مطالعات تجربی کنشهای متقابل بین بافت بلاستما و ماتریکسهای سه بعدی سلول زدایی شده مثانه خرگوش نژاد نیوزیلندی در شرایط in vitro

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف اصلی این پژوهش مطالعات تجربی رویدادهای هیستولوژیکی حاصل از اعمال متقابل بین بافت بلاستما و مثانه سلول زدایی شده خرگوش نیوزیلندی در محیط کشت بود.
مواد و روش‏ها: سلول‏زدایی مثانه خرگوش بر اساس روش فیزیکی با قرار دادن قطعات بافت مثانه در فریزر 4- درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت و سپس قرار دادن مثانه در ازت مایع انجام شد. در ادامه در روش شیمیایی, مثانه را در سدیم دودسیل سولفات(SDS) 1 درصد به مدت 24 ساعت قرار گرفت و سلول‏زدایی مثانه بطور کامل انجام شد. برای تهیه بافت بلاستما با پانچ لاله‏های گوش خرگوش نر نژاد نیوزیلندی و برداشت حلقه بلاستمایی ایجاد شده با پانچ دیگری بعد از 72 ساعت داربست سلول‏زدایی شده در شرایط استریل در مرکز حلقه بلاستما قرار گرفت و به محیط کشت انتقال داده شد. نمونه‏های کشت بعد از انجام مراحل بافتی با رنگ‏های هماتوکسیلین ائوزین, پیک اندیگو و پیکروفوشین رنگ آمیزی شد.
نتایج: مطالعات میکروسکوپ نوری نشان داد که سلول‏های بلاستمایی در روز 15 کشت به صورت کلنی‏های سلولی دارای اتصال بطور کامل به داخل داربست سلول‏زدایی شده مثانه مهاجرت کرده‏اند. همچنین دراین روز سلول‏های بلاستمایی به سلول‏های اپیتلیومی تمایز یافته و به نظر می‏رسد اپیتلیوم پلی‏مورف مثانه در وسط داربست تشکیل شده است. همچنین در روزهای دیگر کشت رویدادهایی از فرایند انژیوژنز در داربست مذکور مشاهده گردید.
نتیجه گیری: مثانه سلول‏زدایی شده خرگوش نیوزلندی به عنوان داربست، قابلیت القا سلول‏های بلاستمایی را در جهت مهاجرت به داربست, ایجاد اتصالات بین سلول‏های بلاستمایی و تمایز فراهم نموده است.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                            مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                                 جلد 2، شماره 1، بهار 1390، 45-35

 

مطالعات تجربی کنشهای متقابل بین بافت بلاستما و ماتریکسهای سه بعدی سلول زدایی شده مثانه خرگوش نژاد نیوزیلندی در شرایط in vitro

 

هاشم راستی M.Sc.1*، ناصر مهدوی شهری Ph.D.2، جواد بهارآرا Ph.D.2, نگار صغیری M.Sc.1

 

1- دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد, گروه زیست شناسی, دانشکده علوم پایه ,عضو باشگاه پژوهشگران جوان دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد, مشهد, ایران

2- دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد, گروه زیست شناسی, دانشکده علوم پایه, مشهد, ایران

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: h_rasti88@yahoo.com

 

تاریخ دریافت: 26/3/1390                               تاریخ پذیرش: 26/5/1390

 


چکیده

هدف: هدف اصلی این پژوهش مطالعات تجربی رویدادهای هیستولوژیکی حاصل از اعمال متقابل بین بافت بلاستما و مثانه سلول زدایی شده خرگوش نیوزیلندی در محیط کشت بود.

مواد و روش‏ها: سلول‏زدایی مثانه خرگوش بر اساس روش فیزیکی با قرار دادن قطعات بافت مثانه در فریزر 4- درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت و سپس قرار دادن مثانه در ازت مایع انجام شد. در ادامه در روش شیمیایی, مثانه را در سدیم دودسیل سولفات(SDS) 1 درصد به مدت 24 ساعت قرار گرفت و سلول‏زدایی مثانه بطور کامل انجام شد. برای تهیه بافت بلاستما با پانچ لاله‏های گوش خرگوش نر نژاد نیوزیلندی و برداشت حلقه بلاستمایی ایجاد شده با پانچ دیگری بعد از 72 ساعت داربست سلول‏زدایی شده در شرایط استریل در مرکز حلقه بلاستما قرار گرفت و به محیط کشت انتقال داده شد. نمونه‏های کشت بعد از انجام مراحل بافتی با رنگ‏های هماتوکسیلین ائوزین, پیک اندیگو و پیکروفوشین رنگ آمیزی شد.

نتایج: مطالعات میکروسکوپ نوری نشان داد که سلول‏های بلاستمایی در روز 15 کشت به صورت کلنی‏های سلولی دارای اتصال بطور کامل به داخل داربست سلول‏زدایی شده مثانه مهاجرت کرده‏اند. همچنین دراین روز سلول‏های بلاستمایی به سلول‏های اپیتلیومی تمایز یافته و به نظر می‏رسد اپیتلیوم پلی‏مورف مثانه در وسط داربست تشکیل شده است. همچنین در روزهای دیگر کشت رویدادهایی از فرایند انژیوژنز در داربست مذکور مشاهده گردید.

نتیجه گیری: مثانه سلول‏زدایی شده خرگوش نیوزلندی به عنوان داربست، قابلیت القا سلول‏های بلاستمایی را در جهت مهاجرت به داربست, ایجاد اتصالات بین سلول‏های بلاستمایی و تمایز فراهم نموده است.

واژگان کلیدی: داربست بدون سلول, مثانه, خرگوش نیوزیلندی, ماتریکس سه بعدی

 

 


مقدمه

فرایندهای ریخت‏زایی و اندام‏زایی تحت کنترل کمپلکسی از مکانیسم‏های تنظیمی هستند که تعیین کننده ویژگی‏های سلول‏ها و بافت‏های مختلف به سمت سازمان‏یابی صحیح در بافت و یا اندام می‏باشد. مولکول‏های تنظیم کننده این مکانیسم‏های تنظیمی هم مواد قابل انتشاری هستند که توسط رسپتورهای سطح سلولی ویژه شناسایی می‏شوند و هم اجزای ماتریکس خارج سلولی‏اند که اعمال متقابل سلول- سلول و سلول- ماتریکس را تنظیم کرده و رفتار سلول و بافت مورد نظر را تعیین می‏کنند (1) . عوامل گوناگونی باعث القای تمایز سلول‏های بنیادی می‏شود که از جمله آن می‏توان به تماس فیزیکی این سلول‏ها با سلول‏های مجاور (یعنی ارتباطات متقابل بین سلولی) و مولکول‏های ویژه موجود در محیط اطراف اشاره کرد. بنابراین در هر مقطع زمانی سلول‏های مجاور و فاکتورهای رشد و ترکیبات ماتریکس خارج سلولی باعث تعدیل و تنظیم فرایندهای تمایز, تقسیم و آپوپتوز سلول‏های بنیادی می‏شوند (2). در سال 1993, لانگر و واکانتی مهندسی بافت را مولد یک حوزه مطالعاتی جدید تعریف کردند که در آن اصول مهندسی و بیولوژی جهت اصلاح بافت زنده آسیب دیده بکار گرفته می‏شد و موجب تجدید ترمیم و حفظ عمل بافت می‏گشت (3). در خلال دهه 1990, مهندسی بافت به سرعت پیشرفت کرد. در این دهه موضوع جانشین‏های بیولوژیکی بافت‏های بدن به منظور بازسازی بافت مطرح شد. اکنون نیز مهندسی بافت به عنوان طراحی جایگزین‏های بافت یا ارگان مطرح می‏باشد (4). مهندسی بافت براساس سه ترکیب اصلی بافت‏های بیولوژیکی یعنی ماتریکس خارج سلولی, مولکول‏های پیام رسان و سلول بنیان نهاده شده است که بترتیب توسط داربست, فاکتورهای رشد و سلول شبیه سازی می‏شود. یکی از ویژگی‏های مهم داربست‏های مهندسی بافت داشتن شبکه متخلخل مرتبط بهم جهت تغذیه رسانی سلول, دفع ضایعات سلولی, تشکیل ماتریکس خارج سلولی و رگزایی است (5,6). این داربست‏های بیولوژیکی تشکیل شده از ماتریکس خارج سلولی (Extracellular matrix=ECM) هستند که عموما برای تجدید بنای بافت‏های آسیب دیده یا بافت‏های از دست رفته استفاده می‏شود (7). سیستم ادراری و مثانه مستعد انواع شرایط پاتولوژیکی از زمان تکوین جنینی تا بزرگسالی می‏باشد. تعدادی از مواد سنتزی و بافت‏های طبیعی برای نوسازی نقص‏های عملکردی مثانه مورد تحقیق هستند. مواد طبیعی شامل الوگرافت‏های مثانه, قطعات معدی روده‏ایی, پوست, ماهیچه, پری‏کاردیوم, جفت, سخت شامه, لایه زیر مخاطی روده کوچک و ماتریکس سلول‏زدایی شده مثانه می‏باشد (8). بلاستما سلول‏های توده‏ایی شکل و شبیه به سلول‏های مزانشیمی هستند که بطور واضح در موضعی که بافت‏ها جراحت دیده‏اند ایجاد می‏گردند و سلول‏های این بافت ویژگی چند توانی دارند این سلول‏ها در محل پیوند تحت تاثیر سیگنال‏های محیطی قرار می‏گیرند و در نتیجه این سلول‏ها توانایی تبدیل به بافت‏های مختلف را دارند. همچنین دو تا سه روز بعد از پانچ لاله‏های گوش خرگوش نیوزیلندی با تشکیل بافت بلاستما در حاشیه و اطراف زخم امکان ترمیم و بازسازی سوراخ‏های ایجاد شده فراهم می‏گردد (9). بنابراین هدف اصلی این پژوهش گزارش رویدادهای هیستولوژیکی حاصل از کنش‏های متقابل بین بافت بلاستما لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزیلندی و مثانه سلول‏زدایی شده خرگوش به عنوان داربست در محیط کشت است.

 

مواد و روش‏ها

خرگوش‏های سفید نر نژاد نیوزیلندی مورد استفاده در این پژوهش با وزن تقریبی 3 کیلوگرم و با سن 4تا 6 ماهه از موسسه تحقیقاتی انستیتو پاستور تهران خریداری شدند و سپس به حیوان خانه دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی مشهد انتقال یافتند. خرگوش‏ها در شرایط 12ساعت روشنایی و 12ساعت تاریکی در دمای میانگین 21درجه سانتی‏گراد قرار گرفته و با خوراک مخصوص خرگوش روزانه تغذیه شدند. درتمامی مراحل انجام این پژوهش، مصوبات مربوط به اصول کار با حیوانات آزمایشگاهی هم چون دسترسی آزادانه به آب و غذا، کشتن بدون درد، جلوگیری از درد ناشی از پانچ کردن مثل استفاده از لیدوکائین رعایت گردیده است. برای تهیه داربست سلول‏زدایی شده مثانه خرگوش ابتدا یک راس خرگوش با پنبه آغشته به غلظت بالایی از کلروفرم بیهوش و معدوم گردید سپس با استفاده از ابزار تشریح ناحیه انتهای شکمی شکافته شده و بافت مثانه خارج شد. پس از قرار دادن مثانه در محلول نرمال سالین 9/0 درصد به مدت 5 دقیقه مثانه بطور کامل با قیچی نوک تیز باز شده و به قطعات مساوی تقسیم و به داخل یک عدد لوله فالکون منتقل شدند. سپس سریعا مرحله سلول‏زدایی فیزیکی مثانه آغاز شد. با توجه به اینکه عوامل موثر زیادی برای سلول‏زدایی هر بافت و ارگان وجود دارد که این عوامل بستگی به چند فاکتور شامل تعداد سلول‏های بافت, چگالی, محتوای لیپید و ضخامت بافت دارد (10), از روش ترکیبی فیزیکی (11,12) و شیمیایی (13,14) برای سلول‏زدایی استفاده شد. به طوریکه قطعات مثانه به مدت 24 ساعت در فریزر 4- درجه سانتی‏گراد قرار گرفتند و هر 6 ساعت یکبار به مدت 10 دقیقه درآب مقطر استریل قرار می‏گرفتند. بعد از پایان 24 ساعت به مدت 2 ساعت و1 ساعت به ترتیب مثانه در فریزر 20- و 40- درجه سانتی‏گراد قرار گرفته و سپس آماده قرار گیری در ازت مایع شدند, به طوریکه مثانه‏ها در 5 مرحله 2 دقیقه‏ایی توسط کرایو تیوب در ازت مایع قرار گرفتند و سپس توسط فسفات بافر سالین (PBS) شستشو شدند. بدین ترتیب سلول‏زدایی به روش فیزیکی به پایان رسید (11,12). در روش سلول‏زدایی شیمیایی, تمامی قطعات مثانه به مدت 24 ساعت در محلول سدیم دو دسیل سولفات (SDS) 1 درصد همراه با چرخش آرام قرار داده شدند سپس نمونه‏ها توسط آب مقطر استریل شستشو شده و بوسیله اتانول 75 درصد و پراستیک اسید 2/0 درصد استریل شدند و در نهایت به مدت 24 ساعت در PBS قرار گرفتند. بدین ترتیب داربست مثانه خرگوش آماده استفاده شد (13,14). این داربست را به مدت 4روز در فریزر 20- درجه سانتی‏گراد نگهداری شد تا تهیه حلقه بلاستمایی انجام شود. بدین منظور یک راس خرگوش انتخاب شده و در دستگاه مخصوص نگهداری خرگوش(مهارکننده) جهت پانچ لاله گوش قرار گرفت. بعد از مو زدایی گوش‏ها با کرم موبر با استفاده اسپری لیدوکائین 10 درصد تمامی سطح گوش بطور کامل بعد از حدود 30 دقیقه بی حس شد. در ادامه با استفاده از پانچور مخصوص تعداد 5 سوراخ در گوش راست و 5 سوراخ در گوش چپ با قطر2 میلی‏متر زده شد. خرگوش مذکور به مدت 3 روز تحت شرایط کاملا استریل نگهداری شد و در پایان روز سوم مجددا با ایجاد شرایط بی حسی برای گوش بر روی سوراخ‏های قبلی با پانچوری به قطر4 میلی‏متر سوراخ جدیدی ایجاد شد و حلقه بلاستمایی برداشت گردید. سپس حلقه‏های بلاستمایی در 7 مرحله شامل 6 مرحله قرار گیری در سرم فیزیولوژی استریل و یک مرحله قرار گیری در محیط کشت, کاملا استریل شدند.

محیط کشت شامل 85 میلی‏لیتر DMEM                             (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) و 15 میلی‏لیتر سرم جنینی گاوی Fetal Bovine Serum=FBS)  (و 500  میکرولیتر پنی‏سیلین- استرپتومایسین بود(15). سپس داربست مثانه آماده شده تحت شرایط استریل به زیر هود لامینار منتقل شده و هر یک عدد داربست مثانه خرگوش در مرکز یک حلقه بلاستمایی قرار گرفت. تمامی نمونه‏ها سپس در داخل پلیت‏های 6 خانه‏ایی مخصوص کشت قرار گرفته و مقدار 3 میلی‏لیتر محیط کشت به آنها افزوده شد و پلیت‏ها به انکوباتور CO2 دار منتقل شدند و هر 2 تا 3 روز یکبار محیط کشت تعویض شد. نمونه‏ها در روزهای 5, 10, 15, 20, 25, 30 بعد از خروج از محیط کشت و انجام عملیات بافتی با رنگ‏های هماتوکسیلین ائوزین(H&E), پیک اندیگو و پیکروفوشین(وان‏گیسون) رنگ آمیزی شدند. رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین به عنوان رنگ آمیزی معمولی استفاده شد بطوریکه رنگ هماتوکسیلین هسته‏ها را بنفش و ائوزین سیتوپلاسم را صورتی می‏کند. رنگ پیک اندیگو (مخلوط 100 میلی‏لیتر اسید پیکریک اشباع+ 1/0 گرم پودر اندیگوکارمین) بعنوان یک رنگ اختصاصی با شدت‏های اسیدوفیلی متفاوت می‏باشد بطوریکه در مسیر معمول رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین به جای رنگ ائوزین از رنگ پیک اندیگو استفاده شد. با این رنگ, زمینه که ماتریکس بافت همبند و کلاژن است به همراه اپیتلیوم به رنگ سبز مغز پسته‏ایی در می‏آید و هسته‏ها با رنگ هماتوکسیلین قهوه‏ایی کم رنگ می‏شوند. رنگ پیکروفوشین یاوان‏گیسون (مخلوط 100 میلی‏لیتر اسید پیکریک اشباع + 1/0 گرم پودر فوشین اسید) بعنوان یک رنگ اختصاصی دیگر می‏باشد, بطوریکه در مسیر معمول رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین به جای رنگ ائوزین از پیکروفوشین استفاده شد با این رنگ, کلاژن قرمز آتشین و اپیتلیوم زرد یا کرمی رنگ شده و هسته‏ها با هماتوکسیلین قهوه‏ایی رنگ می‏شوند.

تجزیه و تحلیل اطلاعات بدست آمده با استفاده نرم افزار آماری Minitab 16 انجام شد و آزمون‏های تحلیل واریانس یک طرفه(ANOVA) و تست توکی بر روی داده‏ها انجام گرفت. P≤0.05 به عنوان سطح معنی‏دار در نظر گرفته شد.

شاخص اول میانگین تعداد سلول‏های مهاجرت یافته به داربست در روزهای مختلف کشت است. بدین منظور برای شمارش تعداد سلول‏های مهاجرت یافته به داربست از لنز چشمی میکروسکپی مخصوص شمارش استفاده شد. تمامی لام‏ها با درشتنمایی x40 مورد بررسی قرار گرفتند و 5 نقطه قراردادی در میدان دید در تمامی تکرارها مورد شمارش قرار گرفت. ضمنا تمامی سلول‏های موجود در داخل محوطه مخصوص لنز مورد شمارش قرار گرفتند.

برای بررسی شاخص دوم که میانگین تغییرات اندازه هسته سلول‏های مهاجرت یافته به داخل داربست است از لنز چشمی میکروسکپی مخصوص که دارای خط کش اندازه گیری بود استفاده شد. هر یک واحد این خط کش در درشتنمایی x40 وقتیکه در عدد 2/3 ضرب شود واحد اندازه‏گیری بر حسب میکرون خواهد شد. تمامی لام‏ها در درشتنمایی x40. مورد بررسی قرار گرفتند و 5 نقطه قراردادی در میدان دید در تمامی تکرارها مورد اندازه‏گیری قرار گرفت. همچنین به دلیل آنکه انواع مختلفی از شکل‏های هسته اعم از کروی, بیضی و کشیده در سلول‏های مهاجرت کرده به داربست دیده می‏شود, جهت یک اندازه‏گیری دقیق برای هسته‏های موجود در میدان دید, برای هر هسته قطر کوچک با قطر بزرگ بعد از اندازه‏گیری جمع شده و بر عدد 2 تقسیم شد تا عدد دقیقی از اندازه هسته سلول‏های مهاجرت یافته به داربست بدست آید.

 

نتایج

مطالعات میکروسکوپ نوری و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین نشان دادکه مناسب ترین داربست تولید شده با حفظ ساختار ماتریکس خارج سلولی (ECM) مثانه استفاده از روش ترکیبی فیزیکی و شیمیایی است که بکار برده شد. بافت مثانه خرگوش نیوزیلندی قبل از سلول‏زدایی (شکل 1) و بافت مثانه بعد از سلول‏زدایی به ترتیب در شکل‏های 1 و 2 نشان داده شده است. نمونه کنترل در هر روز کشت یک قطعه داربست سلول‏زدایی شده بدون بافت بلاستما است که در محیط کشت قرار گرفت. هیچ سلولی در تمامی نمونه‏های کنترل در روزهای مختلف کشت دیده نشد. (شکل 3).

 

 

شکل 1: بافت مثانه خرگوش قبل از سلول‏زدایی

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین. درشتنمایی: x400

 

شکل 2: بافت مثانه خرگوش بعد از سلول‏زدایی

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین. درشتنمایی: x100

 

 

شکل 3 : نمونه کنترل که یک داربست سلول‏زدایی شده بدون بافت بلاستما در محیط کشت است و فاقد سلول می‏باشد.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین. درشتنمایی: x100

 

نتایج شاخص هر روز کشت از نمونه‏هایی که داربست سلول‏زدایی شده در مرکز حلقه بلاستما قرار گرفت بوسیله مطالعات دقیق میکروسکوپ نوری نمونه‏های رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین ائوزین, پیک اندیگو و پیکروفوشین بدست آمد:

در روز 5 کشت, هیچ گونه سلول بلاستمایی از حلقه بلاستمایی به درون داربست مثانه مهاجرت نکرده بود (شکل  4,5).

 

 

شکل 4: روز 5 کشت. هیچ سلولی به داربست مهاجرت نکرده وجود ندارد.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین درشتنمایی: x100

 

شکل 5: روز 5 کشت.

پیکان: حضور سلول‏های بلاستما فقط در حلقه بلاستما.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین. درشتنمایی: x400

 

در روز 10 کشت, شروع مهاجرت سلول‏های بلاستمایی به درون داربست مثانه دیده شد. این سلول‏ها در قالب کلنی‏های سلولی دارای اتصال به داربست, مهاجرت کرده بودند (شکل 6,7,8,9).

 

 

شکل 6 : روز 10 کشت. شروع مهاجرت سلول‏های بلاستمایی.

پیکانها: سلول‏های بلاستمایی به صورت متصل بهم به داربست مهاجرت کرد‏ه‏اند.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین. درشتنمایی: x100

 

 

شکل 7 : روز 10 کشت. نمایی از چند کلنی سلولی

پیکانها: سلول‏های بلاستمایی به صورت کلنی به داربست مهاجرت کرده‏اند.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین. درشتنمایی: x400

 

شکل8: روز10 کشت. مهاجرت سلول‏های بلاستما به داربست

پیکان: یک سلول بلاستما در مجموعه سلول‏های با هم مهاجرت کرده بلاستمایی به داربست.

رنگ آمیزی: پیکروفوشین. درشتنمایی: x400

 

 

شکل9: روز10 کشت. مهاجرت سلول های بلاستما به داربست. 

پیکان: نمایی از یک کلنی سلولی بلاستمایی مهاجرت کرده به داربست. رنگ آمیزی: پیکروفوشین. درشتنمایی: x400

 

در روز 15 کشت بیشترین مهاجرت سلول‏های بلاستمایی به داربست دیده شد و به نظر می‏رسد این کلنی‏های سلولی دارای اتصال با هدف تشکیل اپیتلیوم به درون داربست مهاجرت کرده بودند زیرا در این روز اپیتلیوم پلی‏مورف مثانه در وسط داربست تشکیل شده بود. با استفاده از رنگ آمیزی اختصاصی پیک اندیگو, این امکان ایجاد شد که اپیتلیوم از بافت همبند تشخیص داده شود (شکل10,11,12,13).

در روز 20 کشت, مهاجرت سلول‏های بلاستمایی به درون داربست کاهش یافته بود اما در این روز تشکیل تعدادی سلول فیبروبلاست در داربست دیده شد. همچنین به نظر می‏رسد در این روز رویداد هایی از فرایند انژیوژنز در داربست صورت گرفته باشد (شکل 14).

در روز 25 کشت, بنظر می‏رسد مهاجرت سلول‏ها ادامه داشته ولی به غیر از سلول‏های اپیتلیومی سلول دیگری دیده نمی‏شود. در این روز هنوز سلول‏ها به صورت کلنی‏های سلولی دارای اتصال هستند (شکل 15).

 

شکل 10: روز 15 کشت. تشکیل اپیتلیوم پلی‏مورف در مرکز داربست. پیکانها: محدوده تشکیل اپیتلیوم پلی مورف را نشان می دهد.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین.

درشتنمایی: x100

 

 

شکل 11: روز 15 کشت. نمای نزدیک تشکیل اپیتلیوم پلی‏مورف(اپیتلیوم زایی)

پیکانها: سلول‏های بلاستمایی تمایز یافته به سلوله‏ای اپیتلیومی را نشان می‏دهد

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین.

درشتنمایی: x400

 

 

شکل12: روز15 کشت.

پیکان: سلول‏های بلاستمایی مهاجرت کرده به داربست به سلول‏های اپیتلیومی تمایز یافته‏اند.

رنگ آمیزی: پیک اندیگو .

درشتنمایی: x400

 

شکل13: روز15 کشت.

پیکانها: سلول های بلاستمایی تمایز یافته به سلول اپیتلیومی.

رنگ آمیزی: پیک اندیگو

درشتنمایی: x400

 

 

شکل 14: روز 20 کشت.

پیکانها: سلول‏های بلاستمایی تمایز یافته

 به فیبروبلاست و حضور آنها در داربست.

رنگ امیزی: هماتوکسیلین- ائوزین.

درشتنمایی: x400

 

 

 

 

شکل 15: روز 25 کشت.

پیکانها : حضور سلول‏های بلاستما در داربست. 

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین

درشتنمایی: x100

 

در روز 30 کشت, سلول‏های مهاجرت کرده به داربست به صورت پراکنده و بدون اتصال دیده می‏شوند. اندازه‏گیری هسته سلول‏ها در این روز نشان می‏دهد که هسته سلول‏ها نسبت به روزهای قبل بسیار کوچک شده که این احتمالا نشانه غیر فعال شدن سلول‏ها می‏باشد (شکل 16).

 

شکل 16 : روز30 کشت.

پیکانها: سلول‏های بلاستما مهاجرت کرده به داربست به صورت پراکنده و بدون اتصال بهم.

رنگ آمیزی: هماتوکسیلین- ائوزین

درشتنمایی: x400

 

آنالیز های آماری

دو شاخص مورد بررسی آماری قرار گرفت. شاخص اول میانگین تعداد سلول‏های مهاجرت یافته به داخل داربست در روزهای مختلف کشت است. آنالیزها نشان می‏دهد که مهمترین اختلاف معنی‏دار بین روز 15 با 30 دیده می‏شود. همچنین بین روز 10 با روزهای 25 و 30 اختلاف معنی‏دار وجود دارد ولی بین روز 10 با روز 15 و 20 اختلاف معنی‏داری وجود ندارد. بین روزهایی که اختلاف معنی‏دار وجود دارد p≤0.05 می‏باشد (نمودار1).

شاخص دوم میانگین اندازه هسته سلول های مهاجرت یافته به داخل داربست در روزهای مختلف کشت است. آنالیز ها نشان می‏دهد که اختلاف معنی‏دار بین روزهای 10 و 15 با روزهای 20 و 25 و همچنین روز 30 دیده می شود بطوریکه مهمترین اختلاف معنی‏دار بین روز 15 (که هسته‏ها درشت هستند و نشانه فعال بودن آنها است و در این روز اپیتلیوم پلی‏مورف تشکیل شده است) با روز 30 (که هسته‏ها به طور قابل توجهی کوچک شده‏اند و می‏تواند نشانه غیر فعال شدن آنها باشد) دیده می‏شود. همچنین بین روز 20 و 25 با روز 30 اختلاف معنی‏دار وجود دارد. بین روز 10 با 15 وبین روز 20 با 25 اختلاف معنی‏دار وجود ندارد. بین روزهایی که اختلاف معنی‏دار وجود دارد p≤0.05 است(نمودار 2).

نمودار1: میانگین تعداد سلول‏های مهاجرت یافته به داربست

 

ستون‏هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می‏باشند از نظر آماری و در سطح p≤0.05  فاقد اختلاف معنی‏دار می‏با شند مهمترین اختلاف معنی‏دار بین روز 15 باروز 30 دیده می‏شود.

بین روز 10 با روز 15 و 20 اختلاف معنی‏دار وجود ندارد

بین روز 10 با روز 15 و 20 اختلاف معنی‏دار وجود ندارد.

 

نمودار2:  میانگین اندازه هسته سلولهای مهاجرت یافته به داربست

بر حسب میکرون

 

ستون هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک می باشند از نظر آماری و در سطح p≤0.05  فاقد اختلاف معنی دار هستند. مهمترین اختلاف معنی‏دار بین روزهای 10و 15 با روزهای 20و 25و30 دیده می‏شود. بین روز20و 25 با روز30 اختلاف بین روز 10 با روزهای 25و 30 اختلاف معنی دار وجود دارد. بین روز10با 15 و بین روز 20 با 25 اختلاف معنی دار وجود ندارد.

 

بحث

در پژوهش حاضر مثانه سلول‏زدایی شده خرگوش نیوزیلندی به عنوان داربست مورد استفاده قرار گرفت و اعمال متقابل بین این بافت با بافت بلاستما در شرایط in vitro بررسی شد. ماتریکس خارج سلولی شامل کمپلکس متفاوتی از ساختار و عملکرد پروتئین‏ها است که نقش مهمی در مورفوژنز و حفاظت از سلول و ساختار بافت بازی می‏کنند (16). داربست‏های ماتریکس خارج سلولی (Extracellular matrix=ECM)شامل مولکول‏های ساختاری و عملکردی ترشح شده توسط سلول‏های هر بافت بوده و بنابراین ترکیب بندی و توزیع ترکیبات ماتریکس خارج سلولی به منبع بافت بستگی دارد. ماتریکس خارج سلولی که ماده تشکیل دهنده این داربست‏ها است از انواعی از بافت‏ها از جمله دریچه‏های قلبی, لایه زیر مخاطی روده کوچک و مثانه مشتق شده است. ساختار و عملکرد مولکول‏های ECM شرایط ارتباط سلول‏ها با سلول‏های مجاور و ارتباط سلول‏ها با محیط خارج را فراهم می‏کند (17). روش‏های مهندسی بافت با استفاده از داربست‏های متخلخل سنتزی که سلول روی آن کشت می‏شود پتانسیل قابل توجهی برای القای احیای بافت‏ها به ایجاد دیواره مثانه و عملکرد آن دارد بطوری که درووا و همکارانش(18) با مطالعه القای رشد اوروتلیال در in vivo با استفاده از داربست پلی‏گلی‏کولیک‏ اسید(Poly glycolic acid=PGA) کشت شده با سلول‏های فیبروبلاستی موش به این نتیجه رسیدند که در پیوند کشت شده با سلول ایجاد یک اپیتلیوم چند لایه با حداقل 5 لایه از سلول‏های اپیتلیالی در مرکز داربست دیده می‏شود که این اپیتلیوم با اپیتلیوم سیستم ادراری موش شباهت دارد. بنابراین به نظر می‏رسد با توجه به اینکه در تحقیق حاضر در روز 15 کشت اپیتلیوم پلی‏مورف مثانه در مرکز داربست تشکیل شد (شکل 10,11) می‏توان قرابت نتایج این دو تحقیق را گزارش کرد با این تفاوت که در پژوهش ما از داربست طبیعی استفاده شد.

در پژوهش دیگری کامپودونیکو و همکارانش(19) با کشت سلول‏های مثانه روی داربستی از لایه زیر مخاطی روده کوچک خوک(Small intestinal submucosa=SIS) به منظور مطالعه تجربی مهندسی پیوندهای سیستم ادراری مشاهده کردند که در نمونه‏های روز 10 افزایش ضخامت لایه اپیتلیال سیستم ادراری به صورت پیکر بندی دو لایه دیده می‏شود و در روز 20 در همه پیوندها لایه ترانزیشنال به صورت دو لایه مرتب شده‏اند و شبیه سلول‏های اوروتلیال طبیعی هستند. همچنین در روز 20 انژیوژنز بوسیله تکوین چندین رگ جدید در ماتریکس دیده می‏شود. با توجه به نتایج تحقیق کامپودونیکو و با عنایت به نتایج تحقیق حاضر احتمالا می‏توان گفت که مهاجرت سلول‏های بلاستمایی به داربست با هدف تشکیل اپیتلیوم در داربست در روز 15 انجام شده است (شکل 10,11) بنابراین تشکیل شدن اپیتلیوم پلی‏مورف در مرکز داربست را می‏توان یکی از رویدادهای حاصل از کنش‏های متقابل بین دو بافت مذکور دانست. همچنین انژیوژنز رخ داده در روز 20 با رویدادهایی از فرایند انژیوژنز که در داربست ما در روز 20 رخ داده می‏تواند دارای تطابق باشد. بررسی مطالعه دیگری در راستای مطالعه قبلی که توسط ساکسنا و همکارانش (20) انجام گرفت نیز نشان داد که آنها سلول‏های اپی تلیال مری را از رت‏های جوان گرفته و در شرایط مصنوعی کشت دادند و توانستند سلول‏های اپیتلیال با مورفولوژی اپیتلیوم بالغ ایجاد کنند. همچنین آنها قابلیت ادامه حیات این سلول‏ها را بر روی داربست سه بعدی کلاژن بررسی نمودند. با توجه به مطالعات انجام شده در پژوهش حاضر و با توجه به شکل 10,11 به نظر می‏رسد که سلول‏های بلاستمایی شبه جنینی در داربست سلول‏زدایی شده قابلیت تمایز به سلول‏های اپیتلیومی ترانزیشنال بافت مثانه را دارند با این تفاوت که در این پژوهش از یک داربست طبیعی در کنار  بافت بلاستما به عنوان منبع سلولی استفاده شد.

لیند برگ و همکارانش(21) الگوی رشد سلول‏های اپیتلیال انسان و فیبروبلاست‏ها را که روی ماتریکس خارج سلولی منشا گرفته از SIS کشت شده‏اند را مورد بررسی قرار دادند دیده شد که فیبرو بلاست‏ها معمولا وقتی که با سلول‏های اپیدرمی روی SIS کشت می‏شوند به داربست هجوم می‏آورند همچنین توانایی داربست در حمایت کردن اتصال فیبروبلاست‏ها و سلول‏های اپیدرمی و مهاجرت, تکثیر و تمایز با حضور ترکیبات غشای پایه ما را هدایت می‏کرد که این مدل شاید برای مطالعات بر هم کنش سلول- ماتریکس و برای تحقیقات جانشینی درم مناسب باشد. البته در تحقیق لیند برگ از سلول اپیتلیال انسان و فیبروبلاست برای کشت روی داربست SIS استفاده شد ولی در پژوهش حاضر تلاش شد که از بافت بلاستمایی به عنوان یک بافت پویا در مجاورت داربست مثانه, تمایز سلولی را به عنوان یک مولفه مهم تحقیق دنبال کنیم که تشکیل فیبروبلاست‏ها در روز 20 موید این کار است (شکل 14). بطوریکه در تحقیقات شهری درسال 2003 نشان داده شده که سلول‏های بافت بلاستما قابلیت تمایز در جهات مختلف را دارا هستند (22).

 

نتیجه‌گیری

نتایج پژوهش حاضر نشان می‏دهد که بافت بلاستما و داربست مثانه خرگوش نیوزیلندی مدل مناسبی برای بررسی کنش‏های متقابل بافتی در یک ساختار سه بعدی است. یافته‏های این پژوهش اعم از تشکیل اپیتلیوم پلی‏مورف مثانه (شکل10, 11) وهمچنین ایجاد فیبروبلاست‏ها (شکل 14) و رویدادهایی از فرایند انژیوژنزرا می‏توان نقش تاثیر ماتریکس خارج سلولی مثانه بر تمایز سلول‏های بافت بلاستمایی دانست. زیرا ماتریکس خارج سلولی از طریق رسپتورهای اختصاصی موجود در سطح سلول می‏تواند اثر عمیقی بر روی رفتارهای سلول شامل چسبندگی, قطبیت سلول و مهاجرت گذاشته و برسیگنال‏هایی که بقاء سلول، تمایز و تکثیر را تنظیم می‏کنند موثر باشد (23). تلاش‏های مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی در پژوهش‏های امروزه برای انواع بافت‏ها و ارگان‏های بدن انسان در حال انجام است. پیشرفت‏های اخیر پیشنهاد می‏کند که بافت‏های مهندسی شده ممکن است در آینده کاربردهای کلینیکی گسترده‏ایی پیدا کنند که این کاربردها در جهت ایجاد شرایط بهتر برای حضور جایگزین‏های بافتی در طب پیوند و ترمیم می‏باشد(24). همچنین اشاره به این نکته قابل توجه است که می‏توان در آینده با ادامه پژوهش‏های مشابه و هدف‏دار در این زمینه شرایطی را جهت توجه هرچه بیشتر به صنعتی شدن این داربست‏ها و به خصوص نوع هوشمند آن فراهم نمود.

 

تشکر و قدردانی

 با تشکر و سپاس فراوان از معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد که پژوهش حاضر را مورد حمایت قرار دادند.

 

1. Km Y. Cell surface interactions with extracellular materials. J Annu Rev Biochem.

1983; 52:761-799.

2. Berna G, Leon-Quinto T, Ensenat-Waster R, Montanya E, et al. Stem cell and diabetes. J Biomed and pharmaco. 2001; 55:206-212.

3. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering Science. 1993; 260:920-926.

4. Chapekar MS. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 2000; 53:617-620.

5. Polak JM, Bishop AE. Stem cells and tissue engineering: past, present and future. Ann N Y Acad Sci. 2006; 1068:352-366.

6. Cao Y, Lees J. Scaffolds, stem cells and tissue engineering: A potent combination. Aust J Chem. 2005; 58:691-703.

7. Tottey S, Johnson SA, Crapo PM, Reing JE, et al. The effect of source animal age upon extracellular matrix scaffold properties. J Biomaterials. 2011; 32(1):48-54.

8. Brown AL, Brook-Allred TT, Waddell JE, White J, et al. Bladder acellular matrix as a substrate for studying in vitro bladder smooth muscle-urothelial cell interactions. J Biomaterials. 2005; 26:529-543. 

9. Ferrtti P, Corcoran JP. RA regulation of keratin expression and myogenesid suggests different ways of regenerating muscle in adult amphibian limbs. J of Cell Sci. 1999; 112:1385-94.

10. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. J Biomaterials. 2011; 32:3233-3243.

11. Omae H, Zhao C, Sun YL, An KN, et al. Multilayer tendon slices seeded with bone marrow stromal cells: a novel composite for tendon engineering. J Orthop Res. 2009; 27:937-942.

12. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissue and organ. J Biomaterials. 2006; 27:3675-3683.

13. Abousleiman RI, Reyes Y, McFetridge P,Sikavitsas V. The Human Umbilical Vein: A Novel Scaffold for Musculoskeletal SoftTissue Regeneration. J Artif Organs 2008; 32:735-742.

14. Barnes CA, Brison J, Michel R, Brown BN, et al. The surface molecular functionality of decellularized extracellular matrices. J Biomaterials. 2011; 32:137-143.

15. Tian H, Bharadwaj Sh, Liu Y, Ma H, et al. Myogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on a 3D nano fibrous scaffold for bladder tissue engineering. J Biomaterials. 2010; 31:870-877.

16. Badylak SF. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Cell & Developmental  Biology. 2002; 13:377-383.

17. Badylak SF, Freytes DO, Gilbert TW, Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. J Act Bio. 2009; 5:1-13.

18. Drewa T, Sir J, Czajkowski R, Wozniak A. Scaffold Seeded With Cells Is Essential in Urothelium Regeneration and Tissue Remodeling In Vivo After Bladder Augmentation Using. in Vitro Engineered Graft.J Trans Proceed. 2006; 38:133-135.

19. Campodonico F, Benelli R, Michelazzi A, Ognio E, et al. Bladder Cell Culture on Small Intestinal Submucosa as Bioscaffold: Experimental Study on Engineered Urothelial Grafts. J Eur Uro. 2004; 46:531-537.

20. Saxena  AK, Ainoedhofer  H, Hollwarth  ME. Esophagus tissue engineering: in vitro generation of esophageal epithelial cell sheets and viability on scaffold. J Ped Surg. 2009; 44(5): 896-901.

 

21. Lindberg K, Badylak SF. Porcine small intestinal submucosa (SIS): a bioscaffold supporting in vitro primary human epidermal cell differentiation and synthesis of basement membrane proteins. J BURNS. 2001; 27:254-266.

22. Shahri N M. Geometrical and histological model for: mammalian wound repair and regeneration. J Wound Repair and Regeneration. 2003; 11:513-526.

23. Rozario T, Desimone DW. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. J d bio. 2010; 341:126-140.

24. Atala A. Engineering organs. J C Op Biotech. 2009; 20:575-592.