نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه تهیه ماتریکسهای سه بعدی از بافت لثه انسان و مقایسه القا رفتارهای سلول‌های بنیادی مزانشیمی و بلاستمایی در داربستهای تهیه شده بود.
مواد و روش‌ها: بافتهای حاصل از جراحیهای لثه در کلینیک دندانپزشکی با استفاده از دو شوینده سدیم دودسیل سولفات و تریتون X-100 سلول‌زدایی شدند و پس از مراحل شستشو و استریلیزاسیون، به عنوان داربستی جهت کشت با سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت مورد استفاده قرار گرفتند. این داربست ها قبل و پس از1،2و4 هفته کشت سلول بر روی آن ها با استفاده از میکروسکوپ نوری و الکترونی بررسی شدند. همچنین داربست سه بعدی تهیه شده، در حلقه بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش قرار داده شد و نمونهها پس از 1، 2و4 هفته بعد از کشت بر اساس تکنیکهای هیستولوژی مورد ارزیابی قرار گرفتند.
نتایج: مطالعه داربستها با میکروسکوپ الکترونی نگاره حفظ ماتریکس اپیتلیوم و رشته های کلاژن موجود در بافت را نشان داد. در هر دو نمونه ساختارهایی مشابه اپیتلیوم ایجاد گردید. علاوه بر آن در سلول‌های بلاستمایی مهاجرت یافته به داربست، القا ترشح سلولی نیز مشاهده شد.
نتیجه گیری: داربست حاصل از لثه انسان، می‌تواند بستر مناسبی جهت بررسی رفتارهای سلولی باشد. البته آزمایشهای بیشتر جهت تعیین ماهیت سلول‌های تمایزیافته می‌توانند به پیشرفت دانش ما در رابطه با برهم‌کنش‌های سلول ماتریکس کمک کنند.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Behavioral Comparison of Cultured Rat’s Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Rabbit’s Blastema in Scaffold of Decellularized Human Periodontal Tissue
چکیده [English]
Aim: The main goal of this research was to prepare three-dimensional matrix of gingival palate tissues and compare the behavior of bone marrow mesenchymal stem cells and blastema on the scaffolds.
Material and methods: The tissues obtained from gingival surgeries
in periodontal clinic were decellularized using detergents including sodium dodecyl sulfate and Triton X-100 then after washing and sterilization, were used as scaffold for culturing the rat’s mesenchymal stem cells. The scaffolds were studied by light and electron microscopy before and after 1, 2, and 4 weeks of culture. In addition the prepared scaffolds were assembled within the rings of blastema tissues from rabbit,s pinna. Then the scaffolds were similarly studied by histological techniques after 1, 2, and 4 weeks of culture.
Results: Scanning electron microscopy showed that epithelial matrix and collagen fibers in connective tissue remained intact. In both samples epithelium-like structures were observed. Also in the blastema cells migrating to the scaffolds cell secretion was also observed.
Conclusion: Human gingival matrix can be a suitable scaffold for studying the cell behaviors. More research should be carried out to determine the identity of differentiated cells, which finally can improve our knowledge regarding the cell-matrix interactions.
کلیدواژه‌ها [English]
- Mesenchymal stem cells
- Blastema tissue
- Gingiva
- 3D Matrix
مقدمه
هر بافتی در بدن از سلول‌ها و یک ماتریکس خارج سلولی تشکیل شده که ماتریکس نقش یک داربست سه بعدی را دارد. سلول‌ها در سطح این داربست قرار می گیرند و به طور مداوم با آن در تعامل هستند (2و1).
داربستهای سنتزی و طبیعی از انواع داربستهای مورد استفاده در مهندسی بافت میباشند (3). از آنجا که در داربستهای بیولوژیکی مشتق از بافتها و اندامهای سلول‌زدایی شده، آنتی ژنهای سلولی حذف شده و بسیاری از پروتئینهای ساختاری و عملکردی ماتریکس خارج سلولی حفظ میشوند، این داربستها به طور موفقیت آمیزی در مهندسی بافت مورد استفاده قرار گرفتهاند. هدف از فرایند سلول‌زدایی، برداشت مواد سلولی و هستهای و در عین حال حفظ یکپارچگی و به حداقل رساندن هر گونه آسیب به ترکیب و فعالیت زیستی ماتریکس خارج سلولی میباشد. تاکنون مطالعات زیادی در زمینه روش‌های آماده سازی داربستها صورت گرفته و بافتهای مختلفی از جمله مثانه، سیستم عروقی، دریچه های قلب، غضروف زانو، رباط و تاندون به منظور تولید جایگزینهای بافتی، سلول‌زدایی شدهاند و در بسیاری از این مطالعات از سدیم دودسیل سولفات (SDS) و یا تریتون برای سلول زدایی بافت استفاده شده است (4).
بافت مخاط دهان از دو جز شامل اپی تلیوم سنگفرشی مطبق و بافت همبند در زیر آن تشکیل شده است. در بافت همبند، دونوع رشته اصلی کلاژن (بیشتر نوع I و III) و الاستین مشاهده میشود. این بافت دارای اجزا سلولی و خارج سلولی است که جز خارج سلولی شامل الیاف و ماده زمینهای است و این ماده زمینهای فضای موجود در بین سلول ها و الیاف را پر می کند و حاوی مقدار زیادی آب، پروتئوگلیکانها (اسید هیالورونیک و کندرویتین سولفات) و گلیکوپروتئینها (عمدتا فیبرونکتین) میباشد (5).
Yamada و همکارانش (6) فیبروبلاستهای لثه را بر روی اسفنج هایی از کلاژن نوترکیب نوع I و III انسانی کشت و این اسفنج را در محیط کشت قرار دادند. تکثیر فیبروبلاستها پس از چند روز در داربست محتوی کلاژن نوع III نسبت به نوع I بیشتر بود.
Izumi و همکارانش (7) سلول‌های اپیتلیال گرفته شده از مخاط دهان بیمار را 4 هفته قبل از جراحی روی یک ماتریکس درم آلوژنیک فاقد سلول (آلودرم) کشت دادند و از آن برای پیوند
داخل دهانی استفاده نمودند.
یکی از سلول‌های مورد استفاده در مهندسی بافتهای مختلف، سلول‌های بنیادی مزانشیمی میباشد. در ابتدا تصور بر این بود که پتانسیل تمایزی این سلول‌ها محدود به دودمانهای سلولی مزانشیم است (5). اما بعدها مشخص گردید که در شرایط متفاوت کشت، توانایی تمایز به سلولهایی با منشا غیر مزانشیم را نیز دارا میباشند (8). از این رو از سلول‌های بنیادی مزانشیم در درمان آسیبهای نخاعی، ایسکمیهای میوکاردی، آسیب به استخوان، بیماریهای نورودژنراتیو و پوست استفاده گردیده است (9و10).
سلول‌ها در طی تمایز کراتینوسیتی دستخوش تغییرات اسکلت سلولی و مورفولوژیکی میگردند. تغییر مورفولوژیکی اصلی پهن شدن پیش رونده سلول میباشد. همچنین اجسام غشا دار مختلف شامل گرانول کراتوهیالین درون سلول پدیدار میگردند. علاوه بر این، اتصالات دسموزومی میان سلول‌ها تشکیل شده و در ادامه روند تمایز، بخش عمدهای ازماکرومولکولها و اندامکهای درون سلولی از بین میروند (11). زمانی که زخمی ایجاد می گردد، نه تنها کراتینوسیتهای موجود در مجاورت زخم، بلکه کراتینوسیتهای موجود درضمایم پوستی نیز به بستر زخم مهاجرت میکنند و جزایر کوچکی تشکیل داده و در بازسازی اپیتلیوم مشارکت مینمایند (12).
سلول‌های بافت بلاستما، که در ناحیه سوراخ شده لاله گوش خرگوش بصورت حلقوی تشکیل می‌گردد سلول‌های با ویژگی سلول‌های بنیادی بوده و می توانند تحت تاثیر عوامل محیطی در جهات مختلف تمایز یابند (13).
هدف از انجام این مطالعه بررسی تعامل بین سلول‌های بنیادی مزانشیمی در مقایسه با سلول‌های بافت بلاستمای لاله گوش خرگوش در داربست سه بعدی طبیعی بدست آمده از بافت لثه انسان میباشد.
مواد و روش‌ها
نمونههای لثه انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید. نمونه ها متعلق به مردان و زنان 20 تا 40 ساله، فاقد بیماریهای سیستمیک و غیرسیگاری بودند که جهت درمانهای ترمیمی-پروتز و جراحی دندان عقل نهفته به کلینیک مراجعه نموده بودند. قطعات لثه حاصل از جراحی ها در سرم فیزیولوژی و در دمای صفر درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از جدا نمودن قطعات اضافی، اندازه بافت ها به 6×3 میلیمتر رسید. به منظور سلول‌زدایی بافت ها، نمونهها بمدت 2 دقیقه جهت انجماد سریع وارد ازت مایع گردیدند و سپس برای ذوب شدن سریع به مدت 5 دقیقه در آب مقطر وارد شدند. این فرایند انجماد- ذوب، 6 بار تکرار شد و بعد از آن از محلول 1 درصد سدیم دودسیل سولفات (SDS) (Cinna Gen, Iran) به مدت 24 ساعت و سپس محلول 1 درصد تریتون X-100 (Cinna Gen, Iran) به مدت 12 ساعت استفاده گردید. به منظور خروج شوینده ها از بافت، نمونه ها به مدت 2 ساعت در بافر نمکی فسفات PBS)) (Bio Gene, UK) قرار گرفتند (14، 15و16). به منظور استریلیزاسیون داربست ها، نمونه ها به مدت 30 دقیقه در اتانل 70 درصد قرار گرفتند و پس از شستشو با آب مقطر استریل، به مدت 1 ساعت در PBS استریل قرار داده شدند.
برای آماده سازی سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell، (BM-MSCs) رت نر بالغ نژاد ویستار با استفاده از کلروفرم بیهوش و استخوان ران آن در شرایط کاملا استریل جدا گردید. ابتدا دو سر استخوان جدا و محتویات آن با تزریق محیط کشت(Gibco, USA) (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) DMEM حاوی 10 درصد سرم جنینی گاو (FBS) (Gibco, USA) و 10 میکرو لیتر پنی سیلین/ استرپتومایسین (Biosera, UK) به داخل آن استخراج شد و سپس سوسپانسیون حاصل به فلاسک کشت انتقال و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد وCO2 5 درصد نگهداری گردید. 24ساعت پس از کشت اولیه، محیط رویی خارج و سلول‌های چسبیده به کف فلاسک باقی ماندند (17). محیط کشت سلول‌ها هر 3 الی 4 روز یک بار تعویض گردید و سلول‌ها پس از پاساژ چهارم مورد استفاده قرارگرفتند.
در گروه Aبرای کشت سلو لها بر روی داربستهای سلول‌زدایی شده لثه، ابتدا آن ها را تریپسینه نموده تا از فلاسک جدا گردند. پس از سانتریفیوژ و تعیین تعداد سلول‌ها با لام نئوبار، سوسپانسیون سلولی با تراکم 105×2 سلول در 50 میکرولیتر تهیه گردید. داربست ها پس از 24 ساعت نگهداری در محیط کشت، در ظروف کشت 24 خانه ای قرار گرفتند و105×2 سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان برروی آنها کشت شد (شکلA1). یک ساعت پس از افزودن سوسپانسیون سلولی به داربستها، به هر چاهک 1 میلیلیتر محیط کشت افزوده شده و ظرف کشت به انکوباتور انتقال یافت و هر 3 تا 4روز یک بار محیط کشت آن تعویض گردید. در گروه B، جهت تهیه بافت بلاستما از خرگوش های نر سفید نژاد نیوزلندی 6 تا 8 ماهه با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه تحقیقاتی سرم سازی رازی مشهد تهیه شده بودند، استفاده گردید. در تمام زمان استفاده از این حیوانات، آن ها در حیوان خانه دانشگاه نگهداری شدند و تحت یک رژیم غذایی پایه به صورت انفرادی در قفس و با درجه حرارت کنترل شده 2± 20 درجه سانتیگراد و روشنایی 12 ساعت در شبانه روز قرار داشتند. در تمامی مراحل انجام این پژوهش، مصوبات مربوط به اصول کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت گردید. بعد از بی حس کردن گوش خرگوش توسط لیدوکائین با استفاده از دستگاه پانچه چند سوراخ به قطر 2 میلیمتر در لاله گوش خرگوش ایجاد شد و بعد از گذشت سه روز، در محل مربوطه پانچ دیگری به قطر 4 میلیمتر زده شد وحلقهی بلاستمایی جدا گردید. بعد از جدا سازی حلقه بلاستمایی، جهت آلودگی زدایی، حلقهها 7 بار با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده شدند و سپس در زیر هود لامینار و در شرایط کاملا استریل، داربستهای تهیه شده در میان حلقههای بلاستمایی تهیه شده قرار داده شدند (تصویر B1). در این مطالعه از محیط کشتDMEM و دمای 37 درجه سانتیگراد با CO2 5 درصد استفاده شد.
شکل1:A ) کشت سلول هایبنیادی مزانشیم مغز استخوان روی داربست. B) قرار گرفتن داربست در داخل حلقه بلاستمایی.
در بررسیهای بافت شناسی به منظور بررسی مهاجرت سلول‌ها به داربست مراحل پاساژ بافت مطابق روش معمول انجام شد و رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (H&E)، پیکروفوشین، پیک ایندیگو کارمین و رنگ آمیزی پاس- پیک اندیگو صورت گرفت. در رنگ آمیزی پیکروفوشین (مخلوط 100 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع + 1/0 گرم پودر فوشین اسید) کلاژن قرمز آتشین و اپی تلیوم زرد یا کرمی رنگ میشود. رنگ پیک ایندیگو (مخلوط 100 میلی لیتر اسید پیکریک اشباع +1/0 گرم پودر ایندیگوکارمین) به عنوان یک رنگ اختصاصی با شدتهای اسیدوفیلی متفاوت می باشد. با این رنگ، زمینه که ماتریکس بافت همبند و کلاژن است به همراه اپی تلیوم به رنگ سبز مغز پستهای در می آید و هسته ها با رنگ هماتوکسیلین قهوه ای کم رنگ میشوند. از معرف پریودیک اسید – شیف (PAS) برای جستجو و بررسی گلیکوپروتئینها استفاده میشود. در تکنیک پاس ترکیبات موکوسی حاوی اسید سیالیک و هگزوزها به رنگ صورتی یا قرمز یا مایل به ارغوانی براق در میآیند.
در مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) (Leo-VP1450, Germany) به منظور تهیه تصاویر، نمونهها با گلوتارآلدئید و اسمیم تتراکساید ثابت و با درجات صعودی اتانل آبگیری شدند. پس از خشک شدن، نمونهها روی گرید قرار گرفتند و با پوشش طلا- پالادیوم پوشانده شده و تصویر برداری انجام شد.
در بررسی میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM) (Leo-910, Germany) جهت تهیه مقاطع میکروسکوپی، نمونهها با گلوتارآلدئید و اسمیم تتراکساید ثابت و با درجات صعودی اتانل آبگیری شدند و پس از آغشتگی با رزین قالب گیری شدند. سپس از نمونهها مقاطع نازک با ضخامت 80 نانومتر تهیه و رنگ آمیزی شده با میکروسکوپ الکترونی گذاره مشاهده و عکسبرداری شدند.
نتایج
در این مطالعه بافت لثه انسان طی مراحل مختلف سلول‌زدایی شده و به عنوان داربست و عامل القاکنندهای برای تمایز BM-MSCs رت و سلول‌های بلاستمایی استفاده گردید. برای سلول‌زدایی از انجماد سریع در ازت مایع، سپس 1 درصد SDS به مدت 24 ساعت و تریتون 1 درصد به مدت 12ساعت استفاده گردید. اجزای سلولی طی فرآیند سلول زدایی بطور کامل از بافت لثه حذف شدند (شکل2).
به منظور بررسی بیشتر و دقیق تر تغییرات ساختاری بافت لثه طی فرآیندهای آماده سازی، داربست تهیه شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره مورد مطالعه قرار گرفت. همانطور که شکل3 نشان می دهد، ساختار کلی بافت لثه پس ازفرآیند سلول‌زدایی حفظ شده (A3) و اپی تلیوم لثه مانند یک توری خالی از سلول (B3) و متصل به بافت همبند باقی مانده است. علاوه بر این رشته های کلاژن بافت همبند نیز سالم و دست نخورده ماندهاند (D3).
شکل2:لثه انسانقبل (A) و بعد (B) ازفرآیندسلولزدایی (رنگآمیزی پیک ایندیگو). پیکان ها مشخص کننده هسته سلول ها می باشند.
شکل3: بررسیلثهانسانپسازسلولزداییبامیکروسکوپالکترونینگاره. A) حفظساختارکلیلثهانسانپسازسلولزدایی.شکلB )اپی تلیومرابهصورتیکتوریخالیازسلولوشکل C و D به ترتیب رشتههایکلاژنراقبلوپسازسلولزدایینشانمیدهد.
در این مطالعه در گروهA از سلول های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت ویستار برای کشت بر روی داربست لثه استفاده گردید. بر اساس شکل4 سلول‌ها در هفته اول توانستند یک لایه بر روی اپیتلیوم، تشکیل دهند. درهفته دوم این سلول‌ها تکثیر یافته و ساختاری مشابه اپی تلیوم را به وجود آوردند. در هفته چهارم سلول‌ها ظاهر کشیده و دوکی شکل داشته و ساختارهای منظم تری را تشکیل داده بودند. سلول های بنیادی مغز استخوان رت در هفته اول کشت توانستند روی داربست استقرار یافته و پاهای کاذب تشکیل دهند. در شکل 5 پاهای کاذب سلول‌ها با دید میکروسکوپ الکترونی نگاره و گذاره مشخص میباشد. شکل6 سلول‌ها را در هفته دوم کشت با دید میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان میدهد که اتصالات دسموزومی تشکیل دادهاند. در گروه B، پس از کشت داربست با بلاستما در هفته اول سلولهایی از بافت بلاستما، در حال نفوذ به داربست مشاهده میشدند. هفته دوم بعد از کشت، سلول‌های بیشتری به داربست نفوذ و تعداد سلول‌های موجود در داربست افزایش یافته بودند. در هفته چهارم تشکیل ساختارهای مشابه اپیتلیوم در سطح داربست مشاهده شد (شکل4). علاوه بر این در گروه B از هفته دوم رفتارهای ترشحی (پاسخ پاس مثبت) نیز در سلول‌های مهاجرت یافته به داربست مشاهده شد (شکل7 و جدول 1).
جدول 1: رفتارهای سلولی مشاهده شده در طی دوره مورد مطالعه. مشاهده (+) و عدم مشاهده (-) . نتایج حاصل یک بررسی کیفی است.
|
رفتار سلولی
نوع سلول |
چسبندگی (اتصالات دسموزومی) |
مهاجرت (تشکیل پاهای کاذب) |
تقسیم سلولی |
ترشح سلولی |
|
سلول‌های بنیادی مزانشیمی |
+ |
+ |
+ |
_ |
|
سلول‌های بلاستما |
+ |
+ |
+ |
+ |
شکل 4:مقایسه برهم‌کنش سلول‌های بنیادی مزانشیمی (A،Cو E) و سلول های بلاستمایی (B،DوF) با ماتریکس خارج سلولی لثه.
لایهجدید شبه اپی تلیومدرهفته اول(A)،درهفتهدوم (C)(رنگآمیزی پیک ایندیگو) ودرهفتهچهارم (E)(رنگآمیزیکارمین).
نفوذ سلول‌های بلاستمایی به داربست در هفته اول پس از کشت (B)،دو هفته پس از کشت (D) (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین) و تشکیل لایههای شبه اپی تلیوم در هفته چهارم (F) (رنگ آمیزی پیکروفوشین).
شکل 5:تشکیلپاهایکاذبسلول ها درهفتهاولکشت سلول های بنیادی مزانشیمی. A) سلولهاازنمایمیکروسکوپ SEM. B) پای کاذب سلولاز نمای میکروسکوپ TEM. (ستاره،نمایانگرپاهایکاذبسلولها می باشد(.
شکل 6: تشکیلاتصالاتدسموزومیتوسطسلولهای بنیادی مزانشیمیدرهفتهدوم کشت وتمایز احتمالی بهسمت سلول‌های شبهکراتینوسیترانشانمیدهد(علامتپیکان نمایانگراتصالاتدسموزومی است(.
شکل 7: مقطععرضیازحلقهبلاستماباداربستدر روزهای مختلف بعد از کشت.A) فلش ها تغییر رنگ حاشیهی داربست را که در اثر نفوذ سلول‌ها دو هفته بعد از کشت ایجاد شده است را نشان میدهند. B) سلول‌های بلاستمایی پاس مثبت نفوذ یافته به داربست در هفته دوم بعد از کشت. C) سلول‌های بلاستمایی پاس مثبت نفوذ یافته به داربست، چهار هفته بعد از کشت(رنگ آمیزی پاس –پیک ایندیگو)
بحث
در این پژوهش تلاش گردید ابتدا لثه انسان را با استفاده از روش‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی نموده و سپس از آن به عنوان داربستی جهت کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت ویستار (گروه A) و همچنین سلول‌های بلاستمایی لاله گوش خرگوش (گروهB ) استفاده شود.
در مطالعات اخیر از ماتریکس سلول زدایی شده بافتهای غضروف، استخوان، میزنای، رگ بند ناف و درم به عنوان داربست در مهندسی بافت استفاده گردیده است (18-23). در این مطالعه نیز ماتریکس سلول‌زدایی شده لثه انسان به دلیل دارا بودن مقادیر بالای کلاژن و همچنین وجود سیتوکراتینهای مختلف در بافت همبندش به عنوان داربست و بستری جهت القای مهاجرت و تمایز سلولی استفاده گردید (24).
مطالعات مختلف آثار تخریبی روش‌های سلول‌زدایی و استریلیزاسیون بر ساختمان بافت را گزارش نمودهاند (14و25)، اما بر اساس مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره، بافت لثه پس از مراحل آماده سازی، ساختمان کلی خود را حفظ نمود و ماتریکس اپی تلیوم نیز متصل به بافت همبند زیرینش باقی ماند. علاوه بر این، رشته های کلاژن موجود در بافت همبند نیز سالم مانده بودند.
Wu و همکارانش (26) نشان دادند که BM-MSCs درمان زخم را در موش های دیابتی و غیردیابتی با افزایش تشکیل مجدد اپیدرم، نفوذ سلولی و رگ زایی بهبود بخشیدند. بخش مهمی از این سلول‌ها زیر واحدهای سیتوکراتین را بیان نمودند و ساختارهای دانهای شکل و علاوه بر آن ساختارهایی مشابه غدد عرق یا چربی را تشکیل دادند.
در مطالعه حاضر BM-MSCs پس از استقرار بر روی ماتریکس اپی تلیوم قبلی، پهن شده و تک لایهای بر روی آن تشکیل دادند و در هفته دوم سلول ها تقسیم شدند و ساختاری چندلایه را بوجود آوردند. مطالعات میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان داد که این سلول‌ها اتصالات دسموزومی تشکیل دادند. این مشاهدات پیشنهاد میکند که احتمالا سلول‌های BM-MSCs در اثر القای داربست لثه انسان شروع به تمایز به سمت کراتینوسیتها نمودهاند. گر چه جهت تعیین سرنوشت کراتینوسیتی، مطالعات تکمیلی از جمله روش‌های مولکولی و یا ایمنوسیتوشیمی ضروری مینماید.
مطالعات نشان میدهند که ماتریکس بافت همبند لثه موجب القای کراتینیزه شدن در سلول‌ها می‌گردد (11). در مطالعاتی که از هیدروژل های کلاژنی به عنوان معادل های درمی استفاده گردید، پایداری ضعیف اپی تلیوم بر روی داربست، تمایز ناقص آن و تخریب داربست در مراحل اولیه مشاهده شد (27). در حالی که نتایج این طرح نشان داد که ماتریکس باقی مانده از اپی تلیوم می تواند بستر مناسبی جهت اتصال محکم سلو ل ها به آن را فراهم نماید.
گروهی از محققین، فیبروبلاستهای لثهای و درمی انسانی را در ماتریکس سه بعدی کلاژن به منظور مطالعه تغییرات ماتریکس کشت دادند و ترشح ماتریکس خارج سلولی را توسط این دو نوع سلول بررسی کردند. آنها با مطالعهی metalloproteinases matrix (MMPs) دریافتند که بیان این فاکتورها در ابتدا در سیتوپلاسم سلولی سلول‌های فیبروبلاستی کشت داده شده، متمرکز بوده و سپس در ترکیبات خارج سلولی توزیع شده است (28).
Qi و همکارانش (29) نیز تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از سینوویوم رت را در داربست آلژینات نشان دادند. آنها از چندین عامل القاکننده تمایز کندروژنیک شامل TGF-β3 ،BMP-2 ، پرولین، پیرووات، آسکوربات-2 فسفات و دگزامتازون استفاده نمودند و تکثیر سلولی، تولید ماتریکس جدید و تمایز کندروژنیک سلول‌ها را مشاهده کردند.
در مورد کشت سلول‌های بلاستمایی علاوه بر ایجاد ساختارهای شبه اپیتلیوم، از نکات مورد توجه که از هفته دوم، مشاهده و در روز های بعد شدت و وسعت بیشتری یافته بود، تغییر ترکیبات داربست در اثر بر هم کنش با سلول های بلاستمایی بود (جدول 1). نواحی از داربست که محل نفوذ و استقرار سلول‌های بلاستمایی بود نسبت به رنگ پاس- پیک ایندیگو، پاسخ مثبت نشان داد. لذا می توان نتیجه گرفت که در مطالعه حاضر سلول‌ها بلاستمایی همزمان با نفوذ به داربست، شروع به سنتز و ترشح ترکیباتی به درون داربست کردهاند (شکل7).
نتیجهگیری
ماتریکس سلول‌زدایی شده لثه انسان توانست در هر دو گروه A و B موجب استقرار سلول‌ها و تشکیل ساختارهای مشابه اپیتلیوم گردد. بر اساس یافته های ما در این پژوهش می توان بیان کرد که احتمالا سلول‌های منشا گرفته از بافت بلاستما در مقایسه با سلول‌های بنیادی مزانشیمی قابلیت حیات بیشتری داشتهاند زیرا طبق مطالعات هیستولوژیکی، در هفته چهارم بعد از کشت سلول‌های بلاستمایی مشاهده شده در داربست دارای هستههای روشن و بزرگ بودند، و این در حالی است که در مورد سلول‌های بنیادی مزانشیمی، هستهها به صورت نکروزه مشاهده میشدند. بنابراین احتمالا بافت بلاستمایی می‌تواند منبع مناسبتری برای مطالعه فرایند مهاجرت سلولی و القاء ترشحات سلولی باشد.
تشکر و قدردانی
این طرح به پشتیبانی و حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد و با حمایت پژوهشکده فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد و از محل بودجه مصوبه مربوط به طرح شماره 37145 با عنوان "مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربستهای سه بعدی (Bioscaffold یا 3D matrix) به منظور کاربرد در مهندسی بافت " و با همکاری دکتر سید علی بنی هاشم راد خانم مروارید ساعی نسب انجام شده است که بدین وسیله مراتب قدردانی از ایشان اعلام می‌گردد.
)