مطالعه یک مورد سلول زدایی بافت لثه کامی انسان و آماده سازی مدلی سه بعدی (3D matrix) برای کاربرد در تحقیقات مقدماتی مهندسی بافت لثه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف این تحقیق تهیه شبکه خارج سلولی (ماتریکس) سه بعدی از بافت لثه کامی و بررسی امکان کاربرد داربست‏های طبیعی (Scaffolds) تهیه شده در تحقیقات کشت سلولی و مهندسی بافت می‏باشد.
مواد و روش‏ها: به منظور تهیه داربست‏ها، بافت لثه کامی انسان به صورت بیوپسی تهیه و سلول زدایی به روش فیزیکی (قرار دادن در تانک ازت و شستشو با آب مقطر) شیمیایی با درصدهای متفاوتی ازسدیم دودسیل سولفات SDS (غلظت های 1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/0 درصد) در 5 گروه انجام شد. سپس جهت تست داربست سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد محلول SDS، از سلول‏های شبه جنینی بافت بلاستما برای کشت بر روی این داربست سه بعدی استفاده گردید.
نتایج: کاهش درصد SDS به پایین تر از 5/0درصد به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت شد (P<0/05). مطالعه میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت نفوذ سلولی، مهاجرت، چسبندگی و تمایز را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان می‏دهد که امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. از طرف دیگر نتایج مطالعات هیستولوژیک نشان می‏دهد که داربست‏های سلول‏زدایی شده لثه کامی می تواند همچون لثه آزاد داربست زیستی سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلول‏ها باشد. آزمایشات بیشتر جهت تعیین ماهیت سلول‏های تمایز یافته می‏تواند به پیشرفت دانش ما در رابطه با بر هم کنش‏های سلول- ماتریکس کمک کنند.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                     مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی)

                                                                                                                                        جلد 2، شماره 2، تابستان 1390، 116-107

 

مطالعه یک مورد سلول زدایی بافت لثه کامی انسان و آماده سازی مدلی سه بعدی (3D matrix) برای کاربرد در تحقیقات مقدماتی مهندسی بافت لثه

 

مجتبی چروی *1، ناصر مهدوی شهری 1، جواد بهارآرا 1 ، سیدعلی بنی هاشم راد 2، جینا خیاط زاده 1 ،

خدیجه نژاد شاهرخ آبادی1 ،سمیه نادری 1

 

1-  گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، ایران

2- دانشکده دندانپزشکی و مرکز تحقیقات دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

* پست الکترونیک نویسنده مسئول:  Mojtaba_cheravi@yahoo.com

 

تاریخ دریافت: 26/5/1390                               تاریخ پذیرش: 17/8/1390

 


چکیده

هدف: هدف این تحقیق تهیه شبکه خارج سلولی (ماتریکس) سه بعدی از بافت لثه کامی و بررسی امکان کاربرد داربست‏های طبیعی (Scaffolds) تهیه شده در تحقیقات کشت سلولی و مهندسی بافت می‏باشد.

مواد و روش‏ها: به منظور تهیه داربست‏ها، بافت لثه کامی انسان به صورت بیوپسی تهیه و سلول زدایی به روش فیزیکی (قرار دادن در تانک ازت و شستشو با آب مقطر) شیمیایی با درصدهای متفاوتی ازسدیم دودسیل سولفات SDS (غلظت های 1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/0 درصد) در 5 گروه انجام شد. سپس جهت تست داربست سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد محلول SDS، از سلول‏های شبه جنینی بافت بلاستما برای کشت بر روی این داربست سه بعدی استفاده گردید.

نتایج: کاهش درصد SDS به پایین تر از 5/0درصد به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت شد (P<0/05). مطالعه میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت نفوذ سلولی، مهاجرت، چسبندگی و تمایز را نشان داد.

نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان می‏دهد که امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. از طرف دیگر نتایج مطالعات هیستولوژیک نشان می‏دهد که داربست‏های سلول‏زدایی شده لثه کامی می تواند همچون لثه آزاد داربست زیستی سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلول‏ها باشد. آزمایشات بیشتر جهت تعیین ماهیت سلول‏های تمایز یافته می‏تواند به پیشرفت دانش ما در رابطه با بر هم کنش‏های سلول- ماتریکس کمک کنند.

واژگان کلیدی: بافت بلاستما، سدیم دودسیل سولفات، ماتریکس خارج سلولی، مهندسی بافت

 

 

 


مقدمه

مهندسی بافت یکی از علوم جدید است که در سال های اخیر در درمان ضایعات بافتی و اندامی و حتی جایگزینی کامل یک اندام، بسیار مورد توجه قرار گرفته است (1). مهندسی بافت مولد یک حوزه مطالعاتی جدید است که در آن اصول مهندسی و بیولوژی را جهت اصلاح بافت زنده آسیب دیده بکار می‏گیرد و موجب تجدید، ترمیم وحفظ عمل بافت می شود (2). داربست، سلول و فاکتورهای رشد، سه رکن اصلی در مهندسی بافت هستند. یک داربست ایده آل باید دارای تخلخل مناسب برای انتشار مواد غذایی بوده و امکان پاک سازی مواد زائد را داشته و دارای پایداری مکانیکی مناسبی جهت تثبیت و انتقال بار باشد (3). علاوه بر این، شیمی سطح ماده باید چسبندگی سلول و علامت دهی داخل سلولی را به نحوی ارتقا دهد که سلول‏ها فنوتیپ طبیعی خودشان را بروز دهند (4). مولکول های ماتریکس خارج سلولی ECM (Extracellular matrix) مانند فیبرونکتین، لامینین و رسپتورهای گلیکوپروتئینی سطح سلولی آنها در مهاجرت و تمایز سلولی نقش دارند. در واقع اجزای ماتریکس خارج سلولی زیر بنای مهندسی بافت را تشکیل می‏دهند. دینامیک سلول- ماتریکس نقش مهمی در تسهیل و سازماندهی بسیاری از فرایندهای سلولی بازی می‏کند. ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش اتصالی و داربستی برای سلول‏ها، به آماده سازی و جداسازی فاکتورهای رشد مورد نیاز سلول‏ها کمک می‏کنند. با توجه به ویژگی فوق، استفاده از داربست های طبیعی حاصل از سلول‏زدایی بافت‏های موجودات زنده مفید بنظر می‏رسد (5). سلول زدایی فرآیندی است که طی آن تمامی سلول‏های یک اندام یا بافت از آن جدا می‏شوند، به طوری که فقط شبکه خارج سلولی و چهارچوب ما بین سلول‏ها به صورت دست نخورده باقی بماند. سلول زدایی از بافت‏ها و ارگان‏ها جهت استفاده از ماتریکس‏های خارج سلولی برای ایجاد داربست‏های زیستی به طور موفقیت آمیزی در مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی انجام شده است (6). اولین درخواست‏های کلینیکی به منظور استفاده از سلول های انسانی در مهندسی بافت برای بافت پوست با استفاده فیبروبلاست‏ها ، کراتینوسیت ها و داربست در سال 1980 آغاز شد. اندکی پس از آن تلاش به منظور بازسازی بافت‏های دهانی، استخوان اسفنجی و پریودونتیکس یا اطراف دندانی انجام گرفت (7). تاثیر مهندسی بافت در دندانپزشکی ناشی از درخواست‏های بی شمار آن در بافت‏های مرتبط با حفره دهانی بوده، چرا که درمان‏های پزشکی برای ضایعات بافت‏های دهانی و دندانی سالیانه میلیونها انسان را در بر می‏گیرد (8). بافت دهانی به دلیل وجود سلول‏های بنیادی جوانه دندانی با خصوصیاتی مشابه سلول‏های بنیادی مزانشیمی قادر به تمایز به عاج دندان، سلول‏های چربی و عصبی در شرایط آزمایشگاهی و بدنی، همواره مورد توجه مهندسی بافت بوده است (9). با توجه به اینکه بافت لثه خود از سه قسمت لثه چسبنده، لثه آزاد و مارژینال و لثه چسبنده تشکیل شده، حاوی مقدار زیادی الیاف کلاژن است. کلاژن به عنوان داربست طبیعی دارای سازش پذیری زیستی بالا به عنوان یکی از ویژگی‏های داربست طبیعی است و امکان جایگزینی آسان سلول و فاکتور رشد را فراهم می‏کند (10،11). بافت بلاستما گروهی از سلول های تمایز نیافته ای هستند که در بخش هایی از بدن یک موجود زنده با شباهت بسیار زیادی به سلول های جنینی قادر به تقسیم و تمایز می‏‏باشند و در پیدایش اعضا یا فرایند ترمیم و بازسازی بافت‏های آسیب دیده مشارکت می‏نمایند. گوش خرگوش مدل مناسبی برای مطالعات بافت بلاستما بوده و با ایجاد سوراخی در لاله گوش تمام بافت از دست رفته در آن محل دوباره بازسازی می‏گردد. تشکیل این بافت و بازسازی مجدد در ناحیه آسیب دیده طی فرایندهای تکثیر سلولی، سنتز اجزای ماتریکس خارج سلولی، مهاجرت و تمایز سلولی صورت می‏گیرد (12).

هدف از انجام این تحقیق در مرحله اول، تهیه داربست‏های سه بعدی مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی بافت لثه کامی انسان بود. همچنین تاثیر غلظت‏های مختلفی از سدیم دودسیل سولفات SDS)) به عنوان یک دترجنت یونی که در فرایندهای سلول‏زدایی استفاده می‏شود مورد بررسی قرار گرفت. در بخش دوم این تحقیق جهت آزمایش داربست، بر هم کنش بین داربست تهیه شده و بافت بلاستمای حاصل از گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‏ها

سلول زدایی بافت لثه کامی به منظور تهیه داربست طبیعی: قطعات بافت لثه کامی انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی از نواحی از سطح کامی دندان که نیاز به اعمال جراحی لثه از قبیل: افزایش طول تاج دندان به منظور انجام ترمیم و یا از ناحیه جراحی دندان های عقل نهفته فک بالا، با اجازه و توجیه بیماران و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید (این قطعات اضافی در حالت طبیعی دور ریخته می‏شوند). نمونه ها متعلق به مردان و زنان 20 تا 45 ساله، فاقد بیماری های سیستمیک و غیر سیگاری بودند. نمونه‏ها پس از انتقال به آزمایشگاه به قطعات یکسان برش داده شدند. نمونه های حاصل توسط سرم فیزیولوژی شستشو و حدود یک هفته در فریزر در دمای 4- درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. جهت فریز کردن آنی، نمونه ها درون کرایوتیوب های 2 میلی لیتری قرار گرفته و بمدت 2 دقیقه وارد ازت مایع با دمای 196- درجه سانتی‏گراد گردیدند. سپس برای ذوب شدن سریع به مدت 5 دقیقه نمونه ها در آب مقطر با دمای 27 درجه سانتی‏گراد وارد شدند. این فرایند، 6 بار تکرار شد و بعد از آن نمونه ها برای شستشو به مدت یک ساعت در محلول (PBS)  phosphate-buffered saline قرار داده شدند. سپس نمونه ها به 5 گروه تقسیم و 24 ساعت در شوینده ی سدیم دو دسیل سولفات ((SDS, Merck با 5 غلظت مختلف (1، 75/0، 5/0، 25/0 و 1/ 0درصد) قرار گرفتند و در طی این مدت به آرامی مخلوط شدند. بعد از آن به منظور خروج هسته ها، بقایای سلولی و همچنین شوینده ها از بافت، نمونه ها به مدت 2 ساعت در PBS قرار گرفته، و سپس چندین مرحله با آب مقطر شستشو داده شد. جهت فیکس کردن نمونه ها از محلول بوئن استفاده گردید (برای ساخت این محلول مقدار 75 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع با 25 میلی لیتر فرمالین 37 درصد و 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال مخلوط شد). بعد از انجام  مراحل آبگیری، پارافین دهی و قالب گیری، مقاطع پارافینی از بافت های سلول‏زدایی شده در هر گروه تهیه و به منظور بررسی موفقیت سلول‏زدایی، از رنگ آمیزی های هماتوکسیلین- ائوزین و پیکروفوشین استفاده شد. برای شمارش سلول هایی که در فرایند سلول زدایی از بین نرفته و در ماتریکس حضور دارند، از هر کدام از گروه های که با درصد متفاوتی از SDS سلول زدایی شده اند به طور تصادفی 20 مقطع بافتی انتخاب و با استفاده از عدسی مدرج میکروسکوپ نوری و با درشت نمایی x40 شمارش شد. جهت تعیین اختلاف معنی دار، با استفاده از نرم  افزار آماریMinitab  ویرایش 16 و آنالیز   ANOVAتست Tukey انجام گرفت و نمودار با استفاده از نرم افزار Excel رسم گردید. از نظر آماری مقادیر(05/0P<) معنی دار در نظر گرفته شد.

کشت بافت: جهت کشت، از نمونه های سلول زدایی شده با غلظت 1 درصد SDS که به طور کامل سلول زدایی شده بودند استفاده شد. بعد از سلول زدایی، نمونه ها  به مدت نیم ساعت در الکل 70 درجه و به مدت یک ساعت در  PBS استریل قرار داده شدند. در آخرین مرحله نمونه ها به مدت 24 ساعت در محیط کشت، DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium Euro clone)  همراه با 15 درصد سرم جنینی گاوی FBS (Fetal bovine derum, biosera) در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد با CO2، 5 درصد نگهداری شدند.

تهیه بافت بلاستما: جهت تهیه بافت بلاستما از خرگوش‏های نر سفید نژاد نیوزلندی 8-6 ماهه با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه تحقیقاتی سرم سازی رازی مشهد تهیه شده بودند، استفاده گردید. در تمام زمان استفاده از این حیوانات، آن ها در حیوان خانه دانشگاه نگهداری شدند و تحت یک رژیم غذایی پایه به صورت انفرادی در قفس و با درجه حرارت کنترل شده         2 ± 20 درجه سانتی گراد و روشنایی 12 ساعت در شبانه روز قرار داشتند. با رعایت نکات اخلاقی و بعد از بی حس کردن گوش خرگوش توسط لیدوکائین، با استفاده از دستگاه پانچ چند سوراخ به قطر 2 میلی متر در لاله گوش خرگوش ایجاد شد و بعد از گذشت سه روز در محل سوراخ اولیه، پانچ دیگری به قطر 4 میلی متر زده شد و حلقه ی بلاستمایی جدا گردید. بعد از جدا سازی حلقه بلاستمایی، جهت حذف آلودگی چندین بار با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده شد.

 

قرار دادن داربست آماده شده درون بلاستما و مطالعه بافت شناسی: بعد از آماده سازی داربست و  بافت بلاستما، در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل داربست های تهیه شده در میان حلقه های بلاستمایی قرار داده شدند و در ظروف شش خانه ای کشت قرار گرفتند. در هر خانه میزان 4 میلی لیتر  محیط کشتDMEM  با 15 درصد  FBSو 500 میکرو لیتر آنتی بیوتیک پنی‏سیلین/ استرپتومایسین ریخته شد. سپس نمونه‏ها به انکوباتور 37 درجه سانتی گراد با CO2، 5 درصد منتقل گردید.

به منظور بررسی مهاجرت سلول‏ها از حلقه بلاستمایی به داربست، تا 25 روز کشت ادامه یافت. طی روزهای مختلف (5، 10، 15 ، 20، 25) نمونه های کشت یافته به منظور مطالعات بافت شناسی برداشته شده، در محلول بوئن فیکس و پاساژ بافت مطابق روش معمول انجام شد. به منظور مشاهده رفتار سلول‏های مهاجر از بلاستما به درون داربست از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و پیکروفوشین استفاده شد.

 

نتایج

نتایج سلول زدایی

بافت لثه کامی سلول زدایی شده باSDS  1/0 درصد تا حدی شدت رنگ پذیری ماتریکس نسبت به نمونه های کنترل کاهش پیدا کرده بود (شکل1) و لایه اپی تلیوم همچون یک لایه تور مانند با حفظ اتصالات بین سلولی که فاقد هسته و مواد سیتوپلاسمی بوده کاملا به لایه بازال و بافت همبند متصل باقی مانده بود (شکل 2، A و B). در غلظت 25/0 درصد SDS، جدا شدن اپی تلیوم از بافت همبند و لایه بازال در برخی نواحی قابل مشاهده بود (شکل 2، C و D). در غلظت 5/0 درصد SDS لایه اپی تلیوم حذف ولی لایه بازال باقی مانده بود. از تغییرات واضح در بافت همبند می توان به تخریب الیاف کلاژن اشاره نمود که باعث ایجاد تخلخل در ماتریکس شده بود (شکل2، E و F). در غلظت 75/0 درصدSDS  لایه بازال در اغلب نواحی حذف شده بود و تخلخل ماتریکس نیز افزایش یافته بود (شکل2، G و H). و در نهایت در غلظت 1 درصد SDS چهارچوب اپی تلیوم و لایه بازال کاملا خذف شده بود (شکل 3). با کاهش غلظت SDS  احتمال حضور سلول ها در داربست افزایش می یابد (نمودار 1).

 

نتایج کشت بافت

رفتار سلول های بافت بلاستما در داربست سه بعدی لثه کامی در شرایطin vitro  بعد از5، 10، 15، 20، 25روز بررسی شد. نتایج هیستولوژیک نشان داد که 5 روز پس از کشت هیچ سلول بلاستمایی به داربست نفوذ نکرده بود. مهاجرت سلول های بلاستما از روز 10 در ماتریکس مشاهده شد و در روزهای 15 و 20 و 25 به ترتیب سلول های بیشتری درماتریکس نفوذ کرده بود. از روز 15 به بعد تمایز سلول ها به شبه فیبروبلاست مشاهده شد (شکل 4).

 

 

 

نمودار 1: میانگین تعداد سلول ها در داربست های سلول زدایی شده با درصد های متفاوتی از سدیم دودسیل سولفات (SDS) میانگین ها به صورت Mean±SEM نمایش داده شدند (P= 0.001)***نسبت به غلظت 1درصد.

 

 

   

شکل 1: نمونه‏های بافت لثه کامی کنترل. A) فلش نشان دهنده اپی‏تلیوم کراتینیزه. (بزرگ نمایی X100). B) بافت همبند. فلشها نشان دهنده فیبروبلاستها میباشد (بزرگ نمایی X400). رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.

 

 

   
   
   
   

شکل 2: بافت سلول زدایی شده لثه کامی در غلظت های مختلف سدیم دودسیل سولفات(SDS): (A-B) غلظت 1/0 درصد، فلشها نشان دهنده لایه اپیتلیوم بوده که به بافت همبند متصل هستند. (C-D) غلظت 25/0 درصد، فلش ها نشان دهنده جدا شدن اپیتلیوم از بافت همبند میباشند. F)-E) غلظت 5/0درصد، فلش ها در شکل E تخریب الیاف کلاژن و در شکل F بقایای اپیتلیوم بر روی بافت همبند را نشان میدهند. H)-G) غلظت 75/0 درصد، فلش ها نشان دهنده تخلخل ماتریکس میباشند. A) ، C، E، G)  رنگ آمیزی پیکروفوشین جهت نشان دادن رشته های کلاژنB) ، D، F، ( H رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (بزرگ نمایی X 400).

 

 

   

شکل3: بافت سلول زدایی شده لثه کامی با غلظت 1 درصد A) فلش نشان دهنده از بین رفتن اپی تلیوم به طور کامل است (بزرگ نمایی 100X). B) بافت همبند که به طور کامل سلول زدایی شده. فلش نشان دهنده تخلخل به وجود آمده در ماتریکس است (بزرگ نمایی X 400). رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.

 

 

   

شکل4: مطالعه برهمکنش بین بافت بلاستما و داربست لثه کامی در روز 25 پس از کشت. A) نمای کلی از داربست و سلول‏های بلاستمایی نفوذ یافته به داخل داربست که توسط فلش‏ها نشان داده شده‏اند. (بزرگ نمایی X400). B) سلول های نفوذ یافته و تمایز آنها به سلول‏های شبه فیبروبلاست (بزرگ نمایی X1000) رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین.

 


بحث

فرایندهای ریخت زایی و اندام زایی، تحت کنترل کمپلکسی از مکانیسم‏‏های تنظیمی هستند که تعیین کننده ویژگی‏های سلول‏ها و بافت های مختلف، به سمت سازمان یابی صحیح در بافت و یا اندام می باشد. مولکول های تنظیم کننده این مکانیسم‏های تنظیمی هم مواد قابل انتشاری هستند که توسط رسپتورهای سطح سلولی ویژه شناسایی می شوند و هم اجزای ماتریکس خارج سلولی‏اند که اعمال متقابل سلول- سلول و سلول- ماتریکس را تنظیم می‏کنند و رفتار سلول و بافت مورد نظر را تعیین می‏نمایند (13). در این پژوهش ابتدا با عملیات سلول‏زدایی، داربستی مشتق شده از ECM لثه کامی به دست آمد که از دو روش فیزیکی و شیمیایی برای این کار استفاده شد. در روش فیزیکی از انجماد آهسته و سریع استفاده شد و استدلال این کار این بود که تشکیل کریستال های یخ می تواند به تخریب غشاء کمک کند. همچنین در مرحله شیمیایی سلول‏زدایی از SDS به عنوان ماده سلول زدا استفاده گردید.

طبق نتایج، کاهش غلظت SDS به طور معنی داری باعث کاهش سلول زدایی بافت لثه کامی شد که این کاهش غلظت، تغییرات هیستولوژیکی متفاوتی را به دنبال داشت. یکی از موارد مهم در سلول زدایی، راندمان حذف سلول از بافت می باشد که وابسته به نوع بافت و روش‏های فیزیکی، شیمیایی و آنزیماتیک به کار گرفته شده می‏باشد. هر یک از این روش‏ها در فرایند سلول‏زدایی روی ترکیبات بیوشیمیایی داربست تاثیر دارند (6). با توجه به نحوه عمل دترجنت های یونی از قبیل SDS در حل کردن سلول و غشای هسته و همچنین حفظ ماهیت پروتئین‏های سیتوپلاسمی، این نوع دترجنت ها تاثیر کارآمدی در سلول زدایی بافت ها دارند. علاوه بر آن با توجه به تاثیر میزان غلظت این مواد در ایجاد سمیت و همچنین آسیب‏هایی که به کلاژن وارد می کنند، غلظت های استفاده شده از این نوع دترجنت ها نیز بسیار مهم و ضروری می‏باشد (14 ،15 ،16). از این رو در این تحقیق غلظت های متفاوتی از SDS را برای ایجاد یک داربست مطلوب مورد آزمایش قرار گرفت. Schaner و همکاران (17) با استفاده از SDS با غلظت 1/0 درصد، بافت دیواره رگ را به میزان 96 درصد سلول زدایی کردند و توسط میکروسکوپ الکترونی و مطالعات ایمونوهیستوشیمی، ثابت کردند که در این غلظت SDS، ماتریکس خارج سلولی و ساختار غشا ی پایه حفظ شده و بافت مقاومت کافی را برای پیوند و استفاده در مطالعات  مهندسی بافت دارا می باشد. بافت همبند لثه که دارای مقادیر زیادی کلاژن نوع I و III می باشد، بخش اصلی داربست را تشکیل داده است و از آنجا که تراکم کلاژن بر روی رفتار های سلولی موثر می باشد، حفظ آن پس از فرایند سلول‏زدایی حائز اهمیت است. همچنین حفظ غشاء پایه و اپی تلیوم در تهیه داربست از نکات جالب توجه می باشد زیرا می‏تواند تاثیر مهمی بر روی رفتارهای سلولی از جمله مهاجرت و تمایز سلول ها به کراتینوسیت ها داشته باشد (18). همانطور که در قسمت نتایج اشاره شد کاهش غلظت SDS به پایین تر از 5/0 درصد تفاوت‏های قابل ملاحظه ای نسبت به غلظت‏های بالاتر  نشان می‏دهد. نخستین تفاوت میزان تخلخل کمتر داربست و به هم پیوستگی بافت همبند بود. دومین تفاوت حفظ ساختار اپی تلیوم بر روی بافت همبند بود که با توجه به تخریب هسته و اجزای سلولی اپی تلیوم به شکل یک توری خالی از سلول باقی مانده بود. همچنین این نکته قابل ذکر است که در داربست‏هایی که با غلظت پایین تر سلول زدایی شدند احتمال حضور سلول‏ها نیز افزایش می یابد که این خود از موانع و مشکلات در جهت تهیه داربست مطلوب می باشد. به نظر می رسد با توجه به حفظ ساختار اپی تلیوم، غشای پایه نیز حفظ شده باشد اما این امر نیازمند بررسی با مطالعات ایمنوهیستوشیمی و رنگ آمیزی‏های اختصاصی می باشد تا نتایج رضایت بخشی را به همراه داشته باشد.

با این توضیح چرا داربست های زیستی که از ماتریکس خارج سلولی تشکیل شده اند برای کاربردهای پزشکی ترمیمی و جایگزینی بافت ها یا ارگان ها مناسب هستند؟ مطالعات نشان داده است که ECM شامل اجزای ساختاری مانند انواع کلاژن، گلیکوپروتئین ها، اسیدهیالورونیک، گلیکوزآمین گلیکان ها، رتیکولین و الاستین است که جهت اتصال ECM با گیرنده های سلولی مناسب هستند. ECM در واقع نمایان گر محصولات ترشح شده از سلول‏های مستقر در هر بافت یا ارگان می باشد (19). Karring و همکارانش (20) در مطالعه ای که بر روی هفت میمون با پیوندهای خاصی که در ناحیه حفره دهانی انجام داده بودند با در نظر گرفتن کراتینیزه شدن اپی تلیوم غیر کراتینیزه توسط بافت همبند، مشخص گردید که بافت همبند در زیر اپی تلیوم باعث تمایز اپی تلیوم پوشاننده می گردد. اثرات متقابل بافت های Epithelio-Mesenchymal در دوران جنینی موجب تشکیل بافت ها و ارگان های مختلفی از قبیل، پر، پولک، دندان ها، اپی درمیس، کبد، غدد بزاقی و مخاط دهان می‏گردد. و مشخص شده است که بافت همبند در زیر اپی تلیوم باعث تمایز اپی تلیوم پوشاننده می گردد (21). در واقع تفاوت سلولی یک اپی تلیوم کراتینیزه با غیر کراتینیزه در تنوع سایتوکراتین‏های موجود در لثه است که کراتینیزه شدن را به همراه خواهد داشت. با توجه به مطالب عنوان شده می توان گفت که تفاوت در بافت همبند زیرین می تواند تنوع در سایتوکراتین ها را باعث گردد (22). پس ماتریکس خارج سلولی بافت همبند که توسط فرایند سلول زدایی بدست می آید می تواند در جهت ایجاد داربست های مناسب برای تحقیقات مهندسی بافت مورد استفاده قرار بگیرد. Ott و همکارانش (23) با بکار بردن قلب های گرفته شده از موش و بکار بستن تکنیک سلول زدایی کامل از اندام بر روی آنها و نهایتا تزریق ترکیبی از سلول های زنده به این اندامها، موفق به تولید بافت فعال قلبی شده اند. Guo-feng و همکارانش (24) توسط آنزیم های تریپسین و ریبونوکلئاز، آئورت جنین خوک را سلول زدایی کردند که نتیجه آن تولید داربستی جهت مهندسی بافت رگی بود. نتایج آنها نشان داد که سلول های اندوتلیالی چسبندگی و تکثیر خود را بر روی این داربست بخوبی حفظ می کنند. Long و همکاران (25) دریچه قلب خوکی را با غلظت های مختلف تریپسین و سپس DNase تیمار کردند. این دریچه با استفاده از میکروسکوپ نوری، SEM و TEM مورد بررسی قرار گرفت که نتیجه آن تولید یک داربست فاقد سلول بود. بعد از این سلول های اندوتلیال خوکی و انسانی و همچنین میوفیبروبلاست های سگی به روی این داربست اضافه شد. آنالیز های میکروسکوپ الکترونی و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و ایمنوهیستوشیمی نشان داد که این سلول‏ها به سطح و درون این داربست نفوذ کرده و شروع به رشد و تکثیر نموده اند.

در حالت طبیعی بعد از پانچ گوش خرگوش، رشد اپی تلیوم گوش خرگوش نژاد نیوزلندی به صورت رشد به طرف مرکز می باشد و این باعث ترمیم سوراخ ایجاد شده در گوش خرگوش در شرایط in vivo می‏گردد. در اینجا از این خاصیت گوش خرگوش استفاده شد و بعد از قرار دادن حلقه بلاستمایی در مجاورت داربست، برهمکنش آن در روزهای مختلف بررسی گردید (26). توسلی و همکاران (27) با کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی نشان دادند که کشت بافت بلاستما که دارای سلول های پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد می تواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایطin vitro  باشد.

مطالعه در روز پنجم بعد از کشت نشان داد که هیچ سلولی به درون داربست مهاجرت نکرده است. مهاجرت سلول های بلاستمایی از روز پانزدهم بعد از کشت آغاز شد و اوج نفوذ سلول ها به درون داربست در روز بیست و پنجم مشاهده شد. در این روز تغییر شکل سلول های بافت بلاستما و کشیده شدن این سلول‏ها را می‏توان مشاهده کرد.

Yamada K و همکارانش (28) با کشت فیبروبلاست های لثه بر روی اسفنج هایی از کلاژن نوترکیب تیپ I وIII انسانی کشت دادند و این اسفنج را در محیط کشت قرار داده، تکثیر فیبروبلاست ها پس از چند روز در داربست محتوی کلاژن تیپ III نسبت به نوع I بیشتر بود و نشان دادند که این لثه تشکیل شده در محیط کشت به دلیل تکثیر خوب سلولی و آزاد شدن فاکتور رشد مشتق شده از اندوتلیال رگی در محیط کشت می تواند در درمان کلینیکی برای بیماریهای لثه استفاده شود. با توجه به این که بافت لثه کامی شامل مقادیر بالایی کلاژن نوع I و III می باشد در نتیجه می تواند عاملی برای القاء تمایز سلول‏های بافت بلاستما به سمت فیبروبلاست باشد.

 

نتیجه گیری

نتایج ما در بخش اول این پژوهش یعنی سلول زدایی از بافت لثه کامی انسان و تشکیل یک داربست سه بعدی از ECM این بافت نشان داد که غلظت‏های متفاوتی از دترجنت یونی SDS که به طور گسترده در فرایند‏های سلول زدایی مورد استفاده قرار می‏گیرد، نتایج متفاوتی را در پی دارد. نتایج این تحقیق نشان می‏دهد امکان تهیه یک داربست طبیعی از بافت لثه کامی به وسیله تیمار با SDS وجود دارد. ما در قسمت پایانی این آزمایش جهت تست داربست، از سلول‏های شبه جنینی بافت بلاستما لاله گوش خرگوش نر نیوزلندی برای کشت در داربست سه بعدی تهیه شده با غلظت 1 درصد که به طور کامل سلول زدایی شده بود استفاده کردیم تا تاثیرات ماتریکس خارج سلولی را بر روی این سلول های تمایز نیافته مشاهده کنیم. نتایج اولیه و بررسی‏های هیستولوژیکی نشان داد که داربست‏های سلول زدایی شده لثه کامی می‏تواند مدل سه بعدی مناسبی برای حرکت، تمایز، چسبندگی و مهاجرت سلول‏ها باشد.

 

تشکر و قدردانی

مراتب سپاس بی پایان خود را از تمامی اساتید بزرگوارم ابراز داشته و همچنین از مدیریت محترم گروه زیست شناسی و معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد مشهد که تامین کننده بخشی از هزینه‏های مالی پایان نامه‏ام بودند تشکر می‏نمایم.

 

 

1. Ennett AB, Mooney DJ. Tissue engineering strategies for in vivo neovascularisation. Expert. Opin. Biol. Ther. 2002; 2:805–818.

2. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science. 1993; 260: 920-926.

3. Koh CJ, Atala A. Tissue engineering, stem cells and cloning: opportunities for regenerative medicine. Journal of American Society of Nephrology. 2004; 15: 1113-1125.

4. Cao Y, Lees J. Scaffolds, stem cells and tissue engineering: A potent combination. Australian Journal of Chemistry. 2005; 58(10): 691-703.

5. Ranjna C, Aroop K. Comprehension of ECM-Cell dynamics: A prerequisite for tissue regeneration. Biotechnology Advances. 2010; 28: 764–769.

6. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006; 27: 3675–3683.

7. Yoshito Ikada. Challenges in tissue engineering: J. R. Soc. Interface. 2006;3(10): 589–601.

8. Darnell Kaigler, David Mooney. Tissue Engineering’s Impact on Dentistry. Journal of dental education. 2001; 65: 691-703.

9. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 13625–13630.

10. Thibodeau B, Teixira F, Yamauchi M, Caplan D, Trope M. Pulp revascularization of immature dog teeth with apical periodontitis. J Endod. 2007; 33: 68-90.

11. Feng Z, Yamato M, Akutsu, Nakamura T, Okano T, Umezu M. Investigation on the mechanical properties of contracted collagen gels as a scaffold for tissue engineering. Artificial Organs. 2003; 27: 84–90.

12. Paul GJ, Gerjo JVM, Carel DA, Henriette L. A new in vivo model for testing cartilage grafts and biomaterials: the rabbit pinna punch-hole model. Biomaterials. 2001; 22: 1407-1414.

13. Brown B, Lindberg K, Reing J, Stolz DB, Badylak SF. The basement membrane component of biologic scaffolds derived from extracellular matrix. Tissue Eng  2006; 12(3): 519–526.

14. Alhamdani MS, Schroder C, Werner J, Giese N, Bauer A, et.al. Singlestep procedure for the isolation of proteins at near-native conditions from mammalian tissue for proteomic analysis on antibody microarrays. J Proteome Res 2010; 9(2): 963-971.

15. Reing JE, Brown BN, Daly KA, Freund JM, Gilbert TW, Hsiong SX, et al. The effects of processing methods upon mechanical and biologic properties of  porcine dermal extracellular matrix scaffolds. Biomaterials  2010; 31(33): 8626-8633. 16. Yang B, Zhang Y, Zhou L, Sun Z, Zheng J, Chen Y, et al. Development of a porcine bladder

 

acellular matrix with well-preserved extracellular bioactive factors for tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 2010; 16(5): 1201-1211.

17. Schaner PJ, Martin ND, Tulenko TN, Shapiro IM, et.al. Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering. Journal of Vascular Surgery. 2004; 40: 146-153.

18. Liang R, Woo SL, Nguyen TD, Liu PC, Almarza A. Effects of a bioscaffold on collagen fibrillogenesis in healing medial collateral ligament in rabbits. J Orthop Res. 2008; 26(8): 1098–1104.

19. Bock N, Riminucci A, Dionigi C, Russo A, et.al. A novel route in bone tissue engineering: Magnetic biomimetic scaffolds. Acta Biomaterialia. 2010; 6: 786–796.

20. Karring T, Lang NP, Loe H. Rol of connective tissue in determining epithelial Differentiation. J.Perio.Res. 1974; 10: 1792-1798.       

21. Ledo Arin, N: An experimental analysis of liver development. Med.biol. 1975; 53: 427-432.

22- Mackenzie IC, Fusening E. Regeneration of organized ephithelial structure. J.Invest. Dermato. 1983; 81: 1895-1903.

23. Ott CH. Matthiesen ST, Goh KS, Black DL et.al. Perfusion- decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 2008; 14:213-221. 

24. Guo-feng LIU, Zhi-juan HE, Xue-feng HAN, et.al. Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft. Chinese medical journal. 2008; 121(15): 1389-1406.

25. Long L, Wu C , Pan L, Qi X , et.al, Preparation of heart valve scaffold and cell seeding. Sheng Wu Yi, Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2004; 21(4):610-623.

26. Gardiner, DM, Muneoka K, Bryant SV. The migration of dermal cells during blastema formation in axolotls. Dev Biol. 1986; 118(2): 488-493.

27. Tavassoli A, Shahabipour F, Mahdavi Shahri N, Moghadam Matin M, Fereidoni M. [In vitro experimental study of interaction between blastema tissue and three-dimensional matrix derived from bovine cancellous bone and articular cartilage.] Journal of Cell & tissue. 2010; 1(1): 53-62. Persian.

28. Yamada K, Yamaura J, Katoh M, Hata K, et.al. Fabrication of cultured oral gingiva by tissue engineering techniques without materials of animal origin. J Periodontol. 2006; 77(4): 672-677.