 و 6/0 گرم بر لیتر) بر وزن تر و خشک بخش هوایی (گرم در هر بوته گیاه)، طول نیام (cm)، وزن خشک نیام (گرم در هر نیام)، سطح برگ (cm2) و در صد جوانه‏زنی در لوبیای 60 روزه.

گروه­های تیماری

وزن بخش هوایی (گرم)

نیام

سطح برگ

(cm2)

درصد جوانه زنی

تر

خشک

طول (cm)

وزن خشک (گرم)

شاهد

5/3±34

5/0 ± 5/4

8/0±13

4/2 ± 2/0

5/2 ± 2/0

88 ± 6

تیمار 1/0

2/2 ±27 *

ns± 3/4  4/0

ns12 ± 8/0

ns3/2  ± 2/0

ns4/2 ± 3/0

ns 82 ± 4

تیمار 3/0

*25 ± 4/2

ns2/4  ± 6/0

ns6/0±13

ns2/2 ± 4/0

ns3/2 ± 2/0

ns 79 ± 4

تیمار 6/0

8/1±23*

4/3* ± 3/0

10* ± 5/0

05/2* ± 1/0

8/1* ± 1/0

58** ± 3

 


نتایج مطالعه الگوی پروتئینی بذر و دانه گرده

بذرهای تولید شده توسط گیاهان شاهد و تحت تیمار با غلظت‏های مختلف ذرات خروجی خودروهای دیزل، از نظر الگوی باندهای پروتئینی مورد بررسی قرار گرفتند. پس از تهیه عصاره پروتئینی بذرهای گیاهان شاهد وتحت تیمار، الکتروفورز به روش -PAGE  SDSانجام شد. نتایج نشان داد الگوی باندهای پروتئینی بذرها قابل رویت شده، و تعداد آن در کلیه گروه‏های تیماری و شاهد شبیه هم بود. تنها تفاوت قابل مشاهده در نمونه‏های تحت تیمار، افزایش تراکم در یکی از باندهای پروتئینی با وزن مولکولی 62 کیلو دالتون بود. (شکل 1).

 نیمرخ پروتئینی دانه‏های گرده گیاهان تحت تیمار با ذرات خروجی خودروهای دیزل و گیاهان شاهد مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد که در دو گروه تیماری که تحت تاثیر ذرات خروجی خودروهای دیزل با غلظت 1/0 و 3/0 گرم بر لیتر قرار داشتند، نیمرخ پروتئینی تفاوت محسوسی نداشت. اما در گیاهانی که با غلظت 6/0 گرم بر لیتر ذرات خروجی خودروهای دیزل تحت تیمار قرار داشتند، تفاوت شاخصی ملاحظه گردید. در این گروه تیماری یک باند پروتئینی با وزن ملکولی 55 کیلو دالتون ناپدید و در عوض باند جدیدی با وزن ملکولی 80 کیلو دالتون پدیدار گردید (شکل 2) .   

 

شکل1: نیمرخ پروتئین‏های بذر گیاه لوبیا در گروه‏های تیماری و شاهد: M  مارکر پروتئینی 1- گروه شاهد، 2-گروه گیاهان تیمار شده با غلظت 1/0 گرم در لیتر، 3- گروه گیاهان تیمار شده با غلظت 3/0 گرم در لیتر، 4- گروه گیاهان تیمار شده با غلظت 6/0 گرم در لیتر ذرات خروجی خودروهای دیزل. افزایش تراکم و کمیت باند 62 کیلودالتون از اثرات تیماری است.

 

 

شکل 2: نیمرخ پروتئینی دانه‏های گرده در گیاهان شاهد و تحت تیمار ذرات خروجی خودروهای دیزل. M  مارکر پروتئینی، C گروه شاهد، 1/0، 3/0 و 6/0  گروه‏های تیماری با غلظت‏های مختلف DEP. ناپدید شدن باند 55 کیلو دالتون و تشکیل باند جدید 80 کیلو دالتونی از اثرات تیمار با DEP است.

 

 

بحث

در حال حاضر آلودگی هوا به یک معضل جهانی تبدیل شده است. ذرات خروجی از خودروهای دیزل یکی از عمده ترین آلاینده‏های هوا هستند که مشکل عمده‏ای در بسیاری از کشورها به ویژه کشورهای در حال توسعه محسوب می‏شود (5، 10، 19).  آلودگی هوا با ذرات خروجی خودروهای دیزل موجب آسیب به موجودات زنده، انسان و اندام‏های گیاهی می‏شود (14-12). هدف پژوهش حاضر یافتن برخی اثرات DEP بر ویژگی‏های رشدی گیاهان و پاسخ‏های احتمالی سلولی است.

در پژوهش حاضر، پس از20 روز تیمار گیاهان با محلول‏های حاوی غلظت‏های مختلف ذرات خروجی خودروهای دیزل، وزن خشک بخش هوایی (زی توده) و وزن تر بخش هوایی در گیاهان شاهد و تحت تیمار مورد مقایسه قرار گرفت و نتایج نشان داد که تیمار با ذرات خروجی خودروهای دیزل موجب کاهش وزن تر بخش هوایی در کلیه تیمارها و کاهش وزن خشک هوایی در گروه تیماری با  غلظت 6/0 گرم بر لیتر DEP می‏شود که این کاهش و اختلاف بین گروه‏های تیماری و شاهد از نظر آماری معنی‏دار (05/0 P ≤)می‏باشد ( جدول 1). مفهوم این نتایج این است که ذرات DEP در اغلب غلظت‏های مورد استفاده موجب کاهش محتوای آب گیاه شده و به همین دلیل وزن تر کاهش معنی‏داری را نشان می‏دهد، ولی فقط غلظت 6/0 گرم بر لیتر DEP است که مانع از رشد طبیعی و کامل گیاهان تحت تیمار بوده، برای آنها مسمومیت ایجاد نموده و موجب کاهش معنی دار وزن خشک نیز شده است که با برخی گزارش‏های پیشین در مورد تاثیر ذرات DEP برشاخصه‏های رشد همسو است (5،14،13،12، 20،21). همچنین گزارش‏های مشابهی در مورد تاثیر آلودگی هوا (13، 22) و باران اسیدی (23) بر وزن خشک گیاهان در دسترس است. از آنجاییکه مشخص شده گیاهان تحت تنش از استراتژی تمایز زودرس و سریعتر استفاده می‏کنند (23)، می‏توان نتایج فوق را این گونه تفسیر کرد که تمایز سریعتر در تیمار با آلاینده موجب تسریع در تمایز توام با ماده سازی سریعتر شده است و بنابر این با وجود تفاوت در وزن تر تفاوت در وزن خشک گروه‏های تیماری و شاهد به جز در یک مورد معنی‏دار نیست و در مورد اخیر (6/0 گرم در لیتر) شدت تیمار به حدی بوده که مسمومیت ایجاد کرده و مانع ماده سازی شده است.

یافته‏های ما نشان داد تیمار با اغلب غلظت‏های مورد استفاده ذرات خروجی خودروهای دیزل بر سایر ویژگی‏های رویشی و زایشی شامل وزن خشک نیام،  اندازه نیام و سطح برگی تاثیر مشهودی نداشت به طوری که در گروههای تحت تیمار با غلظت‏های 1/0 و 3/0 گرم بر لیتر DEP، در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنی‏داری در ویژگی های فوق الذکر مشاهده نگردید (05/0 P ≤ ) ( جدول 1) و فقط در گروه تیمار شده با غلظت 6/0 گرم بر لیتر DEP تفاوت معنی‏دار مشاهده گردید. می‏توان نتیجه گرفت که آلاینده مورد مطالعه در غلظت‏های کمتر از 6/0 گرم بر لیتر در حد آستانه مسمومیت برای گیاه لوبیا قرار ندارد. از آنجائی‏که گزارش شده غلظت‏های کمتری از آلاینده‏ها نیز موجب اثرات سوء در گیاهان از قبیل مهار متابولیسم (24)، مهار کلروپلاست (14) و عملکرد گیاهان مختلف (12) شده است، می‏توان نتیجه گرفت که گیاه لوبیا و واریته مورد مطالعه نسبت به آلودگی هوا و به ویژه ذرات DEP از مقاومت نسبی بالایی برخوردار است و فقط تیمار سنگین (6/0 گرم در لیتر) می‏تواند منجر به مسمومیت در آن گردد.

اندازه‏گیری درصد جوانه‏زنی بذر تهیه شده از گروههای تیماری و شاهد نشان داد که ذرات خروجی خودروهای دیزل موجب افت چشمگیر درصد جوانه زنی بذر در گروه تیمار شده با غلظت 6/0 گرم بر لیتر DEP شده است. به نظر می‏رسد رویش بذر و تکوین رویان درون آن از حساسیت بیشتری نسبت به آلودگی با ذرات DEP برخوردار است و به همین دلیل کاهش جوانه‏زنی در تیمار فوق چشمگیر تر و از نظر آماری معنی‏دار است (p≤0.01). مطالعات و پژوهش‏های قبلی نیز وجود دارد که نشان داده تکوین تخمک و رویان یک مرحله بحرانی از زندگی گیاه بوده و نسبت به آلاینده‏های زیست محیطی حساسیت بیشتری دارد و اگر چه تشکیل دانه‏ها را از نظر تعداد و اندازه تحت تاثیر قرار نمی‏دهد ولی موجب تشکیل دانه‏های ناهنجار و با قدرت رویش پایین می‏گردد (25، 26). یافته‏های قبلی ما(27) نیز نشان داده تکوین کیسه رویانی و تخمک در گیاه لوبیا از حساسیت بالایی نسبت به ذرات خروجی خودروهای دیزل برخوردار است  که فقط با مطالعات میکروسکپی قابل مطالعه و آشکارسازی است، اما در همین مورد نیز تیمار 6/0 گرم در لیتر از آستانه مسمومیت فراتر می‏رود.

بررسی الگوی باندهای پروتئینی بذر در گیاهان تحت تیمار  با غلظت‏های مختلف ذرات خروجی خودروهای دیزل و گیاهان شاهد نشان داد، که الگوی باندهای پروتئینی بذر در کلیه گروه‏ها (اعم از تیماری و شاهد) شبیه هم بودند و تفاوت محسوسی در تعداد و الگوی باندها مشاهده نگردید. تنها تفاوت مشاهده شده این است که در گروه  تحت تیمار با غلظت 6/0 گرم در لیتر, افزایش تراکم در یکی از باندها با وزن مولکولی 62 کیلو دالتون دیده شد (شکل 1). این اثر در کلیه تکرارهای آزمایش مشاهده گردید. یافته مشابهی در مورد اثر تیمارهای مشابه با باران اسیدی بر پروتئین‏های بذر لوبیا گزارش شده است (25). به نظر می‏رسد که پروتئین فوق در حفظ سلامت دانه در برابر اثرات سمی ذرات خروجی از خودروهای دیزل نقش مهمی دارد (5).

در گیاهان تحت تیمار با ذرات خروجی خودروهای دیزل و شاهد الگوی پروتئینی دانه‏های گرده نیز مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت. نتایج نشان داد که در دو گروه تیماری که تحت تاثیر ذرات خروجی خودروهای دیزل با غلظت 1/0 و 3/0 گرم بر لیتر قرار داشتند، نیمرخ پروتئینی تفاوت محسوسی نداشت. اما در گیاهان گروه تیماری که با غلظت 6/0 گرم بر لیتر ذرات خروجی خودروهای دیزل قرار داشتند، تفاوت شاخصی ملاحظه گردید. به این ترتیب که در این گروه تیماری، یک باند پروتئینی با وزن ملکولی 55 کیلو دالتون ناپدید و در عوض باند جدیدی با وزن ملکولی 80 کیلو دالتون پدیدار شد (شکل 2). به نظر می‏رسد در دو غلظت کمتر (1/0 و 3/0 گرم بر لیتر) ذرات خروجی خودروهای دیزل، اثر القایی ذرات فوق بر بیان ژن‏ها و تشکیل پروتئین‏های جدید کافی و موثر نیست، اما غلظت 6/0 گرم در لیتر توانسته اثر القایی خود را بر ژنوم اعمال و موجب تشکیل پروتئین جدیدی در دانه‏های گرده گردد. این یافته ما با برخی گزارشات قبلی در مورد اثرات ذرات DEP بر پروتئین های دانه گرده همسویی دارد (5)، ولی در تناقض با برخی از گزارش­ها در مورد دانه‏های گرده سایر گیاهان است (27). احتمالا این اختلاف مربوط به تفاوت در درجه حساسیت گونه‏های مختلف گیاهی نسبت به آلودگی است. از آنجائیکه بر اساس نتایج پژوهش حاضر می‏توان نتیجه گرفت که گیاه لوبیا، گیاه به نسبت مقاومی نسبت به آلاینده DEP است، می‏توان استنباط کرد که تغییرات پروتئینی مورد اشاره فقط در گونه‏های گیاهی مقاوم صورت می‏گیرد.

همانطور که در نتایج اثرات ذرات DEP بر فاکتورهای رشد دیده شد، ذرات DEP در تمام غلظت‏ها، فقط بر وزن تر اثر سوء نسبی داشته و آن را به طور معنی‏داری کاهش داده است. در مورد سایر فاکتورها (وزن خشک بخش هوایی، وزن خشک نیام، اندازه نیام، درصد جوانه‏زنی بذر و سطح برگی) اثر تیمار با کلیه غلظت‏های ذرات DEP محسوس و معنی‏دار نیست و فقط تیمار با 6/0 گرم بر لیتر اثر معنی دار دارد. با توجه به اثرات سوء متعدد گزارش شده برای DEP در انسان و جانوران (9-3) و با در نظر گرفتن تغییرات پروتئینی صورت گرفته در الگوی پروتئینی گیاهان تحت تیمار، به نظر می‏رسد که تشکیل پروتئین (پروتئین‏های) جدید و افزایش مقداری پروتئین‏ها به دلیل نقش ضد سمی این پروتئین‏ها است که باعث کاهش اثرات سوء و سمی ذرات DEP بر گیاهان تحت تیمار شده ­است. به عبارت دیگر گیاهان نسبت به جانوران از مقاومت بیشتری در برابر ذرات DEP از خود نشان می‏دهند. تغییر در الگوی کیفی پروتئینی و تشکیل باندهای جدید در گیاهان تحت تاثیر آلاینده‏های جوی در برخی پژوهش‏ها گزارش شده است (5، 7، 8، 28, 29)، و نشان داده شده که این پروتئین‏های جدید در پاسخ به اثرات تنشی آلاینده‏ها تولید می‏شوند و آنها دارای اثرات ضد سمی و مسمومیت زدایی هستند (26، 30). تیمار با دی بنزو α پیرون که یکی از اجزای تشکیل دهنده ذرات خروجی خودروهای دیزل است، نیز در دانه‏های گرده آفتاب گردان اثر مشابهی را دارد (17).

 

نتیجه‌گیری

همانطور که در نتایج اثرات ذرات DEP بر فاکتورهای رشد دیده شد، ذرات DEP در تمام غلظت‏ها، فقط بر وزن تر اثر سوء نسبی داشته و آن را به طور معنی‏داری کاهش داده است. در مورد سایر فاکتورها (وزن خشک بخش هوایی، وزن خشک نیام،  اندازه نیام، درصد جوانه‏زنی بذر و سطح برگی) اثر تیمار با کلیه غلظت‏های ذرات DEP محسوس و معنی‏دار نیست و فقط تیمار با 6/0 گرم بر لیتر اثر معنی‏دار دارد. با توجه به اثرات سوء متعدد گزارش شده برای DEP در انسان و جانوران (9-3) و  با در نظر گرفتن تغییرات پروتئینی صورت گرفته در الگوی پروتئینی گیاهان تحت تیمار، به نظر می‏رسد که تشکیل پروتئین (پروتئین‏های) جدید و افزایش مقداری پروتئین‏ها به دلیل نقش ضد سمی این پروتئین‏ها است که باعث کاهش اثرات سوء و سمی ذرات DEP بر گیاهان تحت تیمار شده است. به عبارت دیگر موجب می‏شود گیاهان (به ویژه گیاه مورد مطالعه) نسبت به جانوران از مقاومت بیشتری در برابر ذرات DEP از خود نشان دهند.

 

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر بر اساس بخشی از نتایج پایان نامه کارشناسی ارشد (شیوا حسینی) در رشته علوم گیاهی گرایش سلولی- تکوینی نگارش شده است و انجام این پژوهش در دانشگاه آزاد اسلامی واحد بروجرد و با حمایت مالی آن انجام بوده است. مولفین مراتب تقدیر و تشکر خود را از معاونت و مدیر محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد بروجرد برای تامین امکانات پژوهش حاضر اعلام می‏دارند.

1. Mirsa K. C. Plant Ecology. Oxford and Ibh, UK. 1974.

2. Kumagai Y, Koide S, Taguchi K, Endo A, et al. Oxidation of proximal protein sulfhydryls by phenanthraquinone, a component of diesel exhaust particles. Chem Res Toxicol. 2002; 15: 483- 489.

3. Behrendt H, Becker WM. Localization and release from pollen by air pollutants. J Int Arch Allergy Immunol. 2001;113: 69-474.

4. Pandya RJ, Solomon G, Kinner A, Balmes JR. Diesel exhausts particles and asthma: hypotheses and molecular mechanisms of action. Environ Health Perspect Suppl. 2002; 110: 103-112.

5. Chehregani A, Kouhkan F. Diesel Exhaust Particles and allergenicity of pollen grain of Lilium martagon. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2008; 69: 568-573.

6. Emberlin J. The effect of air pollution on allergic pollen. J Eur Respir Rev. 1998; 53: 164-167.

7. Chakraborty P, Gupta-Bhattacharya S, Chanda S. Comparative aerobiology, allergenicity and biochemistry of three palm pollen grains in Calcutta, Indian J. Aerobiology. 1996; 12: 47-50.

8. Chehregani A, Majde A, Gholami M, Shariatzadeh M, et al. Effect of air pollution on some cytogenetic characteristics, structure, viability and proteins of Zinnia elegans pollen grains. Pakistan J. Biological Science. 2004a; 7: 118-122.

9. Ruffin J, Williams D, Banerjee U, Pinnix K. The effect of some environmental gaseous pollutants on pollen-wall proteins of certain airborne pollen grains. J Grana. 1983; 22: 171-175.

10. Behrendt H, Becker WM, Friedrich KH, Ring J. Air pollution and allergy:  experimental studies on modulation of allergen release from pollen by air pollutants. J Int Arch Allergy and Immunology. 1997; 113: 69-74.

11. Chehregani A, Majde A, Moin M, Gholami M, et al. Increasing allergy potency of Zinnia pollen grains in polluted areas. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004b; 58: 267-272.

12. Sverdrup EL, Hagen BS, Krogh PH, et al. Benzo (α) pyrene shows low toxicity to three species of terrestrial plants, two soil invertebrates, and soil-nitrifying bacteria. Ecotoxicology and Environmental safety. 2007; 66: 362-368.

 

13. Majd A, Rezanejad F, Moin M, Aminzadeh M, et al. Air pollution effects on microsporogenesis, pollen development and pollen soluble in Spartium junceum L. (Fabaceae). Pajouhesh and Sazandeghi. 2004; 62: 10-17.

14. Kummerov M, Slovak L, Holoubek I. Phytotoxicity studies of Benzo (α) pyrene with Lactuca sativa. Toxicology and environmental chemistry.1995; 51: 197-203.

15. Rezanejad F. The effect of air pollution on microsporogenesis pollen development and soluble pollen proteins in Spartium junceum L. (Fabaceae). Turkish J. of Botany. 2007; 31: 183-191.

16. Rezaie A, Kamkar-Haghighi AA. Effect of water stress on Phaseolus vulgaris plants in different growth stages. Journal of Soil Research. 2009; 23: 117-124.

17. Baghali Z, Majd A, Chehregani A, Pourpak Z, et al. Cytotoxic effect of Benzo (α) pyrene on development and protein pattern of sunflower pollen grains. Toxicol. Environ. Chem. 2011; 93: 665-677.

18. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 . J Nature.1970; 227: 680-685.

19. Helander M.L, Savolainen J, Ahlholm J. Effects of air pollution and other environmental factors on birch pollen allergens. J Allergy. 1997; 52: 1207-1214.

20. Hwang BF, Lee YL, Lin YC, Jaakola JJ, et al. Traffic related air pollution as a determinant of asthma among Taiwanese school children. Thorax. 2005; 60: 467-473.

21. Knox RB, Suphioglu C. Environmental and molecular biology of pollen allergens. Trends Plant Sci. 1996; 1: 156-164.

22. Majd A, Chehregani A. Studies on Developmental processes in Ovules of Soja Glycine max L. Plants and effects of certain toxins and Environmental Pollutants, Acta Horticulture. 1992; 319: 431-436.

23. Chehregani A, Kavianpour F. Effects of acid rain on the developmental stages of ovules and seed proteins in Bean plants (Phaseolus vulgaris L.). American J Plant Physiology. 2006; 2: 367-372.

24. Kaiser WM, Hofler M, Heber U. Can plants exposed to SO2 excrete sulfuric acid through the roots? Physiol. Plant. 1993; 87: 61-67.

25. Chehregani A, Malayeri BE, Kavianpour F, Yazdi L. H. Effect of acid rain on the development, structure and viability of pollen grains in bean plants. Pakistan J. Biological Science. 2006; 9: 1033-1036.

26. Yousefi N, Chehregani A, Malayeri B,  Lorestani B, et al. Effect of the heavy metals on the developmental stages of ovule and seed proteins in Chenopodium botrys L. (Chenopodiaceae). Biol Trace Elem Res. 2009. (In Press(.

27. Chehregani A, Lari Yazdi H, Hoseini S, Majd A. Toxic effect of diesel exhaust particles on the ovule and embryonic sac development in Phaseolus vulgaris. Middle Eastern and Russian J Plant Science and Biotechnology. 2007; 1: 54-56.

28. Behrendt H, Becker WM, Friedrich KH, Ring J. Air pollution and allergy: experimental studies on modulation of allergen release from pollen by air pollutants. J. Int. Arch. Allergy Immunol. 1997;113: 69-74.

29. Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis.  Planta. 2001; 212: 475-486.

30. Cobbett C, Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis. Annual Review of Plant Biology. 2002; 53: 159-182.