مطالعه ارتباط بین مارکرهای مولکولی و صفات مهم میوه در فندق با استفاده از آنالیز رگرسیونی چندمتغیره

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی، صندوق پستی 31587، کرج، ایران

2 دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی، صندوق پستی 3815688349، اراک، ایران

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق شناسایی نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR مرتبط با صفات ریخت‌شناسی مهم میوه در فندق (Corylus avellana) بود. مواد و روش‌ها: در این مطالعه، رابطه بین نشانگرهای ISSR و RAPD با صفات مهم میوه (ابعاد و وزن نات و مغز) در 35 ژنوتیپ فندق از طریق آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: برخی از قطعات چندشکل ISSR و RAPD با صفات مورد مطالعه میوه فندق ارتباط و همبستگی نشان دادند. برخی از این نشانگرهای آگاهی‌بخش با بیش از یک صفت ارتباط نشان دادند که می‌تواند ناشی از اثرات پلیوتروپیک QTL‏ های مرتبط با هم در صفات مختلف باشد. به‏عنوان مثال، برخی از نشانگرهای آگاهی ‌بخش با دو صفت طول نات و طول مغز همبستگی معنی‌دار نشان دادند که بیان‌کننده همبستگی مثبت این دو صفت با همدیگر می‌باشد. همچنین برخی از این نشانگرها با طول و وزن نات و وزن مغز و برخی دیگر با هر دو صفت وزن و طول مغز رابطه نشان دادند. نتیجه‌گیری: نشانگرهای آگاهی‌‌بخش شناسایی شده در این مطالعه می‌توانند در انتخاب والدین مناسب برای تولید جمعیت‌ جهت نقشه‌یابی به‏کار روند. همچنین برای انتخاب ژنوتیپ‌های برتر به‏خصوص وقتی که اطلاعاتی از پایه ژنتیکی آن‏ها مانند نقشه لینکاژی در دسترس نیست مفید باشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

گونه فندق (Corylus avellana) از خانواده Betulaceae
می­باشد. جنس Corylus دارای 25 گونه بوده که تنها نُه گونه آن از نظر اقتصادی و به­نژادی اهمیت دارند. اکثر گونه­های فندق به‏صورت درختچه بوده و به‏ندرت به صورت درختی دیده
می­شوند. تاریخچه کشت آن به 5000 تا6000 سال قبل از میلاد برمی­گردد. در اروپا، فندق از پوشش­های گیاهی غالب بوده ولی منشا دقیق آن مشخص نشده است. از نظر جغرافیایی دامنه پراکنش آن بسیار وسیع بوده و از سواحل پرتغال، ایرلند، جزایر آرکنیتا و قسمت غربی کوه­های اورال و گسترش شمالی آن از نروژ تا روسیه می­باشد ولی مناطق عمده کشت فندق در نزدیکی حوزه­های بزرگ آبی که دارای زمستان های ملایم و تابستان­های خنک می­باشند، قرار دارد (1). مناطق عمده کشت فندق ترکیه، ایتالیا، اسپانیا و آمریکا می­باشند که این کشورها از نظر تولید فندق در رتبه­های برتر جهان قرار دارند (1). با وجود این که تنوع ژنتیکی فندق در ایران بالا می­باشد، لیکن منشا اصلی آن در ایران چندان روشن نمی­باشد. هر چند رویشگاه اصلی آن در منطقه حیران تا دیناچال در استان گیلان قرار دارد ولی مناطق عمده فندق­کاری در ایران به حاشیه دریای خزر و نواحی کوهستانی محدود می­شود. هنوز مجموعه جامع و کاملی مبنی بر جمع­آوری ارقام و ژنوتیپ­های فندق در ایران تاسیس نشده است. ایران با تولید بالغ بر 14 هزار تن میوه فندق در رتبه هشتم دنیا قرار گرفته است ولی می­تواند با اقدامات به­نژادی و به­زراعی به یکی از کشورهای عمده تولیدکننده فندق تبدیل شود. استان گیلان با بیش از 12 هزار تن تولید فندق در صدر قرار دارد و پس از آن استان­های قزوین با 1780 تن، مازندران با 1320 تن و اردبیل با 500 تن قرار دارند. عمل‏کرد فندق در ایران پایین بوده و به حداکثر یک تن در هکتار می‏رسد، در حالی‏که در کشورهای اصلی تولیدکننده این مقدار 5/4 تا 5 تن در هکتار می­باشد (2).

در طی سال­های گذشته نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA به‏طور گسترده­ای برای اهداف مختلف در گیاهان مورد استفاده قرار گرفته­اند (3). پیشرفت دائمی در بهبود اصلاح گونه­های گیاهی به تنوع ژنتیکی گیاهان بستگی دارد. بنابراین شناسایی و مدیریت این تنوع برای برنامه­های اصلاحی لازم می­باشد. به‏علاوه، آگاهی از تنوع ژنتیکی مدیریت حفاظت از ژرم­پلاسم گیاهی را راحت­تر می­نماید. اگر چه نقشه­یابی بر پایه مکان­های صفات کمی (Quantitative trait loci, QTL) برای ردیابی ژن­های وابسته به این صفات مناسب می­باشد اما این عمل
وقت­گیر و پرزحمت می­باشد (4). برای غلبه بر این محدودیت­ها، شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت از طریق رگرسیون مناسب به‏نظر می­رسد. آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (Multiple regression analysis, MRA) بر پایه رابطه بین نشانگرهای مولکولی (به‏عنوان متغیر مستقل) و صفات ریخت­شناسی (به‏عنوان متغیر وابسته) روش مناسبی برای شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت می­باشد. این آنالیز ضریب تبیین (R2) را تعیین می­کند که این ضریب میزان رابطه صفت ریخت­شناسی را با نشانگر مولکولی نشان می­دهد (5).

در دسترس بودن تعداد زیادی از نشانگرهای مولکولی و صفات ریخت­شناسی می­تواند به مطالعه آنالیز رگرسیونی بین این نشانگرها و صفات ریخت­شناسی کمک نماید. اکثر مطالعات تجزیه ارتباطی مبتنی بر پیوستگی، امکان ردیابی نشانگرهای مختلف مرتبط با صفات ریخت­شناسی را مقدور نموده است، ولی اغلب به‏دلیل فاصله زیاد بین نشانگر و صفت ریخت­شناسی، انتخاب با کمک نشانگر همراه و همچنین جداسازی و
همسانه­سازی ژن مورد نظر را مشکل ساخته است و به‏علاوه فقط از تعداد کمی ژنوتیپ به‏عنوان والد برای نقشه‏یابی ژن­ها استفاده شده است. در سال­های اخیر برای فائق آمدن بر این مشکل از آنالیز رگرسیونی بین نشانگرها و صفات ریخت­شناسی استفاده شده است که نه تنها نقشه­یابی ژن­ها را با درجه اطمینان بالاتری ممکن می­سازد، بلکه شناسایی نشانگرهایی که در نقشه­یابی مبتنی بر لینکاژ قابل ردیابی نبودند را مقدور می­سازد (3، 6 و 7).

استفاده از نشانگرهای مولکولی در تعیین نشانگرهای وابسته به صفت در برخی از گیاهان استفاده شده است و نتایج خوبی نیز گزارش شده است. به‏عنوان مثال رابطه بین داده­های حاصل از تکنیک­های مولکولی مختلف با صفات بیوشیمیایی در گونه­های جنس Morus (8) و گونه Valeriana jatamansi (9) بررسی شده است. همچنین رابطه این نشانگرها با صفات ریخت­شناسی در گونه­هایی مانند کتان (10 و 11)، گندم (12)، ذرت (13)، Morus laevigata (14)، انار (15) و گیلاس (16) بررسی شده است. تکنیک RAPD (Random amplified polymorphic DNA) بر مبنای تکثیر قطعات تصادفی DNA انجام می­شود و نیازی به آگاهی و اطلاع از توالی DNA الگو ندارد. از مزایای دیگر این تکنیک می­توان به هزینه کم، سادگی، سرعت بالا و نیاز به مقدار کم DNA اشاره کرد (14). به‏علاوه، تکنیک ISSR (Inter simple sequence repeat) شامل کاربرد توالی­ ریزماهواره به‏عنوان پرایمر در واکنش زنجیره­ای پلیمراز به‏منظور تکثیر نشانگرهای چندآللی می­باشد. این تکنیک روشی ساده، سریع و سودمند بوده و قابلیت تکرارپذیری بالایی دارد (16).

نتایج تحقیقات بین­المللی بیانگر تنوع وسیع ژرم پلاسم فندق از نظر خصوصیات کمی و کیفی می­باشد (2، 17، 18 و 19). ایران نیز دارای تنوع بالایی از فندق می­باشد ولی تاکنون رابطه رگرسیونی صفات ریخت­شناسی با نشانگرهای مولکولی برای این گونه بررسی نشده است. بنابراین، هدف از این تحقیق شناسایی نشانگرهای RAPD و ISSR مرتبط با صفات ریخت­شناسی مهم میوه در 35 ژنوتیپ فندق با استفاده از آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) می­باشد. نتیجه این مطالعه به شناسایی ژن­های مسئول بروز صفات مهم کمک می­نماید که می­تواند در برنامه­های اصلاحی به‏کار رود.

 

مواد و روش‏ها

مواد گیاهی مورد آزمایش و ارزیابی­های ریخت­شناسی: در این مطالعه 35 رقم و ژنوتیپ فندق (29 ژنوتیپ ایرانی و شش رقم خارجی) مورد مطالعه قرار گرفتند (جدول 1). اکثر ژنوتیپ‏های ایرانی در مناطق فندق­کاری ایران مانند استان­های اردبیل و گلستان مورد استفاده قرار می­گیرند. این ژنوتیپ­ها از نظر ویژگی­های مهم گل (زمان باز شدن گل نر و ماده، طول شاتون و مقدار دانه گرده) و میوه (طول، عرض، وزن و شکل نات، طول، عرض، وزن، رنگ و شکل مغز) تفاوت­های بارزی با یکدیگر دارند. این درختان هشت­ساله و در مراحل باردهی کامل بودند. برداشت میوه­ها به ‏شکل تصادفی از قسمت­های مختلف درختان صورت گرفت. صفات مورد ارزیابی شامل صفات مربوط به نات (طول، عرض و وزن) و صفات مربوط به مغز (طول، عرض، وزن و درصد) بود. ارزیابی صفات در طی دو سال روی 50 عدد میوه از هر ژنوتیپ انجام شد. صفات مربوط به ابعاد نات و مغز با استفاده از کولیس دیجیتالی اندازه­گیری شدند. همچنین اندازه­گیری صفات مربوط به وزن نات و مغز با استفاده از ترازوی الکترونیکی (Lutron, GM-500) با دقت یک‏صدم گرم انجام گرفت (جدول 1). مقایسه میانگین‏ها با استفاده از نرم­افزار SAS و آزمون دانکن انجام شد.

مطالعات مولکولی: استخراج DNA از نمونه های برگی بالغ و تازه با استفاده از روش Doyle و Doyle (20) صورت گرفت. کمیت و کیفیت DNA به‏دست آمده با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موج‏های 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز DNA در ژل آگارز با غلظت یک درصد مشخص گردید و به کمک آن‏ها غلظت یکسان از DNA (5 نانوگرم در میکرولیتر) آماده شد. برای رقیق سازی از آب مقطر دوبار تقطیر استریل استفاده شد. واکنش PCR برای تکنیک RAPD بر اساس روش تشریح شده توسطKhadivi-Khub  و همکاران (21) صورت گرفت و این واکنش برای تکنیک ISSR بر اساس روش بکار برده شده توسطThimmappaiah  و همکاران (22) انجام شد. برای هر مخلوط واکنش، مقدار یک میکرولیتر از DNA تهیه شده با غلظت 5  نانوگرم بر میلی‏لیتر به 24 میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR شامل dNTPS، PCR buffer، Taq DNA polymerase، primer و  MgCl2 (شرکت سیناژن، ایران) و آب دوبار تقطیر استریل اضافه گردید که در نهایت حجم محلول واکنش PCR به 25 میکرولیتر رسید و مخلوط حاصله تحت واکنش زنجیره­ای پلی‏مراز در دستگاه ترمال سایکلر Bio-Rad مدل I-Cycler قرار گرفت. برای تکنیک ISSR، واکنش زنجیره­ای پلیمراز با واسرشت­سازی اولیه DNA ژنومی در دمای 94 درجه سانتی‏گراد به‏مدت چهار دقیقه آغاز و با 35 چرخه شامل دمای 92 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه برای واسرشت­سازی، اتصال پرایمرها به رشته الگو به مدت 50 ثانیه (دمای اتصال پرایمرها از 48 تا 57 درجه سانتی‏گراد متناسب با پرایمر متغیر بود)، گسترش (بسط) رشته جدید به‏مدت یک دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 10 دقیقه دنبال شد. برای تکنیک RAPD، چرخه­های حرارتی شامل 94 درجه سانتی‏گراد به‏مدت چهار دقیقه برای واسرشت­سازی اولیه، تعداد 35 چرخه با دمای 92 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه برای واسرشت­سازی، دمای اتصال 37 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه و دمای تکثیر قطعات 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت دو دقیقه و در نهایت یک چرخه دمایی 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت پنج دقیقه برای تکمیل بسط بود. الکتروفورز محصول PCR در ژل آگاروز با غلظت 5/1 درصد مورد بررسی قرار گرفت.

 

 

 

 

 

جدول 1: میانگین صفات میوه در ژنوتیپ­های فندق مورد مطالعه

درصد مغز (%)

وزن مغز (g)

عرض مغز (mm)

طول مغز (mm)

وزن نات (g)

عرض نات (mm)

طول نات (mm)

منشاء

ژنوتیپ یا رقم

15/32

33/0

95/8

42/8

93/0

15/15

93/13

آذربایجان شرقی

فندقلو1

75/18

40/0

66/13

97/5

90/0

03/13

14/20

آذربایجان شرقی

فندقلو2

64/13

31/0

80/8

20/9

93/0

50/17

88/15

آذربایجان شرقی

فندقلو3

09/30

37/0

83/8

88/10

00/2

17

34/15

اردبیل

فندقلو4

78/15

26/0

85/8

25/11

95/1

52/17

51/15

اردبیل

فندقلو5

28/24

42/0

36/10

59/10

37/1

78/16

45/15

اردبیل

فندقلو6

15/36

30/0

65/8

70/11

90/1

20/18

93/16

اردبیل

فندقلو7

33/33

20/0

74/9

04/11

40/1

41/15

74/16

آذربایجان شرقی

کلیبر1

31/25

21/0

50/10

76/14

30/1

39/16

22/19

آذربایجان شرقی

کلیبر2

94/17

31/0

64/8

62/10

96/0

38/15

38/15

آذربایجان شرقی

کلیبر3

83/14

25/0

03/10

58/11

58/1

43/16

28/17

آذربایجان شرقی

کلیبر4

47/21

28/0

23/11

01/12

56/1

33/16

55/17

آذربایجان شرقی

کلیبر5

24/24

23/0

23/11

66/14

55/1

99/15

33/18

آذربایجان شرقی

کلیبر6

07/19

32/0

13/11

21/15

49/1

65/17

87/19

آذربایجان شرقی

کلیبر7

00/20

32/0

15/10

35/11

32/1

21/15

32/16

آذربایجان شرقی

کلیبر8

64/69

29/0

23/10

65/11

52/1

54/16

56/17

آذربایجان شرقی

کلیبر9

17/30

32/0

90/11

39/12

60/1

65/17

99/18

آذربایجان شرقی

کلیبر10

87/46

86/0

06/13

79/12

81/1

04/17

74/16

گیلان

اشکورات1

59/45

75/0

04/12

40/12

63/1

16/16

49/16

گیلان

اشکورات2

15/46

90/0

60/12

53/13

92/1

62/16

47/18

گیلان

اشکورات3

24/43

88/0

25/13

57/13

93/1

19/17

13/17

گیلان

اشکورات4

91/45

90/0

11/13

75/13

95/1

94/16

46/17

گیلان

اشکورات5

42/50

96/0

40/13

10/14

22/2

52/17

06/18

گیلان

اشکورات6

66/41

90/0

09/13

09/14

96/1

55/16

60/16

گیلان

اشکورات7

33/83

60/0

12/10

28/14

19/1

48/13

50/17

کرج

دانشکده1

54/54

50/0

80/7

37/15

20/1

09/15

80/20

کرج

دانشکده2

54/51

00/1

31/10

82/21

20/1

99/13

33/22

کرج

دانشکده3

64/13

60/0

56/12

89/18

10/1

25/14

32/20

کرج

دانشکده4

33/83

50/0

13/9

08/14

97/0

06/12

35/16

کرج

دانشکده5

35/31

17/1

04/12

31/12

68/1

14/18

36/17

اسپانیا

نگرت

67/40

70/0

47/11

55/14

32/2

31/18

80/20

اسپانیا

مرویله

12/52

90/0

26/11

63/15

87/2

73/19

12/22

اسپانیا

لونگ

45/45

72/0

47/12

38/11

77/1

68/18

15/17

اسپانیا

سگوربه

51/47

86/0

23/13

53/12

65/1

04/16

38/16

ایتالیا

رُند

01/46

05/1

42/13

41/14

31/2

94/17

79/18

اسپانیا

فرتیل

 

 

 

 

 

 

 

آنالیز آماری: پس از انجام آزمایشات ISSR و RAPD، برای بررسی چندشکلی ژنتیکی بین ارقام، به حضور یک باند خاص عدد یک و به عدم حضور آن عدد صفر داده شد. اندازه باندهای تکثیر شده به‏وسیله نرم­افزار کوانتیتی وان (Quantity One) تخمین زده شد. برای هر پرایمر، تعداد کل باندهای تولید شده، تعداد باندهای چندشکل، درصد چندشکلی و قدرت تفکیک یا Rp (Resolving power) محاسبه شد. این ضریب بیانگر میزان کارآیی هر نشانگر برای جداسازی و تفکیک نمونه­های مورد مطالعه می­باشد. این شاخص بر اساس فرمول زیر محاسبه می‫شود:

 

 

در فرمول بالا Ib میزان آگاهی بخش بودن هر باند یک پرایمر می­باشد. این مقدار طبق فرمول بالا برای هر کدام از باندهای تولید شده می­تواند بین یک تا صفر متغیر باشد و p نسبتی از ژنوتیپ­ها که دارای باند مورد نظر می­باشند، می­باشد.

تجزیه رگرسیونی گام به گام (Stepwise) برای ردیابی رابطه بین صفات ریخت­شناسی مورد آزمایش (به‏عنوان متغیرهای وابسته) و نشانگرهای RAPD و ISSR (به‏عنوان متغیرهای مستقل) با استفاده از نرم افزار SPSS ver. 16 انجام شد. دو ضریب R2 و β با استفاده از آنالیز رگرسیونی محاسبه شدند و برای نشانگرهای مختلف وابسته به صفات، مورد بررسی قرار گرفتند. R2 ضریب همبستگی توجیه شده چندگانه بوده که برای هر نشانگر محاسبه می­شود و نشان­دهنده میزان همبستگی نشانگر با صفت ریخت­شناسی می­باشد. همچنین، β ضریب رگرسیون استاندارد شده می­باشد که برای هر نشانگر مرتبط به صفت به‏وسیله MRA محاسبه می­شود (8).

 

نتایج

صفات ریخت­شناسی

نتایج آنالیز واریانس (ANOVA) نشان داد که ارقام مورد بررسی از نظر صفات مورد اندازه­گیری با یکدیگر تفاوت معنی­داری نشان می­دهند و به‏همین دلیل در مراحل بعدی وارد تجزیه و تحلیل آماری برای تعیین رابطه آن‏ها با نشانگرهای مولکولی گردیدند. صفاتی که دارای ضریب تغییرات بالایی می­باشند محدوده وسیعتری از کمیت صفت را دارا بوده که دامنه انتخاب وسیع­تری برای آن صفت محسوب می­شود.

 

تکنیک مولکولی ISSR

پس از غربالگری، در مجموع 10 پرایمر ISSR برای انجام واکنش PCR انتخاب شد و برای تمام ژنوتیپ­ها به‏کار رفتند. پرایمرهای مورد استفاده در مجموع 150 باند در ژرم­پلاسم مورد مطالعه تولید کردند که از این تعداد 140 باند چندشکلی نشان دادند. همچنین میانگین چندشکلی ردیابی شده توسط پرایمرهای مورد استفاده برابر با 14/92 درصد بود که نشان‏دهنده تنوع ژنتیکی بالا در ژرم­پلاسم مورد آزمایش بود (جدول 2).

 

 

 

 

جدول 2: پرایمرهای ISSR مورد استفاده برای مطالعه ژرم­پلاسم فندق مورد مطالعه و خصوصیات آن‏ها

قدرت تفکیک (Rp)

درصد چندشکلی (b/a×100)

تعداد قطعات چندشکل (b)

تعداد کل قطعات تکثیر شده (a)

پرایمر

88/3

31/92

12

13

UBC-810

42/1

43/71

10

14

UBC-813

42/5

75/93

15

16

UBC-816

77/5

100

20

20

UBC-849

77/3

100

16

16

UBC-850

28/6

100

17

17

UBC-866

02/3

75

9

12

UBC-868

97/2

100

12

12

UBC-873

54/7

100

21

21

UBC-880

94/1

89/88

8

9

UBC-881

-

-

140

150

کل

20/4

14/92

14

15

میانگین

 

 

اندازه باندهای تشکیل شده از 250 تا 2000 جفت باز متغیر بود. بیشترین باند چندشکل تکثیر شده 21 عدد (برای پرایمر UBC-880)  و کمترین آن 8 عدد (برای پرایمر UBC-881) بود. قدرت تفکیک­ (Rp) پرایمرها نیز در محدوده 42/1 (برای پرایمر UBC-813) تا 54/7 (برای پرایمر UBC-880) بود. میانگین قدرت تفکیک (Rp) برای تمامی پرایمرهای مورد استفاده به مقدار 20/4 به‏دست آمد. میزان تشابه بین ژنوتیپ­ها در دامنه 18/0 تا 76/0 بود که نشان ­دهنده تنوع بالا در ژرم­پلاسم مورد مطالعه بود.

آنالیز رگرسیونی چندمتغیره (MRA) بین باندهای چندشکل و صفات ریخت­شناسی مورد بررسی نشان داد که برخی از نشانگرهای ISSR همبستگی معنی­داری با این صفات دارند (جدول 3). بیشترین تعداد نشانگر برای صفت طول مغز (34 نشانگر) و کمترین تعداد نشانگر (12 نشانگر) برای عرض مغز بود. تعداد 31 نشانگر با طول نات همبستگی نشان دادند که 24 نشانگر همبستگی مثبت و 7 نشانگر همبستگی منفی داشتند. مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC868300 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β بود (β =0.53 و R2 =0.23). همچنین تعداد 14 نشانگر با عرض نات همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها 99 درصد بود. از این تعداد 12 نشانگر دارای همبستگی مثبت و 2 نشانگر دارای مبستگی منفی با صفت عرض نات بودند. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC8101720 بود (β =-0.70 و R2 =0.48). بعلاوه، تعداد 32 نشانگر با وزن نات همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC8101720 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β بود (β =-0.75 و R2 =0.43).

 

 

 

جدول 3: نتایج حاصل از آنالیز رگرسیونی گام به گام بین باندهای چندشکل نشانگر ISSR با صفات مهم میوه فندق

نشانگر دارای بیشترین β

نشانگر دارای بیشترین R2

بیشترین β

بیشترین R2 توجیه شده (%)

R2 کل (%)

تعداد نشانگر آگاهی­بخش

صفت

UBC868300

UBC868300

53/0

23

100

31

طول نات

UBC8101720

UBC8101720

70/0-

48

99

14

عرض نات

UBC8101720

UBC8101720

75/0-

43

100

32

وزن نات

UBC868300

UBC868300

94/0

25

100

34

طول مغز

UBC810475

UBC810475

71/0

31

95

12

عرض مغز

UBC810735

UBC810735

78/0-

24

100

32

وزن مغز

UBC880845

UBC8801115

64/0-

33

95

13

درصد مغز

 

 

در مورد صفات مربوط به مغز، تعداد 34 نشانگر با طول مغز همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC868300 بود (β =0.94 و R2 =0.25). عرض مغز با 12 نشانگر رابطه داشت که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها 95 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC810475 بود (β =0.71 و R2 =0.31). تعداد 32 نشانگر با وزن مغز همبستگی نشان دادند که مجموع کل R2توجیه شده توسط آن‏ها 100 درصد بود. در بین نشانگرهای

 

وابسته به این صفت، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین مقدار β مربوط به نشانگر UBC810735 بود (β =-0.78 و R2 =0.24). شکل 1 پروفایل پرایمرUBC810  را نشان می­دهد که نشانگر UBC810735 روی آن مشخص شده است. همچنین شکل 2 رابطه رگرسیونی بین نشانگر UBC810735 و صفت وزن مغز را نشان می­دهد.

درصد مغز با تعداد 13 نشانگر ارتباط داشت که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها 95 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به این صفت، نشانگر UBC8801115 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.33) و UBC880845 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.64).

 

 

شکل 1: پروفایل پرایمر UBC810 ISSR  که نشانگر UBC810735 آن بیشترین R2 و β را برای صفت وزن مغز داشته است. این نشانگر با علامت فلش مشخص شده است.

 

UBC810735

 

 

 


شکل 2: پلات رابطه رگرسیونی بین نشانگر UBC810735و صفت وزن مغز

 

 

 

 

 

 

 

 

تکنیک مولکولیRAPD

از تعداد 100 پرایمر آزمایش شده، در مجموع 15 پرایمر RAPD برای انجام واکنش PCR انتخاب شدند و برای تمام ژنوتیپ­ها به‏کار رفتند. این تعداد پرایمر در مجموع 201 قطعه DNA تولید کردند که از بین آن‏ها 188 قطعه در بین ژنوتیپ­ها چندشکلی نشان دادند. همچنین میانگین چندشکلی ردیابی شده توسط پرایمرهای مورد استفاده برابر با 94/97 درصد بود که نشان­دهنده تنوع ژنتیکی بالا در ژرم­پلاسم مورد آزمایش بود(جدول 4). اندازه قطعات در تمام پرایمرها در محدوده 300

 

تا3000 جفت باز تخمین زده شد. بیشترین باند چندشکل تکثیر

شده 20 عدد (برای پرایمر TIBMBC-17)  و کمترین آن 3 عدد (برای پرایمر OPN-08) بود. قدرت تفکیک (Rp) پرایمرها نیز در محدوده 42/1 (برای پرایمر OPN-08) تا 28/6 (برای پرایمر OPAB-04) بود. میانگین قدرت تفکیک (Rp) برای تمامی پرایمرهای استفاده شده 71/3 بدست آمد (جدول 4). میزان تشابه بین ژنوتیپ­ها در دامنه 27/0 تا 75/0 بود که نشان‏دهنده تنوع بالا در ژرم­پلاسم مورد مطالعه بود.

 

 

 

جدول 4: پرایمرهای RAPDمورد استفاده برای مطالعه ژرم­پلاسم فندق مورد مطالعه و خصوصیات آن‏ها

قدرت تفکیک (Rp)

درصد چندشکلی (b/a×100)

تعداد قطعات چندشکل (b)

تعداد کل قطعات تکثیر شده (a)

پرایمر

88/3

33/93

14

15

TIBMBC-07

74/4

47/89

17

19

TIBMBC-04

77/5

100

20

20

TIBMBC-17

88/3

31/92

12

13

TIBMBC-08

94/1

62/84

11

13

TIBMBC-19

62/1

50/87

7

8

TIBMBC-15

48/3

78/77

7

9

TIBMBC-18

48/1

33/83

5

6

TIBMBC-03

14/3

100

19

19

OPE-13

51/4

67/86

13

15

OPN-13

28/6

100

17

17

OPAB-04

48/5

100

15

15

OPE-11

20/3

100

12

12

OPN-01

77/3

100

16

16

OPE-17

42/1

75

3

4

OPN-08

-

-

188

201

کل

71/3

94/97

53/12

40/13

میانگین

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 با استفاده از روش رگرسیونی گام به گام بین هر یک از صفات ریخت­شناسی با 188 باند چندشکل RAPD، نشانگرهای گروه RAPD مرتبط با هر یک از صفات ریخت­شناسی میوه شناسایی شدند (جدول 5). گروه نشانگرهای  RAPDبرای صفات ریخت‏شناسی طول نات، عرض نات و وزن نات به‏ترتیب دارای 28، 32 و 27 نشانگر RAPD بودند که مجموع کل R2 توجیه شده توسط آنها برای صفات ذکر شده 100 درصد بود. همچنین تعداد نشانگرهای وابسته به صفات طول مغز، عرض مغز، وزن مغز و درصد مغز به‏ترتیب 32، 28، 32 و 34 نشانگر بودند که  مجموع کل R2 توجیه شده توسط آن‏ها برای صفات ذکر شده 100 درصد بود. در بین نشانگرهای وابسته به طول نات، نشانگر TIBMBC191545 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده بود (R2 =0.30) و بیشترین مقدار β مربوط به TIBMBC04330 بود (β =0.63). در بین نشانگرهای وابسته به عرض نات، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین β مربوط به TIBMBC081765 بود (β =-0.79 و R2 =0.48). همچنین در بین نشانگرهای وابسته به وزن نات، بیشترین مقدار R2 توجیه شده و بیشترین β مربوط به TIBMBC081765 بود (β =-0.89 و R2 =0. 42).

 

 

جدول 5: نتایج حاصل از آنالیز رگرسیونی گام به گام بین باندهای چندشکل نشانگر RAPD با صفات مهم میوه فندق

نشانگر دارای بیشترین β

نشانگر دارای بیشترین R2

بیشترین β

بیشترین R2 توجیه شده (%)

R2 کل (%)

تعداد نشانگر آگاهی­بخش

صفت

TIBMBC04330

TIBMBC191545

63/0

30

100

28

طول نات

TIBMBC081765

TIBMBC081765

79/0-

48

100

32

عرض نات

TIBMBC081765

TIBMBC081765

89/0-

42

100

27

وزن نات

OPE11440

TIBMBC171850

72/0

41

100

32

طول مغز

TIBMBC191545

TIBMBC151435

91/0-

32

100

28

عرض مغز

OPN131215

TIBMBC041010

78/0

32

100

32

وزن مغز

TIBMBC04680

OPN131970

84/0-

17

100

34

درصد مغز

 

 

در مورد صفت طول مغز، نشانگر TIBMBC171850 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.41) و نشانگر OPE11440 دارای بیشترین مقدار β بود (β =0.72). در بین نشانگرهای وابسته به عرض مغز، نشانگر TIBMBC151435 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.32) و نشانگر TIBMBC191545 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.91). در بین نشانگرهای وابسته به وزن مغز، نشانگر TIBMBC041010 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.32) و نشانگر OPN131215 دارای بیشترین مقدار β بود (β =0.78). در مورد صفت درصد مغز؛ نشانگرهای OPN131970 دارای بیشترین مقدار R2 توجیه شده (R2 =0.17) و نشانگر TIBMBC04680 دارای بیشترین مقدار β بود (β =-0.84).

 

بحث

نتایج این مطالعه نشان داد که ژنوتیپ­های فندق مورد مطالعه دارای تنوع بالایی از نظر صفات ریخت­شناسی میوه و جنبه­های مولکولی می­باشند و در نتیجه این تنوع بالا اجازه ردیابی رابطه بین نشانگرهای مولکولی و صفات میوه را از طریق آنالیز رگرسیونی چندمتغیره را داد. برخی از باندهای تولید شده توسط نشانگرهای ISSR و RAPD با صفات ریخت­شناسی مورد مطالعه همبستگی نشان دادند. محل قرارگیری این نشانگرها در داخل ژنوم احتمالا مناطقی از ژنوم می­باشد که کدکننده ژن­های مربوط به صفات ریخت­شناسی مورد نظر می­باشد (23). با هر صفت چندین نشانگر همبستگی نشان دادند که نشانگری که بالاترین R2 را داشته است به‏عنوان موثرترین نشانگر در کد کردن آن صفت محسوب می­شود (8).

برخی از نشانگرها با بیش از یک صفت میوه ارتباط نشان دادند که ارتباط یک نشانگر با بیش از یک صفت می­تواند ناشی از اثرات پلیوتروپیک (Pleiotropic) QTL های مرتبط با هم در صفات مختلف باشد (24 و 25)، اما برای آگاهی بیشتر از این رابطه، ایجاد یک جمعیت در حال تفرق و نقشه­یابی لینکاژی آن می­تواند مفید باشد (26). اثر پلیوتروپیک زمانی رخ می­دهد که یک ژن بتواند به‏طور هم‏زمان در بروز چندین صفت تاثیر داشته باشد. همچنین QTL های مرتبط با همدیگر که صفات مختلف را کنترل می­کنند نیز می­توانند منجر به ایجاد یک نشانگر واحد شوند که با بیش از یک صفت همبستگی داشته باشد (25). به عنوان مثال در مطالعه حاضر، در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC868300، UBC8101340 و UBC8101750 با دو صفت طول نات و طول مغز همبستگی معنی­دار نشان دادند که بیان­کننده همبستگی مثبت این دو صفت با همدیگر می­باشد. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگرهای TIBMBC191545، TIBMBC151435 و OPE111125 با این دو صفت همبستگی مثبت نشان دادند. این نتیجه با نتایج محققان دیگر مطابقت دارد، به‏طوری‏که گزارش شده است طول نات همبستگی مثبت و معنی­دار با طول مغز دارد (27، 28 و 29).

به‏علاوه، در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC868330، UBC873755، UBC866775، UBC868950، UBC850410، UBC850825، UBC8812410 و UBC810685 با طول نات، وزن نات و وزن مغز همبستگی مثبت نشان دادند. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگر OPE11740 با این صفات همبستگی نشان داد. گزارش شده است که این صفات با همدیگر همبستگی مثبت دارند و کاهش یا افزایش در هر کدام می­تواند باعث کاهش یا افزایش در دیگری شود (27 و 29). در بین نشانگرهای ISSR، نشانگرهای UBC8492335 و UBC8101260 با طول و وزن مغز همبستگی نشان دادند. همچنین در بین نشانگرهای RAPD، نشانگرهای OPAB04380 و OPE11935 با این دو صفت همبستگی نشان دادند. همبستگی مثبت بین این دو صفت با استفاده از مطالعات ریخت­شناسی گزارش شده است (27 و 28).

تجزیه رگرسیونی چندمتغیره (MRA) یک روش مناسب و سریع برای یافتن رابطه بین صفات و نشانگرها می­باشد (30). نشانگرهای شناسایی شده در این مطالعه که با صفات میوه فندق همبستگی نشان داده­اند می­توانند در برنامه­های اصلاحی MAS به‏کار بروند. مزایای بارز این آنالیز این است که این روش می­تواند مکان­های صفات کمی (QTL) را ردیابی کند. همچنین نیاز به زمان و هزینه کمتری داشته (30) و به تشکیل جمعیت جهت نقشه­یابی نیاز ندارد (23).

انتخاب اولیه صفات مطلوب مربوط به میوه و گل نیاز به نمو گیاهان و وارد شدن آنها به مرحله بلوغ دارد و یا به عبارت دیگر درختان میوه باید مرحله طولانی نونهالی را طی نمایند و وارد مرحله میوه­دهی شوند تا بتوان این صفات را مورد بررسی قرار داد و گیاهان دارای صفات مطلوب از نظر گل و میوه پیدا نمود (23). اما با ردیابی نشانگرهای وابسته به این صفات، نیاز به وارد شدن گیاهان به مرحله بلوغ نمی­باشد. به‏عبارت دیگر، برای گیاهان چوبی (مانند درختان میوه) دارای دوره طولانی نونهالی، انتخاب نتاج برتر از نظر صفات مهم گل و میوه کاری دشوار
می­باشد اما با شناسایی نشانگرهای وابسته به صفت (MAS)، می­توان نتاج برتر را در مراحل اولیه رشد آنها شناسایی کرد (23). روش کار به این‏صورت است که می­توان قطعات DNA چندشکل شناسایی شده به‏عنوان نشانگر آگاهی­بخش برای صفت مورد مطالعه (مانند صفات مربوط به میوه) را از روی ژل جدا کرد و کلون نمود. سپس توالی شناسایی شده را در پایگاه اطلاعاتی NCBI با توالی­های موجود هم­ردیف (Alignment) نمود و
ژن­های کاندید (Candidate genes) که شباهت بالایی به نشانگرهای آگاهی­بخش مورد نظر داشتند را مشخص نمود. همچنین می­توان از روی توالی به‏دست آمده، پرایمرهای SCAR را طراحی نمود و در انتخاب به‏واسطه نشانگر وابسته به صفت (MAS) در برنامه­های اصلاحی بهره برد (30).

شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با ژن­های اصلی کنترل­کننده صفات مورد نظر در سال­های اخیر از طریق ایجاد جمعیت­های در حال تفرق همچونF1  درگیاهان هتروزیگوت و F2 ،RIL وDH در گیاهان هموزیگوت انجام گرفته است. بعضی از این نشانگرها جهت انجام کارهای اصلاحی استفاده شده­اند، اما در دسترس نبودن جمعیت­های در حال تفرق جهت نقشه­یابی، در اختیار نبودن زمان کافی و نبود همبستگی کافی بین صفات ریخت­شناسی و نشانگرهای ملکولی از جمله مهمترین محدودیت­ها در زمینه شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات ریخت­شناسی می­باشد اما انجام آنالیز همبستگی رگرسیونی فاقد این محدودیت­ها می­باشد (31).

 

 نتیجه گیری

با توجه به نتایج مطالعه حاضر، می­توان نتیجه گرفت که نشانگرهای آگاهی­بخش شناسایی شده وابسته به خصوصیات میوه در فندق می­توانند راهنمای خوبی برای شناسایی ژنوتیپ‫های دارای صفات با ارزش میوه باشد. در برنامه­های اصلاحی انتخاب مواد گیاهی با کیفیت معمولاً وقت و هزینه زیادی می‫طلبد. با این‏حال، نشانگرهای آگاهی­بخش شناسایی شده در این مطالعه می­توانند در انتخاب ژنوتیپ­های برتر بخصوص وقتی که اطلاعاتی از پایه ژنتیکی آن‏ها مانند نقشه لینکاژی در دسترس نیست مفید باشد. همچنین، این نشانگرها می­توانند در انتخاب والدین مناسب برای تولید جمعیت­ جهت نقشه­یابی به‏کار بروند.

1. Mehlenbacher S.A. Hazelnuts. In: Fulbright DW (eds) A Guide to nut tree culture in North America, vol 1. Northern Nut Growers Assoc; 2003; 183–215

2. Mehlenbacher SA. Genetic resources for hazelnut: state of the art and future perspectives. Acta Hort. 2009;  845: 33–38.

3. Langridge P, Lagudah ES, Holton TA, Appels R, et al. Trends in genetic and genome analyses in wheat: a review. Aus J Agri Res. 2001; 52: 1043–1077.

4. Rakshit A, Rakshit S, Singh J, Chopra SK, et al. Association of AFLP and SSR markers with agronomic and fibre quality traits in Gossypium hirsutum L. J Genet. 2010; 89: 155-162.

5. Gomez, K, Gomez, A.A. Statistical procedures for agricultural research, 2th ED. John Wiley, New York, USA; 1984.

6. Neale DB, Savolainen O. Association genetics of complex traits in conifers. Tre Plant Sci. 2004; 9(7): 325–330.

7. Roy JK, Bandopadhyay R, Rustgi1 S, Balyan1 HS, et al. Association analysis of agronomically important traits using SSR, SAMPL and AFLP markers in bread wheat. Cur Sci. 2006; 90: 5-10.

8. Kar PK, Srivastava PP, Awasthi AK, Urs SR. Genetic variability and association of ISSR markers with some biochemical traits in mulberry (Morus spp.) genetic resources available in India. Tree Genet Genomes. 2008; 4:75–83.

9. Jugran A, Rawat S, Dauthal P, Mondal S, et al. Association of ISSR markers with some biochemical traits of Valeriana jatamansi Jones. Industrial Crops and Products. 2013; 44: 671–676.

10. Shen XL, Guo WZ, Lu QX, Zhu XF, et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for fiber quality and yield trait by RIL approach in Upland cotton. Euphytica. 2007; 155: 371-380.

11. Zeng L, Meredith WR, Gutierrez OA, Boykin DL. Identification of association between SSR markers and fiber traits in an exotic germpelasm derived from multiple cross among Gossypium tetraploid species. Theor Appl Genet. 2009; 119: 93-103.

12. Ma HX, Bai GH, Carver BF, Zhou LL. Molecular mapping of a quantitative trait locus for aluminium tolerance in wheat cultivar Atlas 66. Theor Appl Genet. 2005; 112: 51-57.

13. Song XF, Song TM, Dai JR, Rocheford TR. Collaborative working group on underutilized QTL mapping of kernel oil concentration with high-oil maize by SSR markers. Maydica. 2004; 49: 41-48.

14. Chatterjee SN, Nagaraja GM, Srivastava PP, Naik G. Morphological and molecular variation of Morus laevigata in India. Genetica. 2004; 121(2):133-143.

15. Basaki T, Choukan R, Khayam-Nekouei SM, Mardi M, et al. Association analysis for morphological traits in pomegranate (Punica geranatum L.) using microsatellite markers. Mid East J Sci Res. 2011; 9(3): 410-417.

16. Ganopoulos IV, Kazantzis K, Chatzicharisis I, Karayiannis I, et al. Genetic diversity, structure and fruit trait associations in Greek sweet cherry cultivars using microsatellite based (SSR/ISSR) and morpho-physiological markers. Euphytica. 2011, 24: 835-844.

17.Boccacci P, Botta R. Microsatellite variability and genetic structure in hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars from different growing regions. Sci Hortic. 2010; 124: 128–133.

18. Ferreira JJ, Garcia-Gonzalez C, Tous J, Rovira M. Genetic diversity revealed by morphological traits and ISSR markers in hazelnut germplasm from northern Spain. Plant Breeding. 2010; 129: 435-441.

19. Gokirmak T, Mehlenbacher SA, Bassil NV. Characterization of European hazelnut (Corylus avellana) cultivars using SSR markers. Genet Resour Crop Evol. 2009; 56: 147–172.

20. Doyle JJ, Doyle JL. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 1987; 19: 11-15.

21. Khadivi-Khub A, Zamani Z, Bouzari N. Evaluation of genetic diversity in some Iranian and foreign sweet cherry cultivars by using RAPD molecular markers and morphological traits. Hortic Environ Biotechnol. 2008; 49, 188–196.

22. Timmappaiah WG, Shobha G, Melwyn S. Assessmant of genetic diversity in Cashew germplasm using and ISSR markers.Sci Hortic. 2009; 120: 411-417.

23. Virk PS, Ford-Lloyd BV, Jackson MT, Pooni HS, et al. Predicting quantitative variation within rice germplasm using molecular markers. Hered. 1996; 76: 296–304.

24. Culp TW, Harrell DC, Kerr T. Some genetic implications in the transfer of high fiber strength genes to upland cotton. Crop Sci. 1979; 19:481- 484.

25. Meredith A, Bridge RR. Breakup of linkage block in cotton, Gossypium hirsutum L. Crop Sci. 1971; 11: 695-697.

26. Ebrahimi A, Naghavi MR, Sabokdast M, Moradi AS. Association analysis of agronomic traits with

 

microsatellite markers in Iranian barley landraces barley. J. Mod Genet. 2011; 24: 15-23.

27. Zeki Bostan S, Islam A. Some nut characteristics and variation of these characteristics within hazelnut cultivar Palaz. Tur J Agri For. 1999; 23: 367-370.

28. Yao Q, Mehlenbacher SA. Heritability, variance components and correlation of morphological and phonological traits in hazelnut. Plant Breed. 2000; 119: 369–381.

29. Miletic R, Zikic M, Mitic N, Nicolic R. Pomological characteristic of superior selections of European filbert (C. avellana L.). Genetica. 2005; 37: 103-111.

30. Ruan CJ, Li H, Mopper S. Characterization and identification of ISSR markers associated with resistance to dried-shrink disease in sea buckthorn. Mol Breed. 2009; 24(3): 255–268.

31. Gupta PK, Rustgi S, Kulwal PL. Linkage disequilibrium and association studies in higher plants: Present status and future prospects. Plant Mo. Biol. 2005; 57(4): 461–485.