اثر عصاره آبی الکلی چای سبز بر بیان آکواپورین4 در کورتکس مغز: روشی بالقوه جهت کاهش علائم ادم مغزی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی تهران، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران

2 دانشگاه خوارزمی تهران، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی مولکولی، تهران، ایران

چکیده

هدف: آکواپورین4 اصلی‏ترین کانال آبی موجود در مغز است که در انتقال آب توسط سد خونی- مغزی نقش عمده‏ای را بر عهده دارد. اثبات شده که میزان فشار داخل جمجمه‏ای و همچنین بیان آکواپورین4 در برخی بیماری‌ها نظیر هیدروسفالی هیپوناترمی، ادم سیتوتوکسیک و تومورهای مغزی افزایش می‌یابد و داروهایی که بتوانند بیان این پروتئین‌ها را کاهش دهند، می‏توانند به درمان این بیماری‌ها کمک کنند. در این تحقیق فرض بر این بود که عصاره چای سبز بتواند سطح آکواپورین4 را در کورتکس مغز کاهش دهد.
مواد و روش‏ها: این پژوهش از نوع مطالعه تجربی آزمایشگاهی می‏باشد. تعداد 40 سر رت نژاد ویستار (4 تا 6 هفته‏ای) به‏طور تصادفی انتخاب شده و به 4 گروه تقسیم شدند. گروه شاهد بدون تیمار، گروه شاهد آزمایشگاهی200 میکرولیتر سالین (حلال GTE) و گروه تجربی 1و 2 به‏ترتیب میزان 200 میکرولیتر سالین محتوی عصاره چای سبز را با غلظت 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. پس از گذشت 6 ساعت بیان آکواپورین4 در هر چهار گروه به روش‌های وسترن‌بلات و ایمیونوهیستوشیمی بررسی شد.
نتایج: نتایج حاصل از ایمیونوهیستوشیمی و وسترن بلات نشان داد که عصاره چای سبز می‌تواند به شیوه‌ی وابسته به دوز بیان آکواپورین4 را در کورتکس مغز کاهش دهد.
نتیجه گیری: پیشنهاد می‌شود که عصاره چای سبز با کاهش سطح پروتئین‌ آکواپورین 4 در کورتکس مغز بتواند به‏عنوان یک داروی گیاهی برای کاهش دادن میزان فشار داخل جمجمه‏ای در بیماری‌هایی نظیر  هایپوناترمی، ادم سیتوتوکسیک، تومورهای مغزی و غیره مفید باشد.

مقدمه

آکواپورین‌ها کانال‌های آبی با نفوذ‌پذیری بالا هستند که به‏طور وسیعی در بافت‌های مختلف بدن شناسایی شده‌اند (1). آکواپورین‌ها در بازجذب آب در کلیه‏ها، ترشح و بازجذب مایع مغزی- نخاعی، تولید ترشحات ریوی، ترشح و بازجذب مایع زلالیه، ایجاد اشک و چندین فرآیند فیزیولوژیکی دیگر نقش دارند (2) وجود آکواپورین‌های 1، 4، 9 و 11 در سیستم عصبی مرکزی اثبات شده است (3و4). هومئوستازی آب و مایعات در مغز از اهمیت کلینیکی و فیزیولوژیکی ویژه‏ای برخوردار است و فعالیت‏‏های نورونی و هومئوستازی یون‏ها و آب به‏صورت جدایی‏ناپذیری با یکدیگر در ارتباط هستند به‏طور عمده آکواپورین 4 بیشترین تراکم را در سیستم عصبی مرکزی دارا می‌باشد و در حرکت و هومئوستازی آب و فعالیت عصبی نقش مهمی را ایفا می‏کنند. این پروتئین در غشا سلولی پایانه‌های آستروسیتی در مجاورت نواحی مختلف سیستم عصبی مرکزی  شامل عروق خونی (جایگاه سد خونی- مغزی)، فضاهای پری‌سیناپتیک نورون‌ها، گره‌های رانویه و همچنین در غشای سلولی پایانه‏های آستروسیتی مجاورنرم شامه و غشای قاعده‏ای- جانبی سلول‌های اپاندیمی پوشاننده‌ی بطن‌ها (سطوح مغز- مایع مغزی نخاعی) حضور دارند (5 ).

بیماری‌های متعددی نظیر هیپوناترمی، افزایش فشار داخل جمجمه‌ای، هیدروسفالی، انسفالومیلیت خود ایمن تجربی، صرع، ادم سیتوتوکسیک مغزی و تومورهای مغزی با بر هم خوردن هومئوستازی مایعات مغزی و افزایش  بیان آکواپورین 4 در سیستم عصبی مرکزی همراه هستند (6 و7).  Skjoldingو همکارانش (8) بیان آکواپورین4 را در مغز رت‌های هیدروسفال و سالم مقایسه نمودند. تحقیقات آن‏ها نشان داد که سطح این پروتئین در مغز رت‌های هیدروسفال نسبت به نمونه‌های سالم به‏طور چشمگیری افزایش می‌یابد. مشاهده شده که ادم مغزی  ایجاد شده توسط آسیب مغزی تروما و ایسکمی مغزی یا مسمومیت آب با افزایش بیان آکواپورین 4 در آستروسیت‏ها  همراه بوده که به نقش آکواپورین‏ها در پاتوفیزیولوژی مغز اشاره دارد. Yang و همکارانش (9) نشان دادند که در موش های دچار ادم سیتوتوکسیک حذف آکواپورین4 منجر به کاهش میزان آب ورودی به مغز و در نتیجه کاهش اثرات مخرب ادم مغزی می‌شود. بیان بالای آکواپورین 4 ویژگی astrocytomas می‏باشد، توموری که از آستروسیت‏ها در سیستم عصبی تشکیل شده و نفوذپذیری بالایی دارند. Saadoun و همکارانش (10) و Nico و همکاران (11) نشان دادند که در موش‏های فاقد آکواپورین4 رشد تومور آهسته‌تر است. این محققین اظهار داشتند که آکواپورین4 با تسریع روند رگ‌زایی در بافت سرطانی به مهاجرت سلول‌های توموری کمک می‌کند. این مطالعات نشان می‌دهند که بیماری‌های مختلفی با افزایش میزان آکواپورین4 و فشار داخل جمجمه‌ای همراه هستند. به‏نظر می‌رسد با کاهش بیان آکواپورین4 بتوان روند بهبودی این بیماری‌ها را تسریع بخشید.

چای سبز یک فراورده ساخته شده از برگ و جوانه گیاه Camellia sinensis از خانواده Theaceaeمی­باشد که تقریبا بعد از آب پرمصرف‏ترین نوشیدنی است (12). چای سبز یک چای غیر تخمیری است که آنزیم های پلی فنل اکسیداز موجود در برگ‏های تازه چای به‏وسیله خشک کردن و بخار آب دادن غیر فعال شده و بنابراین مانع اکسیداسیون کاتچین­های چای سبز می‏شود. این امر مانع تبدیل کاتچین­ها به مشتقات پلیمری از قبیل تیافلاوین و تیاروبیجین می‏شود و بنابراین موجب پایداری مواد موثره آن‏ها می‏شود (13).

چای سبز حاوی کافئین، پلی فنل­ها، ویتامین­های B، C و E، فلاونوئیدها، گلیکوپروتئین، فیبر، لیپید و کاروتنوئید­ها می­باشد. کاتچین­ها ترکیبات پلی فنلی اصلی موجود در چای سبز هستند که در میان ترکیبات چای سبز دارای بیشترین فعالیت بیولوژیکی می­باشند و 25 تا 35 درصد از وزن خشک چای سبز را شامل می‏شوند (16-14).

 EGCG (Epigallocatechin gallate) فراوان­ترین کاتچین چای سبز است و تقریبا 59 درصد از کل کاتچین‏ها را شامل می‏شود و به‏نظر می‏رسد که بخش عمده فعالیت‏های بیولوژیک چای سبز مربوط به همین ترکیب باشد (12و17). در سال­های اخیر چای سبز به‏دلیل خواص درمانی خود به‏شدت مورد توجه قرار گرفته است. این خواص درمانی شامل تاثیرات آنتی اکسیدانتی، ضد جهشی، القا کننده آپوپتوزیس، ضد دیابتی، ضد التهابی، ضد سرطانی و تاثیرات ضد باکتریایی می­باشند (20- 18). مطالعات اخیر نشان داده‏اند که EGCG با کاهش بیان آکواپورین5 در رده سلولی سرطان تخمدان SKOV3از متاستاز و آنژیوژنز سلول­های سرطانی جلوگیری کرده و موجب القا آپوپتوزیس می­شود (21). تحقیقات نشان می­دهد که پلی فنل‏های موجود در چای سبز از سد خونی-مغزی عبور می‏کند که احتمالا از این طریق بر فعالیت­های عصبی اثر گذاشته و موجب حفاظت سیستم عصبی می­شود (22). به‏علاوه نشان داده شده است که چای سبز و ترکیبات جدا شده از آن به‏خصوص EGCG  دارای اثرات حفاظتی در مقابل آسیب­های ایسکمی مغزی و ضایعات نخاعی و نیز بیماری­های تحلیل سیستم عصبی می­باشد (23و 24). از آنجایی­که چای سبز دارای خاصیت ضد التهابی بوده و در بهبودی ایسکمی وادم مغزی و سایر بیماری‏هایی که مربوط به افزایش فشار داخل جمجمه‏ای سیستم عصبی مرکزی می‏باشد موثر بوده و همچنین یک ترکیب طبیعی است و عوارض جانبی خاصی برای مصرف آن ذکر نشده؛ لذا در این تحقیق فرض بر این بود که بتوان با به‏کار­گیری عصاره چای سبز بیان ژن­های آکواپورین4 را در کورتکس مغز کاهش داد.

 

مواد و روش­ها

نحوه عصاره گیری چای سبز: به‏منظور به‏دست آوردن عصاره چای سبز، ابتدا میزان یک کیلوگرم برگ­های چای سبز در 5 لیتراتانول 70 درصد حل شده و به مدت یک هفته در دمای اتاق نگهداری شد (20 تا 30 درجه سانتی‏گراد) .سپس محلول حاصله توسط کاغذ صافی فیلتر شده و جهت تبخیر از دستگاه rotary evaporator. استفاده شد. ماده حاصله که عصاره چای سبز می‏باشد در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری گردید.

تیمار گروه ها با عصاره چای سبز: در تحقیق حاضر که از نوع مطالعه تجربی آزمایشگاهی می‏باشد از رت های 4 تا 6 هفته­ای نژاد ویستار (هر دو جنس) استفاده شد. رت­ها به‏طور تصادفی به چهار گروه 10 تایی تقسیم شدند. گروه شاهد: شامل حیواناتی که هیچگونه تیماری دریافت نکردند. گروه شاهد آزمایشگاهی: حیواناتی که حلال عصاره چای سبز یعنی فسفات بافر سالین (PBS) را به‏میزان 200 میکرولیتر به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. گروه تجربی اول: رت­هایی که میزان 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره چای سبز حل شده در 200 میکرولیتر، PBS را دریافت کردند. گروه تجربی دوم: رت­هایی که میزان 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم  عصاره چای سبز حل شده در 200 میکرولیتر، PBS را دریافت کردند. پس از تیمار حیوانات با دوزهای ذکر شده از عصاره چای سبز ، پس از گذشت زمان 6 ساعت، حیوانات تیمار شده با عصاره چای سبز،گروه شاهد آزمایشگاهی و همچنین رت‏های گروه شاهد با غلظت‏های بالای کلروفرم کشته شده و مغز حیوانات جدا شده و به دو دسته جداگانه جهت انجام ایمیونوهیستوشیمی و وسترن بلات تقسیم شدند.

ایمیونوهیستو شیمی: به‏منظور انجام بررسی کیفی ایمیونوهیستوشیمی در هر چهار گروه تحت آزمایش (شاهد، شاهد آزمایشگاهی، تجربی1 و تجربی2) مغزها جدا شده و به‏مدت 24 ساعت در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. در مرحله بعد به‏ترتیب آبگیری با محلول‏های الکل با درجات صعودی، شفاف سازی با تولوئن، نفوذ پارافین، قالب‏گیری، برش گیری توسط میکروتوم و قرار دادن برش­ها بر روی لام­های پوشش شده با پلی­ال-لایزین 1 درصد انجام شد. جهت انجام ایمیونوهسیتوشیمی به‏ترتیب پارافین زدایی با زایلن، آبگیری با الکل مطلق، بلوکه کردن با محلول پراکسید هیدروژن و شستشو با آب دیونیزه انجام شد. بازیابی آنتی‏ژنی با بافر سیترات انجام شده و پس از بلوکه کردن با BSA، 1 درصد (آلبومین سرم گاوی) آنتی بادی اولیه آکواپورین4 (Abcam) با غلظت  1:200 به‏مدت 6 ساعت در دمای اتاق روی نمونه­های بافتی ریخته شد. پس از شستشو با PBST (Tween –Phosphate buffer saline)، یک قطره آنتی‏بادی ثانویه بیوتینه (Bethyl Laboratories) حل شده در  میلی‏لیتر2 PBS به نمونه‏ها اضافه شده و به‏مدت یک ساعت در دمای اتاق نگه‏داری شد. سپس به‏ترتیب شستشو با سوبسترای DAB (دی آمینو بنزیدین)، PBST و رنگ هماتوکسیلین انجام شد. در نهایت آبگیری نمونه‏ها با درجات صعودی الکل (70 تا 90 درصد و 100 درصد)، لامل گذاری با چسب انتالن انجام شد. تغییرات بیان آکواپورین4 در هر چهار گروه توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت.

استخراج پروتئین و تعیین غلظت: علاوه بر تکنیک ایمیونوهیستوشیمی، بیان آکواپورین4 در بافت کورتکس مغز به‏روش وسترن‌‌بلات نیز بررسی شد. به این منظور در چهار گروه تحت آزمایش پس از جراحی و خارج سازی مغز بخش کوچکی از بافت کورتکس مغز جدا شده و درون PBS‌ سرد قرار گرفت. پس از هضم مکانیکی به بافت‏ها بافر لیز‌کننده‌ سرد (Invitrogen, UK) اضافه گردید. پس از هموژنیزه کردن، نمونه‌ها با دور rpm11000 به‏مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شده و محلول رویی که حاوی کل محتوای پروتئینی بافت کورتکس می‌باشد به‏درون میکروتیوب‌های جدید منتقل شد. جهت بررسی کمی محتوای پروتئینی عصاره‌های پروتئینی از روش بردفورد استفاده شد. جهت رسم نمودار استاندارد بردفورد ازBSA  به‏عنوان پروتئین استاندارد استفاده شد. در نهایت با استفاده معادله خطی به‏دست آمده از نمودار استاندارد و همچنین جذب‌های به‏دست آمده از عصاره‌های مختلف، غلظت پروتئین بر حسب میلی‏گرم بر میلی‏لیتر محاسبه گردید (25).

الکتروفورز به روش SDS-PAGE و وسترن بلات: الکتروفورز به‏روش SDS-Page انجام شد. پس از انجام تست بردفورد 34 میکروگرم از هر نمونه پروتئینی به‏نسبت 1:1 با بافر نمونه مخلوط شده و مورد استفاده قرار گرفت. جهت مشخص شدن جایگاه پروتئین آکواپورین4 از نشانگر وزن مولکولی استفاده شد. همچنین جهت Loading control از آنتی بادی actin-β استفاده شد. پس از انجام الکتروفورز جهت انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشا مدل ساندویچ توسط برگه‏های واتمن، غشا نیترو سلولزی و ژل تهیه شده و در تانک انتقال حاوی بافر انتقال قرار داده شد. پس از بلوکه کردن توسط 5 میلی‏لیتر محلول بلوکه‌کننده BSA، 3 درصد و شستشو با محلول بافر تریس نمکی حاوی Tween غشا به‏مدت 1 ساعت با ‌2 میلی‏لیتر

آنتی‌بادی اولیه آکواپورین4 (Abcam,Rabbit anti- Aquaporin 4) رقیق شده در BSA، 3 درصد به نسبت 1 به 1000و پس از آن به‏مدت 30 دقیقه در آنتی‏بادی ثانویه بیوتینه (ABC Staining Kits) با غلظت 1000/1 در PBS/BSA انکوبه گردید. سپس فیلتر به‏مدت 30 دقیقه در معرضABC-AP reagent (Vector Laboratories) قرار داده شد. در نهایت

محلول سوبسترایVector Blue- Alkaline Phosphatase Substrate بر روی فیلتر ریخته شد. پس از ظهور باند‌های پروتئینی آبی رنگ محلول سوبسترا خارج شده و فیلتر شستشو شد. در نهایت پس از خشک شدن از غشا توسط دوربین (japan) canon g 11 عکس‏برداری شد. در نهایت برای دانسیتومتری باندها از نرم افزار Image J استفاده شد.

 آنالیز آماری: نتایج کیفی حاصل از سه بار تکرار تست وسترن بلات توسط نرم افزار image j‌ به‏صورت کمی برآورد شده و به‏وسیله نرم افزار INSTAT3 و تست پارامتریک one-way ANOVA آنالیز شدند. سپس نمودار توسط نرم افزار EXCEL رسم شده و   05/0  P≤معنی‌دار محسوب گردید.

نتایج

نتایج حاصل از ایمنوهیستوشیمی

یافته‏های حاصل از بررسی‏های  ایمنوهیستوشیمیایی بیان آکواپورین4 در برش‏های کرونال از قشر مغز گروه‏های شاهد، شاهد آزمایشگاهی و تحت تیمار با دوز های 100 و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن بدن از عصاره چای سبز حاکی از آن دارد که میزان بیان این پروتئین در قشر مغز حیوانات گروه شاهد آزمایشگاهی در مقایسه با گروه شاهد تفاوت قابل ملاحظه‏ای را نشان نمی‏دهد ولی در گروه‏های تحت تیمار با عصاره چای سبز تفاوت بیان چشمگیری را در مقایسه با گروه شاهد مشاهده می‏کنیم (شکل 1).

 

 

شکل 1: رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی با آنتی‏بادی آکواپورین4، رنگ هماتوکسیلین و دی آمینو بنزیدین.به‏منظور بررسی بیان آکواپورین4 در بافت قشر مغز رت‏های گروه‏های شاهد و شاهد آزمایشگاهی و تحت تیمار با عصاره چای سبز.(a) نمونه شاهد .(b) نمونه شاهد آزمایشگاهی. (c) نمونه تیمار شده با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره چای سبز. (d) نمونه تیمار شده با دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم  عصاره چای سبز. پیکان‏ها محدوده سلول‏های گلیال را در مجاور نرم شامه نشان می‏دهد که بیان آکواپورین 4 در این ناحیه بسیار زیاد می باشد. بیان آکواپورین4 (به‏رنگ قهوه‏ای) در قشر مغز نمونه های تیمار شده با  عصاره چای سبز در مقایسه با شاهد و شاهد آزمایشگاهی کاهش چشمگیری را نشان می‏دهد. همچنین دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره چای سبز موجب کاهش بیشتر بیان آکواپورین4 نسبت به دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم شده است. بزرگنمایی ×100.

نتایج حاصل از وسترن بلات

 

نتایج حاصل از وسترن بلات آکواپورین4 در نمونه‏های کورتکس مغز رت در گروه‏های شاهد، شاهد آزمایشگاهی و تیمار شده با دوزهای 100 و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم وزن بدن در شکل 2 نشان داده شده است. این بررسی نشان داد که در حیوانات گروه شاهد آزمایشگاهی که تنها سالین دریافت کرده بودند هیچ تفاوت معنی‏داری در میزان بیان پروئین آکواپورین4 نسبت به گروه شاهد وجود ندارد. این درحالی بود که در گروه‏های تحت

تیمار با عصاره چای سبز تفاوت بیان چشمگیری در سطح بیان این پروتئین نسبت به گروه شاهد وجود دارد. نتایج کمی حاصل از تست وسترن بلات در نمودار 1 نشان داده شده است. این نتایج نشان داد که دوز ‌100 میلی‏گرم بر کیلوگرم باعث 46 درصد کاهش بیان و دوز ‌200 میلی‏گرم بر کیلوگرم باعث 72 درصد کاهش در بیان آکواپورین4 نسبت به گروه شاهد می­گردد.

 

 

 

 

 

شکل2: تصویر غشا نیتروسلولز حاصل از بررسی بیان آکواپورین4 در سلول­های کورتکس مغز رت‏های گروه شاهد، شاهد آزمایشگاهی و تیمار شده با دوزهای 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم و 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره چای سبز. نتایج کاهش بیان آکواپورین4 را در گروه­های تیمار شده با عصاره چای سبز نشان می‏دهد. آنتی بادی β-actin‌ با وزن مولکولیKDa42 به‏عنوان loading control مورد استفاده قرار گرفته است.

 

 

نمودار1: نمودار حاصل از نتایج کمی تست وسترن بلات که به‏وسیله نرم افزار Image J برآورد شده است. این نتایج نشان می‏دهد که دوز ‌200 میلی‏گرم بر کیلوگرم عصاره چای سبز موجب بیشترین میزان کاهش در بیان آکواپورین4 در کورتکس می­گردد. 001/0>P ***. Mean± SEM.

 

 

 

بحث

در بررسی حاضر اثر عصاره چای سبز بر بیان کانال آبی آکواپورین4 موجود در کورتکس مغز رت به‏وسیله تکنیک­های ایمنوهیستوشیمی و وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که عصاره چای سبز می‏تواند به‏طور چشمگیری بیان این پروتئین را در کورتکس مغز کاهش دهد (شکل 1 و2). به‏طوری‏که نتایج حاصل از کمی سازی تست وسترن بلات کاهش 46 درصدی را در دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم و کاهش72 درصدی را در دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم برای این پروتئین نسبت به گروه شاهد نشان داد. بررسی­های اخیر نشان داده‏اند که در بیماری­هایی نظیر افزایش فشار داخل جمجمه­ای،میگرن، هیدروسفالی، تومور‌های مغزی، بیماری خود‌ایمنی انسفالومیلیت تجربی و ادم مغزی میزان مایع مغزی- نخاعی و فشار داخل جمجمه‏ای افزایش می­یابد که این افزایش در فشار داخل جمجمه­ای تا حد زیادی در ارتباط با افزایش بیان پروتئین‏های آکواپورین4 می­باشد (6،7، 29-26). نتایج تحقیقاتی که با استفاده از موش‏های فاقد اکواپورین 4 صورت گرفته است نشان داده که کاهش آکواپورین 4 با کاهش ادم سیتوتوکسیک مغزی در موش‏های دچار مسمویت آبی‏، ایسکمی مغزی و یا مننژیت باکتریایی همراه می‏باشد. برای مثال موش‏های فاقد اکواپورین 4 تورم نیمکره ای مغز کمتر از 35 درصد را 24 ساعت بعد از انسداد شریان میانی مغز در مقایسه با موش‏های وحشی  نشان داده‏اند (30 و 31). بیان آکواپورین 4 در بسیاری از تومورهای مغزی با منشا آستروسیتی نیز افزایش می‏یابد و شواهد اخیر نشان داده که آکواپورین 4 در مهاجرت، آنژیوژنز و رشد تومورهای مغزی و تشکیل ادم دخالت دارند و بازدارنده‏های بیان و یا عمل‏کرد  آکواپورین 4 می‏توانند از رشد این تومورها جلوگیری کنند (11). از سوی دیگر بررسی‏ها نشان داده که موش‏هایی که در ژن آکواپورین 4 دارای جهش می‏باشند آستانه تحریک‏پذیری بالاتری نسبت به موش‏های سالم دارند و همچنین موش‏های فاقد آکواپورین 4 قابلیت کاهش حمله القا شده توسط تشنج شیمیایی Pentylenetetrazole را نشان می‏دهند و این امکان را می‏دهد که بازدارنده‏های آکواپورین 4 بتوانند در درمان بیماری صرع  نیز سودمند باشند (32 و 33) . در هیپوناترمیا، یک گرادیان اسمزی بین پلاسما و مغز ایجاد می‏شود و منجر به نفوذ مایع از رگ‏ها و تورم سلولی می‏شود و Frigeri و همکارانش (34) نشان دادند که  عدم حضور آکواپورین 4 در مغز موش‏های هیپوناترمیا، سبب کاهش خیز مغزی در این موش‏ها می‏شود. بنابراین هر عامل مهار کننده‏ی بیان آکواپورین4 می‏تواند به‏عنوان یک فاکتور درمانی جهت درمان بیماری­های فوق مورد استفاده قرار گیرد.

با توجه به خواص ضدالتهابی عصاره چای سبز و توانایی این ماده در عبور از سد خونی مغزی در این تحقیق اثر عصاره چای سبز بر بیان کانال‏های آکواپورین4 موجود در کورتکس مغز مورد بررسی قرار گرفت. در مطالعات مختلف خواص حفاظت کننده عصب عصاره چای سبز به اثبات رسیده است. چای سبز دارای آثار حفاظتی در مقابل آلزایمر، پارکینسون (35)، ضایعات نخاعی، ایسکمی مغزی، آسیب مغزی بعد از سکته و نیز بیماری‏های تحلیل سیستم عصبی است (23 و 24)، بررسی‏ها نشان داده که کاتچین‏های موجود در چای سبز از جمله EGCG آثار حفاظت کننده از عصب خود را از طریق مهار رادیکال‏های آزاد، کاهش پراکسیداسیون چربی و کاهش آپوپتوزیس و آثار التهابی اعمال می‏نمایند (36). به‏علاوه در ارتباط با اثر چای سبز بر مهار کانال­های آبی، Chunxiao و همکاران (21) نشان دادند که EGCG با کاهش بیان آکواپورین5 در رده سلولی سرطان تخمدان SKOV3 از متاستاز و آنژیوژنز سلول­های سرطانی جلوگیری کرده و موجب القاء آپوپتوز می­شود. با استناد به این مطالعات و با توجه به نتایج حاصل از بررسی حاضر که نشان داد عصاره چای سبز توانایی کاهش بیان آکواپورین4 را دارا می­باشد؛ می‌توان نتیجه گرفت که عصاره چای سبز می‌تواند به‏عنوان آنتاگونیست این کانال‌ آبی به‏کار رود.

 

نتیجه­گیری

با توجه به اینکه بسیاری از بیماری‌های سیستم عصبی مرکزی با بر هم خوردن هومئوستازی مایعات مغزی و افزایش  بیان آکواپورین 4 در سیستم عصبی مرکزی همراه هستند، نتایج تحقیقات اخیر نشان داده که هر عامل مهار کننده‏ی بیان آکواپورین4 می‏تواند به‏عنوان  یک فاکتور درمانی جهت درمان بیماری­های فوق مورد استفاده قرار گیرند. با در نظر گرفتن اینکه عصاره چای سبز به‏عنوان یک ترکیب طبیعی که عوارض جانبی خاصی برای مصرف آن ذکر نشده توانست بیان آکواپورین4 را در کورتکس مغز کاهش دهد امید است که با انجام تحقیقات بیشتر بتوان از عصاره چای سبز به‏عنوان یک داروی گیاهی جهت درمان بیماری‏هایی که با افزایش بیان آکواپورین 4 و فشار داخل جمجمه همراه است استفاده نمود

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق در قالب پایان‏نامه کارشناسی ارشد در آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی- تکوینی دانشگاه خوارزمی انجام گرفته است، لذا از ریاست محترم دانشکده علوم زیستی که امکانات اجرایی این طرح تحقیقاتی را فراهم نمودند صمیمانه سپاسگزاریم.

1. Verkman AS. More than just water channels: unexpected cellular roles of aquaporins. J Cell Sci. 2005; 118: 3225-3232.

2. Beitz E. Aquaporins; Handbook of Experimental Pharmacology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2009;190: 320-400.

3. Elkjaer M, Vajda Z, Nejsum LN, Kwon T, et al. Immunolocalizationof AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochem Biophys  Res. 2000; 276: 1118-1128.

4. Gorelick DA, Praetorius J, Tsunenari T, Nielsen S, et al. Aquaporin-11: a channel protein lacking apparent transport function expressed in brain. BMC Biochem. 2006; 1: 7-14.

5. Zheng W, Chodobski A. The Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier. Taylor and Francis group. 2005; 227-350.

6. Miyamoto K, Nagaosa N, Motoyama M, Kataoka K, et al. Upregulation of water channel aquaporin-4 in experimental autoimmune encephalomyeritis. J Neurol Sci. 2009; 276(1-2): 103-7.

 7. Eid T, Lee TS, Thomas MJ, Amirymoghaddam M, et al. Loss of perivascular aquaporin 4 may underlie deficient water and K+ homeostasis in the human epileptogenic hippocampus. Proc  Natl  Acad  Sci  USA. 2005; 102: 1193-1198.

8. Skjolding AD, Rowland IJ, Sogaard LV, Praetorius J, et al. Hydrocephalus induces dynamic spatiotemporal regulation of aquaporin-4 expression in the rat brain.Cerebrospinal Fluid Research. 2010; 7: 20. 

9. Yang B, Zador Z, Verkman AS. Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling. J  Biol Chem. 2008; 283(22): 15280-15286.

10. Saadoun S, Papadopoulos MC, Watanabe H, Yan D. Involvement of aquaporin-4 in astroglial cell migration and glial scar formation.J  Cell Sci. 2005b; 118: 591–598.

11. Nico B, Ribatti D. Role of aquaporins in cell migration and edema formation in human brain tumors. J Experimental cell research. 2011; 317: 2391-2396.

12. Cai YJ, Ma LP, Hou LF, Zhou B. Antioxidant effects of green tea polyphenols on free radical initiated peroxidation of rat liver microsomes. ChemPhys Lipids. 2002; 120: 109–117.

13. Pan X, Niu G, Liu H. Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves. Chemical Engineering and Processing. 2003; 42: 129-133.

14. Shahidi F, Wanasundara PD. Phenolic antioxidants.Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1992; 32(1): 67-103.

 15. Wiseman  SA, Balentine DA, Frei B. Antioxidants in tea.Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1997; 37: 705-718.

16. Ho CT, Chen  CW, Wanasundara UN, Shahidi  F. Natural antioxidants from tea in natural antioxidants.Champaign IL  AOCS Press. 1997; 213–223.

17. Nakazoto T, Ito K, Miyakawa Y. Catechin, a green tea component, rapidly induces apoptosis of myeloid leukemic cells via modulation of reactive oxygen species production in vitro and inhibits tumor growth in vivo. Haematologica. 2005; 90: 317–325.

18.  Xie M, Von Bohlen A, Klockenka ¨mper  R, Jian X, et al. Multielement analysis of Chinese tea (Camellia sinensis)by total-reflection X-ray fluorescence. Z LebensmUntersFor. 1998; 207: 31–38.

19. Feng Q, Kumagai T, Torii Y, Nakamura Y, et al. Anticarcinogenic antioxidants as inhibitors against intracellular oxidative stress. Free Radic Res. 2001; 35: 779-788.

20. Pan TH, Jankovic J, Le WD. Potential therapeutic properties of green tea polyphenols in Parkinson’s disease. Drugs Aging. 2003; 20(10): 711–721.

21. Chunxiao Y, Jianhua Y, Lan Sh, Xuejun Ch. Inhibitory effect of Epigallocatechingallate on ovarian cancer cell proliferation associated with aquaporin 5 expression. Arch GynecolObstet. 2012; 285: 459–467.

 22. Caturla N, VeraSamper E, Villalain J, Mateo CR, et al. The relationship between the antioxidant and the antibacterial properties of galloylatedcatechins and the structure of phospholipid model membranes.Free RadicBiol Med. 2003; 34: 648– 62.

23. Ames BN, Shigenaga M, Hagen TM. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993; 90(17): 7915 – 22.

24. Stadtman ER. Protein oxidation and aging.Sci. 1992; 257: 1220 – 4.

 

25. Copeland RE. Methods for protein analysis. Chapman and Hall. 1994; 243-246.

26. Faraci FM, Kinzenbaw D, Heistad DD. Effect of endogenous vasopressin on blood flow to choroid plexus during hypoxia andintracranial hypertension. Am J Physiol. 1994; 266(2): 393-8.

27. August H, van Alphen MM. A result ofincreased CSF pressure: A new pathophysiological concept (preliminary report).Neuro  Rev. 1986; 9: 121-124.

28. Parker JN, Parker PM. Hydrocephalus.ICON Group International. 2004; 3-67.

29. Zador Z, Bloch O, Yao X, Manley GT. Aquaporins: role in cerebral edema and brain water balance. Prog  Brain Res. 2007; 161: 185–194.

30.Tait MJ, Saadoum S, Bell BA, Papadopoulos CP. Water movements in the brain: role of aquaporins. J Trends in Neurosciences. 2007; 31:37-43.

31. Badaut J, Fukuda AM, Jullienne A, Petry KG. Aquaporins and brain diseases. Biochim Biophys Acta. 2014; 1840(5):1554-65.

32. Binder DK, Nagelhus EA, Ottersen O. Aquaporin-4 and Epilepsy. Glia. 2012; 60(8): 1203-1214.

33. Castle NA. Aquaporins targets for drug discovery. J Drug Discovery Today. 2005; 10: 485-493.

34. Frigeri A, Nicchia GP, Nico B, Quondamatteo F, et al. Aquaporin-4 deficiency in skeletal muscle and brain of dystrophic mdx mice. FASEB J. 2001; 15(1): 90-98.

35. Weinreb O, Mandel S, Amit T, Youdim MBH. Neurological mechanisms og green tea polyphenols in Alzhimer’s and Parkinson’s diseases. Journal of Nutritional Biochemistry. 2004; 15: 506–516.

36. Sutherland BA, Rahman RM, Appleton I. Mechanisms of action of green tea catechins, with a focus on ischemia-induced neurodegeneration. J NutrBiochem. 2006; 17(5): 291-306.