بررسی خواص ضد سرطانی تاکسول و عصاره های الکلی و آبی رزماری بر سلول های سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رت های نژاد SD

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: مطالعه حاضر به بررسی اثرات سایتوتوکسیک گیاه رزماری (Rosmarinus officinalis) روی سلول‏های سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رت‏های نژاد SD پرداخته است.
 مواد و روش‏ها: 10 میلی‏گرم از کارسینوژن DMBA به رت های گروه تیمار خورانده شد. پس از ایجاد تومورها، جهت تعیین نوع تومور و بررسی هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت. جهت تهیه سلول از روش خرد کردن تومور استفاده شد. از برگ‏های خشک رزماری با استفاده از متانول به روش digestion عصاره گیری شد. سپس عصاره فیلتر شده و مقداری از آن کنار گذاشته و مابقی آن توسط حلال های غیرقطبی هگزان، دی کلرومتان و اتیل استات شستشو داده شد تا مواد غیرقطبی آن جدا شود.  ﻋﻤﻞ ﺣﺬف ﺣـﻼل ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از ‫دﺳﺘﮕﺎه  تبخیرکننده چرخشی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓت. از تاکسول و هریک از عصاره‏ها 5 غلظت تهیه شده و  بر روی سلول‏ها اثر داده شد و توانایی زیستی سلول‏ها به دو روش جذب تریپان بلو و رنگ سنجی MTT ارزیابی شد.
نتایج: عصاره‏ی الکلی رزماری و تاکسول برروی سلول‏های سرطانی دارای اثرات سمی قابل توجهی بودند ولی عصاره آبی خواص ضدسرطانی بسیار ضعیفی داشت.
نتیجه گیری: عصاره الکلی رزمای به صورت وابسته به دز قادر به از بین بردن سلول های سرطانی بوده و خواص سایتوتوکسیک آن قابل مقایسه با داروی تاکسول است. همچنین مدل سرطان پستان القایی یک مدل مناسب برای انجام آزمایشاتی از این دست می‏باشد.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                               مجله علمی سلول و بافت (علمی - پژوهشی)

                                                                                                                                      جلد 2، شماره 2، تابستان 1390، 126-117

 

بررسی خواص ضد سرطانی تاکسول و عصاره های الکلی و آبی رزماری بر سلول های سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رت های نژاد  SD

 

احمد همتا *1، پیوند پروینی 2

 

1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156

2- دانش آموخته کارشناسی ارشد زیست شناسی تکوینی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

* پست الکترونیک نویسنده مسئول:  a-hamta@araku.ac.ir

 

تاریخ دریافت: 14/4/1390                               تاریخ پذیرش: 15/8/1390

 


چکیده

هدف: مطالعه حاضر به بررسی اثرات سایتوتوکسیک گیاه رزماری (Rosmarinus officinalis) روی سلول‏های سرطان پستان القا شده توسط DMBA در رت‏های نژاد SD پرداخته است.

 مواد و روشها: 10 میلی‏گرم از کارسینوژن DMBA به رت های گروه تیمار خورانده شد. پس از ایجاد تومورها، جهت تعیین نوع تومور و بررسی هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت. جهت تهیه سلول از روش خرد کردن تومور استفاده شد. از برگ‏های خشک رزماری با استفاده از متانول به روش digestion عصاره گیری شد. سپس عصاره فیلتر شده و مقداری از آن کنار گذاشته و مابقی آن توسط حلال های غیرقطبی هگزان، دی کلرومتان و اتیل استات شستشو داده شد تا مواد غیرقطبی آن جدا شود.  ﻋﻤﻞ ﺣﺬف ﺣـﻼل ﺑـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده از ‫دﺳﺘﮕﺎه  تبخیرکننده چرخشی اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓت. از تاکسول و هریک از عصاره‏ها 5 غلظت تهیه شده و  بر روی سلول‏ها اثر داده شد و توانایی زیستی سلول‏ها به دو روش جذب تریپان بلو و رنگ سنجی MTT ارزیابی شد.

نتایج: عصاره‏ی الکلی رزماری و تاکسول برروی سلول‏های سرطانی دارای اثرات سمی قابل توجهی بودند ولی عصاره آبی خواص ضدسرطانی بسیار ضعیفی داشت.

نتیجه گیری: عصاره الکلی رزمای به صورت وابسته به دز قادر به از بین بردن سلول های سرطانی بوده و خواص سایتوتوکسیک آن قابل مقایسه با داروی تاکسول است. همچنین مدل سرطان پستان القایی یک مدل مناسب برای انجام آزمایشاتی از این دست می‏باشد.

واژگان کلیدی: تاکسول، تومورهای پستان، زیستایی سلول‏ها، عصاره رزماری،  DMBA

 

 

 

 

 

 


مقدمه

طبق آمار منتشر شده از سوی وزارت بهداشت و درمان در حال حاضر سرطان پستان شایع ترین سرطان در میان زنان کشور به شمار می‏رود و دومین سرطان کشنده پس از سرطان ریه است. کارشناسان می‌گویند از هر هشت زن ایرانی، یک نفر شانس ابتلا به سرطان پستان را داراست و حدود یک چهارم کل سرطان‏های زنان در کشور مربوط به سرطان پستان می‏باشد (1). بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی بردن به مکانیسم‏های ایجاد سرطان و ابداع روش‏های درمانی مؤثرتر را آشکار می‏سازد.

سرطان پستان را می‏توان در رت‏ها توسط انواع مختلفی از عوامل نظیر هورمون‏ها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود اما یکی از پرکاربرد ترین روش‏های القا سرطان پستان در رت استفاده از نوعی ماده شیمیایی به نام 7و12 دی متیل بنزانتراسن می‏باشد که یک هیدروکربن آروماتیک چندحلقه‏ای است که به وفور در دود تنباکو یافت می‏شود (2).

با توجه به پیچیدگی مکانیسم و وجود عوامل متعدد در ایجاد سرطان تا کنون درمان قطعی برای این بیماری یافت نشده است اما امروزه از روش‏های درمانی برای درمان سرطان پستان استفاده می‏شود. با این حال وجود عواملی مانند تنوع   پروسه‏های پاتولوژیک و مکانیسم‏های مقاومت به درمان انتخاب مناسب ترین و کارآمدترین نوع درمان را برای هر یک از   بیماران مشکل ساخته است و این امر لزوم انجام آزمایشات      in vitro drug sensitivity/resistance را روشن می‏سازد. این آزمایشات قادرند شناخت و آگاهی نسبی در باره اثر عوامل مختلف مورد استفاده در درمان استاندارد را پیش از انجام آزمایشات in vivo فراهم کنند. به عبارت دیگر این روش به انکولوژیست‏ها کمک می‏کند تا بتوانند داروهای مناسبی را برای شیمی درمانی بیماران برگزینند. همچنین از این روش برای انتخاب رژیم‏های شیمی درمانی بالقوه مؤثرتر و نیز جلوگیری از سمیت بالقوه داروهای غیر مؤثر استفاده می‏شود (3).

مواد گیاشیمیایی ( (phytochemicalsکه قابلیت کاهش میزان بروز تعدادی از تومورها را دارا می باشند به صورت روزافزون رو به افزایش است و از این میان مشتقات غذایی از این نظر که تقریباً غیرسمی می‏باشند مورد توجه خاصی قرار دارند. با این حال شواهد علمی محدودی که در رابطه با مکانیسم عمل و عوارض احتمالی استفاده از این ترکیبات وجود دارد از ورود آنها به مسیر اصلی مراقبت‏ها و درمان‏های پزشکی جلوگیری نموده است (3). تا به امروز مشخص شده که بسیاری از گیاهان رایج دارای خواص یا حفاظت کننده در برابر سرطان کموپروتکتیو chemoprotective)) می‏باشند، از جمله این گیاهان می‏توان به اعضای گونه Allium (سیر و پیاز و موسیر)، اعضای خانواده نعناعیان (ریحان، نعناع، آویشن و رزماری)، اعضای خانواده Zingiberaceae (زنجبیل و زردچوبه) اشاره نمود. این گیاهان منابعی غنی از فیتوکمیکال‏های کموپروتکتیو مانند فیتواسترول‏ها، فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، ترپنوئیدها و ...      می‏باشند که این مواد به عنوان آنتی اکسیدانت عمل کرده و رادیکال‏های آزاد را جاروب می‏کنند و موجب تحریک سیستم ایمنی بدن می‏شوند و همچنین تشکیل DNA adducts با کارسینوژن‏ها را مهار نموده و علاوه بر این مسیرهای متابولیک مرتبط با گسترش سرطان را مهار می‏کنند (4).

رزماری نیز یکی از گیاهانی است که خاصیت آنتی اکسیدانتی بالایی دارد. اما چیزی که به تازگی و در یکی دو دهه اخیر مورد توجه محققان قرار گرفته است خواص ضد سرطانی و آنتی کارسینوژنیک آن می‏باشد. از آنجا که سرطان یک بیماری پیچیده و مولتی فاکتوریال است، یافتن مدل مناسبی که بتوان آن را جایگزین مدل انسانی نمود همواره یکی از آرمان‏های محققان بوده است. در این پژوهش از مدل موش صحرایی استفاده شده است که قادر به تقلید شرایط تومورهای انسانی تا حد بسیار زیادی می‏باشد و بنابراین می تواند مدل مناسبی برای مطالعه اثر داروهای ضدسرطان به شمار آید. با بررسی داده‏های به دست آمده از این مطالعه به این موضوع پی خواهیم برد که آیا استفاده از مدل موشی سرطان پستان می‏تواند مدل جایگزین مناسبی برای مدل انسانی باشد و اینکه آیا عصاره‏های الکلی و آبی (فاقد عوامل غیرقطبی) رزماری قادر به از بین بردن سلول‏های سرطانی هستند؟ و اگر این گونه است میزان اثر بخشی آن‏ها در مقایسه با داروی رایج تاکسول به چه میزان است؟

 

مواد و روش‏ها

برای انجام این پژوهش رت‏های ماده‏ی بالغ از نژاد Sprague dawley با میانگین وزنی (10 150گرم (از موسسه‌ی سرم سازی رازی خریداری شده و در شرایط 12 ساعت تاریکی و12 ساعت روشنایی و حرارت 3 ± 22 درجه‏ی سانتی‏گراد و دسترسی آزاد به آب و غذا، در قفس‌های مخصوص در اتاق حیوانات نگهداری شوند.

دوز دارو و روش تیمار: حیوانات به 3 گروه تقسیم شده و به گروه اول (10=n) به عنوان گروه کنترل 1 میلی لیتر روغن کنجد به گروه دوم (10=n) به عنوان گروه تیمار 1 میلی لیتر محلول حاوی10 میلی‏گرم DMBA (Sigma، آلمان) که در 1 میلی لیتر روغن کنجد حل شده بود و به گروه آخر (10=n)، بعنوان گروه تیمار 2 محلول حاوی 20 میلی گرم DMBA که در1 میلی لیتر روغن کنجد حل شده بود بوسیله گاواژ داده شد. این دارو2 بار در طول 2 هفته و در روز مشخص به گروه تیمار خورانده شد. پس از پایان دوره تیمار و رسیدن تومور به اندازه لازم حیوانات توسط دی ‌اتیل ‌اتر بیهوش و محل تشریح استریل گردید سپس تومور بطور کامل خارج شده و به زیر هود لامینار منتقل شد (شکل1). یک سوم تومور به منظور تهیه مقاطع بافتی، برای مطالعه پاتولوژیک در فرمالین 10درصد قرار داده شد و دو سوم باقیمانده جهت کشت سلول مورد استفاده قرار گرفت. لازم به ذکر است که تمامی اصول بهداشتی در نگهداری و معدوم سازی حیوانات بر اساس پروتکل کمیته اخلاق پزشکی مصوب 28/5/1385 ( مطابق با پروتکل هلسینکی 1975 ) در این پژوهش رعایت شد.

مطالعه هیستوپاتولوژیکی: نمونه به دست آمده از تومور به مدت 48 تا 72 ساعت در فرمالین10 درصد قرار داده شد و در ادامه مراحل پاساژ بافتی (به اختصار آبگیری با درجات صعودی الکل، شفاف سازی با زایلین و قالب‏ گیری در پارافین مذاب) بر روی قطعات تومور انجام گرفت. سپس با استفاده از میکروتوم (Leitz 1512) از قالب ها برش هایی به ضخامت 3 میکرومتر تهیه شده و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین روی برش‏ها انجام گرفت. در نهایت لام‏ها با میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین مورد مطالعه و عکس برداری قرار گرفتند.

 

 

شکل 1: تومور خارج شده از رت تیمار شده با DMBA

 

تهیه سلول‏های منفرد از بافت تومور: برای تهیه سلول از بافت تومور، تومورها به زیر هود لامینار انتقال داده شده و سپس از قسمت‏های داخلی تر قطعاتی بریده و به فالکون‏های حاوی 10 میلی‏لیتر HBSS (Gibco، آلمان) استریل انتقال داده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقیماندۀ تومور با اسکالپل به ذرات بسیار ریز خرد شد (chopping) و سوسپانسیون حاصله به فالکون منتقل شده و با دور rpm1500 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد. پس از آن محلول رویی دور ریخته شد و به رسوب ته فالکون 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM (Gibco، آلمان) حاوی10درصد FBS (Gibco، آلمان) اضافه گشت. پس از پیپتاژ کردن، 5/1 تا 2 میلی لیتر از مخلوط همگن شده به فلاسک‌های T25 منتقل شده و حجم محیط داخل فلاسک به 5 میلی‏لیتر ‌رسانده شد. سپس فلاسک به انکوباتور CO2 دار (Memmert، آلمان) با دمای 37 درجه سانتی‏گراد منتقل گردید. پس از گذشت 24 ساعت محیط رویی فلاسک تخلیه و 5 میلی‏لیتر محیط کشت تازه به فلاسک افزوده گشت. تعویض محیط و پاساژ سلول‏ها هرچند روز یکبار و در صورت نیاز انجام گرفت و این کار تا پاساژ هفتم تکرار شد.

تهیه عصاره های گیاهی: حدود 2 کیلوگرم برگ و سرشاخه‏های تازه گیاه رزماری چیده شده و در محیطی خنک و به دور از نور آفتاب خشک شد. سپس حدود 500 گرم برگ خشک رزماری آسیاب و غربال شد تا پودر یک دستی حاصل شود. 100 گرم از پودر در ظرف مناسبی ریخته شده و حدود 250 میلی لیتر متانول خالص به آن افزوده شد و به مدت 24 ساعت بر روی شیکر با دمای 40 تا 50 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. سپس مخلوط به دست آمده با استفاده از کاغذ صافی صاف و عصاره به دست آمده در یک ظرف دردار شیشه‏ای ریخته و در جایی دور از نور نگهداری شد. مجدداً روی تفاله باقی مانده 250 میلی‏لیتر متانول خالص ریخته شده و ظرف حاوی تفاله مجدداً به مدت 24 ساعت بر روی شیکر با دمای 40 تا 50 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. مقدار مورد نیاز از عصاره متانولی برداشته شد و بقیه آن در دستگاه تبخیرکننده چرخشی قرار گرفت تا حلال آن کاملاً تبخیر شده و رسوب آن باقی بماند. روی رسوب حاصله 200 میلی‏لیتر آب مقطر (حاوی 5 تا 10 درصد متانول به منظور کمک به انحلال رسوب) ریخته شد و پس از حل کردن رسوبات در آن ظرف محتوی مخلوط به مدت 24 ساعت در یخچال قرار گرفت. سپس با کاغذ صافی صاف شد. برای ارزیابی نقش ضد سرطانی ترکیبات قطبی و محلول در آب رزماری، عصاره به دست آمده با استفاده از سه حلال هگزان،  دی کلرومتان و اتیل استات (Merck، آلمان) (که قادر به جدا نمودن ترکیبات غیرقطبی می‏باشند) شستشو داده شد و تفاله باقی مانده به عنوان عصاره حاوی مواد قطبی مورد استفاده قرار گرفت. عصاره آبی در حمام آب گرم با دمای 40 تا 45 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد تا حلال آن کاملاً تبخیر شود و رسوب خشکی برجا بماند. سپس غلظت های مورد نیاز از هر یک از عصاره‏ها با حل کردن مقدار مورد نیاز از پودر عصاره در محیط کشت فاقد سرم و گذراندن آن از فیلتر (milipore) با قطر منافذ 22/0 میکرومتر تهیه شده و تا زمان استفاده در یخچال و برای مدت طولانی تر در فریزر نگهداری شد.

سنجش توانائی زیستی سلولی با استفاده از رنگ آمیزی  تریپان بلو: تعداد 6 10 × 1 سلول در هر ویال پلیت 6 خانه کشت داده شد و سپس پلیت به مدت 24 ساعت به منظور اتصال سلول‏ها به کف پلیت در انکوباتور قرار گرفت. محیط رویی سلول‏ها خارج و محیط فاقد سرم حاوی غلظتهای 25/1، 5/2، 5، 10، 20 نانومول بر لیتر از تاکسول (Ebewe pharma اتریش) به هر چاهک اضافه و پلیت به انکوباتور منتقل گردید. پس از 24 ساعت، تمام خانه‏های پلیت تریپسین زنی شد. سپس با اضافه کردن محیط کشت کامل، تریپسین غیر فعال شده و به نسبت 1:1 تریپان بلو 4/0 درصد (Sigma، آلمان) به هر خانه اضافه و پلیت به مدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. شمارش سلول‏ها با استفاده از لام نئوبار (در خانه‏های متعلق به شمارش گلبول‏های سفید) انجام گرفت. سلول‏های آبی رنگ به عنوان سلول‏های مرده و سلول‏های بی رنگ به عنوان سلول‏های زنده در نظر گرفته شد. سپس با استفاده از فرمول زیر، درصد حیات سلول‏ها در هر غلظت محاسبه گشت.

100 ×  = توانایی زیستی سلول‏ها

 

سنجش تترازولیوم(MTT)  : اساس این تست شکسته شدن نمک زرد رنگ تترازولیوم توسط آنزیم سوکسینات      دهیدروژناز میتوکندریایی سلول‏های زنده و تولید          بلورهای بنفش رنگ و نا محلول فورمازان است. هرچه تعداد سلول‏های زنده بیشتر باشد شدت رنگ تولید شده نیز        بیشتر خواهد بود (و برعکس). برای انجام این تست           تعداد 104سلول در هر چاهک پلیت 96 خانه کشت و به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. سپس محیط رویی خارج و هر چاهک دو بار توسط PBS- شسته شد. سپس 100 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم حاوی غلظت های 0، 25/1، 5/2، 5، 10، 20 نانومول بر لیتر از تاکسول به هر چاهک پلیت اضافه و پلیت به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن محیط هر چاهک با 100 میکرولیتر محیط فاقد سرم تازه جایگزین گردید. به هریک از چاهک ها 10 میکرولیتر محلول MTT (Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma، آلمان) با غلظت 5 میلی گرم بر میلی لیتر اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه گشت. سپس محیط رویی هر چاهک تخلیه و به منظور حل شدن بلورهای فورمازان 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکسایدDMSO  به هر یک از آنها اضافه و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق و در مکانی تاریک قرار داده شد. سپس محتوای هر چاهک از پلیت به یک چاهک دیگر منتقل و جذب نوری (OD) هر چاهک در طول موج 492 نانومتر با استفاده از دستگاه ELISA-reader قرائت و درصد حیات سلول‏ها با استفاده از فرمول زیر، در مورد هر غلظت محاسبه گردید:

100×

OD نمونه

= توانایی زیستی سلول‏ها

OD کنترل

 

تمامی مراحل فوق برای عصاره الکلی (با غلظت‏های 100، 200، 400، 800 و 1200 میکروگرم بر میلی‏لیتر) و عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی (با غلظت‏های 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلی لیتر) تکرار شده و نتایج ثبت گردید.

 

آنالیز آماری داده‏ها: برای بررسی اثر دوزهای مصرفی تاکسول، عصارۀ آبی، عصارۀ الکلی بر توانایی زیستی سلول‏های سرطان پستان القا شده در موش صحرایی، داده‏های به دست آمده توسط روش آماری Univariate و تست Duncan مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و تفاوت میانگین ها در سطح 05/0 P<معنی دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

نتایج حاصل از مطالعه ی هیستوپاتولوژیک

برش‏های تهیه شده از بافت‏های توموری توسط متخصص هیستوپاتولوژی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس اطلاعات هیستوپاتولوژیکی تمامی خصوصیات مرفولوژیک مشاهده شده در برش‏ها مؤید وجود بافت تومورال بدخیم بود. همانطور که در شکل 2-a و 2-b سلول های سرطانی در حال تکثیر مشاهده می‏شود، در بافت تومورال، فضاهای غده مانند تغییرشکل یافته‏ای دیده می‏شود که به وسیله یک ردیف از سلول‏های اپی‏تلیال توموری احاطه شده‏اند و تمایل دارند به بافت غده ای توموری تمایز یابند. هردوی مشخصات مزبور از نشانه‏های تشخیصی آدنوکارسینوما می‏باشد. علاوه بر این چنان که در شکل 2- c مشاهده می‏شود سلول‏های سرطانی دارای هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی می‏باشند، این در حالی است که در هیچ یک از اعضای گروه کنترل هیچ گونه بافت توموری مشاهده نشد.

 

 

 

شکل 2: a) برشی از تومور که در آن پیکان ها نشان دهنده فضاهای غده مانند متعدد می باشند ( عدسی شیئیx20 ) b)پیکان ها تکثیر سلول های سرطانی را در یک مجرا (که با } نشان داده شده است) نشان می دهد (عدسی شیئیx40 )، c) سلول های سرطانی با هسته های مشخص و هستک های بزرگ (پیکان ها) (عدسی شیئیx100 ). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین.

 

 

نتایج سنجش توانایی زیستی سلول‏ها بر اساس رنگ آمیزی تریپان

مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول‏های سرطانی پس از گذشت 24 ساعت اختلاف معنی‏داری میان تمام گروه غلظت‏‏های 1 تا 5 برای هر یک از مواد مذکور به این شرح است: به ترتیب گروه‏های 1 تا 5 جدول دوزهای 25/1، 5/2، 5، 10 و 20 نانومول بر لیتر از تاکسول، دوز های 100، 200، 400، 800 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره الکلی و دوزهای 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلی‏لیتر از عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی.

 بر اساس این نتایج غلظتی که بتواند رشد سلول‏ها را 50 درصد مهار کند (IC50) برای هر یک از ترکیبات مذکور بدین شرح بود:

تاکسول: دوز 72/12 نانومول بر لیتر. عصاره الکلی: دوز 677 میکروگرم بر میلی‏لیتر.

عصاره آبی: از آنجا که با افزایش دوز عصاره از 5000 میکروگرم بر میلی لیتر به بالا قابلیت حیات سلول‏ها افزایش قابل ملاحظه و معنی داری پیدا کرد بنابراین سمی ترین دوز عصاره آبی معادل 4000 میکروگرم بر میلی‏لیتر درنظر گرفته شد.

به طور کلی می‏توان گفت مقایسه داده‏های به دست آمده از سنجش قابلیت حیات سلول‏های سرطانی تحت تیمار با تاکسول و عصاره‏ها با داده‏های به دست آمده از گروه کنترل، تفاوت معنی‏داری (05/0P<) نشان داد.

 


 

جدول1: مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی سلول‏های سرطانی پس از تیمار با دوزهای مختلف تاکسول، عصارۀ آبی، عصارۀ الکلی در زمان 24 ساعت که به روش رنگ آمیزی تریپان بلو اندازه گیری شده است. مقادیر به صورت ±SD means بوده و تفاوت میانگین‏ها در سطح 05/0P<  معنی‏دار در نظر گرفته شده است. میانگین های با کد حرف‏های متفاوت در هر ستون دارای تفاوت معنی دار می‏باشند (ANOVA, one way, Duncan test).

 

عصاره الکلی

عصاره آبی

تاکسول

ماده

دوز

52/1±a51/94

33/1±b01/71

10/2±c92/64

48/2±d67/56

20/4±e17/48

09/2±f03/26

03/1±a75/94

82/1±a25/92

42/3±ab46/90

44/3±bc70/84

76/2±c23/82

45/2±ab73/86

97/0±a71/94

96/3±b54/80

05/3±b82/76

77/0±c50/66

07/3±d58/53

81/1±e40/34

0

1

2

3

4

5

 

میانگین توانائی زیستی سلول‏های سرطانی در گروه های تیمار شده با تاکسول و عصاره الکلی نسبت به یکدیگر اختلاف معنی‏داری نداشت، اما میانگین توانائی زیستی سلول‏های تیمار شده با این گروه‏ها دارای اختلاف معنی‏داری نسبت به گروه تیمار با عصاره آبی بود (05/0Univariate, P<). این نتایج نشان داد که دوز تیمار و توانایی زیستی سلول‏های سرطانی دارای اثرات متقابل می‏باشند، به صورتیکه با افزایش میزان دوز،  قابلیت حیات سلول‏ها کاهش معنی‏داری پیدا می‏کند. البته این مسئله درمورد عصاره آبی به طور کامل صدق نمی‏کرد زیرا همانطور که قبلاً نیز اشاره شد، با افزایش میزان دوز عصاره آبی از 4000 میکروگرم به بالا نه تنها کاهشی در میزان زیستایی سلول‏ها مشاهده نشد بلکه درصد حیات آنها در سطح معنی‏داری افزایش یافت.

 

نتایج سنجش توانایی زیستی سلول ها به روش MTT

از مقایسه داده های به دست آمده از سنجش درصد حیات سلول‏های سرطانی تیمار شده با تاکسول، عصاره آبی و عصاره الکلی، مشخص شد که تفاوت میانگین درصد حیات سلول‏ها در دوزهای متفاوت و زمان 24 ساعت در گروه های تیمار نسبت به گروه کنترل در سطح 05/0P<معنی دار بود. میانگین زیستی سلول‏های سرطانی در گروه های تیمار شده با تاکسول و    عصاره الکلی نسبت به یکدیگر اختلاف معنی‏داری نداشت، اما میانگین زیستی سلول‏های تیمار شده با این دو گروه اختلاف معنی‏داری نسبت به گروه تیمار با عصاره آبی نشان داد (05/0Univariate, P<).

همانند نتایج به دست آمده از آزمون تریپان بلو، نتایج تست MTT نیز مؤید این مطلب بود که دوزهای بالاتر از 4000 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره آبی نه تنها موجب کاهش قدرت زیست سلول‏های سرطانی نشده، بلکه قابلیت حیات آنها را در سطح معنی‏داری افزایش داده است. این نتایج همچنین نشان داد که دوز مصرفی دارای اثر متقابل بر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی می‏باشد به این معنا که با افزایش دوز، درصد حیات سلول‏ها به صورت معنی داری کاهش می‏یابد (جدول2).

غلظت‏های 1 تا 5 برای هر یک از گروه‏ها در جدول به این شرح است: به ترتیب از گروه 1 تا 5 دوزهای 25/1، 5/2، 5، 10 و 20 نانومول بر لیتر از تاکسول، دوزهای 100، 200، 400، 800 و 1000 میکروگرم بر میلی‏لیتر از عصاره الکلی و دوزهای 1000، 2000، 3000، 4000 و 5000 میکروگرم بر میلی‏لیتر از عصاره آبی فاقد عوامل غیر قطبی.

میزان IC50 محاسبه شده برای هریک از ترکیبات مورد استفاده بدین شرح بود:

تاکسول: دوز 11/10 نانومول بر لیتر. عصاره الکلی: دوز 664 میکروگرم بر میلی‏لیتر.

عصاره آبی: از آنجا که با افزایش دوز عصاره از 5000 میکروگرم بر میلی‏لیتر به بالا قابلیت حیات سلول‏ها افزایش قابل ملاحظه و معنی‏داری پیدا کرد. بنابراین سمی‏ترین دوز عصاره آبی معادل 4000 میکروگرم بر میلی‏لیتر در نظر گرفته شد.

 

 

 

جدول 2: مقایسه میانگین درصد توانایی زیستی سلول‏های سرطانی پس از تیمار با دوزهای مختلف تاکسول، عصارۀ آبی و عصارۀ الکلی در زمان 24 ساعت که به روش MTT اندازه گیری شده است. مقادیر به صورت ± SD means بوده و تفاوت میانگین ها در سطح 05/0  p< معنی دار در نظر گرفته شده است. میانگین های با کد حروف متفاوت در هر ستون دارای تفاوت معنادار می باشند (ANOVA, one way, Duncan test).

 

عصاره الکلی

عصاره آبی

تاکسول

ماده

دوز

00/0±a100

55/1±b20/67

37/3±c83/59

05/2±d39/53

85/0±e16/48

87/3±f01/36

00/0±a100

54/1±a16/93

99/0±b23/86

68/3±b14/84

89/1±b92/77

76/2±c67/87

00/0±a100

83/2±b74/86

60/1±c93/76

49/4±d44/65

64/1±e06/50

03/1±f84/44

0

1

2

3

4

5

 

 

 


بحث

نتایج بدست آمده از بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافت‏های توموری که به روش هماتوکسیلین- ائوزین رنگ آمیزی شده بودند مؤید این مطلب بود که پاتولوژی تومورهای ایجاد شده در موش‏های صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان دارد. پیش از این نیز Russo (5) گزارش کرده بود که اکثر تومورهای پستانی القا شده توسط DMBA از نوع ادنوکارسینوما بوده و مشخصات تومورهای پستان انسانی را از نظر رشد وابسته به هورمون و هیستولوژی تقلید می‏کند و بنابراین مدل حیوانی مناسبی جهت تحقیق در مورد کارسینوژنز تومورهای پستان انسانی می‏باشند. با توجه به این یافته‏ها و با نظر به اینکه ژنوم انسان و رت تا حد زیادی به یکدیگر مشابه است بنابراین از دیدگاه ژنتیکی نیز می‏بایست تشابهات زیادی بین تومورهای پستانی ایجاد شده در رت و تومورهای انسانی وجود داشته باشد. بررسی توانایی زیستی سلول‏های سرطانی با استفاده از دو آزمون رنگ آمیزی با تریپان بلو و MTT نشان داد که عصاره الکلی و تاکسول موجب کاهش چشمگیر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی شدند. گرچه عصاره‏ی آبی نیز توانست سلول‏های سرطانی را تا حدودی از بین ببرد، اما اثرات سایتوتوکسیک آن نسبت به تاکسول و عصاره الکلی بسیار ناچیز بود. نتایج به دست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تأیید نمودند.

سایر مطالعاتی که پیش از این در رابطه با اثرات سایتوتوکسیک تاکسول و عصاره‏ی الکلی رزماری صورت گرفته است نیز توانایی این ترکیبات در کاهش توانایی زیستی سلول‏های سرطانی را نشان داده‏اند. تحقیقات متعددی که در مورد اثرات سایتوتوکسیک تاکسول چه به صورت in vivo و چه in vitro صورت گرفته است سمیت تاکسول برای سلول‏های سرطانی را نشان داده‏اند. مشخص شده است که تاکسول با ایجاد وقفه در چرخه سلولی موجب مرگ سلول‏ها می‏شود. بررسی‏های صورت گرفته بر رده‏های سلولی MCF-7،HeLa  ، A549، U373، HT-29، OVG-1، PC-Sh و PC-Zd (6) NUGC-3، SC-M1 (7) SKOV3،  U937(8) همگی سایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول را نشان داده‏اند.

مطالعاتی که تا کنون در رابطه با اثرات ضد تکثیری         (Anti proliferative) و سایتوتوکسیک عصاره الکلی رزماری بر روی رده‏های سلولی سرطانی انسانی از جملهHL60 ، K562،MCF7  و MDA-MB-468  (9) M14 و A375 ، NCI-H82، DU-145، K-562،  Hep-3B، MCF7، MDA-MB-231 وPC-3  صورت گرفته نشان می‏دهد و IC50 عصاره وابسته به نوع سلول بوده و در رده‏های سلولی مختلف متفاوت است (10). تاکنون ترکیبات بسیار زیادی از رزماری استخراج شده‏اند که بسیاری از آنها دارای خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی، ضد توموری و غیره می‏باشند. عصاره الکلی رزماری حاوی 5/0 تا 1 درصد کارنوسیک اسید، 8/3 تا 6/4 درصد کارنوسول،2 تا 4 درصد رزمارینیک اسید، 5/16 تا 2/19 درصد اورسولیک اسید و کمتر از 5/0 درصد رزمانول است که از این میان تنها رزمارینیک اسید در آب محلول بوده و سایر ترکیبات در حلال‏های آلی محلول می‏باشند. بسیاری از ویژگی‏های فارماکولوژیکی رزماری را به این ترکیبات منتسب می‏دانند و تا امروز نقش آنتی اکسیدانتی و ضد سرطانی برخی از آنها به خوبی به اثبات رسیده است. مطالعات گسترده‏ای که روی ترکیبات مؤثر رزماری صورت گرفته مکانیسم عمل آنها را تا حدودی مشخص نموده است، با این حال هنوز تا درک کامل مکانیسم عمل این ترکیبات راه زیادی باقی است (11). نتایج بررسی انجام گرفته روی سرطان پستان القا شده توسط DMBA در موش های نژاد FVB/N مشخص نموده است که DMBA بیان برخی از ژن‏های دخیل در روند کارسینوژنز از جمله ژن c-myc و cyclin D1 را افزایش داده و مسیر NF‐κB را در این تومورها فعال می‏کند. همچنین DMBA موجب القاء التهاب مزمن و تولید بیش از اندازه ROS و ایجاد آسیب اکسیداتیو در DNA شده و اثرات مخرب خود را بدین صورت اعمال می‏کند (12).

استفاده از عصاره متانلی رزماری روی پوست موش از اتصال کووالان بنزوپیرن به DNA اپیدرمال جلوگیری نموده و آغاز تومور توسط آن را مهار می‏کند. همچنین مشخص شده است که اورسولیک اسید  از اتصال بنزوپیرن و DMBA به DNA سلول‏های اپیدرم و اتصال TPA به غشاء این سلول‏ها ممانعت به عمل می‏آورد. اورسولیک اسید موجود در رزماری مسیر NF‐κB را در سلول‏های سرطانی مهار می‏کند و احتمالاً این کار را از طریق سرکوب مهارکننده فسفریلاسیون P65 و NF‐κB انجام می‏دهد و بدین ترتیب موجب تنظیم کاهشی انکوژن‏هایی مانند COX-2، MMP-9، Cyclin D1، C-Jun و C-Fos می‏شود. کارنوسول موجود در برگ‏های رزماری نیز مانند اورسولیک اسید عمل کرده و فعالیت NF‐κB را مهار می‏کند (13).

COX-2 آنزیمی است که بیان آن در شرایط بدخیم و پیش بدخیم سرطان‏هایی مانند پستان، کولون، کبد، پانکراس، ریه، معده، سر و گردن، پوست و حلق افزایش می‏یابد. تحقیقات نشان داده اند که بیان بیش از حد COX-2 می‏تواند با جلوگیری از اپپتوزیس، توموریژنز را افزایش دهد (14). فلاونوئیدهای     موجود در رزماری، زیره، گشنیز و آویشن PPARγ        (peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) را فعال کرده و به موجب آن بیان COX-2 را مهار می‏نمایند. رزمارینیک اسید نیز موجب کاهش COX-2 شده و سلول‏های سرطان کولون را از بین می‏برد. علاوه بر این رزمانول نیز قادر به مهار کردن بیان COX-2 بوده و نقش ضد التهابی نشان می‏دهد (15).

کارنوسیک اسید موجود در برگ های رزماری نیز با جارو کردن رادیکال‏های آزاد اکسیژن- مانند رادیکال هیدروکسیل و رادیکال‏های لیپید پراکسی- غشاهای بیولوژیک را از گزند آنها حفظ نموده و از پراکسیداسیون لیپیدی جلوگیری می‏کند (16). گزارش شده است که کارنوسیک اسید قادر است تحت شرایط استرس اکسیداتیو، پراکسیداسیون لیپیدی را بین 88 تا 100 درصد کاهش دهد. اورسولیک اسید نیز به روشی مشابه با کارنوسیک اسید قادر به کنترل استرس اکسیداتیو می‏باشد (20). رزمانول هم از مسیر میتوکندریایی و هم از مسیر رسپتور مرگ، موجب القاء مرگ سلولی در سلول‏هایCOLO 205  می‏شود و ممکن است دارای کاربرد بالینی در درمان و پبشگیری از سرطان باشد (17).

گزارشات متعددی منتشر شده اند که نشان می‏دهند در بسیاری از سلول‏های سرطانی بیان ژن‏هایی مانند bcl-2، bcl-Xl، IAP (پروتئین مهار کننده اپوپتوزیس)، survivin، Cyclin D1 و فاکتور مرتبط با رسپتور TNF1 (TRAF1) افزایش می‏یابد و این افزایش بیان موجب ترقی و افزایش حیات و تکثیر سلول‏های سرطانی شده و آنها را نسبت به اپوپتوزیس مقاوم و غیرحساس می‏کند. اما ترکیبات رزماری از قبیل اورسولیک اسید قادرند از طرق مختلفی همچون مهار رونویسی DNA، تنظیم افزایشی بیان ژن‏های خانواده MMP، القاء بیان ژن سرکوبگر تومور P53، فعال سازی JNK1 و JNK2، فعال کردن کاسپازهای 3، 8 و 9 و همچنین کاهش بیان پروتئین‏های خانواده bcl-2 موجب القاء مرگ سلولی در رده‏های سلولی مختلفی از قبیل K652، HL-60، A549، H460، PC-3، M4Beu، MCF-7 و HepG2 شوند (11). سایر تحقیقات نشان داده اندکه کارنوسول نیز قادر است با کاهش دادن سطوح Bcl-2 به میزان 34 تا 53 درصد موجب القاء مرگ سلولی در سلول‏های لوکمی حاد انسانی شود (18).

از آنجا که اکثر ترکیبات اصلی رزماری (به غیر از رزمارینیک اسید) در آب محلول نبوده و در حلال‏های غیرقطبی و آلی حل می‏شوند (19)، بنابراین نتایج به دست آمده از اثرات عصاره آبی فاقد عوامل غیرقطبی در رزماری دور از انتظار نبود، با این حال این عصاره توانست به میزان ناچیزی سلول‏های سرطانی را از بین برد که شاید بتوان این اثر را ناشی از حضور رزمارینیک اسید دانست، علاوه بر این در گروه تیمار مشاهده شد که با افزایش دوز عصاره آبی از 4000 میکروگرم بر میلی‏لیتر به 5000 میکروگرم بر میلی‏لیتر توانایی زیستی سلول‏ها افزایش پیدا کرد. شاید بتوان این نتیجه را ناشی از اثر عوامل محرک رشد نا شناخته موجود در عصاره آبی دانست که در غلظت‏های بالا اثر سایتوتوکسیک ترکیبات موجود در این عصاره را خنثی می‏کنند اما به هرحال با نظر به اینکه ترکیبات موجود در عصاره مورد آنالیز و تجزیه کمی و کیفی قرار نگرفته‏اند و با توجه به عدم وجود تحقیقات مشابه در این زمینه، نمی‏توان در این مورد اظهار نظر قطعی نمود.

 

نتیجه گیری

تاکسول و عصاره الکلی رزماری موجب القا مرگ در سلول‏های سرطانی القا شده توسط DMBA شدند ولی عصاره آبی رزماری که فاقد عوامل غیرقطبی است اثرات سایتوتوکسیک چندانی از خود نشان نداد علاوه بر این تشابه نتایج حاصله با نتایج صورت گرفته بر روی رده‏های سلولی انسانی مؤید این مطلب است که مدل القایی سرطان پستان رت که در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفته است یک مدل مناسب و قابل اطمینان برای انجام آزمایشات سایتوتوکسیک می‏باشد که قادر به تقلید رفتار تومورهای پستانی انسانی بوده و می‏توان در بسیاری از پژوهش‏هایی از این قبیل از آن بهره جست.

 

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از معاونت پژوهشی دانشگاه اراک جهت تامین هزینه‏های مالی این پژوهش و همچنین آقای فراهانی که در کارهای آزمایشگاهی ما را یاری رساندند تشکر و قدردانی می‏گردد.

 

1. Ahmadi M, Asadi F, Jalali-fard B, Sadoghi F.[Management of health nformation]. Tehran:Nopardaz ublications; 2005.

  1. Fruebauf JP, Bosanquet AG. In vitro determination of drug response: a discussion of clinical applications. principle and practice of oncology. 1993; 7: 25-32.
  2. Tian B, Wang Z, Zhao Y, Wang D, et al. Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model, Cancer Letter. 2008; article in press.
  3. Craig wJ. Health promoting properties of common herbs. American journal of clinical nutrition. 1999; 70(3): 491-499.
  4. Russo J, Russo IH. Atlas and Histologic Classification of Tumors of the Rat Mammary Gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 2000; 5(2): 187-200.
  5. Liebmann JE, Cook JA, Lipschultz C, Teague D, et al. Cytotoxic studies of Paxlitaxel (Taxol) in human tumor cell lines. British Journal of Cancer. 1993; 68(6): 1104-1109.
  6. Chang YF, Li LL, Wu C, Liu T, et al. Paclitaxel induced apoptosis in human gastric carcinoma cell lines. Cancer. 1996; 77(1): 8-14.
  7. Ofir R, Seidman R, Rabinski T, Kurp M, et al. Taxol-induced apoptosis in human SKOV3 ovarian and MCF7 breast carcinoma cells is caspase-3 and caspase-9 independent. Cell Death and Differentiation. 2002; 9(6): 636-642.
  8. Cheung S, Tai J. Anti-proliferative and antioxidant properties of rosemary Rosmarinus officinalis. Oncology reports. 2006; 17: 1525-1531.
 

10. Yesil-Celiktas O, Sevimli C, Bedir E, Vardar-Sukan F. Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carnosic Acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines. Plant Foods Human Nutrition. 2010; 65: 158-163.

11. Yasutaka Ikeda A, Hajime Ohigashi M. Ursolic acid: An anti- and pro-inflammatory triterpenoid. Mol. Nutr. Food Res. 2008; 52(1): 26-42.

12. Currier N, Solomon SE, Demicco EG, Chang D, et al. Oncogenic Signaling Pathways Activated in DMBA-Induced Mouse Mammary Tumors. Toxicologic Pathology. 2005; 33(6): 726-737.

13. Lo AH, Liang YC, Lin-Shiau SY, Ho CT, et al. Carnosol, an antioxidant in rosemary, suppresses inducible nitric oxide synthase through down-regulating nuclear factor-kappaB in mouse macrophages. Carcinogenesis. 2002; 23(6): 983-991.

14. Aggarwal BB, Ichikawa H, Garodia P, Weerasinghe P, et al. From traditional Ayurvedic medicine to modern medicine: identification of therapeutic targets for suppression of inflammation and cancer. Oncologic, Endocrine & Metabolic. 2006; 10(1): 87-118.

15. Liang YC, Tsai SH, Tsai DC, Lin-Shiau SY. Suppression of inducible cyclooxygenase and nitric oxide synthase through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by flavonoids in mouse macrophages. FEBS Letters. 2001; 496(1): 12–8.

16. Serafini M, Bellocco R, Wolk A, Ekstrom AM. Total antioxidant potential of fruit and vegetables and risk of gastric cancer. Gastroenterology. 2002; 123(4): 985–91.

17. Cheng A, Lee m, Tsai ML, Lai CS, et al. Rosmanol potently induces apoptosis through both the mitochondrial apoptotic pathway and death receptor pathway in human colon adenocarcinoma COLO 205 cells. Food and Chemical Toxicology. 2010; article in press.

18. Dorrie J, Sapala K, Zunino SJ. Carnosol-induced apoptosis and downregulation of Bcl-2 in B-lineage leukemia cells. Cancer Letters. 2001; 170: 33-39.

Huang MT, Ho CT, Wang ZY, Ho CT, et al. Inhibition of skin tumorigenesis by rosemary and its constituents carnosol and ursolic acid. Cancer Researches. 1994; 54: 701-708.