اثر نانوذرات‌نقره بر برخی پارامتر‌های خون‌شناسی گربه ماهی رنگین کمان (Pangasius hypophthalmus)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر نانوذرات نقره بر برخی شاخص‌های خون‌شناسی گربه‌‌ماهی ‌رنگین‌‌کمان به‏عنوان یک گونه ارزشمند آکواریمی و پرورشی است. مواد و روش‏ها: 40 قطعه گربه ‌ماهی ‌رنگین ‌کمان (میانگین وزنی 12 گرم) به‏مدت 10 روز تحت شرایط ساکن-تجدید در معرض مقادیر  1 و 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات‌نقره (میانگین قطر هیدرودینامیکی 8/54 نانومتر( و نیترات‌نقره قرار گرفتند. یک گروه آزمایشی حاوی 10 قطعه نیز به‏عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد. پس از پایان آزمایش، خون‌گیری از ماهیان (5 قطعه از هر تیمار) صورت گرفت و شاخص‌های مرسوم خون‌شناسی مورد ارزیابی گرفت. نتایج: میزان هموگلوبین، هماتوکریت و تعداد گلبول قرمز (RBC) در دوز 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات نقره در روز اول افزایش یافت )05/0(p<؛ در حالی‌که در روز دهم تفاوت معنی‏داری بین تیمار‌ها مشاهده نشد )05/0(p>. در هر دو زمان بررسی شاخص‌های ثانویه خون‌شناسی تغییرات معنی‌داری نشان نداد )05/0(p>. دوز 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات‌نقره در روز دهم منجر به  افزایش تعداد گلبول سفید (WBC) نسبت به گروه شاهد و روز اول شد )05/0(pنتیجه‌گیری: تغییر معنی‌دار RBC، هماتوکریت، هموگلوبین، WBC، فراوانی آن‌ها و میزان گلوکز در دوز بالای نانوذرات‌نقره می‌تواند نشان‌دهنده سمیت ترکیب مورد استفاده و بروز تنش در گونه مورد بررسی باشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

فناوری نانو در معنای ساده استفاده از مواد و ساختارهای در مقیاس نانو (حداقل با قطر 1 تا100نانومتر) است. توانایی دستکاری ماده در چنین مقیاس اتمی و مولکولی کوچکی، سبب کاربرد وسیع این علم در شیمی، زیست شناسی، فیزیک، داروسازی و علوم مهندسی شده است (1). افزایش تولیدات و محصولات نانو به ناچار منجر به افزایش فاضلاب نانو­مواد می‏شوند. این فاضلاب­ها از طریق هوازدگی اکسید و به‏طور عمدی یا تصادفی وارد محیط می­شوند. محیط­های آبی که بسیار آسیب­پذیر هستند، محل رسوب و تجمع بسیاری از این نانو­ذرات و فاضلاب­­های شیمیایی هستند. در نهایت این نانوذرات وارد واکنش با موجودات زنده و عوامل غیرزنده می­شوند، اما اثرات مضر و تخریب کننده آن­ها هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است و این عدم شناخت کافی منجر به ایجاد نگرانی­هایی برای سلامت انسان و محیط زیست شده است (2). از نانومحصولات تولید شده امروزی می­توان به دی­اکسید تیتانیوم، نقره، آهن، اکسید روی و همچنین نانولوله­های کربنی و گرافن اشاره کرد. نانوذرات­نقره به‏دلیل خاصیت ضدمیکروبی کاربردهای گسترده­ای داشته­اند، از جمله در باندهای بهداشتی (3)، ماشین­های لباس­شویی­ (4)، فیلتر­های تصفیه آب (5)، پارچه‌ها (6)، حسگرها (7) و داروسازی (8) از نانوذرات­نقره استفاده شده است.

مطالعات مختلف نشان داد که نانوذرات­نقره می­توانند منجر به افزایش پراکسیداسیون چربی (3)، ایجاد اکسیژن واکنش پذیر (7)، کاهش عمل‏کرد میتوکندریایی (7)، مرگ برنامه­ریزی شده سلول و تنش اکسیداتیو (9) شوند. با این وجود مکانیزم سمیت نانوذرات­نقره در ماهی­ها به درستی مشخص نیست. بیشتر بودن سمیت نانوذرات­نقره در مقایسه با یون‌ نقره، ممکن است به‏دلیل شکل و یا اندازه نانوذرات، میزان رهاسازی یون نقره (10)، یا ترکیبی از هر دو باشد (2). بنابراین در مطالعه اثر سمیت نانوذرات­نقره همواره لازم است با اثرات حاصله از یون نقره مقایسه شود.

خون یک شاخص مفید در تعیین سلامتی یک ارگانیسم است و شاخص­های خون­شناسی در تشخیض وضعیت عمل‏کردی جانورانی که در تماس با مواد سمی بوده­اند بسیار مهم هستند (11). به‏دلیل اینکه سیستم گردش خون و محیط خارجی با یکدیگر مرتبط هستند، متغیر­های خون­شناسی برای تشخیص اثرات مواد تنش­زا و سمی استفاده می­شود. پیشنهاد شده است خون­شناسی، تغییرات زیست­شیمیایی، نرخ رشد و میزان مصرف اکسیژن ماهی در تشخیص سمیت آلاینده­ها استفاده شود. تخریب خون و اندام­های خون­ساز در ماهی ممکن است به‏دلیل شرایط محیط زیست یا آلودگی آب­ها یا هر دو باشد (12). فاکتور­های سلولی در خون ( تعداد گلبول­های قرمز و سفید و شمارش افتراقی گلبول­های سفید) شاخص­های مفیدی در واکنش­های حاصله از تنش­های خارجی هستند که در نهایت سبب تغییرات مورفولوژیکی و توزیع سلولی در خون می­شوند (13). Davis و همکاران (14) گزارش کردند مواد تنش­آور محیطی سبب ایجاد پاسخ­های تنشی در پروفیل گلبول­های سفید می­شود (). همچنین ناهنجاری­های مورفولوژیکی در گلبول­های قرمز شاخص مفیدی در سمیت سلولی هستند (15).

تاکنون اطلاعات اندکی در مورد اثر نانوذرات بر روی خون ماهی گزارش شده است از جمله آن می­توان به مطالعات انجام شده بر  تیلاپیای موزامبیک Oreochromis mossambicus (16) و قزل­آلای­رنگین­کمان Oncorhynchus mykiss (17) اشاره کرد. نانوذرات آهن سبب ایجاد تغییرات معنی­دار در تعداد گلبول سفید و قرمز، هماتوکریت و هموگلوبین خون تیلاپیا شد در حالی­که نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم اثر معنی­داری بر شاخص‏های ذکر شده در قزل­آلای­رنگین­کمان نداشت. نانوذرات­نقره موجب کاهش میزان تری­گلیسیرید و تعداد گلبول­های سفید در موش­هایی که از این ماده به‏جای آب آشامیدنی استفاده کرده بودند، شد (18)، در صورتی‏که موجب تغییرات معنی­داری در تعداد گلبول­های سفید و آنزیم­های خونی جوجه نسبت به گروه شاهد نشد (19).

گربه­ماهی­رنگین­کمانPangasius hypophthalmus  یک گونه سریع­الرشد و همه چیزخوار است که از آن به‏عنوان غذای ماهی و یک گونه ارزشمند در آبزی­پروری آسیا نام برده می­شود و به بسیاری از رودخانه­ها و دریاچه­های قاره آسیا وارد شده است. این گونه به‏طور گسترده در مزارع تجاری پرورش ماهی تایلند، هند، چین و میانمار پرورش داده می­شود (20). همچنین این ماهی از سال 2004 وارد ایران شد و به‏عنوان ماهی آکواریمی از آن استفاده می­شود (21).

با توجه به محدودیت مطالعات علمی در زمینه تاثیر نانوذرات بر آبزیان، این تحقیق با هدف ارزیابی اثر نانوذرات­نقره بر شاخص‏های خون­شناسی گربه ­ماهی­رنگین ­کمان طراحی و اجرا شد.

 

مواد و روش‏ها

در این آزمایش از کلوئید نانوذرات نقره (Ag-NPs) با نام تجاری Nanocid و غلظت اسمی 4000 میلی‏گرم بر لیتر شرکت نانونصب پارس (تهران- ایران به شماره ثبت اختراع 20090013825) استفاده گردید. مشخصات نانوذره مورد استفاده در این تحقیق بر اساس آنالیز­های صورت گرفته پیشین به شرح جدول 1 بود (22).

 

 

 

 

جدول1: برخی از مشخصات اندازه­گیری شده کلوئید نانوذرات­نقره توسط سالاری­جو و همکاران (22)

پارامتر

روش سنجش

نوع یا مقدار

توضیحات

غلظت

ICP-AES

3980  میلی‏گرم بر لیتر

با غلظت اعلام شده از کارخانه تولیدی اختلاف ناچیزی دارد.

شکل

TEM

کروی

-

اندازه ذرات(قطر هیدرودینامیکی)

Zetasizer

9/3 تا 5/163 نانومتر

1/54 درصد  از ذرات قطر هیدرودینامیکی کم­تر از 100 نانومتر دارند.

میانگین قطر هیدرودینامیکی

Zetasizer

8/54   نانومتر

-

قطر بیشینه

TEM

129  نانومتر

14/65 درصد از ذرات قطری بین 1 تا13 نانومتر دارند.

خلوص

EDX

 

تنها عنصر نقره در کلوئید نانوذرات نقره وجود دارد.

         

 

 

طرح آزمایش: 50 قطعه گربه ­ماهی رنگین­کمان با میانگین وزنی26/0±12 گرم و طولی46/0±7/10 سانتی­متر تهیه شد. ماهی­ها به‏مدت دو هفته مرحله تطابق را طی کرده و سپس به اکواریوم با حجم کلی 100 لیتر و هوادهی شده با سنگ هوای 2 سانتی­متری و پر شده با آب شیر بدون کلر مستقر شدند. هر آکواریوم حاوی10 قطعه ماهی بود و آزمایش در 5 تیمار شامل: غلظت­های 1 میکروگرم بر لیتر نانوذرات نقره (1Ag-NPs)، 1 میکروگرم بر لیتر نیترات نقره (1AgNO3) ، 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات نقره (20Ag-NPs)، 20 میکروگرم بر لیتر نیترات نقره (20AgNO3) و گروه شاهد در قالب طرح آزمایش کاملا تصادفی اجرا شد. غلظت پائین نانوذرات نقره (1میکروگرم بر لیتر) به‏منظور ارزیابی اثرات سمیت این مواد در محیط طبیعی و غلظت بالا (20 میکروگرم بر لیتر) به منظور پی­بردن به سمیت بحرانی یا کم­ترین غلظتی که سبب کاهش زنده­مانی می­شود، انتخاب شد (2). نیترات نقره به‏منظور مقایسه اثر نانوذرات­نقره و یون نقره استفاده شد. ماهی­ها به‏مدت 10 روز در تماس با این مواد بودند و در طول این مدت تغذیه نشدند (23).

نانوذرات­نقره و نیترات­نقره قبل از هر بار استفاده به‏مدت 30 دقیقه به‏منظور یکنواخت پخش شدن، در محلول سونیکاسیون شدند. تانک­های آزمایش 24 ساعت قبل از اضافه کردن ماهی به دوز مورد نظر رسیدند، سپس شسته شده و مجددا قبل از اضافه کردن ماهی به دوز مورد نظر رسیدند تا میزان کاهش دوز ذرات مورد نظر که در اثر چسبیدن به سنگ­هوا و شیشه تانک ایجاد می­شود، به حداقل برسد. تعویض آب و تنظیم دوز مورد نظر هر 48 ساعت یک­بار تحت شرایط ساکن- تجدید انجام شد (24). شاخص­های فیزیکوشیمیایی آب در طول دوره ارزیابی شدند که شامل دما (8/29- 2/31 درجه سانتی­گراد)،  اکسیژن محلول (1/6-2/7 میلی­گرم بر لیتر)، pH (2/8-8/7)، هدایت الکتریکی (2/482 میکروزیمنس بر سانتی­متر)، آمونیوم (37/1 میلی­گرم بر لیتر)، فسفات کل)  09/0 قسمت در میلیون) و سختی (182 میلی­گرم بر لیتر کربنات کلسیم) بود.

در پایان روز اول و دهم (5 قطعه از هر تیمار) ماهی­ها با استفاده از گل­میخک با غلظت 100میلی­گرم در لیتر بی‏هوش شدند. سپس خون­گیری از ماهیان پس از خشک کردن ساقه دمی، با استفاده از سرنگ 5/2 میلی­لیتری هپارینه انجام شد و ویژگی‏های مرسوم خون­شناسی مطابق روش‏های استاندارد خون­شناسی برگرفته از Houston, 1990 به شرح زیر اندازه‏گیری شد (25).

شمارش تعداد گلبول سفید (هزار در میلی­متر­مکعب) و قرمز (میلیون در میلی­متر­مکعب)  پس از رقیق سازی نمونه خون با استفاده از محلول دیس (Dace)، شامل رنگ بریلیانت کریزل آبی (Brilliant cresyl blue)  (1/0 گرم)، سیترات سدیم (8/3 گرم)، فرمالین 37 درصد (2/0 میلی لیتر) و آب مقطر تا حجم 100 میلی لیتر با استفاده از پیپت ملانژور سفید یا قرمز و لام هموسایتومتر به صورت دستی اجرا شد. درصد هماتوکریت (Hct) با پر کردن لوله­های میکروهماتوکریت به‏میزان حداقل 3/2 حجم لوله از خون کامل و سانتریفیوژ (Sigma; Germany) 5 دقیقه در  rpm7000 تعیین گردید. همچنین میزان هموگلوبین (Hb گرم در دسی لیتر)، با استفاده از روش سیان­مت­هموگلوبین (Cyan methemoglobin) با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer lambda Z 800; USA) طول موج 540 نانومتر در آزمایشگاه تشخیص طبی میلاد، اصفهان اجرا شد. به‏منظور شمارش افتراقی گلبول­های سفید، لام اسمیر (گسترش خونی) تهیه و سپس با رنگ­آمیزی توسط محلول گیمسا سلول­های خونی قابل شناسایی شدند. شمارش افتراقی گلبول­ها با استفاده گسترش خونی رنگ­آمیزی شده و مطابق شکل گلبول­ها با کلید شناسایی مرتبط صورت گرفت (26). میزان گلوکز خون نیز در پایان روز دهم با استفاده از کیت­های شرکت پارس نانومتر در آزمایشگاه تشخیص طبی میلاد اندازه­گیری شد. حجم متوسط گلبول­های قرمز(MCV) ، مقدار متوسط هـموگلوبین گلبول قرمز (MCH) و غلظـت متوسط هموگلـوبین گلبول قـرمز (MCHC) بر اساس روابط زیر محاسبه شد (16 و 27).

MCV= (HCT/RBC)×10, MCH= (Hb/RBC)×10, MCHC= (Hb/RBC)×100

آزمایش با استفاده از آنالیز آماری یک‏طرفه (ANOVA) مشخص و سپس با استفاده از آزمون دانکن (Duncan) و      T-Test  معنی­دار بودن تفاوت بین میانگین تیمارها به تفکیک در سطح اعتماد 05/0p> ارزیابی گردید. تجزیه و تحلیل داده­ها به‏کمک نرم­افزار SPSS ver 18 انجام شد. جهت رسم نمودارها از Excel 2007 استفاده گردید.

 

نتایج

نتایج فراسنجه­های خونی نشان داد در روز اول میزان هموگلوبین، هماتوکریت و تعداد گلبول قرمز در دوز 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات نقره نسبت به سایر تیمار­ها افزایش معنی­داری داشت و به‏ترتیب معادل90/0± 26/14گرم بر دسی‏لیتر، 73/0±41 درصد و 11/0± 49/3 میلیون در متر مکعب بود (شکل1، 05/0p<)؛ در حالی­که در روز دهم تفاوت معنی­داری از نظر این شاخص­ها بین تیمار­ها مشاهده نشد

)05/0(p>. مقایسه مقادیر هموگلوبین، هماتوکریت و تعداد گلبول قرمز بین روز اول و دهم نشان داد میزان این سه فاکتور در همه تیمار­ها در روز دهم به طور معنی­داری )05/0(p< نسبت به روز اول کاهش یافته است (شکل 1).

 

 

ب

 

الف

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


                                                        ج

 

 

 

 

 

شکل 1: میانگین ± خطای استاندارد  (mean ± SE)الف: هموگلوبین، ب: هماتوکریت، ج: تعداد گلبول­های قرمزدر گربه­ماهی رنگین­کمان پس از مواجهه با نانوذرات نقره و نیترات نقره. علائم  انگلیسی کوچک و بزرگ به‏ترتیب برای تفاوت معنی­دار در بین تیمارهای مختلف در روز اول و دهم است.علامت * نشان دهنده وجود تفاوت معنی­دار بین روز اول و دهم خون‏گیری در یک تیمار است )05/0 .(p<

 

 

شاخص­های ثانویه خون­شناسی شامل متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، میانگین هموگلوبین گلبولی (MCH) و غلظت متوسط هموگلوبین گلبولی (MCHC) در روز اول به‏ترتیب در گستره 12/120-33/139، 71/40-89/45، 15/32-2/34 و در روز دهم به‏ترتیب در گستره 4/135-22/147 فمتولیتر، 87/43-07/48 پیکوگرم و 46/32-71/32 درصد بود. نتایج مقایسه آماری نشان داد که تفاوت معنی­داری در هیچ­یک از این شاخص‏های مورد بررسی بین گروه­های مختلف آزمایشی وجود نداشت (جدول2، 05/0 p>). همچنین در مقایسه بین دو زمان مورد بررسی در هیچ یک از شاخص­ها تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (جدول 2، 05/0 p>).

 

 

جدول2: میانگین ± خطای استاندارد (mean ± SE) شاخص­های ثانویه خون‏شناسی اندازه­گیری شده در گربه ماهی رنگین­کمان پس از مواجهه با نانوذرات نقره و نیترات نقره. در هر ردیف، وجود حداقل یک حرف مشابه بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار است )05/0 .(p>

        تیمار

 

فاکتور

زمان (روز)

شاهد

نیترات ­نقره

1 میکروگرم بر لیتر

نیترات ­نقره

20 میکروگرم بر لیتر

نانوذرات نقره

1 میکروگرم بر لیتر

نانوذرات ­نقره

20 میکروگرم بر لیتر

MCV(fL)

1

10

29/126 ± 95/13a

22/147 ± 76/8a

49/126 ± 14a

66/136 ± 28/11a

77/125 ± 8a

81/144 ± 05/11a

33/139 ± 82/11a

4/135 ± 04/9a

12/120 ± 56/4a

59/143 ± 87/19a

MCH(Pg)

1

10

71/40 ± 86/4a

07/48 ± 15/3a

39/42 ± 55/5a

68/44 22/4 ±a

55/42 ± 1/3a

19/47 ± 90/3a

89/45 ± 81/2a

87/43 62/2 ±a

96/40 ± 36/1a

59/46 ± 60/5a

MCHC(%)

1

10

15/32 ± 37/0a

62/32 ± 64/0a

35/33 ± 89/0a

94/32 ± 61/0a

82/33 ± 62/0a

54/32 ± 34/0a

9/32 ± 24/0a

46/32 ± 50/0a

20/34 ± 85/0a

71/32 ± 65/0a

 

 

در روز اول بررسی تعداد گلبول­های سفید (WBC) در زمان یکسان و همچنین در تیمارهای مختلف دارای تفاوت معنی­دار بود. در روز اول بیش­ترین تعداد گلبول سفید ( cell/mm3103 × 22/11±122) در ماهیان تیمار شده با دوز 1 میکروگرم بر لیتر نیترات­نقره مشاهده شد، اگرچه تفاوت معنی‏داری بین این گروه از ماهیان با سایر تیمار­های آزمایشی (به جز ماهیان گروه AgNPs20) مشاهده نشد (جدول3، 05/0 p>). در روز دهم تعداد گلبول سفید در دوز  AgNPs20 معادل 7/14 ±135 هزار در مترمکعب بود و نسبت به گروه شاهد افزایش معنی­داری داشت (جدول3، 05/0p<). در مقایسه بین دو زمان نمونه‏برداری، تفاوت معنی­داری در هیچ از یک شاخص­های مورد بررسی به‏جز افزایش معنی­دار WBC در گروه AgNPs20 مشاهده نشد (جدول3، 05/0 p>). در گسترش خونی رنگ‏آمیزی شده با گیمسا، انواع گلبول­های سفید شامل لنفوسیت، مونوسیت، نوتروفیل و ائوزینوفیل قابل تفکیک بودند که به‏ترتیب در گستره 66/47-66، 33/10-5/24، 5/10-66/39 و 33/1-5/3 درصد قرار داشتند (جدول 3). نانوذرات­نقره و نیترات­نقره اثر معنی­داری بر درصد ائوزینوفیل نداشت )05/0(p>. درصد لنفوسیت­ها و نوتروفیل­ها به‏طور معنی­داری در بین گروه­های مختلف آزمایشی متفاوت بود )05/0(p). درصد مونوسیت نیز در روز اول و دهم در هر دو تیمار نیترات­نقره کاهش پیدا کرد (جدول3، 05/0p>). میزان گلوکز اندازه­گیری شده در روز دهم در هر دو تیمار 20 و1 میکروگرم بر لیتر نانوذرات­نقره نسبت به سایر تیمارها افزایش معنی­داری داشت )05/0(p> (شکل 2).

 

 

 

 

 

                                       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل2: میانگین ± خطای استاندارد (mean ± SE) گلوکز اندازه­گیری شده در گربه­ ماهی رنگین ­کمان پس از 10 روز مواجهه با نانوذرات نقره و نیترات نقره.   

 

 

جدول 3: میانگین ± خطای استاندارد (mean ± SE)تعداد گلبول سفید و شمارش افتراقی گلبول سفید در گربه­ماهی رنگین­کمان                          P hypophthalmus)) بر اساس خون­گیری پس از مواجهه با نانوذرات نقره و نیترات نقره.    

 

      تیمار

 

فاکتور

زمان (روز)

شاهد

نیترات ­نقره

µg/L 1

نیترات ­نقره

µg/L20

نانوذرات نقره

µg/L 1

نانوذرات ­نقره

µg/L 20

WBC

(3 mm103)

1

10

9±5/102 ab

68 ± 1/9b

22/11±122 a

5/102  ± 53/8ab

44/14±110 a

5/107 ± 1/13ab

8/8±78 ab

80 ± 08/4b

89/4±58 b*

135 ± 7/14a

لنفوسیت (%)

1

10

66/64 ± 2/1a

66 ± 1a

5/59  ± 5/0b

75/61 ± 03/1a

66/47 ± 88/0c

52 ± 04/2b

5/63  ± 5/0a

25/62 ± 85/0a

57  ± 2b

25/56 ± 93/1b

مونوسیت (%)

1

10

33/23 ± 88/0a

6/21 ± 74/1a

25 ± 12/0a

25/24 ± 25/0a

33/10 ± 88/0c

5/13 ± 78/1b

24  ± 1a

5/24 ± 86/0a

17 ± 15/0b

25/20 ± 65/1a

نوتروفیل (%)

1

10

66/10 ± 33/0c

11 ± 94/0c

5/13 ± 5/0c

12 ± 08/1c

66/39 ± 66/0a

5/32 ± 7/1a

5/10 ± 5/1c

5/11 ± 86/0c

5/22 ± 5/0b

75/20 ± 1/1b

ائوزینوفیل (%)

1

10

33/1 ± 33/0a

4/1 ± 5/0a

2 ± 12/0a

5/1 ± 64/0a

33/2 ± 33/0a

2 ± 7/0a

2  ± 5/0a

75/1 ± 85/0a

5/3 ± 98/0a

7/2 ± 47/0a

 

در هر ردیف، وجود حداقل یک حرف مشابه بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار است (05/0P>).

علامت * نشان دهنده وجود تفاوت معنی­دار در سطح 05/0p< بین روز اول و دهم در یک تیمار است.

 

 

بحث

نانوذرات­نقره به‏دلیل اندازه بسیار کوچک و نسبت سطح به حجم زیاد (2) واکنش­پذیری بالایی با غشای سلول دارند و به‏عنوان یک عامل تنش­زا عمل می­کنند. پاسخ به تنش در ماهیان شامل سه مرحله است که توسط سیستم پیچیده عصبی- درون ریز کنترل می‏شود. اولین تغییری که معمولا پس از بروز تنش رخ می­دهد، تحریک محور هیپوتالاموس- هیپوفیز -کلیه است که باعث آزادسازی کورتیزول و کاته­کولامین می‏شود. پاسخ ثانویه شامل تغییرات ایمونولوژیکی، هماتولوژیکی و متابولیکی است که ناشی از عملکرد کورتیزول و کاته­کولامین است و باعث تنظیم اسمزی، افزایش قند خون و افزایش فشار خون می­شود. پاسخ سوم در مرحله نهایی بروز می­کند، در این مرحله، بیماری، کاهش رشد و در نهایت مرگ پدید خواهد آمد (28).

 تعداد گلبول­های قرمز، هماتوکریت و هموگلوبین پس از یک روز مواجهه با دوز 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات­نقره افزایش معنی‏داری یافت )05/0 .(p<این سه شاخص خون­شناسی اطلاعات با ارزشی را برای زیست­شناسان شیلاتی و پرورش‏دهندگان آبزیان به عنوان شاخص مناسبی از وضعیت سلامت ماهی و واکنش به تنش­های محیطی فراهم می­کند (29). به‏نظر می­رسد افزایش نیاز اکسیژنی ماهی در مواجهه با تنش منجر به بروز این تغییرات شده باشد. افزایش نیاز اکسیژنی در مواجه با تنش محیطی در آبزیان مختلف نظیر افزایش مصرف اکسیژن در قزل­آلای­رنگین­کمان پس از تغذیه با غذای آلوده به مس گزارش شده است (30 و 31) که معمولا به‏دلیل افزایش تقاضای انرژی برای مواجهه با شرایط تنش­زا است (29). از آنجایی‏که قسمت اعظم اکسیژن به‏صورت اتصال با هموگلوبین در گلبول قرمز منتقل می­شود، در شرایط تنش­زا معمولا تعداد گلبول قرمز افزایش می‏یابد که خود منجر به افزایش هموگلوبین و هماتوکریت خواهد شد. مشابه با نتایج این تحقیق Karthikeyeni و همکاران (16)، افزایش تعداد گلبول­های قرمز، هماتوکریت و هموگلوبین را پس از یک روز مواجه با نانوذرات ­اکسید آهن گزارش کردند. با این وجود، تفاوت معنی­داری در سه شاخص مورد بررسی در روز دهم مشاهده نشد که می­تواند ناشی از ایجاد حالت تطابق در ماهی پس از گذشت زمان باشد. مستندات بسیاری مبتنی بر ایجاد حالت تطابق و سازگاری در جانداران پس از مواجهه با عوامل تنش­زا وجود دارد. به‏عنوان مثال، ارزیابی اثر نانوذرات­نقره بر آنزیم کبدی آلانین­آمینو­ترانسفراز در موش ویستار جنس نر (32) نشان داد پس گذشت 3 روز این آنزیم در سرم خون افزایش معنی­داری نسبت به گروه شاهد داشت در صورتی­که پس از گذشت 8 و 12 روز میزان آن به‏حالت طبیعی بازگشت که علت را می­توان به ایجاد سازگاری‏های فیزیولوژیکی در جاندار و در نتیجه کاهش اثر سمیت ترکیب پس از گذشت زمان نسبت داد. نانوذرات­نقره و نیترات نقره در هیچ یک از تیمار­های آزمایشی اثر معنی­داری بر شاخص­های ثانویه متوسط حجم گلبول قرمز (MCV)، میانگین هموگلوبین هرگلبول قرمز (MCH) و غلظت متوسط هموگلوبین گلبول قرمز (MCHC) در روز اول و دهم نداشتند. نتایج متناقضی در خصوص تاثیر عوامل تنش­زا از جمله آلاینده­های محیطی بر شاخص­های ثانویه خون­شناسی وجود دارد. به‏عنوان مثال، مواجهه با نانوذرات ­اکسید آهن پس از 96 ساعت سبب افزایش MCV و MCH در تیلاپیای موزامبیک شد (16). در‏حالی‏که مواجه تاس­ماهی استرلیاد، Acipenser ruthenus  با کادمیوم محلول در آب منجر به تغییر معنی­دار در شاخص­های ثانویه خون­شناسی نشد (34). به‏نظر می‏رسد پاسخ شاخص­های ثانویه خون­شناسی به عوامل تنش­زای محیطی متاثر از عوامل مختلفی هم­چون نوع گونه، شرایط زیستی، نوع و غلظت مواد آلاینده باشد.

تعداد گلبول سفید در تیمار 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات­نقـره

در روز دهم افزایش یافت. همچنین دوز 20 میکروگرم بر لیتر نانوذرات­نقره سبب کاهش درصد لنفوسیت و افزایش درصد نوتروفیل شد. گلبول‌های سفید نقش مهمی را در ایمنی غیراختصاصی ایفا می‌کنند و تعداد آن‌ها شاخصی از میزان سلامتی در ماهیان است. مطالعات مختلف نشان داده است که معمولا شرایط تنش­زا منجر به افزایش تعداد گلبول‌های سفید می‌شود که احتمالا نشان دهنده تغییرات فیزیولوژیک آبزی در مواجه با عامل تنش­زا است (33). تعداد گلبول‏های سفید در روز اول در تیمارهای مختلف با گروه شاهد تفاوتی را نشان نداد. این مساله می‏تواند ناشی از کوتاه بودن دوره در معرض‏گذاری باشد، چراکه معمولا تغییرات در تعداد گلبول­های سفید در مقایسه با تعداد گلبول قرمز با تاخیر رخ می­دهد. نتایج این تحقیق در روز دهم نشان داد که تعداد گلبول­های سفید در دوز بالای نانوذرات­نقره نسبت به گروه شاهد افزایش یافته است )05/0>.(p بر اساس مطالعات صورت گرفته، تاکنون گزارشی مبنی بر تاثیر نانوذرات نقره بر تعداد گلبول­های سفید در ماهیان منتشر نشده است و لذا امکان مقایسه دقیق این نتایج با سایر مطالعات وجود ندارد. با این وجود، افزایش تعداد گلبول­های سفید خون موش‏های تزریق شده با نانوذرات­نقره پس از گذشت 12 روز گزارش شده است. این پدیده، شاید به‏دلیل نقش گلبول­های سفید در فاگوسیتوز نانوذرات­نقره باشد (32). با این وجود، به‏نظر می­رسد که پاسخ فیزیولوژیک افزایش تعداد گلبول سفید در مواجهه با آلاینده‏ها متاثر از دوره در معرض گذاری و شدت (غلظت) آلاینده باشد. در درازمدت ممکن است به‏دلیل تاثیر نامطلوب آلاینده­ها بر بافت­های تامین کننده گلبول­های سفید در خون، تعداد این دسته از گلبول­ها کاهش یابد. به‏عنوان مثال، رضویان و همکاران (19) گزارش کردند که 6 ماه استفاده از آب حاوی نانوذرات نقره به‏عنوان آب آشامیدنی موش­های صحرایی نژاد ویستار (Vistar rats) منجر به کاهش معنی­دار تعداد گلبول سفید می­شود که دلیل آن‏را مرگ برنامه­ریزی شده سلولی (آپوپتوزیس سلولی) عنوان کرده­اند. تغییر در شمارش افتراقی گلبول­های سفید می­تواند به‏عنوان شاخصی برای ارزیابی ایمنی بدن در مواجه با مواد آلاینده مورد استفاده قرار گیرد (35). تغییرات ناشی از تنش می­تواند تعادل هومئوستازی بدن را به‏هم‏زده و منجر به نابسامانی­هایی در سیستم ایمنی بدن شود. تغییر در میزان کورتیکواستروئیدها متاثر از بروز تنش می­تواند توجیه کننده تغییر در شمارش افتراقی گلبول­های سفید باشد. در بسیاری از موارد، تنش­های فیزیولوژیک می­تواند منجر به کاهش تعداد لنفوسیت­ها و افزایش نسبت نوتروفیل­ها شود (36). در این تحقیق افزایش درصد نوتروفیل و کاهش درصد لنفوسیت و مونوسیت در دوز بالای نانوذرات­نقره و نیترات­نقره مشاهده شد. با توجه به این­که تاثیر نانوذرات بر شمارش افتراقی گلبول­های سفید ماهیان تاکنون مورد اشاره قرار نگرفته است، لذا امکان مقایسه نتایج با سایر تحقیقات وجود ندارد. با این وجود Mekkawy و همکاران (12) با در معرض قراردادن گربه ماهی­آفریقایی Clarias gariepinus با ماده سمی 4- نونیل فنل، کاهش فراوانی لنفوسیت و افزایش فراوانی نوتروفیل و ائوزینوفیل را گزارش کردند. در صورتی­که غلظت­های مختلف کادمیوم اثر معنی­داری بر شمارش افتراقی گلبول­های سفید در بچه­ماهی استرلیاد نداشت (34). اگرچه نقش­های متعددی برای انواع گلبول­های سفید تاکنون گزارش شده است (29). اما یکی از نقش‏های اصلی نوتروفیل­ها، فاگوسیتوز است. شاید افزایش تعداد آن‏ها در تیمارهای مواجه شده با دوز بالای یون و نانوذرات­نقره به‏منظور فاگوسیتوز ذرات و یون­های وارد شده به پیکره آبزی باشد، با این وجود نتیجه گیری قطعی در این خصوص نیازمند مطالعات تکمیلی است.

میزان گلوکز در هر دو تیمار نانوذرات نقره پس 10 روز مواجهه نسبت به سایر گروه­ها روند افزایشی داشت. مشاهدات نشان داده است که تنش به‏عنوان یک فرآیند انرژی‌خواه باعث تجزیه گلیکوژن کبدی و در نتیجه افزایش گلوکز خون می‌شود. این عمل در پاسخ به افزایش کاته‌کولامین رخ می‏دهد (28). افزایش میزان گلوکز خون در اثر نانوذرات­نقره پس از 3 ماه تغذیه موش با آب محتوی این ترکیب نیز مشاهده شده است (19). همچنین افزایش میزان گلوکز در تیمارهای نانوذرات­نقره نسبت به نیترات­نقره می­تواند ناشی از بیشتر بودن سمیت نانوذرات­نقره نسبت به یون نقره آزادشده از نیترات نقره در آب باشد (2).

 

نتیجه گیری

با توجه به تغییرات ایجاد شده در تعداد گلبول­های قرمز، سفید و شمارش افتراقی آنها و همچنین میزان گلوکز سرم تنها پس از 10 روز در معرض­گذاری می­توان به اثر نامطلوب و تنش­زای نانوذرات نقره خصوصا در دوزهای بالا در مقایسه با نیترات نقره و گروه شاهد اذعان نمود. چنین تغییراتی شاید در دراز مدت  بتواند با تاثیر بر بخش های مختلف فیزیولوژیک آبزی، منجر به بروز پاسخ­های تنشی مرحله سوم و در نهایت کاهش رشد و مرگ آبزی شود. با این وجود، نتیجه­گیری قطعی در این خصوص نیازمند تحقیقات بیشتر و وسیع­تر بر روی همین گونه و گونه‏های دیگر است.

 

تشکر و قدردانی

نگارندگان از مهندس مهتاب خلجی، مژگان زارع، مهسا برهانی، بهزاد پورنوری (دانشجویان کارشناسی ارشد بوم شناسی آبزیان شیلاتی دانشگاه صنعتی اصفهان) و مهندس صمد بهرامی (دانشجوی کارشناسی ارشد رشته تکثیر و پرورش آبزیان دانشگاه صنعتی اصفهان) به‏سبب همکاری­های ارزنده ایشان سپاسگزاری می­نماید. بخشی از هزینه­های انجام این تحقیق از محل پژوهانه شماره 25248/91/502 پرداختی از سوی معاونت پژوهشی دانشگاه صنعتی­اصفهان به دکتر سالار درافشان تامین شده است.

  1. 1. Masciangioli T,  Zhang W. Environmental technologies at the nanoscale, Environ. Sci. Technol. 2003; 37(5): 102-108.
  2. 2. Scown TM, Santos, EM, Johnston BD, Gaiser B, et al. Effects of aqueous exposure to silver nanoparticles of different sizes in rainbow trout. Toxicol. Sci. 2010; 115(2): 521-534.
  3. 3. Arora S, Jain J, Rajwade JM, Paknikar KM. Cellular responses induced by silver nanoparticles: in vitro studies, Toxicol. Let. 2008; 179(2): 93–100.

4. Jung WK, Kim SH, Koo HC, Shin S, et al. Antifungal activity of the silver ion against contaminated fabric, Mycoses. 2007; 50(4): 265–269.

5. Li QL, Mahendra S, Lyon DY, Brunet L, et al. Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: potential applications and implications, Water Res.  2008; 42(18): 4591–4602.

6. Perelshtein I, Applerot G, Perkas N, Guibert G, et al. Sonochemical coating of silver nanoparticles on textile fabrics (nylon, polyester and cotton) and their antibacterial activity, Nanotechnology. 2008; 19: 245705.

7. Schrand AM, Braydich-Stolle LK, Schlager JJ, Dai L, et al. Can silver nanoparticles be useful as

 

potential biological labels, Nanotechnol. 2008; 19(23): 235104.

8. Sun L, Singh AK, Vig K, Pillai SR, et al. Silver nanoparticles inhibit replication of respiratory syncytial virus, J. Biomed. Nanotechnol. 2008; 4: 149–158.

9. Hussain SM, Hess KL, Gearhart JM, Geiss KT, et al. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells, Toxicol. 2005; 19(7): 975–983.

10. Mayer GD, Leach A, Kling P, Olsson PE, et al. Activation of the rainbow trout metallothionein-a promoter by silver and zinc, Biochem. Mol. Biol. 2003; 134(1): 181–188.

11. Joshi PK, Bose M, Harish D. Changes in haematological parameters in asiluroid catfish Clarias batrachus (Linn) exposed to mercuric choloride, Pollut. Rec. 2002; 21 (2): 129–131.

12. Mekkawy IA, Mahmoud UM, Sayed AH. Effects of 4-nonylphenol on blood cells of the African catfish Clarias gariepinus (Burchell, 1822), Tissue and cell. 2011; 43(4): 223-229.

13. Srivastava S, Choudhary SK. Effect of artificial photoperiod on the blood cell indices of the catfish, Clarias batrachus. J. Stress Physiol. Biochem. 2010; 6(1): 22-32.

14. Davis AK, Maney DL, Maerz JC. The use of leukocyte profiles to measure stress in vertebrates: a review for ecologists, Fun. Ecol. 2008; 22(5): 760-772.

15. Bushra A, Abul farah M, Niamat MA, Waseem A. Induction of micronuclei and erythrocyte alterations in the catfish Clarias batrachus by 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid and butachlor, Mutat. Res. 2002; 518: 135-144.

16. Karthikeyeni S, Vijayakumar TS, Vasanth S, Ganesh A, et al. Biosynthesis of Iron oxide nanoparticles and its haematological effects on fresh water fish Oreochromis mossambicus, J. Acad. Indus. Res. 2013; 1(10): 645-649.

17. Federici G, Shaw BJ, Handy RD. Toxicity of titanium dioxide nanoparticles to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Gill injury, oxidative stress, and other physiological effects, Aquat. Toxicol. 2007; 84: 415-430.

18. Ahmadi J. Application of different levels of silver nanoparticles in food on the performance and some blood parameters of broiler chickens, World Appl. Sci. J. 2009; 7: 24-27.

19. Razavian MH, Safarpour E, Roshanai K, Yazdian MR, et al. Study of Biochemical and hematological parameters changes of Wistar rats blood parallel to oral nanosilver consumption, J Babol Univ. Med. Sci. 2011; 13(1): 22-27.

20. Rahman MM, Islam Ms, Halder GC, Tanaka M. Cage culture of sutchi catfish, Pangasius sutchi (Fowler 1937): effects of stocking density on growth, survival, yield and farm profitability, Aqua. Res. 2006; 37: 33-39.

21. Molnar K, Szekely C, Mohamed K, Harrison FSh.  Myxozoan pathogens in cultured Malaysian fishes. I. Myxozoan infections of the sutchi catfish Pangasius hypophthalmus in freshwater cage cultures, Dis. Aquat. Org. 2006; 68: 209-218.

22. Salari joo H, Kalbassi MR, Yu IJ, Lee JH, et al. Bioaccumulation of silver nanoparticles in Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Influence of concentration and salinity, Aquat. Toxicol. 2013; 15: 398-406.

23. Bernet D, Schmidt H, Meier W, Burkhardt-Holm P, et al. Histopathology in fish: proposal for a protocol to assess aquatic pollution, J Fish Diseases. 1999; 22: 25-34.

24. Kalbassi MR, Abdollahzadeh E, Salari joo H. Effect of colloidal silver nanoparticles on population of gut bacterial flora of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), J. Vet. Res. 2012; 67(2): 181-189.

25.Houston H. Review: are the classical hematological variables acceptable indicators for fish health? Tran Am Fish Soc. 1997; 126(6): 879-894.

26. Blaxhall PC. The haematological assessment of the health of fresh water fish, J fish Biol. 1972; 4: 593-604.

27. Atef M, Attar A. Changes in haematological parameters of the fish, Oreochromis niloticus treated with sub-lethal concentration of cadmium, Pak. J. Boil. Sci. 2005; 8(3): 421-424.

28. Mommsen TP, Vijayan MM, Moon TW. Cortisol in telieosts: dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation, Fish Biol and Fisheries. 1999; 9: 211–268.

29. Kazemi, R, Pourdehghani, M, Yousefi Joudehi, A, Yarmohammadi, M, et al. Cardiovascular system physiology of aquatic animals and applied techniques of fish haematology. 1th Ed. Rasht. Bazargan co; 2010.

30. Van der Oost R, Beyer J, Vermeulen NPE. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review, Environ. Toxicol.  Pharmacol. 2003; 13: 57-149.

31. Campbell HA, Handy RD, Sims DW. Shifts in a fish’s resource holding power during a contact paired interaction: the influence of a copper contaminated diet in rainbow trout, Physiol. Biochem. Zool. 2005; 78: 706–714.

32. Naghsh N, Noori A, Aqababa H, Amirkhani S, et al. Effect of nanosilver particles on alanin amino transferase (ALT) activity and white blood cells (WBC) level in male Wistar rats, In vivo condition, Zahedan J. Res. Med. Sci. 2012; 14(7): 34-37.

33. Roberts, R.J. The pathophysiology and systemic pathology of teleosts, 1th Ed. London. Bailliere Tindal; 1978.

34. Orojali M, Paykan Heyrati F, Mahboobi Soofiani N, Dorafshan S. Cadmium sub-lethal concentration effects on the haematological parameters of sterlet (Acipenser ruthenus), J. Fish. Sci.Tech. 2013; 2(2): 11-22.

35. Adedeji OB, Adeyemo OK, Agbede SA.  Effects of diazinon on blood parameters in the African catfish (Clarias gariepinus), Afr. J. Biotechnol. 2009; 8 (16): 3940-3946.

36. Pickering, A.D. The concept of biological stress. 1thEd. London: Academic Press; 1981.