اثر عصاره الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس بر تمایز اوستئوژنیک و آدیپوژنیک سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی و مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، مشهد، ایران

2 دانشجوی دکترای تخصصی زیست شناسی تکوین جانوری، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، تهران، ایران

3 دانشجوی دکترای تخصصی زیست شناسی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات، تهران، ایران

چکیده

هدف :خیار دریایی به‏دلیل دارا بودن ترکیبات بیواکتیو مانند کندروئیتین سولفات در درمان بیماری‏های استخوانی مورد توجه است. در زمینه به‏کارگیری سلول‏های بنیادی مزانشیمی در ترمیم آسیب‏های استخوانی در سال‏های اخیر پیشرفت‏های خوبی انجام شده است. بنابراین پژوهش حاضر با هدف بررسی تمایز استئوژنیک و آدیپوژنیک عصاره الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس روی سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار صورت گرفت. مواد و روش‏ها: در این تحقیق تجربی آزمایشگاهی، سلول‏های بنیادی مغزاستخوان موش صحرایی نر توسط فلاشینگ جداسازی و توسط ایمنوسیتوشیمی تایید گردیدند. سلول‏ها در 9 گروه تجربی با دوزهای مختلف عصاره الکلی خیار دریایی 5/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100، 200، 400 و 800  میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شده و با روش MTT سیتوتوکسیسیته عصاره مشخص گردید. 21 روز بعد، تمایز اوستئوژنیک و آدیپوژنیک توسط رنگ‏آمیزی آلیزارین رد، اویل رد و کیت آلکالین فسفاتاز بررسی شد. داده های کمی توسط نرم افزار SPSS، آزمون ANOVA  در سطح 05/0 P<تحلیل شدند. نتایج: دوز مناسب برای تیمار سلول‏های بنیادی غلظت‏های کمتر از 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر تعیین شد. رنگ‏آمیزی اویل رد نشان داد خیار دریایی قابلیت تمایز سلول‏های بنیادی به دودمان آدیپوژنیک ندارد. رنگ‏آمیزی آلیزارین رد و فعالیت آلکالین فسفاتاز نشان دادند دوز 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره الکلی خیار دریایی موثرترین دوز تمایز سلول‏های بنیادی به‏ دودمان استئوژنیک است. نتیجه‏گیری: نتایج این پژوهش بیان‏گر پتانسیل تمایزی اوستئوژنیک عصاره خیار دریایی خلیج فارس بر سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی می‏باشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

بیماری‏های استخوانی ایجاد شده توسط هومئوستازی غیر طبیعی استخوان می‏توانند از طریق القا عمل‏کرد اوستئوبلاستی درمان شوند. از این رو شناسایی داروهایی که موجب تسریع شکل‏گیری استخوان شوند، ابزار کلیدی در درمان بیماری‏های استخوانی به‏شمار می‏رود (1). سلول‏های بنیادی مزانشیمی چند توان به‏دلیل دارا بودن ظرفیت بالای تکثیر و تمایز منبع سلولی ارزشمندی در پزشکی ترمیمی به‏شمار رفته و می‏توانند به چند نوع سلول از جمله اوستئوبلاست، آدیپوسیت و کندروسیت تمایز یابند (2). مطالعات نشان داده‏اند این سلول‏ها به‏عنوان منبع سلول‏های پیش ساز استخوانی می‏باشند و تمایز اوستئوبلاستی توسط فاکتورهای مختلفی از جمله(bone morphogenetic proteins) BMPs،(transforming growth factor ß) TGFβ،(fibroblast growth factor-2) FGF-2 ،(insulin growth factor-1) IGF-1 و برخی عوامل دیگر تنظیم می‏شود (3).

تمایز اوستئوبلاستی رویداد کلیدی در شکل‏گیری استخوان است و می‏تواند به سه مرحله تکثیر، مرحله بلوغ و سنتز ماتریکس خارج‏سلولی و مرحله معدنی شدن تقسیم شود که نشان‏گر‏های فنوتیپی به‏طور متمایزی در هر مرحله بیان می‏شوند، به‏عنوان مثال اوستئوبلاست‏های فعال، مارکرهای اولیه تمایز اوستئوبلاستی یعنی بیان فراوان آلکالین فسفاتاز و کلاژن نوع ׀ را نشان می‏دهند، این در حالی است که به‏نظر می‏رسد اوستئوکلسین و اوستئوپونتین در مراحل دیرتر همزمان با معدنی شدن بیان می‏شوند (4).

تا به امروز داروهای فراوانی در درمان بیماری‏های استخوانی گزارش شده‏اند که در هر حال اکثر این داروها متوقف کننده بازجذب استخوان هستند و اثرات جانبی زیادی دارند، برای مثال درمان جایگزینی استروژن که از دژنره شدن توده استخوان در زنان، پس از دوره یائسگی پیشگیری می‏نماید، علی‏رغم وجود فواید بسیار موجب افزایش بروز سرطان تخمدان و پستان می‏شود، از این‏رو پژوهشگران سعی دارند ترکیباتی را شناسایی کنند که بتوانند بدون ایجاد عارضه جانبی خاص، شکل‏گیری استخوان را افزایش دهد (5).

سلول‏های بنیادی مزانشیمی پتانسیل قابل توجه درمانی زیادی را در زمینه درمان بیماری‏های مختلف دارا هستند (6)، از طرفی با توجه به توان بالای سلول‏های مزانشیمی مشتق از مغز استخوان در تمایز به رده‏های سلولی متفاوت و استفاده از این رده‏های سلولی در درمان بسیاری از بیماری‏ها از جمله نقایص استخوانی و غضروف، فراهم نمودن شرایطی که روند تمایز و ترمیم بافت‏های سخت و اسکلتی بهبود یا تسهیل یابد از اهمیت ویژه‏ای برخوردارند (7). یکی از غنی‏ترین منابع حاوی چنین ترکیباتی اکوسیستم‏های آبی است که در آنها گونه‏های مختلفی از جانوران، گیاهان و میکروارگانیسم‏ها زیست می‏نمایند، این اکوسیستم‏ها به‏دلیل وجود تنوع بالای مواد طبیعی دارای فعالیت بیولوژیک منحصر به‏فرد هستند و توجه دانشمندان را در  دهه‏های اخیر به‏شدت معطوف خود کرده‏اند، به‏عنوان مثال فراورده‏های طبیعی نظیر عصاره‏های استخراج شده از جلبک‏های دریایی دارای ترکیباتی هستند که می‏توان آن‏ها را برای سنتز داربست‏ها و نیز تمایز استفاده نمود (1). موجودات دریایی همچون اسفنج‏ها، مرجان‏های دریایی، تونیکات‏ها، نرم‏تنان دریایی و میکروارگانیسم‏های دریایی امروزه برای مطالعه و جستجوی کاندیداهای دارویی جدید مورد توجه قرار گرفته‏اند و بسیاری از ترکیبات مشتق شده از موجودات زنده دریایی دارای فعالیت‏های بیولوژیک امید بخشی در زمینه درمان بیماری‏ها هستند (8).

محققین در حدود 7000 فراورده دریایی را جداسازی نموده‏اند که 20 درصد آن مربوط به جلبک‏ها، 33 درصد اسفنج‏ها، 18 درصد مرجانیان و 24 درصد مربوط به سایر بی‏مهرگان از جمله اکینودرم‏ها می‏باشند (9). کشور ایران از لحاظ دارا بودن چنین منابعی در زمینه فراورده‏های طبیعی غنی به‏شمار می‏آید (10).  بررسی ترکیبات موجود در اکینودرم‏ها نشان می‏دهد که این جانوران حاوی ترکیبات فعال زیستی با خواص دارویی می‏باشند که در بسیاری از فرایند‏های زیستی نقش ایفا می‏کنند (11). خیار دریایی در طب سنتی برای درمان بیماری‏های مختلف  مورد استفاده قرار گرفته است و یکی از ارگانیسم‏های دریایی با ارزش غذایی و درمانی بالا به‏شمار می‏آید که خواص دارویی آن به‏دلیل حضور ترکیبات عمل‏کردی با فعالیت بیولوژیکی چند گانه نسبت داده می‏شود (12).

خیار دریایی به‏عنوان یک بی‏مهره دریازی دارای پروفایل با ارزش منحصر به‏فرد، از مواد مغذی دارای خاصیت دارویی همانند تیامین، ریبوفلاوین، نیاسین و مواد معدنی از جمله کلسیم است که دارای خواص بیولوژیک نظیر مهار رگ‏زایی، ضد سرطان، ضد التهاب، آنتی اکسیدانت است. همچنین این جانور حاوی ترکیبات فعال زیستی نظیر گلیکوزآمینو‏گلیکان، کندروئیتین سولفات، گلیکوزیدهای تری‏ترپنه، ترکیبات فنلی و اسیدهای چرب  می‏باشد و امید می‏رود در جهت تمایز سلول‏ها و تسهیل و پیشبرد این فرایند با هدف تولید رده‏های سلولی گوناگون و استفاده از آن‏ها در درمان بسیاری از بیماری‏ها مفید واقع شود (13). با توجه به رویکرد نو و اقبال جامعه جهانی به فراورده‏های طبیعی و از آنجایی‏که در طب سنتی از موجودات دریایی نظیر خیار دریایی برای التیام دردهای مفصلی و استخوانی استفاده می‏شود و کشور ایران نیز دارای ذخایر دریایی غنی از این گروه جانوری می‏باشد که تا کنون مطالعه‏ای در زمینه اثرات ترکیبات آن‏ها بر تمایز سلول‏های بنیادی و سلول درمانی انجام نشده است لذا در پژوهش حاضراثر عصاره تام الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس در پیشبرد تمایز سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نژاد ویستار به‏سمت دودمان‏های اوستئوژنیک و آدیپوژنیک بررسی شده است .

 

مواد و روش‏ها

جداسـازی و کشت سلـول‏های بنیادی مزانشیمی مغـز استخوان:

موش‏های صحرایی نژاد ویستار با سن تقریبی ٤ تا  ۶ هفته و با وزن تقریبی 100 تا 130 گرم از انستیتو رازی مشهد خریداری و در اتاق حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی مشهد، در شرایط طبیعی و با پریود نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی نگه‏داری شدند. برای انجام تجربیات، موش‏ها با استفاده از کلروفرم کشته شدند، استخوان‏های ران و درشت نی آن‏ها جدا گردید و داخل PBS (PAA, Germany) سرد قرار داده شد. پس از پاک‏سازی بافت‏های اطراف و قطع دو سر استخوان، مغز استخوان با روش Flushing از درون استخوان تخلیه گردید. پس از سانتریفیوژ، به پلیت سلولی حاصل ۲ میلی‏لیتر DMEM (Bio idea, Iran) حاوی 15 درصدFBS  (GIBCO, USA) و یک درصد پنی‏سیلین استرپتومایسین  اضافه شده و درون انکوباتور (Memmert, Germany) با دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد و  CO2 پنج درصد قرار داده شدند. بعد از 2 روز محیط رویی تخلیه و هر 3 روز یکبار تعویض محیط صورت گرفت. زمانی‏که تراکم سلول‏ها به  80  درصد رسید، پاساژ سلولی انجام و سلول‏ها پس از پاساژ سوم جهت کشت استفاده شدند. در کلیه مراحل انجام تحقیق، موارد اخلاقی کار با حیوان مطابق مقررات کمیته اخلاق دانشگاه رعایت گردید.

تکنیک ایمنوسیتوشیمی جهت اثبات بنیادی بودن سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: برای این منظور دو هفته پس از جداسازی و تخلیص سلول‏های مزانشیمی و حذف سایر سلول‏های موجود در مغز استخوان، سلول‏های مزانشیمی در پلیت 96 خانه‏ای کشت داده شد و پس از چسبیدن سلول‏ها به کف فلاسک، سلول‏ها سه مرتبه با PBS سرد شستشو داده شده، سپس در معرض پارافرمالدئید سرد 4 درصد قرار گرفته و با آنتی‏بادی اولیه بر علیه مارکر سطحی سلول‏های بنیادی(Abcam, England) CD44  به‏مدت یک ساعت انکوبه شدند. پس از طی زمان مذکور، سلول‏ها در معرض آنتی‏بادی ثانویه کونژوگه با FITC (Sigma,USA) برای نشان دادن سلول‏ها و همچنین رنگ DAPI (Sigma, USA) جهت رنگ‏آمیزی هسته سلول‏ها قرار داده شدند و سپس با میکروسکوپ فلورسنت(Labomed, Korea)  بررسی انجام شد.

آماده سازی عصاره الکلی خیار دریایی: نمونه‏های خیار دریایی از آب‏های خلیج فارس مجاور جزیره قشم جمع‏آوری و به مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی مشهد منتقل و پس از بررسی‏های مورفومتریک اولیه محتویات داخلی بدن آن‏ها تخلیه و بخش بیرونی بدن آن‏ها را خشک کردیم، سپس به ازای هر گرم وزن خشک بدن، 10 میلی‏لیتر متانول استفاده شد و به‏مدت سه شبانه روز بر روی شیکر چرخشی قرار داده شد. پس از طی زمان مذکور، عصاره با استفاده از کاغذ واتمن 10صاف گردیده و توسط دستگاه وکیوم تبخیری (Heidolph, Germany) عصاره گیری و تغلیظ انجام و درون آون (Memmert, Germany) 40 درجه سانتی‏گراد خشک و سپس در دمای 20- درجه نگه‏داری شدند.

تعیین سیتوتوکسیسیته عصاره الکلی خیار دریایی با استفاده از روشMTT: به‏منظور بررسی دوز مناسب عصاره خیار دریایی بر روی سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی نژاد ویستار، 24 ساعت پس از کشت سلول‏های مذکور، این سلول‏ها  با دوزهای متفاوت میکروگرم بر میلی لیتر 50، 100، 200، 400 و 800 رقیق شد، در DMSO 10 درصد عصاره تام الکلی خیار دریایی تیمار شد و پس از 24، 48 و 72 ساعت از تیمار، محیط رویی تخلیه و 20 میکرولیتر محلول 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر MTT (Sigma, USA) به سلول‏ها اضافه شده و پس از 4 ساعت انکوباسیون درون انکوباتور، DMSO به سلول‏ها افزوده شده، سپس جذب در560 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Epoch, USA) اندازه گیری و طبق فرمول ذیل میزان سمیت سلولی تحت تاثیر تیمار با عصاره خیار دریایی تعیین شد:

100×

متوسط جذب کنترل – متوسط جذب نمونه

= درصد بقا سلولی

متوسط جذب کنترل

 

القا تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: جهت القا تمایز، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی پس از پاساژ سوم به تعداد 103 تا 104 درون پلیت‏های 96 خانه‏ای کشت داده شد و پس از 24 ساعت با دوزهای مختلف عصاره خیار دریایی 5/3، 25/6، 5/12 و 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر تیمار گردید و تا 21 روز، هر سه روز یک بار با محیط تیماری تازه تعویض انجام شد.

تعیین تمایز به اوستئوسیت با استفاده از رنگ آمیزی آلیزارین رد: برای رنگ‏آمیزی آلیزارین رد و اندازه گیری سطح ذخایر کلسیمی در ماتریکس خارج سلولی، سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی به‏مدت 21 روز با دوزهای 5/3، 25/6، 5/12 و 25  میکروگرم بر میلی لیتر عصاره تام الکلی خیار دریایی تیمار شد و پس از طی زمان مورد نظر، محیط رویی تخلیه و با PBS شستشو داده شد و پس از 5 دقیقه  با فرمالین 4 درصد تثبیت انجام شد،  سپس 30 دقیقه در معرض رنگ‏آمیزی آلیزارین رد(Bio Idea, Iran)   قرار داده شدند.

تعیین تمایز به اوستئوسیت با استفاده از سنجش فعالیت آلکالین فسفاتاز: به‏منظور سنجش فعالیت آلکالین فسفاتاز، سلول‏های بنیادی مغز استخوان به تعداد 104 × 2 در پلیت کشت 96 خانه‏ای کشت داده شده و به‏مدت 14 روز تحت تاثیر محیط کشت DMEM با دوز‏های متفاوت عصاره خیار دریایی 5/3، 25/6، 5/12 و 25 میکروگرم بر میلی لیتر تحت تیمار قرار گرفتند. پس از طی زمان مورد نظر، محیط رویی خارج و دو مرتبه با PBS شستشو شد و توسط تریتون X-100 یک درصد لیز شدند. سپس با استفاده از کیت سنجش آلکالین فسفاتاز (پارس آزمون) فعالیت آنزیمی در طول موج 405 نامتر به‏کمک اسپکتروفتو‏متر مورد بررسی قرار گرفت.

تعیین تمایز به آدیپوسیت توسط رنگ آمیزی اویل رد: جهت بررسی میزان تمایز به آدیپوسیت‏ها تحت تاثیر محیط القایی عصاره تام خیار دریایی، سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان 21 روز پس از تیمار با عصاره تام خیار دریایی، به‏مدت 45 دقیقه  با فرمالین 4 درصد تثبیت شد و در ادامه پس از شستشو با الکل 70 درصد، با محلول اویل رد(Bio Idea, Iran)   رنگ آمیزی شدند. پس از طی این زمان، سلول‏ها سه تا چهار مرتبه  با الکل 70 درصد شستشو و با میکروسکوپ اینورت (Bio Photonic, Brazil) بررسی شدند.

 

آنالیز آماری: داده های کمی حاصل توسط نرم افزار SPSS، آزمون آماری ANOVA در سطح  05/0 P<تحلیل شد و نمودارها توسط نرم‏افزار EXCEL رسم گردیدند.

 

 

نتایج

بنیادی بودن سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

بررسی مورفولوژیک سلول‏ها توسط میکروسکوپ فلورسانس نشان داد که وجود مارکر سطحی CD44 بر سطح سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی، دال بر اثبات بنیادی بودن سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی است (شکل 1).

 

B

A

A

شکل1: A) رنگآمیزیDAPI جهت نشان دادن هسته سلول‏های بنیادی، B) وجود آنتی ژن سطحی CD44 بر سطح سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی

 

تعیین دوز مناسب عصاره تام الکلی خیار دریایی بر تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

یافته‏های حاصل از آزمون MTT  نشان داد که عصاره تام الکلی خیار دریایی گونه خلیج فارس در دوزهای بالاتر از 400 میکروگرم بر میلی لیتر باعث تجزیه سلولی می‏شوند. همچنین در دوزهای 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر تا 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر به‏صورت وابسته به دوز منجر به مهار تکثیر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان موش صحرایی می‏شوند. از این‏رو غلظت مناسب برای بررسی تمایز عصاره الکلی خیار دریایی کمتر از 50  میکروگرم بر میلی‏لیتر تعیین شد (نمودار1).

 

 

 

نمودار 1: اثر عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس بر روی بقاء سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی در ظرف 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار  توسط MTT. ANOVA ، 05/0>P*،01/0>P **،001/0 >P *** Mean±S.E) ). نتایج نشان داد که دوزهای بالاتر از  400 میکروگرم بر میلی‏لیتر عصاره منجر به تجزیه سلول‏ها می‏شود و عصاره الکلی خیار دریایی در دوز میکروگرم بر میلی‏لیتر 50 تا 200 میکروگرم بر میلی‏لیتر مهار تکثیر سلول‏ها را در پی دارد.

 

اثر عصاره تام الکلی خیار دریایی بر تمایز اوستئوژنیک سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

نتایج حاصل از تست آلکالین فسفاتاز نشان داد که سلول‏های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی نر تیمار شده با عصاره الکلی خیار دریایی پس از طی 14 روز از تمایز، به‏طور چشمگیری نسبت به گروه شاهد افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و معدنی شدن دارند. رنگ‏آمیزی آلیزارین رد پس از 21 روز از تمایز نیز نشان داد که عصاره خیار دریایی به‏طور چشمگیری در دوزهای بین 25/6  میکروگرم بر میلی‏لیتر تا 25 میکروگرم بر میلی لیتر معدنی شدن و میزان ذخایر کلسیمی سلول‏های مغز استخوان را تحریک نموده است (شکل 2و نمودار2).

 

 

A

E

B

C

D

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل2: تصاویر میکروسکوپ معکوس از معدنی شدن سلول‏های مغز استخوان موش صحرایی 21 روز پس از تیمار با

عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس در غلظت‏های 25/6 تا  25 میکروگرم بر میلی‏لیتر در مقایسه با گروه کنترل.

 A) کنترل، B) 25/6 میکروگرم بر میلی‏لیتر، C) 5/12 میکروگرم بر میلی‏لیتر، D) 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر، E)

 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر. ( رنگ‏آمیزی آلیزارین رد، بزرگنمایی ×100 )

 

 

نمودار2: نمودار فعالیت آلکالین فسفاتازی عصاره الکلی خیار دریایی خلیج فارس در غلظت های 25/6 تا 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نر در مقایسه با گروه کنترل05/0> P01/0>P  ** ،001/0 >P *** Mean±SE))

 

 

 

 

 

اثر عصاره تام الکلی خیار دریایی بر تمایز آدیپوژنیک سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش صحرایی نر نژاد ویستار

اثر عصاره خیار دریایی بر تمایز آدیپوژنیک با استفاده از رنگ آمیزی اویل رد 21 روز پس از تمایز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از رنگ آمیزی اویل رد نشان داد که سلول‏های مزانشیمی که به‏مدت 3 هفته تحت تیمار با دوزهای 25/6 تا 25 میکروگرم بر میلی‏لیتـر عصـاره الکلـی خیـار دریایی قـرار گرفته

بودند به سلول چربی تمایز نیافتند.

 

بحث

در پژوهش حاضر، پتانسیل تمایزی عصاره الکلی خیار دریایی به تنهایی و بدون استفاده از محیط تمایزی به دودمان‏های اوستئوژنیک و آدیپوژنیک ارزیابی شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که از آنجایی‏که بیان بالای آلکالین فسفاتاز به‏عنوان یکی از شاخص‏های تمایز اولیه دودمان اوستئوژنیک و بیان اوستئوپونتین از علائم تمایز پایانی دودمان اوستئوژنیک در نظر گرفته می‏شود، دوز مناسب عصاره الکلی خیار دریایی به‏تنهایی به‏دلیل افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و حضور گرانول‏های معدنی نسبت به گروه کنترل موجب تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به دودمان اوستئوژنیک می‏شود که با نتایج سایر پژوهشگران مثل Byuna  و همکاران (14) دال بر وجود ترکیبات موثر در اکوسیستم دریایی درگیر در تمایز به دودمان اوستئوژنیک مطابقت دارد.

به‏دلیل وجود ترکیبات فعال زیستی در منابع دریایی، در سال‏های اخیر بحث استفاده از این ترکیبات فعال در حوزه فارماکولوژیک و درمانی به دلیل دارا بودن عوارض جانبی کمتر

مورد توجه فراوان قرار گرفته است (15). با توجه به اینکه در طب سنتی خیار دریایی به‏دلیل دارا بودن ترکیبات زیستی فراوان دارای خاصیت درمانی، در درمان بیماری‏های مربوط به مفاصل، استخوان و مهره‏ها در طب سنتی مورد استفاده زیاد بوده است (13). از این‏رو بررسی اثر خیار دریایی در پیشبرد روند تمایز سلول‏های بنیادی می‏تواند اهمیت ویژه‏ای در درمان بیماری‏های استخوانی داشته باشد.

بررسی‏ها نشان می‏دهند که عوامل متعددی نظیر محرک‏های شیمیایی، اتصال سلول به ماتریکس خارج سلولی و کشت توام با سایر سلول‏ها بر تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمی در شرایط آزمایشگاه اثر می‏گذارند، به‏عنوان مثال تمایز سلول‏های مزانشیمی به دودمان‏های استخوان و چربی تحت تاثیر محرک‏های شیمیایی از قبیل دگزامتازون و انسولین صورت می‏پذیرد. به‏طوری‏که وقتی سلول‏های بنیادی مزانشیمی در حضور اسکوربیک اسید – 2 – فسفات,  B –گلیسروفسفات  و دگزامتازون کشت شوند سلول‏ها فنوتیپ استخوانی به‏خود گرفته و ماتریکس خارج سلولی از جنس فسفات کلسیم از خود ترشح می‏کنند که به‏صورت کریستال‏های هیدروکسی آپاتیت‏ رسوب می‏کند (16).

در بخش بیرونی بدن خیار دریایی مواد و ترکیباتی همانند گلیکوزآمینو گلیکان، کلسیم، گلیکوزیدهای تری ترپنه و کندروئیتین سولفات وجود دارند که در طب سنتی در درمان دردهای مفصلی، استخوانی و آرتریت نقش دارند (13). یافته‏های حاصل از تجربه حاضر نشان داد که عصاره خیار دریایی می‏تواند به‏عنوان یک منبع ارزشمند حاوی مواد دارای ظرفیت استخوان سازی در عدم حضور فاکتورهای مغذی موجود در محیط اوستئوژنیک از جمله دگزامتازون اسکوربیک اسید،  B – گلیسروفسفات در آینده پس از بررسی در مدل‏های جانوری به منظور درمان بیماری‏های استخوانی از جمله اوستئوپورزیس موثر مورد توجه قرار گیرد.

Zhang و همکارانش (17) اثرات فلاونوئیدها را بر تکثیر و تمایز استئوبلاست‏های اولیه مورد بررسی قرار دادند و یافته‏های آن‏ها نشان داد، فلاونوئید‏ها با بهبود فعالیت آلکالین فسفاتاز سبب پیشبرد تکوین استئوبلاست‏ها می‏شوند که می‏توانند به‏عنوان تسهیل کننده در روند تمایز استئوبلاست‏ها به‏کار روند. این نتایج با یافته‏های حاصل پژوهش حاضر که نشان داد عصاره خیار دریایی به‏عنوان منبعی از فراورده های طبیعی از طریق افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و بیان اوستئوپونتین پیشبرنده تمایز اوستئوژنیک است، مطابقت دارد.  Park  و همکارانش (18) نشان دادند پلی ساکارید سولفاته فوکوئیدان به‏عنوان یک نوع فراورده طبیعی تمایز استئوژنیک سلول‏های بنیادی مشتق شده از بافت چربی انسانی را تحریک می کند.  Song و همکاران (19) نیز نشان دادند، حضور ویتامین D3 به‏صورت سینرژیست با BMP2 در غلظت‏های پایین موجب تسریع تمایز اوستئوژنیک سلول‏های بنیادی چربی می‏شود که با نتایج به‏دست آمده در این پژوهش مبنی بر به‏کارگیری دوزهای پایین عصاره متانولی خیار دریایی بر تمایز اوستئوژنیک سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان همخوانی دارد.

Kim  (20) گزارش کرد که Quercetin  به‏عنوان یک فلاونوئید بر روی متابولیسم استخوان تاثیر گذاشته و موجب تمایز و تکثیر اوستئوژنیک سلول‏های بنیادی استرومایی مشتق از بافت چربی به‏صورت وابسته به دوز می شود. همچنین Lee (21) شش بیفلاونوئید را از گیاه Cephalotaxus koreana جداسازی نموده و میزان تاثیر آن‏ها را بر روند تمایز اوستئوبلاست بررسی کرد. وی چنین گزارش نمود که وجود گروه‏های متوکسیل در حلقه های B بیفلاونوئیدها ممکن است در تمایز اوستئوبلاستی نقش داشته باشد. Ryu و همکاران (22) نیز توالی پپتیدی تحت عنوان LEDPFDKDDWDNWK (1821Da)) را از seahorse (نوعی ماهی استخوانی) جداسازی و تخلیص نمود. نتایج آن‏ها  نشان داد که پپتید استخراج شده از طریق افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز، معدنی شدن و سنتز کلاژن موجب القا تمایز سلول‏های اوستئوبلاستی MG-63 و سلول‏های کندروسیتی SW-1353 می شود.  یافته‏های حاصل از این پژوهش، نیز نشان می‏دهد که عصاره الکلی خیار دریایی به‏صورت وابسته به دوز در یک محدوده خاص تسریع کننده تمایز اوستئوژنیک است و با توجه به نتایج Jeong و همکاران (23) ساپونین به‏عنوان ترکیبی پیشنهاد می‏شود که از طریق افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز می‏تواند تسریع کننده پتانسیل اوستئوژنیک باشد. برخی مطالعات اثر عصاره خیار دریایی را بر روی بارداری و اسپرم کشی بررسی و گزارش شده است که گلیکوزیدهای تری ترپنوئید موجود در عصاره خیار دریایی تحت عنوان holotoxin A1,B1 اثر ضد بارداری دارند و ترکیبی به‏نام cucumariosid استخراج شده از خیار دریایی در لانه گزینی تداخل نموده و اثر ضد بارداری دارد، همچنین یکی از ترکیبات استخراج شده از خیار دریایی ترکیبی تحت عنوان Bivittoside D  استخراج شده از گونه Bohadschia vitiensis فعالیت اسپرم کشی قوی دارد که در استفاده از این عصاره بایستی به این موارد منع توجه نمود (24).

 

 

نتیجه گیری

بر اساس یافته‏های حاصل از پژوهش، ترکیبات موجود در بخش بیرونی بدن خیار دریایی با مهار تمایز به دودمان آدیپوژنیک موجب تسریع تمایز به دودمان اوستئوژنیک بر روی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش صحرایی نژاد ویستار می‏شوند. لذا جهت استفاده از این منبع طبیعی مفید در درمان بیماری‏ها و اختلالات استخوانی در شرایط بالینی و پتانسیل درمانی آن می‏بایست مطالعات بیشتری به‏ویژه بر روی مدل‏های جانوری صورت پذیرد.

 

تشکر و قدردانی

از تلاش‏ها و مسـاعدت‫هـای همکـاران محتـرم مرکـز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی مشهدکه در اجرای این پروژه مشارکت داشتند، صمیمانه سپاسگزاریم.

1. Thi Nguyen MH, Jung WK, Kim SK. Marine Algae Possess Therapeutic Potential for Ca Mineralization via Osteoblastic Differentiation. Adv in Food & Nutri Res, 2011; 64: 429–441.

2. Pansky A, Roitzheim B, Tobiasch E. Differentiation potential of adult human mesenchymal stem cells. Clin Lab. 2007; 53(1-2):81-4.

 

3. Cho YS, Jung WK, Kim JA, Choi IW, et al. Beneficial effects of fucoidan on osteoblastic MG-63 cell differentiation. Food Chem, 2009; 116 (4): 990-994.      

4. Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M. Coordinated activation of Notch, Wnt, and  transforming growth factor-b signaling pathways in bone morphogenic protein 2-induced osteogenesis. Notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity.  J. Biol.OGICAL ChemISTRY, 2004; 279(36): 37704–37715.

5. Glorieux FH. Osteogenesis imperfecta, Best Prac & Res Clin Rheuma, 2008; 22(1): 85–100.

6. Fernández Vallone VB, Romaniuk MA, Choi H, Labovsky V, et al. Mesenchymal stem cells and their use in therapy : What has been achieved?, Differentiation. 2013; 85(1-2): 1–10.

7. Donzelli E, Salvadè A, Mimo P, Viganò M, et al. Mesenchymal stem cells cultured on a collagen scaffold : In vitro osteogenic differentiation, Arch Oral Biol. 2007; 52(1): 64–73.

8. Venugopal V. Marine Products for Healthcare: Functional and Bioactive Nutraceutical Compounds from the Ocean. J. of Aqu Food ProTech. 2010; 19:48-54.

9. Newman DJ , Cragg GM.  Natural Products as Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 2010. J. Nat. Prod. 2012; 75 (3): 311–335.

10. Keshavarz  M, Mohammadikia D, Dabbagh AR. The Echinoderms Fauna in Intertidal zone of Southern Oli village coast (Boushehr, Persian Gulf). J Anim Sci Adv, 2012; 2(5): 495-498.

11. Haefner  B. Drugs from the deep: marine natural product as drug candidates, Drug Dis Today, 2003; 8(12) : 536–544.

12. Park SY, Lim HK, Lee S, Cho SK, et al. Biological Effects of Various Solvent Fractions Derived from Jeju Island Red Sea Cucumber (Stichopus japonicus). J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem, 2011; 54(5):718-724.

13. Bordbar S, Anwar F, Saari N. High-Value Components and Bioactives from Sea Cucumbers for Functional Foods — A Review, Mar. Drugs. 2011; 9: 1761–1805.

14. Byuna MR, Kim AR, Hwang JH, Sung MK, Lee YK, Hwang BS, et al. Phorbaketal A stimulates osteoblast differentiation through TAZ mediated Runx2 activation. FEBS Lett 2012; 586:1086–1092.

 15. Wijesekara I, Pangestuti R, Kim S. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae. Carbo Poly, 2011; 84(1): 14–21.

16.  Ahn SE, Kim S,  Park KH,  Moon SH, et al. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem & Bioph Res Comm, 2006; 340(2) : 403–408.

17. Zhang DW, Cheng Y, Wang  NL, Zhang JC, et al. Effects of total flavonoids and flavonol glycosides from Epimedium koreanum Nakai on the proliferation and differentiation of primary osteoblasts. Phytomedicine, 2008; 15: 55–61.

18. Park SJ, Lee KW, Lim DS, Lee S. The Sulfated Polysaccharide Fucoidan Stimulates Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells & Dev. 2011; 21(12): 2204-2211.

19. Song I, Kim BS, Kim CS, Im  G. Biochemical and Biophysical Research Communications Effects of BMP-2 and vitamin D 3 on the osteogenic differentiation of adipose stem cells. Biochem &  Bioph .Res Comm. 2011; 408: 126–131.

20. Kim YJ, Bae YC, Suh  KT, Jung JS. Quercetin , a flavonoid , inhibits proliferation and increases osteogenic differentiation in human adipose stromal cells, biochem  pharma. 2006; 72(10): 1268–1278.

21. Lee  MK, Lim SW, Yang H, Sung SH, et al. Osteoblast differentiation stimulating activity of biflavonoids from Cephalotaxus koreana, Bio& Medi Chem Letters. 2006; 16: 2850–2854.

22.  Ryu B, Qian ZJ, Kim SK. Chemico-Biological Interactions Purification of a peptide from seahorse , that inhibits TPA-induced MMP , iNOS and COX-2 expression through MAPK and NF-  B activation , and induces human osteoblastic and chondrocytic differentiation. Chemico-Bio Interactions. 2010; 184(3): 413–422.

23. Jeong HM, Han EH, Jin YH, Hwang YP, et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum stimulate osteoblast differentiation via p38 MAPK- and ERK-dependent RUNX2 activation. Food & Chem Toxic. 2010; 48: 3362–3368.

24. Lakshmi V, Saxena A, Mishra SK, Raghubir R, et al. Spermicidal Activity of Bivittoside D from Bohadschia vitiensis. Archives of Medical Research, 2008; 39(7): 631-638.