مطالعه انحرافات کروموزوم 15 در مدل انتخابی مبتلا به سرطان اندومتریال آدنوکارسینوما با استفاده از روش FISH

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی رفتار ژن‏های موجود در نواحی است که در مسیر بروز و پیشرفت سرطان آندومتریوم دچار تغییر آللیک شده‏اند.
مواد و روش‏ها: موش‏های صحرائی ماده نژاد BDII/Han با نرهای دو نژاد از موش‏های صحرائی که دارای رخداد کمی برایECA  می‏باشند، آمیزش داده شد  BN/Han)&(SPRD-Cu3/Han . برای بدست آوردن زاده‏های نسل دوم, افراد نسل اول با هم آمیزش داده شد و همچنین رت های ماده نسل اول با والد پدری آمیزش داده شد تا زاده‏های بک کراس بدست آیند. به منظور بررسی تغییرات ژنتیکی ایجاد شده در تمامی 18 تومور مطالعه شده، از روش‏های سیتوژنتیک مولکولی (مانند FISH و Paint) استفاده شد.
نتایج: آنالیز انجام شده توسط  تکنیکFISH  در تومورها نشان داد که نواحی کوچکی دارای فزونی یابی ژنی می‏باشند.
نتیجه گیری: این تغییرات بطور مخفی می‏باشند به طوریکه در نواحی از کروموزوم که از نظر سیتوژنتیکی طبیعی به نظر می‏رسیدند مشاهده شد. در این پژوهش نشان داده شده که ناهنجاری‏های کروموزومی اختصاصی مانند فزونی‏یابی ژنی، حذف و جابجائی که منجر به تغییرات در نسخه‏های ژنی می‏گردند، در قطعات کوچکی از کروموزوم 15 مشاهده گردیدند.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                            مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                                 جلد 2، شماره 1، بهار 1390، 24-17

 

مطالعه انحرافات کروموزوم 15 در مدل انتخابی مبتلا به سرطان اندومتریال آدنوکارسینوما با استفاده از روش

FISH

 

احمد همتا Ph.D.1*، علی رضا شهرجردی M.D.2، علی رضا شایسته فر Ph.D.1، طاهره نصرآبادی Ph.D.3

 

1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156

2- دانشگاه پونه بخش علوم پزشکی. هندوستان

3- دانشکده پرستاری دانشگاه آزاد زاهدان. ایران

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: a-hamta@araku.ac.ir

 

تاریخ دریافت: 23/12/ 1389                               تاریخ پذیرش: 2/5/1390

 


چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی رفتار ژن‏های موجود در نواحی است که در مسیر بروز و پیشرفت سرطان آندومتریوم دچار تغییر آللیک شده‏اند.

مواد و روش‏ها: موش‏های صحرائی ماده نژاد BDII/Han با نرهای دو نژاد از موش‏های صحرائی که دارای رخداد کمی برایECA  می‏باشند، آمیزش داده شد  BN/Han)&(SPRD-Cu3/Han . برای بدست آوردن زاده‏های نسل دوم, افراد نسل اول با هم آمیزش داده شد و همچنین رت های ماده نسل اول با والد پدری آمیزش داده شد تا زاده‏های بک کراس بدست آیند. به منظور بررسی تغییرات ژنتیکی ایجاد شده در تمامی 18 تومور مطالعه شده، از روش‏های سیتوژنتیک مولکولی (مانند FISH و Paint) استفاده شد.

نتایج: آنالیز انجام شده توسط  تکنیکFISH  در تومورها نشان داد که نواحی کوچکی دارای فزونی یابی ژنی می‏باشند.

نتیجه گیری: این تغییرات بطور مخفی می‏باشند به طوریکه در نواحی از کروموزوم که از نظر سیتوژنتیکی طبیعی به نظر می‏رسیدند مشاهده شد. در این پژوهش نشان داده شده که ناهنجاری‏های کروموزومی اختصاصی مانند فزونی‏یابی ژنی، حذف و جابجائی که منجر به تغییرات در نسخه‏های ژنی می‏گردند، در قطعات کوچکی از کروموزوم 15 مشاهده گردیدند.

واژگان کلیدی: اندومتریال آدنوکارسینوما، FISH، Paint، موش صحرائی نژاد BDII.

 

 

 

 

 

 


مقدمه

سرطان آندومتریال(EC)  از جمله سرطان‏های شایع در جهان و سومین عامل مرگ و میر بین زنان مبتلا به سرطان می‏باشد که سالانه در کشورهای صنعتی 35000 مورد جدید شناسائی می‏گردد. مهمترین نوع آندومتریال آدنوکارسینوما می‏باشد که بطور مشخص در چند دهه یائسگی ایجاد می‏گردد. رت‏های ن‍ژاد BDII از نظر ژنتیکی مستعد ایجاد سرطان آندومتریال Endometrial Cancer (EC) می‏باشند و به عنوان مدل‏های ژنتیکی مورد استفاده قرار می‏گیرند. در این تحقیق به منظور آشکارسازی فاکتورهای ژنتیکی مداخله کننده در بروز سرطان آندومتریال از سلول‏های فریز شده برای کشت سلولی و از DNA استخراج شده زاده‏های حاصل از آمیزش طراحی شده مورد استفاده قرار گرفت. در این آمیزش رت‏های نژاد BDII و رت‏هایی که مستعد بروز این سرطان نبودند با یکدیگر کراس داده شدند و زاده‏های آنها با یکدیگر برای تولید نتاج F1 و با  والد ماده نژاد BDII خود جهت انجام بک کراس آمیزش داده شدند(1، 2، 3، 4، 5 و 6). نتایج تحقیقات قبلی نشان داده بود که یک الگوی شایعی از تغییرات کروموزومی در تومورهای در حال رشد قابل مشاهده و ثبت می‏باشد. در این الگو 6 کروموزوم بطور مشخص دیده می‏شد(7). یکی از این کروموزوم‏ها کروموزوم شماره 15 می‏باشد که حذف شدگی در بازوی کوتاه و اضافه شدگی در بازوی بلند آن قابل مشاهده می‏باشد. در تحقیق حاضر  به منظور بررسی دقیق‏تر این تغییر ساختاری در کروموزوم شماره 15 بر روی سلول‏های حاصل از کشت 18 تومور آندومتریال آدنوکارسینوما Endometrial adenocarcinoma (EAC) با استفاده از روشهای سیتوژنتیک مولکولی مانند (FISH و Paint) بررسی و تحقیق انجام گرفت. با استفاده از این روش‏ها ناهنجاری‏های کروموزومی خاصی مانند جابجائی، حذف، فزونی یابی تشخیص داده شد این تغییرات اغلب در قطعات کوچک کروموزومی، منجر به تغییر در تعداد نسخه‏های ژنی می‏گردد.

 

مواد و روش‏ها

نژاد پرورشی BDII  مستعد بروز EAC می‏باشد(8 و 9). در این تحقیق موش‏های صحرائی ماده نژاد BDII/Han با  موش‏های صحرائی نر از دو نژاد BN/Han و SPRD-Cu3/Han آمیزش داده شدند. به منظور تولید نسل F2  زاده‏های نسل F1  و برای تولید زاده‏های بک کراس نرهای نسل اول با موش‏های صحرائی ماده والد آمیزش داده شدند. برای مشخص شدن ظهور تومور در زاده‏ها، آنها بطور منظم مورد بررسی و معاینه قرار می‏گرفتند. هنگامی که تومور ظاهر می‏شد موش صحرائی را با رعایت حقوق حیوانات و با استفاده از اتاقک کلروفرم بیهوش نموده و سپس کشته می‏شدند. در این تحقیق 18 تومور جدا شده از موش‏های مبتلا مورد مطالعه قرار گرفت و از نظر پاتولوژیکی نیز EAC تشخیص داده شد. قابل ذکر است که در بین زاده‏ها سایر انواع سرطان آندومتریال مشاهده شد که در این مطالعه مورد استفاده قرار نگرفتند.

 

تکنیک‏های FISH و painting: برای تهیه کروموزوم‏های متافازی، به سلول‏های حاصل از کشت، کلشیسین (05/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به مدت 20 دقیقه اضافه گردید. هاروست سلول‏ها با تکان دادن شدید فلاسک‏های کشت انجام گردید و سپس سلول‏ها توسط عمل سانتریفوژ ته نشین شدند. پلیت سلولی حاصل در 075/0 مول کلرید پتاسیم مجددا معلق گردید و به مدت 15 دقیقه در هوای آزمایشگاه قرار گرفت. عمل فیکس شدن سلول‏ها با فیکساتیو کارنوی (10) انجام گرفت. اسلایدهای تهیه شده در هوای آزمایشگاه خشک شد و در الکل 70درصد و در 20- سانتی‏گراد تا زمان استفاده شدن نگهداری گردید. تکنیک Fluorescence in situ hybridization (FISH) به روش پینکل (11) و با کمی اصلاحات انجام گرفت. کلون‏هایBAC  حامل ژن‏های مورد مطالعه با استفاده از برنامه بک- فایندر در پایگاه اطلاعاتی Ratmap و به آدرس اینترنتی (http://ratmap.org/bacfinder/bacfinder/) تعیین گردید و سپس از BACPACorders@chori.org. خریداری شد. کلون‏های بک  توسط بیوتین و دایگوکسینان (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany)  و با استفاده از روش نیک ترنسلیشن Nick translation (Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A) و در درجه حرارت 16  درجه سانتی‏گراد و به مدت 90 دقیقه انجام گرفت.                 (Nick Translation System, GibcoBRL, Life Technologies, Gaithersburg, MD) پراب‏ها همراه با DNA موش صحرائی سونیکیت شده رسوب داده شد و دوباره در 20 میلی‏لیتر بافر هیبریداسیون شامل فرمآمید 50 درصد، سولفات دکستران 10 درصد، و  saline-sodium citrate ((2xSSC حل گردید. پراب‏ها برای مدت 5 دقیقه در 75 درجه سانتی‏گراد دناتوره شدند و بطور دو تایی به اسلایدهای حاوی کروموزوم‏های متافازی که قبلا در فرمآمید 70 درصد و 2xSSC  برای مدت 2 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد دناتوره شده بودند، اضافه گردید. هیبریداسیون پراب‏ها در اتاق مرطوب و در درجه حرارت  37 درجه سانتی‏گراد به مدت 48 ساعت انجام شد       و به دنبال آن در فرمآمید 50 درصد و 2xSSC به             مدت 15 دقیقه و در درجه حرارت 45 درجه سانتی‏گراد   شستشو گردید. آشکارسازی پراب‏ها توسط اضافه کردن fluorescein isothiocyanate ((FITC کنجوگیت             با آودین و رودامین آنتی‏دایگوکسی ناین                      (Oncor inc, Gaithersburg, MD) انجام گرفت.         سرانجام کروموزوم‏ها توسط DAPI                                    (-Diamidino-2-phenylindole4-6) رنگ آمیزی گردید و تصاویر دیجیتالی متافازهای رنگ آمیزی شده با             DAPI، FITC و رودامین توسط دوربین CCD  تهیه گردید    و آنالیز کروموزوم‏ها بوسیله نرم افزار لایکا Leica Q-FISH انجام شد. از آنجائیکه پراب اخصاصی Paint برای کروموزوم    15 موش صحرائی (RNO15) وجود ندارد لذا از           پراب‏های اختصاصی کروموزوم 14 موش خانگی                     Mus musculus, (MMU14) برای این منظور استفاده شد. Cambio Ltd Cambridge CB23 8AR England. لازم به ذکر است که کروموزوم 14 موش (MMU14) همولوژی زیادی با کروموزوم 15 موش صحرائی Rattus norvegicus (RNO15) دارد (12).

 

نتایج

به عنوان اولین مرحله، جهت مطالعه انحرافات کروموزوم 15 در EAC روش سیتوژنتیک سنتی و سیتوژنتیک مولکولی با همدیگر ترکیب گردید. کروموزوم 15 نرمال و یا نزدیک به حالت طبیعی به آسانی توسط روش G-banding قابل شناسائی می‏باشد. اما چون کروموزوم 15، کروموزوم نسبتا کوچکی می‏باشد و همچنین مشخصه باندی منحصر به فردی ندارد لذا اغلب موارد شناسایی قطعاتی از آن در کروموزوم‏های مرتب شده،  بسیار مشکل است. یک راه برای تعیین وجود این قطعات در ساختار کروموزوم‏های مارکر آن است که از پراب اختصاصی Paint برای کروموزوم 15 استفاده گردد. متاسفانه پراب کروموزوم 15 همراه با کروموزوم‏های 13 و 14 عرضه       می‏گردد و چون سایز آنها بسیار بهم نزدیک است            نمی‏توان آنها را بر اساس جدا کننده دستگاه فلوسایتومتر (Fluorescence-activated cell sorting)  از هم جدا کرد. چون کروموزوم 15 با کروموزوم 14 موش (14MMU) همولوژی دارد و بنابراین از نظر توالی با هم همپوشانی دارند (13 و 14) بنابراین توالی paint اختصاصی کروموزوم 14 موش می‏تواند تمام طول کروموزوم 15 موش صحرائی را رنگ نماید که از آنها به عنوان قطعات مثبت کروموزومی نام برده می‏شود. در این تحقیق پراب paint کروموزوم 14 موش برای مجموعه 18 تایی از تومورهای EAC بکار برده شد. بر اساس نتایج بدست آمده آرایش کروموزوم 15 در هر یک از تومورها قابل شناسائی بود. نتایج نشان داد که اکثریت کروموزوم‏های پینت مثبت       paint-positive به ظاهر کروموزوم‏های 15 سالمی بودند همچنین کروموزوم‏های مشتق شده از کروموزوم 15  (RNO15-derived) نیز بطور آشکار دچار نو آرائی مختلف، شامل حذف یا جابجایی شده بودند (شکل 1). مجموعه‏ای از BAC ها که شامل ژن‏های مستقر بر کروموزوم 15 بود برای تکنیک dual-color FISH بکار برده شد. به دلیل آنکه پراب‏ها تمامی طول کروموزوم 15 را می‏پوشاندند لذا در این تحقیق این امکان فراهم شد تا قطعات مختلف این کروموزوم در تومورها مورد بررسی قرار گیرد و همچنین محل احتمالی شکستن کروموزوم 15 در تومورهای مختلف هنگامی که یک کروموزوم مارکر مشتق شده از کروموزوم 15 بوجود آمده بود، قابل شناسائی باشد. در بررسی کروموزوم‏ها اغلب موارد یک نوع مارکر خاص دیده می‏شد که گاهی نیمی از کروموزوم حذف (مارکر نوع حذفی) و یا اینکه به انتهای یک کروموزومی غیر از کروموزوم 15 منتقل شده بود (مارکر نوع جابجایی). مثال‏هایی از این مارکرها در شکل 1 مشاهده می‏شود که در آن نمونه‏هایNUT 12  و RUT2 مارکرهای نوع جابجایی را نشان می‏دهد. آنالیز با پراب‏های اختصاصی ژن‏ها نشان داد که بیشتر این مارکرهای دارای حذف شدگی (8 تا از 12 نمونه) بعد از ایجاد شکستگی در ناحیه بسیار باریکی بین ژن‏های Fgf9  و  Gata4بوجود آمده است. این کروموزوم‏های مارکر برای تمامی ژن‏ها بکار رفته که بین ژن Gata4 ( Mb42) و تلومر بازوی بلند کروموزوم (Mb109) قرار دارند مثبت بوده در حالی که برای ژن‏های آزمایش شده‏ای که بین تلومر بازوی کوتاه کروموزوم 15 (Mb0) و ژن Fgf9 (Mb37) قرار گرفته‏اند، منفی می‏باشد. بنابراین می‏توان نتیجه گیری کرد که در فاصله بین این دو ژن (Fgf9 و Gata4) با فاصله‏ای برابر با Mb5 احتمالا نقطه شکستی وجود دارد. آنالیز نیمه کمی اطلاعات بدست آمده از تکنیکFISH  نشان داد که برخی از ژن‏ها دارای افزایش تعداد نسخه‏های ژنی داشتند در حقیقت 9 تا از نمونه‏ها فزونی یابی ژنی برای یک یا چند ژن را در کروموزوم نشان دادند. گاهی این فزونی یابی به صورت خوشه‏ای از سیگنال‏ها بوده و گاهی تعداد این نسخه‏های ژنی متعادل تر بوده و معمولا بین 10 تا 30 افزایش تعداد را نشان می‏داد که مثال‏هایی از آن در شکل 1 قابل مشاهده است. فزونی یابی اغلب در ناحیه سانترومر بازوی بلند کروموزوم 15 دیده شد که ژن‏های Egr3 و Fgf17 که به ترتیب در Mb 50 و  Mb51 قرار دارند و در چند مورد نیز ژن  Gfra2 (Mb 3/51) این فزونی یابی را نشان داد. در دو نمونه مورد مطالعه ناحیه فزونی یابی در محل سانترومر و در ناحیه کوچکی بودند (RUT3, NUT72) و در برخی دیگر ناحیه فزونی یابی فقط یک ژن را شامل می‏شد. این بدین معنی است که این ناحیه بایستی طولی برابر با Mb 1  و یا کمتر داشته باشد. این ناحیه فزونی یابی سانترومری, که شایع ترین حالت بین تومورهای مورد مطالعه را دارد در 8 مورد از 9 نمونه این فزونی یابی مشاهده گردید. فزونی یابی در سه ناحیه کروموزومی دیگر نیز مشاهده گردید: الف) در 2 نمونه توموری، فزونی‏یابی در ژ‍ن Thrb مشاهده شد که در فاصله Mb 3/9 از تلومر بازوی کوتاه قرار داشت. ب) در یک نمونه توموری فزونی یابی در ژن Gata4 واقع در Mb 42 کروموزوم 15 مشاهده گردید و ج) در 2 نمونه توموری فزونی یابی در ژن (Mb  109) Fgf14 انجام شده بود که نزدیک به نوک بازوی بلند کروموزم قرار دارد. در تمامی این تومورها بجز یکی از دو نمونه ناحیه ج، فزونی یابی همچنین در ناحیه سانترومری کروموزوم نیز قابل مشاهده بود. قابل ذکر است که فزونی یابی بیشتر در کروموزوم هایی مشاهده می‏شد که از نظر شکل ظاهری کروموزوم در نواربندی G طبیعی به نظر می‏رسیدند. به عنوان یکی از مهمترین ژن‏های سرطانی در این تحقیق, به رفتار ژن Rb1 در این سرطان پرداخته شد. این ژن درست در زیر سانترومر کروموزوم 15 که بیشترین فزونی یابی ها در این ناحیه باریک مشاهده می شود، قرار دارد. در یکی از نمونه‏های مطالعه شده (NUT99) این ژن دارای فزونی یابی بود. بدلیل آنکه در این تومور سایر فزونی یابی‏های ژنی مشاهده گردیده است لذا فزونی یابی ژن Rb1 کومپلیفیکاسیون نمی‏باشد. چون نسخه های اضافی Rb1 بر روی کروموزوم مارکر جداگانه ای نیز دیده می‏شد. (شکل1).

 

 

 

شکل 1: نمونه‏هایی از اطلاعات بدست آمده از تکنیک FISH و Paint بر روی تومورهای EAC

ژن های مورد استفاده در این تحقیق همراه با راهنمای رنگ های آنها و همچنین نام برخی از تومورهای آنالیز شده در شکل نشان داده شده است. هیبریداسیون های مشاهده شده مربوط به 9 تومور مختلف می‏باشد. چهار نمونه فزونی یابی ژنی و بقیه حداقل حذف یک آلل را نشان می‏دهند. قابل ذکر است که در بیشتر فزونی یابی‏ها هیچ علامت سیتوژنتیکی قابل مشاهده و تشخیص نمی‏باشد, مانندHomogeneously staining regions (Hsr) و فزونی یابی در کروموزوم های 15 که طبیعی به نظر می رسیدند مشاهده می شد. در بسیاری از موارد فزونی یابی ژنی در نزدیکی لوکوس ژن دیده می‏شد, (مانند ژن Fgf17 در NUT3), ولی در برخی دیگر از نمونه‏ها فزونی یابی ژنی بر روی کروموزوم پخش بودند, (مانند ژن Gpr18 در NUT72.


ولی آنچه که بیشتر در تومورها مشاهده می گردید این است که تعداد نسخه‏های ژن Rb1 در تومورها کاهش یافته بود. چنانچه در برخی از سلول‏های متعلق به 11 تومور هیچ گونه سیگنالی برای ژنRb1  و همچنین برای برخی از ژن‏های همسایه آن مانند (Htr2a, Tnfsf11) مشاهده نگردید. احتمالا این نشانه وقوع یک حذف هموزیگوت در ناحیه کوچکی (Mb 59-54) از کروموزوم 15 می‏باشد. معمولا در تومورها فقدان سیگنال، تنها در زیر گروهی از جمعیت سلولی دیده می‏شد اما در تومور (RUT2) در هیچ یک از سلول‏های توموری سیگنالی برای ژن Rb1 مشاهده نگردید.

 

بحث

یافته‏های روش ((CGH Comparative genomic hybridization بر روی تومورهای EAC نشان داده است که RNO15 به کررات دچار انحرافات کروموزومی شده است بطوریکه خذف در بازوی کوتاه و محل قرارگیری تغییرات           copy number  در بازوی بلند کروموزوم بوقوع پیوسته است (2 و 7). در مطالعه قبلی یک مجموعه 36 تائی از مارکرهای میکروساتلیت که طول کروموزوم 15 (RNO15) را می پوشانند برای بررسی عدم تعادل آلیلیک ((AI Allelic imbalance مورد استفاده قرار گرفت (15). در آن مطالعه چهار ناحیه کروموزومی که تحت تاثیر AI قرار گرفته بودند شناسائی گردید. دو ناحیه در بخش دیستال بازوی کوتاه، یک ناحیه در بخش میانی کروموزوم که احتمالا شامل سانترومر نیز می گردید و ناحیه چهارم در قسمت دیستال بازوی بلند کروموزوم واقع شده بود. در تحقیق حاضر 21 ژن مستقر در این ناحیه مورد بررسی دقیق تر قرار گرفته است. آنالیز اطلاعات بدست آمده با استفاده از روش FISH  نشان داد که محل قرار گیری تغییرات      Copy number که در بازوی کوتاه کروموزوم مشاهده می‏شد بعلت تشکیل کروموزوم‏های مارکری بوده است که شامل بخش کوچکی از بازوی بلند کروموزوم یعنی تا محل ژن (Mb 42) Gata4 می‏باشد. شکستگی کروموزوم 15 که منجر به تشکیل این کروموزوم‏های مارکر گردیده است در قطعه کوچکی از کروموزوم قرار گرفته است. در حال حاضر اهمیت این کروموزوم مارکر در فرایند تشکیل سرطان را نمی‏توان حدس زد و نیاز به مطالعات دقیق‏تر دارد. با این وجود، یک احتمال آن است که افزایش نسخه‏های ژنی مشاهده شده در این تحقیق، احتمالا در تشکیل و پیشرفت سرطان EAC نقش کلیدی دارد. احتمال دیگر آن است که شکستگی که این کروموزوم‏های مارکر         را بوجود می‏آورد موجب غیر فعال شدن یک ژن سرکوبگر توموری می‏گردد که در این جایگاه سیتوژنتیکی قرار گرفته        و در حال حاضر ناشناخته است. وقوع یک فزونی یابی ژنی   مخفی در کروموزوم 15 بسیار مهم به نظر می‏رسد.          چنانچه فزونی یابی ژنی معمولا همراه با برخی علائم سیتوژنتیکی خاص به وقوع می‏پیوندد. به عنوان مثال وجود homogeneously staining regions (hsr) یا نواحی رنگ آمیزی شده بطور یکنواخت در کروموزوم متافازی                نوار بندی شده به روشG-banding  و یا مشاهده دابل ماینوت (Double minutes) از جمله علائم سیتوژنتیکی هستند که نشانه فزونی یابی ژنی در نظر گرفته می‏شوند (16). اما فزونی یابی ژنی مشاهده شده در کروموزوم 15 (تحقیق حاضر) کاملا متفاوت به نظر می‏رسد. چنانچه در بیشتر موارد این فزونی یابی در جایگاه سیتوژنتیکی ژن و یا نزدیک به آن اتفاق افتاده است و منجر به هیچگونه تغییر آشکاری در مورفولوژی کروموزوم مربوطه نگردیده است. در یک مورد (ژن‏های Plau و Thrb در تومور NUT100)  توالی فزونی یافته در طول کروموزوم مهاجرت کرده بطوریکه سیگنال های حاصل از ژن در سرتاسر کروموزوم 15 مشاهده می‏شود ولی با این حال هیچگونه تغییر مورفولوژیکی در طول کروموزوم قابل مشاهده نمی‏باشد. قابل ذکر است که اکثریت فزونی یابی های مشاهده شد در بین پراب‏هایی که برای روش FISH بکار رفته است در منطقه III شناسائی شده در طول کروموزوم قرار دارد. در حقیقت اگر فرض کنیم که تمامی 8 فزونی یابی مشاهده شده در ناحیه سانترومر یک هدف یکسانی داشته است، آن هدف بایستی در بین دو جایگاه ژنی Egr3 و Fgf17 قرار گرفته باشد. بر اساس جستجوی انجام شده در پایگاه های اطلاعاتی ژنومی، در این قطعه کروموزومی 14 ژن شناخته شده تا زمان انجام این تحقیق وجود داشته است که تاکنون دخالت 5 تای آنها در بروز سرطان‏های مختلف به اثبات رسیده است. همچنین سایر فزونی یابی های ژنی مشاهده شده در این تحقیق در سایر نواحی دارایAI  قرار می‏گیرد. چنانچه دو فزونی یابی مشاهده شده برای ژن Thrb در ناحیه I و فزونی یابی مربوط به Gata4 در ناحیه III همچنین دو فزونی یابی مربوط به ژن Fgf14 در منطقه IV مستقر می‏باشد.

 

 

 

نام ژن

Mb

RUT3

NUT49

NUT56

NUT72

NUT100

NUT42

NUT46

NUT99

RUT2

NUT12

RUT30

NUT128

NUT50

15PTER

0/0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Plau

4/0

*

*

*

*

Am

*

*

*

*

*

*

*

*

Anxa7

5/4

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

ND

*

*

Thrb

3/9

Am

*

*

*

Am

*

*

*

*

*

*

*

*

Ngly1

7/10

*

*

*

ND

*

*

*

*

*

*

ND

*

*

Fhit

0/17

Am

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Gmfb

7/22

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Apex1

0/27

*

ND

*

*

*

*

*

*

ND

*

*

*

*

Cebpe

0/32

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Cideb

9/33

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Fgf9

0/38

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Gata4

0/42

*

*

*

Am

*

*

*

*

Am

*

*

*

*

Ctsb

4/42

*

*

*

Am

*

Am

*

*

Am

*

*

*

Am

Clu

0/45

Am

*

*

Am

*

*

*

*

*

*

*

*

*

15CEN

UN

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Loxl2

02/50

*

*

*

Am

*

*

*

*

Am

*

*

*

Am

Pebp4

34/50

Am

Am

*

*

*

*

*

*

Am

*

*

Am

*

Egr3

5/50

Am

*

*

Am

*

*

*

Am

Am

Am

Am

*

*

Bmp1

9/50

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Fgf17

0/51

*

*

*

Am

Am

*

*

Am

Am

Am

Am

*

Am

Gfra2

3/51

*

*

*

*

Am

*

*

*

*

*

*

*

*

Rb1

0/54

*

*

*

*

*

*

*

Am

*

*

*

*

*

Htr2a

5/55

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Cog3

6/56

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Tnfsf11

0/59

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Calm2

0/64

*

*

*

*

*

*

*

*

*

ND

*

*

*

Uchl3

6/85

ND

*

*

*

ND

*

*

*

*

ND

*

ND

*

Gpr18

0/107

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Fgf14

0/109

*

*

*

*

*

*

*

Am

*

*

*

Am

*

15QTER

7/109

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1: وقوع فزونی یابی پنهان ژنی در 13 نمونه تومور .EAC Am نشاندهنده فزونی یابی ژنی، ND نشاندهنده عدم وجود اطلاعات.

 


نتیجه گیری

آنالیز با روش CGH نشان داده بود کروموزوم 15 محل تغییرات copy number در تومورهای EAC می باشد(2). این تغییرات توسط روش FISH مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و نشان داده شد که چندین مکانیسم مختلف (مانند حذف شدگی، جابجائی یک جانبه و فزونی یابی ژنی) در کروموزوم فعال گردیده است.

 

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از آقای دکتر محمدی جهت کمک در تهیه برخی ازBAC  ها مورد استفاده در این پژوهش و همچنین سرکار خـانم فاطمه صـدری که در کارهـای آزمایشگاهـی ما را یـاری

رساندند تشکر و قدردانی می‏گردد.

 

1. Behboudi A, Levan G, Hedrich HJ, Klinga-Levan K. High-density marker loss of heterozygosity analysis of rat chromosome 10 in endometrial adenocarcinoma. Genes, Chromosomes and Cancer. 2001; 32: 330-341.

2. Helou KA, Walentinsson B, BeckmannÅ, Johansson H J, et al. Klinga-Levan and G. Levan. Analysis of genetic changes in rat endometrial carcinomas by means of comparative genome hybridization. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2001; 127(2): 118-127.

 

3. Karlsson ÅK, Helou A, Walentinsson HJ, Hedrich C, et al. Amplification of Mycn, Ddx1, Rrm2, and Odc1 in rat uterine endometrial carcinomas. Genes, Chromosomes and Cancer. 2001; 31(4): 345-356.

4. Roshani LD, Wedekind J, Szpirer Z, Taib C, et al. Genetic identification of multiple susceptibility genes involved in the development of endometrial carcinoma in a rat model. International Journal of Cancer. 2001; 94(6): 795-799.

5.Walentinsson AK, Helou V, Wallenius H J, Hedrich C, et al. Independent amplification of two gene clusters on chromosome 4 in rat endometrial cancer: identification and molecular characterization. Cancer Research. 2001; 61(22): 8263-8273.

6. Roshani LP, Mallon E, Sjostrand D, Wedekind J, et al. Genetic analysis of susceptibility to endometrial adenocarcinoma in the BDII rat model. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2005; 158: 137-141.

7. Hamta A, Adamovic T, Helou K, Levan G. Cytogenetic aberrations patterns in spontaneous endometrial adenocarcinomas in a rat model as revealed by chromosome banding and comparative genome hybridization. Cancer Genet Cytogenet. 2005; 159(2): 123-8.

8. Deerberg F, Kaspareit J. Endometrial carcinoma in BDII/Han rats: model of a spontaneous hormone-dependent tumor." Journal of the National Cancer Institute. 1987; 78: 1245-1251.

9. Kaspareit-Rittinghausen J, Deerberg F, Rapp K. Mortality and incidence of spontaneous neoplasms in BDII/Han rats." Zeitschrift für Versuchstierkunde. 1987; 30(5-6): 209-216.

10. Islam MQ, Levan G. A new fixation procedure for improved quality G-bands in routine cytogenetic work. Hereditas. 1987; 107: 127-130.

11. Pinkel DJ, Landegent C, Collins J, Fuscose R, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specefic libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4." Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 1988; 85: 9138-9142.

12. Helou K, Walentinsson A, LevanG, Ståhl F.  Between rat and mouse zoo-FISH reveals 49 chromosomal segments that have been conserved in evolution.  Mammalian Genome. 2001; 12(10): 765-771

13. Grützner F, Himmelbauer H, Paulsen M, Ropers HH, Haaf T. Comparative mapping of mouse and rat chromosomes by fluorescence in situ hybridization. Genomics. 1999; 55(3): 306-313.

14. Helou K, Walentinsson A, Levan G, Stahl F. Between rat and mouse zoo-FISH reveals 49 chromosomal segments that have been conserved in evolution. Mammalian Genome. 2001; 12(10): 765-771.

15.Hamta A,Talebbeigy F. Recurrent Regional Allelic Imbalance in Chromosome 15 inRat Endometrial Adenocarcinomas. Yakhteh Medical Journal. 2010; 12( 1), : 59-72.

16. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Seminars in Cancer Biology. 1999; 9(4): 319-325.