مقایسه رفتار سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت و سلول‏های بلاستمایی لا له گوش خرگوش کاشته شده در داربست بافت فاقد سلول لثه انسان

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه تهیه ماتریکس‏های سه بعدی از بافت لثه انسان و مقایسه القا رفتارهای سلول‏های بنیادی مزانشیمی و بلاستمایی در داربست‏های تهیه شده بود. 
مواد و روش‏ها: بافت‏های حاصل از جراحی‏های لثه در کلینیک دندانپزشکی با استفاده از دو شوینده سدیم دودسیل سولفات و تریتون  X-100 سلول‏زدایی شدند و پس از مراحل شستشو و استریلیزاسیون، به عنوان داربستی جهت کشت با سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت مورد استفاده قرار گرفتند. این داربست ها قبل و پس از1،2و4 هفته کشت سلول بر روی آن ها با استفاده از میکروسکوپ نوری و الکترونی بررسی شدند. همچنین داربست سه بعدی تهیه شده، در حلقه بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش قرار داده شد و نمونه‏ها پس از 1، 2و4 هفته بعد از کشت بر اساس تکنیک‏های هیستولوژی مورد ارزیابی قرار گرفتند.
نتایج: مطالعه داربست‏ها با میکروسکوپ الکترونی نگاره حفظ ماتریکس اپی‏تلیوم و رشته های کلاژن موجود در بافت را نشان داد. در هر دو نمونه ساختارهایی مشابه اپی‏تلیوم ایجاد گردید. علاوه بر آن در سلول‏های بلاستمایی مهاجرت یافته به داربست، القا ترشح سلولی نیز مشاهده شد.
نتیجه گیری:  داربست حاصل از لثه انسان، می‌تواند بستر مناسبی جهت بررسی رفتارهای سلولی باشد. البته آزمایش‏های بیشتر جهت تعیین ماهیت سلول‌های تمایزیافته می‌توانند به پیشرفت دانش ما در رابطه با برهم‌کنش‌های سلول ماتریکس کمک کنند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

هر بافتی در بدن از سلول‏ها و یک ماتریکس خارج سلولی تشکیل شده که ماتریکس نقش یک داربست سه بعدی را دارد. سلول‏ها در سطح این داربست قرار می گیرند و به طور مداوم با آن در تعامل هستند (2و1).

داربست‏های سنتزی و طبیعی از انواع داربست‏های مورد استفاده در مهندسی بافت می‏باشند (3). از آنجا که در داربست‏های بیولوژیکی مشتق از بافت‏ها و اندام‏های سلول‏زدایی شده، آنتی ‏ژن‏های سلولی  حذف شده و بسیاری از پروتئین‏های ساختاری و عملکردی ماتریکس خارج سلولی حفظ می‏شوند، این داربست‏ها به طور موفقیت آمیزی در مهندسی بافت مورد استفاده قرار گرفته‏اند. هدف از فرایند سلول‏زدایی، برداشت مواد سلولی و هسته‏ای و در عین حال حفظ یکپارچگی و به حداقل رساندن هر گونه آسیب  به ترکیب و فعالیت زیستی ماتریکس خارج سلولی می‏باشد. تاکنون مطالعات زیادی در  زمینه روش‏های آماده سازی داربست‏ها صورت گرفته و بافت‏های مختلفی از جمله مثانه، سیستم عروقی، دریچه های قلب، غضروف زانو، رباط و تاندون به منظور تولید جایگزین‏های بافتی، سلول‏زدایی شده‏اند و در بسیاری از این مطالعات از سدیم دودسیل سولفات (SDS) و یا تریتون برای سلول زدایی بافت استفاده شده است (4).

بافت مخاط دهان از دو جز شامل اپی تلیوم سنگفرشی مطبق و بافت همبند در زیر آن تشکیل شده است. در بافت همبند، دونوع رشته اصلی کلاژن (بیشتر نوع I و III) و الاستین مشاهده می‏شود. این بافت دارای اجزا سلولی و خارج سلولی است که جز خارج سلولی شامل الیاف و ماده زمینه‏ای است و این ماده زمینه‏ای فضای موجود در بین سلول ها و الیاف را پر می کند و حاوی مقدار زیادی آب، پروتئوگلیکان‏ها (اسید هیالورونیک و کندرویتین سولفات) و گلیکوپروتئین‏ها (عمدتا فیبرونکتین) می‏باشد (5).

Yamada و همکارانش (6) فیبروبلاست‏های لثه را بر روی اسفنج هایی از کلاژن نوترکیب نوع I و III انسانی کشت و این اسفنج را در محیط کشت قرار دادند. تکثیر فیبروبلاست‏ها پس از چند روز در داربست محتوی کلاژن نوع III نسبت به نوع I بیشتر بود.

Izumi و همکارانش (7) سلول‏های اپی‏تلیال گرفته شده از مخاط دهان بیمار را 4 هفته قبل از جراحی روی یک ماتریکس درم آلوژنیک فاقد سلول (آلودرم) کشت دادند و از آن برای پیوند

 داخل دهانی استفاده نمودند.

یکی از سلول‏های مورد استفاده در مهندسی بافت‏های مختلف، سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏باشد. در ابتدا تصور  بر این بود که پتانسیل تمایزی این سلول‏ها محدود به دودمان‏های سلولی مزانشیم است (5). اما بعدها مشخص گردید که در شرایط متفاوت کشت، توانایی تمایز به سلول‏هایی با منشا غیر مزانشیم را نیز دارا می‏باشند (8). از این رو از سلول‏های بنیادی مزانشیم    در درمان آسیب‏های نخاعی، ایسکمی‏های  میوکاردی، آسیب به استخوان، بیماری‏های نورودژنراتیو و پوست استفاده گردیده است (9و10).

سلول‏ها در طی تمایز کراتینوسیتی دستخوش تغییرات اسکلت سلولی و مورفولوژیکی می‏گردند. تغییر مورفولوژیکی اصلی پهن شدن پیش رونده سلول می‏باشد. همچنین اجسام غشا دار مختلف شامل گرانول کراتوهیالین درون سلول پدیدار می‏گردند. علاوه بر این، اتصالات دسموزومی میان سلول‏ها تشکیل شده و در ادامه روند تمایز، بخش عمده‏ای ازماکرومولکول‏ها و اندامک‏های درون سلولی از بین می‏روند (11). زمانی که زخمی ایجاد می گردد، نه تنها کراتینوسیت‏های موجود در مجاورت زخم، بلکه کراتینوسیت‏های موجود درضمایم پوستی نیز به بستر زخم مهاجرت می‏کنند و جزایر کوچکی تشکیل داده و در بازسازی اپیتلیوم مشارکت می‏نمایند (12).

سلول‏های بافت بلاستما، که در ناحیه سوراخ شده لاله گوش خرگوش بصورت حلقوی تشکیل می‏گردد سلول‏های با ویژگی سلول‏های بنیادی بوده و می توانند تحت تاثیر عوامل محیطی در جهات مختلف تمایز یابند (13).

هدف از انجام این مطالعه بررسی تعامل بین سلول‏های بنیادی مزانشیمی در مقایسه با سلول‏های بافت بلاستمای لاله گوش خرگوش در داربست سه بعدی طبیعی بدست آمده از بافت لثه انسان می‏باشد.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‏های لثه انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید. نمونه ها متعلق به مردان و زنان 20 تا 40 ساله، فاقد بیماری‏های سیستمیک و غیرسیگاری بودند که جهت درمان‏های ترمیمی-پروتز و جراحی دندان عقل نهفته به کلینیک مراجعه نموده بودند. قطعات لثه حاصل از جراحی ها در سرم فیزیولوژی و در دمای صفر درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. پس از جدا نمودن قطعات اضافی، اندازه بافت ها به 6×3 میلی‏متر رسید. به منظور سلول‏زدایی بافت ها، نمونه‏ها بمدت 2 دقیقه جهت انجماد سریع وارد ازت مایع گردیدند و سپس برای ذوب شدن سریع به مدت 5 دقیقه در آب مقطر وارد شدند. این فرایند انجماد- ذوب، 6 بار تکرار شد و بعد از آن از محلول 1 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) (Cinna Gen, Iran) به مدت 24 ساعت و سپس محلول 1 درصد تریتون X-100 (Cinna Gen, Iran) به مدت 12 ساعت استفاده گردید. به منظور خروج شوینده ها از بافت، نمونه ها به مدت 2 ساعت در بافر نمکی فسفات PBS)) (Bio Gene, UK) قرار گرفتند (14، 15و16). به منظور استریلیزاسیون داربست ها، نمونه ها به مدت 30 دقیقه در اتانل 70 درصد قرار گرفتند و پس از شستشو با آب مقطر استریل، به مدت 1 ساعت در PBS استریل قرار داده شدند.

 برای آماده سازی سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell،                 (BM-MSCs) رت نر بالغ نژاد ویستار با استفاده از                   کلروفرم بی‏هوش و استخوان ران آن در شرایط کاملا                  استریل جدا گردید. ابتدا دو سر استخوان جدا                       و محتویات آن با تزریق محیط کشت(Gibco, USA) (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) DMEM حاوی 10 درصد سرم جنینی گاو (FBS) (Gibco, USA) و 10 میکرو لیتر پنی سیلین/ استرپتومایسین (Biosera, UK) به داخل آن استخراج شد و سپس سوسپانسیون حاصل به فلاسک کشت انتقال و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد وCO2  5 درصد نگهداری گردید. 24ساعت پس از کشت اولیه، محیط رویی خارج و سلول‏های چسبیده به کف فلاسک باقی ماندند (17). محیط کشت سلول‏ها هر 3 الی 4 روز یک بار تعویض گردید و سلول‏ها پس از پاساژ چهارم مورد  استفاده قرارگرفتند.

در گروه  Aبرای کشت سلو ل‏ها بر روی داربست‏های سلول‏زدایی شده  لثه، ابتدا آن ها را تریپسینه نموده تا از فلاسک جدا گردند. پس از سانتریفیوژ و تعیین تعداد سلول‏ها با لام نئوبار، سوسپانسیون سلولی با تراکم 105×2 سلول در 50 میکرولیتر تهیه گردید. داربست ها پس از 24 ساعت نگهداری در محیط کشت، در ظروف کشت 24 خانه ای قرار گرفتند و105×2 سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان برروی آن‏ها کشت شد (شکلA1).  یک ساعت پس از افزودن سوسپانسیون سلولی به داربست‏ها، به هر چاهک 1 میلی‏لیتر محیط کشت افزوده شده و ظرف کشت به انکوباتور انتقال یافت و هر 3 تا 4روز یک بار محیط کشت آن تعویض گردید. در گروه B، جهت تهیه بافت بلاستما از خرگوش های نر سفید نژاد نیوزلندی 6 تا 8 ماهه با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه تحقیقاتی سرم سازی رازی مشهد تهیه شده بودند، استفاده گردید. در تمام زمان استفاده از این حیوانات، آن ها در حیوان خانه دانشگاه نگهداری شدند و تحت یک رژیم غذایی پایه به صورت انفرادی در قفس و با درجه حرارت کنترل شده 2± 20 درجه سانتی‏گراد و روشنایی 12 ساعت در شبانه روز قرار داشتند. در تمامی مراحل انجام این پژوهش، مصوبات مربوط به اصول کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت گردید. بعد از بی حس کردن گوش خرگوش توسط لیدوکائین با استفاده از دستگاه پانچه چند سوراخ به قطر 2 میلی‏متر در لاله گوش خرگوش  ایجاد شد و بعد از گذشت سه روز، در محل مربوطه پانچ دیگری به قطر 4 میلی‏متر زده شد  وحلقه‏ی بلاستمایی جدا گردید. بعد از جدا سازی حلقه بلاستمایی، جهت آلودگی زدایی، حلقه‏ها 7 بار با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده شدند و سپس در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل، داربست‏های تهیه شده در میان حلقه‏های بلاستمایی تهیه شده قرار داده شدند (تصویر B1). در این مطالعه از محیط کشتDMEM  و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با CO2 5 درصد استفاده شد.

 

 

 

شکل1:A ) کشت  سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان روی داربست. B) قرار گرفتن داربست در داخل حلقه بلاستمایی.

 

در بررسی‏های بافت شناسی به منظور بررسی مهاجرت سلول‏ها به داربست مراحل پاساژ بافت مطابق روش معمول انجام شد و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (H&E)، پیکروفوشین،  پیک ایندیگو کارمین و رنگ آمیزی پاس- پیک اندیگو صورت گرفت. در رنگ آمیزی پیکروفوشین (مخلوط 100 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع + 1/0 گرم  پودر فوشین اسید) کلاژن قرمز آتشین و اپی تلیوم زرد یا کرمی رنگ  می‏شود. رنگ پیک ایندیگو (مخلوط 100 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع  +1/0 گرم پودر ایندیگوکارمین) به عنوان یک رنگ اختصاصی با شدت‏های اسیدوفیلی متفاوت می باشد. با این رنگ، زمینه که ماتریکس بافت همبند و کلاژن است به همراه اپی تلیوم به رنگ سبز مغز پسته‏ای در می آید و هسته ها با رنگ هماتوکسیلین قهوه ای کم رنگ می‏شوند. از معرف پریودیک اسید – شیف (PAS) برای جستجو و بررسی گلیکوپروتئین‏ها  استفاده می‏شود. در تکنیک پاس ترکیبات موکوسی حاوی اسید سیالیک و هگزوزها به رنگ صورتی یا قرمز یا مایل به ارغوانی براق در می‏آیند.

در مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)                     (Leo-VP1450, Germany) به منظور تهیه تصاویر، نمونه‏ها با گلوتارآلدئید و اسمیم تتراکساید ثابت و  با درجات صعودی اتانل آبگیری شدند. پس از خشک شدن، نمونه‏ها روی گرید قرار گرفتند و  با پوشش طلا-  پالادیوم پوشانده شده و تصویر برداری انجام شد.

در بررسی میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM)               (Leo-910, Germany) جهت تهیه مقاطع میکروسکوپی، نمونه‏ها با گلوتارآلدئید و اسمیم تتراکساید ثابت و با درجات صعودی اتانل آبگیری شدند و پس از آغشتگی با رزین قالب گیری شدند. سپس از نمونه‏ها مقاطع نازک با ضخامت 80 نانومتر تهیه و رنگ آمیزی شده با میکروسکوپ الکترونی گذاره مشاهده و عکسبرداری شدند.  

 

نتایج

در این مطالعه بافت لثه انسان طی مراحل مختلف سلول‏زدایی شده و به عنوان داربست و عامل القاکننده‏ای برای تمایز      BM-MSCs رت و سلول‏های بلاستمایی استفاده گردید. برای سلول‏زدایی از انجماد سریع در ازت مایع، سپس 1 درصد SDS  به مدت 24 ساعت و تریتون 1 درصد به مدت 12ساعت استفاده گردید. اجزای سلولی طی فرآیند سلول زدایی بطور کامل از بافت لثه حذف شدند (شکل2).

به منظور بررسی بیشتر و دقیق تر تغییرات ساختاری بافت لثه طی فرآیندهای آماده سازی، داربست  تهیه شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره مورد مطالعه قرار گرفت. همانطور که شکل3 نشان می دهد، ساختار کلی بافت لثه پس ازفرآیند سلول‏زدایی حفظ شده (A3) و اپی تلیوم لثه مانند یک توری خالی از سلول (B3) و متصل به بافت همبند باقی مانده است. علاوه بر این رشته های کلاژن بافت همبند نیز سالم و دست نخورده مانده‏اند (D3).

 

 

 

 

شکل2: لثه انسان قبل (A) و بعد (B) از فرآیند سلول زدایی (رنگ آمیزی پیک ایندیگو). پیکان ها مشخص کننده هسته سلول ها می باشند.

 

 

شکل3: بررسی لثه انسان پس از سلول زدایی با میکروسکوپ الکترونی نگاره. A) حفظ ساختار کلی لثه انسان پس ازسلول زدایی. شکلB ) اپی تلیوم را به صورت یک توری خالی از سلول و شکل C و D به ترتیب رشته های کلاژن را قبل و پس از سلول زدایی نشان می دهد.

 

 

در این مطالعه در گروهA  از سلول های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت ویستار برای کشت بر روی داربست لثه استفاده گردید. بر اساس شکل4 سلول‏ها در هفته اول توانستند یک لایه بر روی اپی‏تلیوم، تشکیل دهند. درهفته دوم این سلول‏ها تکثیر یافته و ساختاری مشابه اپی تلیوم را به وجود آوردند. در هفته چهارم سلول‏ها ظاهر کشیده و دوکی شکل داشته و ساختارهای منظم تری را تشکیل داده بودند. سلول های بنیادی مغز استخوان رت در هفته اول کشت توانستند روی داربست استقرار یافته و پاهای کاذب تشکیل دهند. در شکل 5 پاهای کاذب سلول‏ها با دید میکروسکوپ الکترونی نگاره و گذاره مشخص می‏باشد. شکل6 سلول‏ها را در هفته دوم کشت با دید میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان می‏دهد که اتصالات دسموزومی تشکیل داده‏اند. در گروه B، پس از کشت داربست با بلاستما در هفته اول سلول‏هایی از بافت بلاستما، در حال نفوذ به داربست مشاهده می‏شدند. هفته دوم  بعد از کشت، سلول‏های بیشتری به داربست نفوذ و تعداد سلول‏های موجود در داربست افزایش یافته بودند. در هفته چهارم تشکیل ساختارهای مشابه اپی‏تلیوم در سطح داربست مشاهده شد (شکل4). علاوه بر این در گروه B  از هفته دوم رفتارهای ترشحی (پاسخ پاس مثبت) نیز در سلول‏های مهاجرت یافته به داربست مشاهده شد (شکل7 و جدول 1).

 

 

جدول 1: رفتارهای سلولی مشاهده شده در طی دوره مورد مطالعه. مشاهده (+) و عدم مشاهده (-) . نتایج حاصل یک بررسی کیفی است.

رفتار سلولی

 

نوع سلول

چسبندگی

(اتصالات دسموزومی)

مهاجرت

(تشکیل پاهای کاذب)

تقسیم سلولی

ترشح سلولی

سلول‏های بنیادی مزانشیمی

+

+

+

_

سلول‏های بلاستما

+

+

+

+

 

 

شکل 4: مقایسه برهم‌کنش سلول‌های بنیادی مزانشیمی (A،Cو E) و سلول های بلاستمایی (B،DوF) با ماتریکس خارج سلولی لثه.

لایه جدید شبه اپی تلیوم در هفته اول (A)، در هفته دوم (C) (رنگ آمیزی پیک ایندیگو) و در هفته چهارم (E) (رنگ آمیزی کارمین).

نفوذ سلول‌های بلاستمایی به داربست در هفته اول پس از کشت (B دو هفته پس از کشت (D) (رنگ آمیزی  هماتوکسیلین- ائوزین) و تشکیل لایه‏های شبه اپی تلیوم در هفته چهارم (F) (رنگ آمیزی پیکروفوشین).

 

 

شکل 5: تشکیل پاهای کاذب سلول ها  در هفته اول کشت سلول های بنیادی مزانشیمی. A) سلول ها از نمای میکروسکوپ SEM. B) پای کاذب سلول از نمای میکروسکوپ TEM. (ستاره، نمایانگر پاهای کاذب سلول ها می باشد(.

 

شکل 6: تشکیل اتصالات دسموزومی توسط سلول‏های بنیادی مزانشیمی در هفته دوم کشت و تمایز احتمالی  به سمت سلول‏های شبه کراتینوسیت را نشان می‏دهد (علامت پیکان نمایانگر اتصالات دسموزومی است(.

 

 

 

شکل 7: مقطع عرضی از حلقه بلاستما با داربست در روزهای مختلف بعد از کشت. A) فلش ها تغییر رنگ حاشیه‏ی داربست را که در اثر نفوذ سلول‏ها دو هفته بعد از کشت ایجاد شده است را نشان می‏دهند.  B) سلول‏های بلاستمایی پاس مثبت نفوذ یافته به داربست در هفته دوم بعد از کشت. C) سلول‏های بلاستمایی پاس مثبت نفوذ یافته به داربست، چهار هفته بعد از کشت (رنگ آمیزی پاس پیک ایندیگو)

 

 

 

 

بحث

در این پژوهش تلاش گردید ابتدا لثه انسان را با استفاده از روش‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی نموده و سپس از آن به عنوان داربستی جهت کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت ویستار (گروه A) و همچنین سلول‏های بلاستمایی لاله گوش خرگوش (گروهB ) استفاده شود.

در مطالعات اخیر از ماتریکس سلول زدایی شده بافت‏های غضروف، استخوان، میزنای، رگ بند ناف و درم به عنوان داربست در مهندسی بافت استفاده گردیده است (18-23).  در این مطالعه نیز ماتریکس سلول‏زدایی شده لثه انسان به دلیل دارا بودن مقادیر بالای کلاژن و همچنین وجود سیتوکراتین‏های مختلف در بافت همبندش به عنوان داربست و بستری جهت القای مهاجرت و تمایز سلولی استفاده گردید (24).

مطالعات مختلف آثار تخریبی روش‏های سلول‏زدایی و استریلیزاسیون بر ساختمان بافت را گزارش نموده‏اند (14و25)، اما بر اساس مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره، بافت لثه پس از مراحل آماده سازی، ساختمان کلی خود را حفظ  نمود و ماتریکس اپی تلیوم نیز متصل به بافت همبند زیرینش باقی ماند. علاوه بر این، رشته های کلاژن موجود در بافت همبند نیز سالم مانده بودند.

Wu و همکارانش (26) نشان دادند که BM-MSCs درمان زخم را در موش های دیابتی و غیردیابتی با افزایش تشکیل مجدد اپی‏درم، نفوذ سلولی و رگ زایی بهبود بخشیدند. بخش مهمی از این سلول‏ها زیر واحدهای سیتوکراتین را بیان نمودند و ساختارهای دانه‏ای شکل و علاوه بر آن ساختارهایی مشابه غدد عرق یا چربی را تشکیل دادند.

در مطالعه حاضر BM-MSCs پس از استقرار بر روی ماتریکس‌ اپی تلیوم قبلی، پهن شده و تک لایه‏ای بر روی آن تشکیل دادند و در هفته دوم سلول ها تقسیم شدند و ساختاری چندلایه را بوجود آوردند. مطالعات میکروسکوپ الکترونی گذاره  نشان داد که این سلول‏ها اتصالات دسموزومی تشکیل دادند. این مشاهدات پیشنهاد می‏کند که احتمالا سلول‏های BM-MSCs در اثر القای داربست لثه انسان شروع به تمایز به سمت کراتینوسیت‏ها نموده‏اند. گر چه جهت تعیین سرنوشت کراتینوسیتی، مطالعات تکمیلی از جمله روش‏های مولکولی و یا ایمنوسیتوشیمی ضروری می‏نماید.

مطالعات نشان می‏دهند که ماتریکس بافت همبند لثه موجب القای کراتینیزه شدن در سلول‏ها می‏گردد (11).  در مطالعاتی که از هیدروژل های کلاژنی به عنوان معادل های درمی استفاده گردید، پایداری ضعیف اپی تلیوم بر روی داربست، تمایز ناقص آن و تخریب داربست در مراحل اولیه مشاهده شد (27). در حالی که  نتایج این طرح نشان داد که ماتریکس باقی مانده از اپی تلیوم می تواند بستر مناسبی جهت اتصال محکم سلو ل ها به آن را فراهم نماید.

گروهی از محققین، فیبروبلاست‏های لثه‏ای و درمی انسانی را در ماتریکس سه بعدی کلا‍ژن به منظور مطالعه تغییرات ماتریکس کشت دادند و ترشح ماتریکس خارج سلولی را توسط این دو نوع سلول بررسی کردند. آنها با مطالعه‏ی metalloproteinases matrix (MMPs) دریافتند که بیان این فاکتورها در ابتدا در سیتوپلاسم سلولی سلول‏های فیبروبلاستی کشت داده شده، متمرکز بوده و سپس در ترکیبات خارج سلولی توزیع شده است (28).

Qi و همکارانش (29) نیز تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از سینوویوم رت را در داربست آلژینات نشان دادند. آن‌ها از چندین عامل القاکننده تمایز کندروژنیک شامل     TGF-β3 ،BMP-2 ، پرولین، پیرووات، آسکوربات-2 فسفات و دگزامتازون استفاده نمودند و تکثیر سلولی، تولید ماتریکس جدید و تمایز کندروژنیک سلول‌ها را مشاهده کردند.

در مورد کشت سلول‏های بلاستمایی علاوه بر ایجاد ساختارهای شبه اپی‏تلیوم، از نکات مورد توجه که از هفته دوم، مشاهده و در روز های بعد شدت و وسعت بیشتری یافته بود، تغییر ترکیبات داربست در اثر بر هم کنش با سلول های بلاستمایی بود (جدول 1). نواحی از داربست که محل نفوذ و استقرار سلول‏های بلاستمایی بود نسبت به رنگ پاس- پیک ایندیگو، پاسخ مثبت نشان داد. لذا می توان نتیجه گرفت که در مطالعه حاضر سلول‏ها بلاستمایی همزمان با نفوذ به داربست، شروع به سنتز و ترشح ترکیباتی به درون داربست کرده‏اند (شکل7).  

نتیجه گیری

ماتریکس سلول‏زدایی شده لثه انسان  توانست در هر دو گروه  A و B موجب استقرار سلول‏ها و تشکیل ساختارهای مشابه اپی‏تلیوم گردد. بر اساس یافته های ما در این پژوهش می توان بیان کرد که  احتمالا سلول‏های منشا گرفته از بافت بلاستما در مقایسه با سلول‏های بنیادی مزانشیمی قابلیت حیات بیشتری داشته‏اند زیرا طبق مطالعات هیستولوژیکی، در هفته چهارم بعد از کشت سلول‏های بلاستمایی مشاهده شده در داربست دارای هسته‏های روشن و بزرگ بودند، و این در حالی است که در مورد سلول‏های بنیادی مزانشیمی، هسته‏ها به صورت نکروزه مشاهده می‏شدند. بنابراین احتمالا بافت بلاستمایی می‏تواند منبع مناسب‏تری برای مطالعه فرایند مهاجرت سلولی و القاء ترشحات سلولی باشد.

 

تشکر و قدردانی

این طرح به پشتیبانی و حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد و با حمایت پژوهشکده فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد و از محل بودجه مصوبه مربوط به طرح شماره 37145 با عنوان "مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربست‏های سه بعدی (Bioscaffold  یا 3D matrix) به منظور کاربرد در مهندسی بافت " و با همکاری دکتر سید علی بنی هاشم راد خانم‌ مروارید ساعی نسب انجام شده است که بدین وسیله مراتب قدردانی از ایشان اعلام می‌گردد.

 

1. Müh E, Zimmermann J, Kneser U, Marquardt J, et al.  Lysineurethanedimethacrylate-a novel generation of amino acid based monomers for bone cements and tissue repair. Biomaterials. 2002; 23: 2849-2854.

2. Agrawal CM, Ray RB. Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering. J Biomed Mater Res. 2001;  55: 141-150.

3. Naderi H, Matin MM, Bahrami AR. Review paper: Critical Issues in Tissue Engineering: Biomaterials, Cell Sources, Angiogenesis, and Drug Delivery Systems. J Biomater Appl. 2011; 26, 383-417.

4. Abousleiman RI, Reyes Y, McFetridge P, Sikavitsas V .The human umbilical vein: a novel scaffold for musculoskeletal soft tissue regeneration. Artif Organs. 2008; 32:735-742.

 

5. Yura T, Osataka H, Inoue T. Three-Dimensional structure of connective tissue papillae in the human gingiva. Yonago Acta medica. 2000; 43)1): 39-46.

6. Yamada K, Yamaura J, Katoh M, Hata K, et al. Fabrication of cultured oral gingiva by tissue engineering techniques without materials of animal origin. J Periodontology. 2006; 77:672-677.

7. Izumi K, Ferinberg SE, Iida A, Yoshizawa M .Intraoral grafting of an ex vivo produced oral mucosa equivalent: a preliminary report. Int J Oral Maxillofac Surg. 2003; 32:188-197.

8. Musina RA, Bekchanova ES, Belyavskii AV, Sukhikh GT. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bull Exp Biol Med. 2006; 141:147-151.

9. Hwang NS, Zhang C, Hwang YS, Varghese S. Mesenchymal stem cell differentiation and roles in regenerative medicine. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2009; 1(1): 97-106.

10. Tran CT, Huynh DT, Gargiulo C, Nguyen PT, et al. In vitro culture of keratinocytes from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: the Saigonese culture. Cell Tissue Bank. 2011; 12(2): 125-133.

11. Eckert RL, Rorket EA. Molecular biology of keratinocyte differentiation. Environ Health Perspect. 1989; 80:109-116.

12. O'Toole EA. Extracellular matrix and keratinocyte migration. Experimental Dermatology. 2001; 26: 525-530.

13. Tsonis PA. Stem cell from differentiated cells. Molecular interventions. 2004; 4: 81-83.

14. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006; 27: 3675-3683.

15. Yarjanli Z, Mahdavi Shahri N, Moghaddam Matin M, Fereidoni M, et al. In Vitro Histological Investigation of Interactions between Rat s Mesenchymal Stem Cells and Human Gingival Matrix. J Mashhad Dental School. 2011; 36: 79-90.

16. Cheravi M, Mahdavi Shahri N, Baharara J, Banihashem Rad SA, et al. A Case Study of Decellularization of Human Palatal Gingiva Tissue and Preparation Three-Dimensional Model for Use in Primary Research Gingival Tissue Engineering. J. Cell &Tissue. 2011; 2: 107-116.

17. Dennis JE, Merriam A, Awadallah A, Yoo JU, et al. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res.1999; 14: 700-709.

18. Elder BD, Eleswarapu SV, Athanasiou KA. Extraction techniques for the decellularization of tissue engineered articular cartilage constructs. Biomaterials. 2009; 30: 3749-56.

19. Fröhlich M, Grayson WL, Marolt D, Gimble JM, et al. Bone grafts engineered from human adipose-derived stem cells in perfusion bioreactor culture. Tissue Eng Part A. 2010; 16:179-89.

20. Narita Y, Kagami H, Matsunuma H, Murase Y, et al. Decellularized ureter for tissue-engineered small-caliber vascular graft. J Artif Organs. 2008; 11:91-99. 

21. Abousleiman RI, Reyes Y, McFetridge P, Sikavitsas V. The human umbilical vein: a novel scaffold for musculoskeletal soft tissue regeneration. Artif Organs. 2008; 32: 735-742.

22. Clark JM, Saffold SH, Israel JM. Decellularized dermal grafting in cleft palate repair. Arch Facial Plast Surg. 2003; 5: 40-44.

23. Bannasch H, Stark GB, Knam F, Horch RE, et al. Decellularized dermis in combination with cultivated keratinocytes in a short- and long-term animal experimental investigation. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2008; 22: 41-9.

24. Tamizi M. Amouian B. Mahdavie N. Clinical and histological evaluation of the effect of storage time on healing and success of free gingival graft stored in normal saline. J M Dental S. 1996; 20:38-49.

25. Wiegand C, Abel M, Ruth P, Wilhelms T, et al. Effect of the sterilization method on the performance of collagen type I on chronic wound parameters in vitro. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2009; 90: 710-9.

26. Wu Y, Chen L, Scott PG, Tredget EE. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells. 2007; 25(10): 2648-59.

27. Stark HJ, Boehnke K, Mirancea N, Willhauck MJ, et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 2006; 11: 93-105.

28. Miller CC, Septier D, Lecolle BS, Decoster CL, et al. Human dermal and gingival fibroblasts in a three-dimensional culture:a comparative study on matrix remodeling. Clin Oral Invest , 2002; 6: 39–50.

29. Qi J, Chen A, You H, Li K, et al. Proliferation and chondrogenic differentiation of CD105-positive enriched rat synovium-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional porous scaffolds. Biomed Mater .2011; 6(1), 015006.